MX2011002328A - Celulas adherentes del tejido de placenta y su uso en terapia. - Google Patents

Abstract

Se divulga un método para cultivar células adherentes de un tejido de placenta o adiposo. El método que comprende cultivar las células adherentes del tejido de placenta o adiposo bajo condiciones de cultivo tridimensionales (3D) que permiten la expansión celular, las condiciones que comprenden perfusión.

Description

CELULAS ADHERENTES DEL TEJIDO DE PLACENTA Y SU USO EN TERAPIA CAMPO Y ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN j La presente invención, en algunas modalidades; de la j 1 misma, se relaciona a células adherentes de tejido de i placenta y, más particularmente, pero no exclusivamente, a métodos para cultivarlas y usarlas para tratamiento .| En años recientes, la actividad considerable se ha I enfocado sobre el potencial terapéutico de las células estromales mesenquimales (MSCs) para varias ap icaciones médicas incluyendo la reparación de tejido de órganos dañados tales como el cerebro, corazón, hueso e hígado ! y en el i soporte de transplantaciones de médula ósea (BMT) . ¡Las MSCs, una población heterogénea de células obtenidas ! de, por ejemplo, médula ósea, tejido adiposo, placenta y sjangre, es i capaz de diferenciarse en diferentes tipos de células (por ejemplo, células endoteliales reticulares, fibroblastos, adipocitos, células precursoras osteogénicas ) dependiendo de i influencias de varios factores bioactivos. Por consiguiente, las MSCs se han estudiado ampliamente en la j medicina ' regenerativa como la base para construir nuevos tejidos tal como hueso, cartílago y grasa para la reparación de; lesión o reemplazo de tejidos patológicos y como el tratamiento; para enfermedades genéticas y adquiridas [Fibbe y Noort,| Ann N Y i Acad Sci(2003) 996:235-44; Horwitz y colaboradores, Cytotherapy (2005) 7 (5): 393-5; Zimmet 'y Haré, Básic Res Cardiol' (2005) 100 ( 6) : 471-81 ] . Además, la I habilidad multipotente de las MSCs, su fácil aislamiento y cuiltivo, asi como su alto potencial de expansión ex vivo las | hacen una ¦herramienta terapéutica atractiva [Fibbe and Noort, supra; Minguell y colaboradores. Exp Biol Med (Maywjood) (2001) 226 (6) : 507-20] . | ! Un cuerpo emergente de datos indica quej las MSCs , I 1 escapan del reconocimiento de células alorreactivas y se consideran que son inmunoprivilegiadas [Le ¡ Blanc y colaboradores, Exp Hematol (2003 ) 31 ( 10 ): 890-6] .. Teniendo baja inmunogenicidad, las MSCs no son rechazadas por el sistema inmune del paciente y por lo tanto se consideran que no requieren igualación de HLA. · i Las MSCs derivadas de placenta exhiben muchos marcadores comunes a las MSCs aisladas de otros tejidos, por ejemplo, CD105, CD73, CD90 y CD29, y la falta de expresión de marcadores de células especificas hematopoyéticas, I endoteliales y trofoblásticas . La diferenciación adipogénica, i osteogénicas y neurogénica se ha logrado después de cultivar j las MSCs derivadas de placenta bajo condiciones apropiadas [Yen y colaboradores, Stem Cells (2005) 23(1) : 3-9 ]| . Además, las MSCs aisladas de la placenta y cultivadas in vitro se ha demostrado que son inmunoprivilegiadas en un aspecto similar I como las MSCs [Li y colaboradores, Cell Res (2005) 15(7): 539- 47] . Asi, la placenta proporciona una fuente éticamente no ! i I ! controversial y fácilmente accesible de MSCs para aplicaciones experimentales y clínicas ['Zhang y colaboradores, Exp Hematol (200 ) 32 (7 ) : 657-64 ] . Además, los í presente inventores han ideado previamente condiciones de i cultivo tridimensionales (3D) adecuadas para la expansión de MSCs derivadas de placenta (WO/2007/108003) . ¡ BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN ¡ De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de i la presente invención se proporciona un método pará cultivar células adherentes de un tejido de placenta o adiposo, el método que comprende cultivar las células adherentes del i tejido de placenta o adiposo bajo condiciones dje cultivo i tridimensionales (3D) que permiten la expansión celular, las i I condiciones que comprenden perfusión. i De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de I la presente invención se proporciona una población ide células generadas de acuerdo con el método anterior. j De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de i la presente invención se proporciona una población de células que comprende un perfil de expresión génica esencialmente como es descrito en la presente. j De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un uso de la población de células, para la manufactura de un medicamento i identificado para tratar una condición que puede beneficiarse de la transplantación de células u órganos. j De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para inducir tolerancia y/o inmunosupresión en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente ,efectiva de las células adherentes, para de esta manera inducir tolerancia y/o inmunosupresión en el sujeto. | De acuerdo con algunas modalidades de la invención, I la perfusión se ajusta de acuerdo con la concentración de glucosa del medio de cultivo. I De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el medio de cultivo se mantiene en una concentración de glucosa de aproximadamente 550 mg/L. j De acuerdo con algunas modalidades de la invención, las condiciones de cultivo 3D comprenden un biorreactor 3D. i De acuerdo con algunas modalidades de la invención, ¡ las condiciones de cultivo 3D comprenden un j material adherente seleccionado del grupo que consiste de J vidrio y i plástico; poliéster, polipropileno, poliestireno, dextrano y colágeno. j i De acuerdo con algunas modalidades de la invención, las condiciones de cultivo 3D son efectuadas durante por lo menos 3 días. I i De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el cultivo de las células se efectúa hasta que por lo menos 10% de las células están proliferando. ! De acuerdo con algunas modalidades de la ¡invención, por lo menos 10% de las células adherentes están en una fase proliferativa . ¡ De acuerdo con algunas modalidades de la invención, las células adherentes son capaces de suprimir una reacción las células adherentes son menos comprometidas a : un linaje adipogénico como es comparado con las células adherentes de la médula ósea cultivadas y dejadas diferenciar: bajo las I mismas condiciones. ? , I : De acuerdo con algunas modalidades de la Jinvénción, la condición se selecciona del grupo que consiste de isquemia, enfermedad arterial periférica (PAD) , isquemia de i : miembro critico (CLI), isquemia de extremidad j inferior, enfermedad vascular isquémica, enfermedad vascular del riñon, i enfermedad de corazón isquémico, isquemia mibcardiaca, enfermedad de arteria coronaria (CAD) , enfermedad cardiovascular ateroesclerótica, enfermedad dej arteria coronaria principal izquierda, enfermedad oclusiva | arterial, isquemia periférica, enfermedad vascular . periférica, arteriosclerosis, enfermedad de cerebro isquémico, ataque apoplético, isquemia cerebral, enfermedad cerebro ¡vascular, retinopatia, reparación retinal, desorden de remodelación, I I síndrome de von Hippel-Lindau, enfermedad ¡ vascular I telengiectasiaisquémica hemorrágica hereditaria, enfermedad i ; de Buerger, enfermedad renal isquémica, placenta isquémica, desórdenes asociados con la reproducción, enfermedad de injerto contra hospedero, transplantación de órganó sólido, ! :¦ I transplantación de célula madre hematopoyética, i |diabetes, i daño de tejido conectivo, cáncer, pre-cáncer, cáncer de hueso, osteosarcoraa, metástasis de hueso, fractura '¡de hueso, lesión por quemadura, defecto de cartílago 'articular, sanación de heridas, herida profunda, sanación ¡de herida retardada, sanación de úlcera retardada, quiste; de hueso subcóndrico, osteoporosis, osteoartritis, hueso degenerado, I ¡ daño de cartílago, defecto de cartílago articular; tendones i lesionados, enfermedad autoinmune, desórdenes mejtabqlicos, psoriasis, dolor neuropático, lesión del nervio periférico, soporte de transplantación del -riñon y '¡enfermedad inflamatoria. i De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la condición ¦ se selecciona del grupo que consiste de enfermedad de intestino inflamatorio (IBD) y enfermedad de Crohn.

A menos que se defina de otra manera, ¡todos los términos técnicos y científicos utilizados en la¡ presente tienen el mismo significado como es comúnmente enténdido por ¡ uno de habilidad ordinario en la técnica a laj cual la invención pertenece. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente jse pueden utilizar en la práctica o la prueba de modalidad de la invención, métodos y/o' materiales ejemplares se ¡describen enseguida. En caso de conflicto, la especificación de i patentes, incluyendo las definiciones, lo controlarán. i Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solamente y no se proponen para ser necesariamente i invención. A este respecto, la descripción tomada con los dibujos hace evidente a aquellos expertos en la /¿écnica de cómo se pueden practicar las modalidades de la invención.

En los dibujos: 1 i La FIG. 1 es un diagrama de flujo que representa la producción de células adherentes 3D de placenta de acuerdo con las presentes enseñanzas (designadas células PLX-C) .

La FIG. 2 es un diagrama de un recipiente de biorreactor ejemplar y orificios adaptados del sitio de la red The New Brunswick Scientific. \ Las FIGs. 3A-B representan el análisis ¡ de . ciclo i celular de células adherentes 3D de la manufactura por Plurix I (designadas PLX, Figura 3B) y por las presentes enseñanzas (PLX-C, Figura 3A) . Las células se fijaron en EtÓH al 70% O.N, se centrifugaron y se resuspendieron en una solución de Yoduro de Propidio PI) y luego se analizaron mediante FACS.

Las FIGs. 4A-D representan la expresión marcadores típicos de fibroblasto pero no la expresión de marcador de célula mononuclear (MNC) de las células! Las FIGs. 6A-B representan la inhibición de la proliferación de linfocito por PLX-C. La Figura 6A representa las pruebas de Reacción de Linfocito Mezclado (MLR) \ realizada con células mononucleares (MNC, donador A) derjivadas de sangre periférica (PB) 2 x 105 estimuladas con una cantidad igual de MNCs (donador B) derivadas de PB irradiadas, (3000 Rad) seguido por la adición de incrementar cantidades de i células PLX-C a los cultivos. Tres réplicas de cada grupo se sembraron en placas de 96 cavidades. La velocidad de I proliferación se midió mediante la incorporación de [ H] timidina; la Figura 6B representa las MNCs derivadas de sangre periférica (PB) estimuladas con ConA (1.5 mg/ml) . Cantidades incrementadas de células PLX-C se adicionaron a los cultivos. Tres réplicas de cada grupo se sembraron en placas de 96 cavidades. La velocidad de proliferación se medición mediante la incorporación de [3H] timidina . ¡ ¡ j Las FIGs. 7A-C representan la regulaciónj de ' PLX-C I de la secreción de citoquina pro-inflamatoria ¡ y anti- i ; inflamatoria después del co-cultivo con células de sangre periférica. Las Figuras 7A-B representan la secreción de IFNy i (Figura 7A) y TNFa (Figura 7B) después del co-cultivo de las MNCs derivadas de humano (aislados de la sangre periférica) estimuladas con ConA con PLX-C; la Figura 7C representa la secreción de IFNy, TNFa e IL-10 después del co-cultivo de las derivadas de placenta (Figuras 8D-F) se colocaron en el medio de crecimiento (Figuras 8A y 8D) , medio de diferenciación de i osteogénesis (Figuras 8B y 8E) o medio de diferenciación de adipogénesis (Figuras 8C y 8F) en una placa de 24 i cavidades recubierta con vitronectina y colágeno. El medio se ¡reemplazó cada 3-4 días. Al final del período de crecimiento las i células se fijaron, se mancharon y se fotografiaron como es i descrito en detalle en la sección de Ejemplos que si'gue.

Las FIGs. 9A-F son fotografías que representan el i crecimiento de células de médula ósea y de placenta bajo condiciones de diferenciación de osteogénesis o adipogénesis modificadas. Las células derivadas de médula ósea! (Figuras 9A-C) o células derivadas de placenta (Figuras ' 9D-F) se colocaron en el medio de crecimiento (Figuras 9A y 9D) , medio i 1 de diferenciación de osteogénesis (Figuras 9B y 9E) o 'medio I I de diferenciación de adipogénesis (Figuras 9C y 9F) en una placa de 24 cavidades recubierta con vitronectina y ¡colágeno.

I : células PLX-C que expresan Luciferasa en ratones SCID/Beige.

Un ratón se inyectó IM y uno IV. Los ratones ' inyectados se monitorearon utilizando el sistema IVIS con el fin de estimar la biodistribución in vivo de PLX-C. Los resultados de IVIS de los días 1 (Figura 12A) , día 4 (Figura 12B) , díai6 (Figura 12C) y día 22 (Figura 12D) son presentados.

DESCRIPCIÓN DE MODALIDADES ESPECÍFICAS DE LA INVENCIÓN I 1 La presente invención, en algunas modalidades : de la • misma, se relaciona a células adherentes de ¿ejido de placenta y, más particularmente, pero no exclusivamente, a métodos para cultivarlas y usarlas para tratamiento! Los principios y operación de la presente invención se pueden entender mejor con referencia a los dibujos- y las descripciones acompañantes. | j Antes de explicar por lo menos una modalidad de la invención en detalle, se va a entender que la invención no í está necesariamente limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados por i los Ejemplos. La invención es capaz de otras modalidades o de I ser practicado o llevado a cabo de varias maneras! También, j se va a entender que la fraseología y terminología' empleadas i en la presente es para propósitos de descripción ¡y no debe ser considerada como limitativa.

Mientras que se reduce la presente inven'ción a la i práctica, los presentes inventores han descubierto que el cultivo de células adherentes derivados de placenta bajo condiciones de cultivo tridimensionales (3D) que ¡ comprende ! perfusión, genera cantidades grandes de células adherentes que se caracterizan por un perfil de expresión génica ¦ i ¡ distintivo, son capaces de suprimir una respuestaj inmune y j son altamente proliferativas . Así, estas células adherentes de placenta se pueden utilizar para aplicaciones terapéuticas . ' ! ' j Como se ilustra en la presente enseguida y en el Ejemplo 1-8 de la sección de Ejemplos que 'sigue, los ! I I I I I presentes inventores fueron capaces de expandiir células i adherentes derivadas de placenta bajo condiciones 3D. Las condiciones 3D de la presente invención comprenden la perfusión del medio celular dentro del biorreactojr (ver el Ejemplo 2) . Como se muestra en el E emplo 3, las células i adherentes de placenta de la presente invención 'comprenden propiedades de la célula madre estromal, por ejemplo, expresa i marcadores celulares típicos de. las células madre ejstromales, y comprende propiedades inmunosupresoras . Además, estas i células son altamente proliferativas (28% dé células estuvieron en las fases S y G2/M) y son retenidas en el cuerpo por unas cuantas semanas después de la administración (ver los Ejemplos 3 y 8), sugiriendo que estas células se i pueden utilizar para el tratamiento. ¡ i Además, en su etapa 2D, las células adherentes I. derivadas de placenta de la presente invención no se diferenciaron en osteocitos (Ejemplos 4-5) o adipocitos (Ejemplos 6-7), en agudo contraste a las células adherentes de médula ósea de las cuales un alto porcentaje (arriba de 50%) se sometió a diferenciación cuando se cultivan bajo las i 7 mismas condiciones. ! Así, de acuerdo con un aspecto de lai presente ¡ I invención se proporciona un método para cultivar células ¡ adherentes de un tejido de placenta o adiposo, el método que comprende cultivar las células adherentes del ¿ejido de placenta o adiposo bajo condiciones de; cultivo tridimensionales (3D) que permiten la expansión celular, las condiciones que comprenden perfusión. : Como se utiliza en la presente, la frase "células adherentes" se refiere a una población homogénea o heterogénea de células que son dependientes de la| fijiación, es decir, requieren la unión a una superficie con ¡el fin de crecer in vi tro. ! Como se utiliza en la presente la frase "tejido adiposo" se refiere a un tejido conectivo que ¡ comprende células de grasas (adipocitos ) . i Como se utiliza en la presente, el término "tejido de placenta" se refiere a cualquier porción djsl órgano mamífero que recubre la pared uterina y durante ¡la preñez envuelve el feto, al cual se une por el cordón umbilical. Después del nacimiento, la placenta es expulsada (y es referida como una placenta de post parto). En una ¡ modalidad ejemplar, la placenta se refiere a la placenta compieta. i De acuerdo con las presentes enseñanzas, las células adherentes derivadas de placenta o de tejido adiposo se propagan utilizando condiciones de ! cultivo tridimensionales (3D) . j : i Como se utiliza en la presente, la frase "cultivo tridimensional" se refiere a un cultivo en el ! cual las células se disponen a condiciones que están compatibles con el crecimiento celular incluyendo una estructura que permite los contactos de célula a célula en tres dimensiones. Es bien j . apreciado que el ambiente in situ de una célula en un organismo viviente (o un tejido) está en una arquitectura tridimensional. Las células son circundadas por ¦ otras I células. Ellas se mantienen en una red compleja de fibras de nanoescala de matriz extracelular que permite el I establecimiento de varios microambientes locales. Estos i ligandos extracelulares median no solamente la unión a la membrana basal sino también el acceso a una variedaL de1 vasos í vasculares y linfáticos. El oxigeno, las hormonas y nutrientes se aferran a las células y los projductos de i : desecho son desechados. Las condiciones en el cultivo i tridimensional de la invención se diseñan para imitar -tal ambiente como es ejemplificado adicionalmente enseguida: i Será apreciado que las condiciones del cultivo I tridimensional son tales que permiten la expansión de las ' i ; células adherentes. I I Como se utiliza en la presente los ¡ términos "expandir", y "expansión" se refieren al mantenimiento i ! sustancialmente menor de diferenciación de las ¡células y finalmente el crecimiento celular, es decir, el incremento de una población de células (por ejemplo, por lo menos 2 veces) sin la diferenciación que acompaña tal incremento. ¡ Como se utiliza en la presente los ! términos "mantener" y "mantenimiento" se refieren a la renovación de células sustancialmente de menos diferenciación, esj decir, la I ' población de células sustancialmente estacionaria sin la diferenciación que acompaña tal estacionariedad. \ Como es mencionado, las células adherentes de este aspecto de la invención son recuperadas de un ¡tejido de i placenta o adiposo. j Las células de placenta se pueden obtener de una placenta de plazo completo o pre-plazo. La placenta es de preferencia recolectada una vez que ha sido exanguineada . la i placenta es de preferencia perfusionada durante un periodo de tiempo suficiente para remover las células residuales (por ejemplo, sangre) .

El término "perfusionar" o "perfusión" utilizada en i la presente se refiere al acto de vaciar o hacer; pasar un j fluido sobre la placenta o en etapas posteriores del método sobre las células cultivadas. El tejido de placenta ! puede ser ¡ de cualquier mamífero; por ejemplo, el tejido de placenta es humano. Una fuente conveniente de tejido de placenta es de una placenta de post parto (por ejemplo, 1-6 ho'ras), sin embargo, la fuente de tejido o células de placenta o el método de aislamiento del tejido de placenta no es crítico para la invención. ¡ Las células adherentes derivadas de placenta se i pueden obtener de partes tanto fetales (es decir, ámniónica, coriónica, coriónica villi o partes interior s de la placenta, ver Ejemplo 1) y maternales (es decir,¡ deciduas I basalis y deciduas parietalis) de la placenta. Las muestras i ; ¡ de tejido se lavan en una solución reguladora fisiológica [por ejemplo, solución salina regulada con fosfatp (PBS) o I solución reguladora de Hank] . Las suspensiones dej una sola célula se hacen al tratar el tejido con una enzima digestiva (ver enseguida) y/o al desmenuzar e inundar las partes de i tejido a través de un filtro de nylon o mediante él pipeteo i moderado (Falcon, Becton, Dickinson, San José, CA) con el medio de lavado. i Será apreciado que las células adherentjes pueden I ser derivadas del tejido adiposo. Las células adherentes I derivadas del tejido adiposo se pueden aislarj por una variedad de métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica. Por e emplo, tales métodos se describen en la' patente norteamericana No. 6, 153,432. El tejido ajdiposo se puede derivar de sitios de tejido omental/visceral,j mamario, gonadal u otro tejido adiposo. Una fuente de tejido adiposo i j es el adiposo omental. En humanos, el adiposo es típicamente aislado por liposuccion. i I Las células adherentes aisladas del tejido de i placenta o adiposo se pueden derivar al tratar el tejido con ! una enzima digestiva tal como colagenasa, tripsina y/o i dispasa; y/o concentraciones efectivas de hialuronidása o i I DNAsa; y ácido etilendiaminotetraacético (EjDTA) ; a temperaturas entre 25-50°C, durante periodos de j entre 10 minutos a 3 horas. Las células luego se pasan a través de una malla de nylon o de tela con filtro de entre 20 mieras a 1 mm. Las células se centrifugan a velocidades de entre 100 a 3000 x g durante periodos de entre 1 minuto a |l hora a temperaturas de entre 4-50°C (ver la patente norteamericana No. 7, 078, 230) . j i La recuperación de células de tejido de placenta o i ! adiposo de preferencia se efectúa bajo condiciones a'sépticas. i Una vez que se obtienen las células aisladas, ellas! se dejan adherir a un material adherente (por ejemplo, configurado como una superficie) para de esta manera aislar las células ! adherentes.

Como se utiliza en la presente "un material adherente" se refiere a un material sintético, q¿e ocurre naturalmente o una combinación de los mismos de un material no citotóxico (es decir, biológicamente compatible) jque tiene I una estructura química (por ejemplo, grupos expuestos de superficie cargada) que puede retener las células ¡sobre una ! superficie. 'j I Ejemplos de materiales adherentes que se pueden utilizar de acuerdo con este aspecto de la invención incluyen, pero no están limitados a, un poliéjster, un polipropileno, un polialquileno, un polifluorocloroetileno, un cloruro de polivinilo, un poliestireno, una po isulfona, un acetato de celulosa, una fibra de vidrio, una partícula de ceramida, un matrigel, un componente de matriz extracelular I i (por ejemplo, fibronectina, vitronectina, condronectina, laminina) un colágeno, un ácido poli L láctico, un dextrano y I una fibra de metal inerte. j Las etapas adicionales de purificación o enriquecimiento para células madre estromales jse ¡ puede efectuar utilizando métodos que son bien conocidos en la i técnica (tal como mediante FACS utilizando la ¡expresión i marcadora de célula madre estromal, como es j descrito adicionalmente enseguida en la presente) . j Ejemplos no limitativos de medios de base útiles en el cultivo de acuerdo con la invención incluyen I el Medio Esencial Mínimo Eaglé, ADC-1, LPM (libre de Albúmina de Suero Bovino), FIO(HAM), F12 (HAM) , DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, Medio i BGJ (con o sin Modificación de Fitton-Jackson) , Médio Basal Eagle (BME con la adición de la base de sal de Earíe) , Medio ! de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM-sin suero)!, Yámane, i' '.

IMEM-20, Medio de Eagle de Modificación de Glasgojw (GMEM) , i Medio L-15 de Leibovitz, Medio 5A de McCoy, Medio M199 (M199E I con la base de sal de Earle) , Medio M199 (M199H-cojn la base de sal de Hank) , Medio Esencial Mínimo Eagle (MEM-E-con la base de sal de Earle) , Medio Esencial Mínimo Eagle (MEM-H-con la base de sal de Hank) y Medio Esencial Mínimo Eagle ; (MEM- i I j NAA sin aminoácidos esenciales) , entre otros numerosos, incluyendo el medio 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, i NCTC 135, B 75261, MAB 8713, DM 145, G de Williams,; Neuman & I Tytell, Higuchi, CDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB ¡401, MCDB I 411, MDBC 153. Un medio preferido para el uso en la ¡ invención es DME . Estos y otros medios útiles ; son disponiibles de GIBCO, Grand Island, N. Y, USA and Biological Industries, Bet : i HaEmek, Israel, entre otros. Un número de estos medios se I resumen en Methods in Enzymology, Volume LVIII, "Cell Culture", pp. 62 72, editado por William B. Jakoby ánd Ira H. i Pastan, publicado por Academic Press, Inc. j El medio se puede suplementar tal como on ¡ suero I : tal como suero fetal de bovino o humano _u otras especies, y opcionalmente o alternativamente, factores de crecimiento, vitaminas (por ejemplo, ácido ascórbico) , citoquinjas, | sales (por ejemplo, B-glicerofosfato) , esteroides (por i ejemplo, dexametasona) y hormonas, por ejemplo, hormona de ¡ crecimiento, eritropoyetina, trombopoyetina, interljeucina 3, ! interleucina 6, interleucina 7, factor de estimulación de I colonia de macrófago, ligando de c-equipo/factor de célula madre, ligando de osteoprotegerina, insulina, factor de crecimiento similar a insulina, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblasto, jfactor de crecimiento de nervio, factor neurotrófico ciliar, jfactor de crecimiento derivado de plaqueta, y proteína morfoge'nética de hueso en concentraciones de entre picogramo/ml a njiveles de miligramo/mi .

I Además se reconoce que componentes adicionales se pueden adicionar al medio de cultivo. Tales componentes i pueden ser antibióticos, antimicóticos, albúmina, aminoácidos y otros componentes conocidos en la técnica para ejl cultivo . i de células. Adicionalmente, componentes se pueden ¡adicionar i para mejorar el proceso de diferenciación cuando es ¡necesario (ver enseguida adicionalmente) . .

Como es mencionado, una vez que las células adherentes están a la mano ellas se pueden | pasar a i instalaciones bidimensionales o tridimensionales \ (ver los i Ejemplos 1 y 2 de la sección de Ejemplos que sigue). Será ! ! i apreciado, que las células se pueden transferir a ¡través de una matriz configurada 3D inmediatamente después del aislamiento o alternativamente, que se pueden ¡ pasar a instalaciones tridimensionales después de. las condiciones bidimensionales (2D) (como es mencionado anteriormente en la presente) .

Será apreciado que durante las condiciones de ¡ cultivo 2D, las células adherentes se pueden pasar continuamente. De acuerdo con una modalidad de la ¡ presente invención, las células se pueden pasar por lo I merios 4 I pasajes, por lo menos 5 pasajes, por lo menos 6 pasajes, por lo menos 7 pasajes o por lo menos 8 pasajes. Será apreciado que las células son típicamente pasadas cuando' el cultivo alcanza aproximadamente 70-90% ' de confluencia, típicamente i después de 3-7 días (por ejemplo, 3-5 días,: 1-3 duplicamientos ) . Por otra parte, bajo las condiciones de cultivo 2D, las células se pueden cultivar en el ! medio de perfusión del medio de crecimiento de células constante. Además, los cultivos de células se pueden monitorear para los niveles de concentración de glucosa, lactato, glutamina, glutamato y amonio. La velocidad de consumo de glu¡cosá y la velocidad de formación de lactato de las células ádherentes. permiten medir la velocidad de crecimiento c!elular y determinar el tiempo de recolección. ¡ Otros biorreactores 3D que se pueden utijlizar con la invención incluyen, pero no están limitado's a, un biorreactor de tanque agitado continuo donde un ¡ medio de i cultivo se alimenta continuamente en el biorreactor y luego el medio utilizado se retira continuamente, para mantener un estado permanente constante del tiempo dentro del biorreactor. El biorreactor de tanque agitado ¡se puede i utilizar con el lecho fluidizado (portadores suspendidos) o i i una canastilla de lecho fibroso (que está disponible por ! ejemplo en New Brunswick Scientific Co., Edison,] NJ) , un i biorreactor de lecho estacionario, un biorreactor de i elevación con aire, donde el aire típicamente se aljimenta en el fondo de un tubo de arrastre central después ¡ del cual mientras que se forman burbujas de formación,! Y el desacoplamiento del gas de escape en la parte superior de la columna, un biorreactor con espumas Poliactivas ' [como es descrito en Wendt, D. y colaboradores, Biotechnól Bioeng ! 84:205-214,(2003)], estructuras porosas en un biorr'eactor de perfusión de flujo Radial [como es descrito en Kjitagawa y colaboradores, Biotechnology and Bioengineering 93(5) : 947-954(2006)], un biorreactor de flujo radial con estructura o portadores como un biorreactor de fibra hueca j y micro de cultivo se puede cambiar con el fin de prolongar jy mejorar las condiciones de cultivo. cuando la concentración de glucosa es aproximadamente 500 mg/L, aproximadamente 550 mg/L, o aproximadamente 600 mg:/L.

Las células adherentes de algunas modalidades -de la Así por ejemplo, las células pueden tener ¡una forma de husillo. Alternativamente o adicionalmente las células pueden expresar un marcador o una colección de marcádores ! (por ejemplo, marcador de superficie) típico para las células madre estromales. Ejemplos de marcadores de superficie de célula madre estromal (positivo y negativo) incluyen pero no I están limitados a CD105+, CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, D7- I fib+, CD3-, CD4-, CD34-, CD45-, CD80-, CD5-, CD20-;, CD11B-, CD14-, CD19-, CD79-, HLA-DR-, CD31-, KDR-, y FMCy-. Otros marcadores de célula madre estromal incluyen pero j no ¡están j limitados a tirosina hidroxilasa, nestina y H-NF. ¡ i Las células adherentes de tejido de j placenta i generadas de acuerdo con las presentes enseñanzas ;tienen un perfil de expresión génica esencialmente como es descrito en i ¦ el ejemplo 3 de la sección de Ejemplos que sigue. ¡ Ejemplos de fenotipos funcionales típicojs dé las células madre estromales incluyen, pero no están limitados a, actividad de supresión de célula T (ellas no jestimulan células T y a la inversa las suprime) y actividad d'e soporte j de célula madre hematopoyética . i De acuerdo con una modalidad ejemplar, las células adherentes de la presente invención son menos propensas; a la diferenciación en linajes osteogénicos o adipogénicoS como es comparado con las células adherentes de la médula ósea cultivadas y diferenciadas bajo las mismas condiciones (ver los Ejemplos 4-5 y Ejemplos 6-7, respectivamente) . j Como se muestra en los Ejemplos 3 de la sección de Ejemplos que sigue, las células adherentes de la' presente invención se encontraron que suprimen la reacción ¡inmune de las células mononucleares humanas en un ensayo de reacción de ¦ I linfocito mezclado (MLR) asi exhiben actividades ¿iológicas i que pueden ser preferencialmente utilizadas en lia clínica i (por ejemplo, actividad de supresión de célula T, i actividad de soporte de célula madre hematopoyética) .

I ' De acuerdo con una modalidad de la invención, las células adherentes de la invención son capaces de suprimir la i reacción inmune en un sujeto. I I Como se utiliza en la presente la frase j "suprimir i 1 la reacción inmune en un sujeto" se refiere a disminuir o inhibir la reacción inmune que ocurre en un sujeto en respuesta a un antigeno (por ejemplo, una célula foránea o una porción de la misma) . La respuesta inmune que jpuede ser suprimida por las células adherentes incluye las respuestas inmunes humorales, y respuestas inmunes celulares, que involucran el reconocimiento específico de antígenos de patógeno por la vía de anticuerpos y T-íinfocitos t i (proliferación de células T) , respectivamente. | Las formulaciones de células generadas de acuerdo con las presentes enseñanzas se pueden utilizar para tratar I una condición que puede beneficiarse de la transplantacion de i células u órganos. ¡ Como se utiliza en la presente, elj término "condición" se refiere a cualquier patología (enfermedad, condición, síndrome o desorden) que puede beneficiajrse 'de la transplantación de células (por ejemplo, célula j madre) u I órgano. Ejemplos incluyen condiciones isquémicas, condiciones cardiovasculares, condiciones del sistema ¡nervioso, condiciones del tracto gastrointestinal-, condiciones ortopédicas, condiciones hematopoyéticas, condiciones renales y condiciones hepáticas, tales como, pero no lim tadas a, enfermedad arterial periférica (PAD) , tal como isquemia de extremidad e isquemia de extremidad crítica (CLI),| isquemia de extremidad inferior, enfermedad vascular isquémica, enfermedad de corazón isquémico, isquemia miócardiaca, i infarto miocardiaco agudo (MI) , enfermedad de| arteria ! i coronaria (CAD) , enfermedad cardiovascular ateroesclerótica, i i enfermedad de arteria coronaria principal izquierda, I enfermedad oclusiva arterial, isquemia periférica, enfermedad vascular periférica, arteriosclerosis , · enfermedad de cerebro ¡ isquémico, ataque apoplético, isquemia cerebral, enfermedad cerebro vascular, retinopatía, reparación retinal,! desorden de remodelación, síndrome de von Hippel-Lindau, enfermedad I vascular telengiectasiaisquémica hemorrágica hereditaria, enfermedad de Buerger, diabetes, enfermedad vascular del ! riñon, enfermedad renal isquémica, enfermedad del hígado, intestino inflamatorio ( IBD) ] , colitis ulcerativa,] sanación de herida retardada, sanación de úlcera retardada, cáncer i (por ejemplo, cáncer de mama) , pre-cáncer, condiciones caracterizadas por el daño de tejido conectivo tal como el ! cáncer de hueso, osteosarcoma, metástasis de hueso,¡ fractura de hueso, enfermedad de disco degenerativa, ostleogénesis i imperfecta (01), quemadura, lesión por quemadura, defecto de i cartílago articular, sanación de heridas, herida ¡profunda, i sanación de herida retardada, sanación de úlcera retardada, I quiste de hueso subcóndrico, osteoporosis, osteoartritis (OA) , ! hueso degenerado, daño de cartílago, defecto de ¡cartílago articular, tendones lesionados (por ejemplo, j lesiones inducidas por sobreesfuerzo de los tendones) y .ligamentos i lesionados. ¡ Será apreciado que las células adherentjes de la i presente invención son capaces de inducir inmunosupresión y/o tolerancia en un sujeto. Así, las células adherentes se pueden utilizar para tratar cualquier condición en ¡necesidad ! de inmunosupresión y/o tolerancia. Tales condiciones incluyen, pero no están limitadas a, enfermedades autoinmunes j y enfermedades inflamatorias ( incluyendo enfermedades inflamatorias agudas y crónicas) incluyendo, pero ¡ no están i limitados a, enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumatoides, enfermedades glandulares, enfermédades gastrointestinales, enfermedades cutáneas, enfermedades hepáticas, enfermedades neurológicas (por ejemp o, dolor neuropático, lesión del nervio periféri ,co) , enf iermedades musculares, enfermedades néfricas, soporte para la transplantación renal, enfermedades relacionadas | con la reproducción, enfermedades del tejido conectivo y enfermedades sistémicas. ! j Ejemplos de enfermedades cardiovasculares i autoinmunes incluyen, pero no están limitadas a ateroesclerosis (Matsuura E. y colaboradores, Lupus!. 1998/ 7 Suppl 2:S135), infarto miocardiaco (Vaarala O. Lupus;. 1998; 7 I i Suppl 2:S132), trombosis (Tincani A. y colaboradoras, Lupus 1998; 7 Suppl 2:S107-9), granulomatosis de Wegener, .Jart ritis I de Takayasu, síndrome de Kawasaki ( Praprotnijk S. y colaboradores, Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25;j 112(15- i 16): 660), enfermedad autoinmune de anti-factor VIII ¡ (Lacroix- Desmazes S. y colaboradores, Semin Thromb Hemost. 2000; i 26(2): 157), vasculitis de vaso pequeño necrjotizante, poliangitis microscópica, síndrome de Churg y j Strauss, glomerulonefritis necrotizante y crescéntica focal pauci-inmune (Noel LH. Ann Med Interne (París) . 2()00 May; i 151(3): 178), síndrome de antifosfolípido (Flamhdlz R. y i colaboradores, J Clin Apheresis 1999; 14 ( 4 ) : 17 lj) , falla cardiaca inducida por anticuerpo - ( allukat colaboradores, Am J Cardiol. 1999 Jun 17; 83 ( 12A) : 75H) , púrpura trombocitopénica ( occia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-Jun; 14(2) :114; Semple JW. y colaboradores, Blood 1996 May 15; 87 ( 10) : 4245) , anemia hemolítica autoinmunej (Efremov i DG. y colaboradores, Leuk Lymphoma 1998 Jan; 28 (:3-4 ) : 285; I : Sallan S. y colaboradores, Ann Hematol 1997 Mar; 74(3) ¿139), ' i ! autommunidad cardiaca en la enfermedad de Chagas (Gunha-Neto E. y colaboradores, J Clin Invest 1996 Oct 15; 98 (8¡): 1709) y autoinmunidad de linfocito T anti-ayudante (Caporossi AP. y colaboradores, Viral Immunol 1998; 11(1) :9). ¡ i Ejemplos de enfermedades reumatoides autoinmunes i incluyen, pero no están limitadas a, artritis rjeumatoide I (Krenn V. y colaboradores, Histol Histopathol 2000 ¡ Jul; 15(3) :791; Tisch R, McDevitt HO. Proc Nati Acad Sci ¡units S A I 1994 Jan 18; 91(2) :437) y espondilitis anquilosante (Jan i Voswinkel y colaboradores, Arthritis Res 2001; 3(3) : 189) .

Ejemplos de enfermedades glandulares autoinmunes incluyen, pero no están limitadas a, enfermedad pancreática, i diabetes Tipo I, enfermedad de tiroides, enfermedad jde Grave, tiroiditis, tiroiditis autoinmune espontánea, tiroiditis de Hashimoto, mixederma idiopática, autoinmunidad j ovárica, I infertilidad anti-esperma autoinmune, prostatitis ajutoinmune , I y síndrome poliglandular autoinmune Tipo I. Enfermedades incluyen, pero no están limitadas a enfermedades autoinmunes del páncreas, diabetes Tipo I (Castaño L. and Eisenbarth GS . 1 Ann. Rev. Immunol . 8:647; Zimmet P. Diabetes Res Glin Pract 1996 Oct; 34 Suppl:S125), enfermedades de j tiroides autoimmune, enfermedad de Grave (Orgiazzi J. Endocrijnol etab j Clin North Am 2000 Jun; 29(2) :339; Sakata S. y colaboradores, Mol Cell Endocrinol 1993 Mar; 92(1): 77), tiroiditis autoimmune espontánea (Braley-Mullen H. and Yu S, 'J Immunol 2000 Dec 15; 165 ( 12 ) : 7262 ) , tiroiditis de Hash'imotp (Toyoda I N. y colaboradores, Nippon Rinsho 1999 Aug; 57 (¡8 ) : 1810 ) , Ejemplos de enfermedades gastrointestinales autoinmunes incluyen, pero no están limitados a, enfermedades intestinales inflamatorias- crónicas (García Herojla A. colaboradores, Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan; 2¡3(1) enfermedad celiac (Landau YE. and Shoenfeld Y. Hare!fuah i Jan 16; 138(2): 122), colitis, ileitis y enfermedad dé Crohn.

Ejemplos de enfermedades cutáneas autoinmunes incluyen, pero no están limitadas, enfermedades de la piel bulosa autoinmune, tales como, pero no limitadas, a pénfigo vulgaris, penfigoide buloso, psoriasis y pénfigo foliáceo.

Ejemplos de enfermedades hepáticas autoinmunes incluyen, pero no · están limitadas a, hepatitis, ¡hepatitis active crónica autoimmune (Franco A. y colaboradores , : Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar; 54(3) :382), cirrosis biliar primaria (Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 Nov; 9¡1 (5> : 551; I Strassburg CP. y colaboradores, Eur J Gastroenterolj Hepatol.

I 1999 Jun; 11(6) :595) y hepatitis autoimmune (Manns MP. J Hepatol 2000 Aug; 33(2): 326). ¡ Ejemplos de enfermedades neurológicas autoinmunes i incluyen, pero no están limitadas a, esclerosis ¡ múltiple (Cross AH. y colaboradores, J Neuroimmunol 2001 Jan jl; 112(1-2):1), enfermedad de Alzheimer (Orón L. y colaboradores, J Neural Transm Suppl . 1997; 49:77), miastenia gravej (Infante I AJ. And Kraig E, Int Rev Immunol 1999; 18(1-2) :83; lOshima M. y colaboradores, Eur J Immunol 1990 Dec; 20 (Í2) : 2563) , i : neuropatías, neuropatías motoras (Romberg AJ. ! J : Clin Neurosci. 2000 May; 7(3):191); síndrome de Guillain-Bárre y ' i neuropatías autoinmunes (Kusunoki S. Am J Med Sci. j2000 Apr; .319 (4 ) : 234 ) , miastenia, síndrome miástenico de Lambert-Eaton (Takamori M. Am J Med Sci. 2000 Apr; 319 (4) :204) ; colaboradores, Biomed Pharmacother 1999 Jun; 53 (5-6) : 234) .

Ejemplos de enfermedades néfricas autoinmunes incluyen, pero no están limitadas a, nefritis y| nefritis I ' intersticial autoinmune (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol 11990 Aug; 1(2) : 140) . ! Ejemplos de enfermedades autoinmunes relacionadas con la reproducción incluyen, pero no están limitadas a, pérdida fetal repetida (Tincani A. y¦ colaboradores, Lupus 1998; 7 Suppl 2:S 107-9). j Ejemplos de enfermedades del tejido ¡conectivo I autoinmune incluyen, pero no están limitadas a, enfermedades del oído, enfermedades del oído autoinmune (Yojo TJ. y colaboradores, Cell Immunol 1994 Aug; 157 (1)' : 249) y enfermedades autoinmunes. del oido interno (Gloddek ;B. y colaboradores, Ann N Y Acad Sci 1997 Dec 29; 830:266¡). i Ejemplos de enfermedades sistémicas autoinmunes incluyen, pero no están limitadas a, lupus eritematoso sistémico (Erikson J. y colaboradores, Immunol í^es 1998; "tratamiento" se refiere a la inhibición o detención ' del i ¡ desarrollo de una patología y/o que causa la reducción, remisión o regresión de una patología'. Aquellos de; ¡habilidad en la técnica entenderán que varias metodologías y eksayos se pueden utilizar para estimar el desarrollo de una patología, y de manera similar, varias metodologías y ensayos . se pueden utilizar para estimar la reducción, remisión o regresión de una patología. El término "tratamiento" también se refiére al alivio o disminución de un síntoma asociado con la patología.

El sujeto tratado por las células adheren|tes >puede I I ! ; ser cualquier sujeto (por ejemplo, un mamífero), tal como un , i sujeto humano o un animal domesticado que incluye, pero no limitado a, caballos (es decir, equino) , ganado vacuno, i cabras, ovejas, cerdos, perros, gatos, camellos,, alpaca, llama y y quien es diagnosticado con o sufre de la- 'patqlogía y puede beneficiarse de la transplantación de célala ¡madre estromal . ( | ' Los métodos para derivar células especificas de linaje de las células adherentes (por ejemplo,' células .imadre estromales) de la invención son bien conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5 , 48 6 , 359 , 5 , 942 , 225 , 5 , 736 , 396 , 5 , 908 , 784 y 5 , 902 , 741 . ; Las células adherentes pueden ser naive o pueden ser genéticamente modificadas tal como para derivar ¡un linaje I ! de interés (ver la solicitud de patente norteamericana No. 20030219423) .

Las células pueden ser de fuente autólpga : o no autóloga. Una fuente no autóloga puede ser halogeneica o I xenogeneica. Las células se pueden utilizjar como I ! preparaciones frescas o congeladas (por ejemplo, cío-preservadas) . j I Dependiendo de la condición médica, el sujeto se puede administrar con fármacos químicos adicionales '¦ (por ejemplo, inmunomodulador, quimioterapia, etc.) o células.

Aunque las células se caracterizan por ¡actividad inmunosupresora, ellas todavía pueden provocar la ¡respuesta inmune indeseable derivada, del hospedero o donador. Se han desarrollado procedimientos para reducir la probabilidad de ¡ i rechazo de las células no autólogas o GvHD. Estos incluyen ya sea suprimir el sistema inmune recipiente o encapsular las células no autólogas en membranas semipermeables de i inmunoaislamiento antes de la transplantación. ¡ i Las técnicas de encapsulación generalmente se clasifican como microencapsulacion, que involucran 'vehículos esféricos pequeños y macroencapsulación, que ¡involucra membranas de lámina plana más grande y de fibra hueca (Uludag, H. y colaboradores. Technology of mammaiian cell i encapsulation. Adv Drug Deliv Rev. 2000; 42: 29-64). ¡ Los métodos para preparar microcápsulas son conocidos en la técnica e incluyen por ejemplo aquellos i divulgados por Lu MZ, y colaboradores, Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly (allylaraine) . Biotechnol Bioeng. 2000, 70:479-83, Chang TM and Prakash S. Procedures for . microencapsulation of enzymes , células and genetically engineered microdrganisms . i ! Mol Biotechnol. 2001, 17: 249-60, and Lu MZ, y colaboradores, A novel cell encapsulation method using photosensitive poly (allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetatej) . : J Microencapsul. 2000, 17:245-51. j Por ejemplo, las microcápsulas se preparan al i formar en complejo el colágeno modificado con una cubierta de ter-polimero de metilacrilato de 2-hidroxietil (HEMA) , ácido metacrilico (MAA) y metacrilato de metilo (MMA) , que da por resultado un espesor de cápsula de 2-5 µ???. Tales i microcápsulas se pueden encapsular adicionalménte 1 con cubiertas de ter-polimero 2-5 µp adicionales con el fin de impartir una superficie lisa negativamente cargada y; para I minimizar la absorción de proteina en el plasma (Chija, S.M. y colaboradores. Multi-layered microcapsules for cell encapsulation Biomaterials . 200223:849-56). j Otras microcápsulas están basadas en alginato, un I polisacárido marino (Sambanis, A. Encapsulated ijslets in diabetes treatment. Diabetes Technol . Ther. 2003, 5¡: 665-8) o I sus derivados. Por ejemplo, preparar mediante la formación entre los polianiones alginato de sodio y sulfato de' celulosa de sodio con el policatión clorhidrato de poli (metileno-co-guanidina) en la presencia de cloruro de calcio.

Será apreciado que la encapsulación de lajs células se mejora cuando se utilizan cápsulas más pequeñas]. Así, el I control de calidad, estabilidad mecánica, propiedades de difusión, y actividades in vitro de las células encapsuladas se mejora cuando el tamaño de la cápsula se redujo ¡de 1 mm a 400 µ?? (Canaple L. y colaboradores, Improving . cell encapsulation through size control. J Biomater Sci |Polym Ed. s ! 2002 ; 13 : 783- 96 ) . Por otra parte, las biocápsulas nánoporosas con tamaño de poro bien controlado tan pequeño como 7 nm, i adaptado a las químicas de superficie y microarquitecturas precisas se encontraron que inmunoaíslan exitosamente microambientes para las células (Williams D. ¡Sitia11 is ¡ : beautiful: microparticle and nanoparticle technolocjjy in medical devices. Med Device Technol. 1999 , 10 : 6-j9 ; Desai, T.A. Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation. Expert Opin Biol Ther. 2002 , 2 : 633-46 I) .

Ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen, pero I no están limitados a, metrotrexato, ciclofosfamida, 4 i : agente biológico que dirige una citoquina inflamatoria y fármaco antiinflamatorio no esteroidal (NSAIDs) . Ejemplos de NSAIDs incluyen, pero no están limitados a ácido acetil i ; salicilico, salicilato de magnesio de colina, fijfluriisal, I salicilato de magnesio, salsalato, salicilato de sodio, diclofenaco, etodolac, fenoprofen, flurbiprofen, indometacina, cetoprofen, cetorolac, meclqfenamato, ? i ¦ ¦ naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, jsulindac, tolmetin, acetaminofen, ibuprofen, inhibidores de! COX-2 y tramadol. ! ; Además , será apreciado que las células se pueden administrar ya sea per se o, de preferencia, una parjte de una i composición farmacéutica que además comprende un ¡ portador farmacéuticamente aceptable. 1 I Como se utiliza en la presente una "composición I farmacéutica" se refiere a una preparación de las células adherentes de la invención (es decir, células adh'ereñtes) , con otros componentes químicos tales como portjadores y excipientes farmacéuticamente adecuados . El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de I las células a un suj eto . ! Después en la presente, el término ¡"portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un j portador diluyente que no causa irritación significante a unj sujeto y I no anula la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Ejemplos, sin limitaciones, de portadores son propilenglicol, solución salina, emulsiones y mezclas de solventes orgánicos con agua. | En la presente el término "excipiente" se ¡refiere a i una sustancia inerte adicionada a una composición I ! farmacéutica para facilitar además la administración de un compuesto. Ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y I tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina aceites vegetales y polietilenglicoles . i Las técnicas para formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en "Remington' s Pharmaceutical Sciences," ack Publishing Co, Easton, PA, última edición que es incorporada en la presente por referencia. j Las composiciones farmacéuticas para el uso de I ¡ acuerdo con la invención asi se pueden formular en jla manera I : convencional utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliajres, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en i preparaciones que, se pueden utilizar farmacéuticamente. La formulación apropiada es dependiente de la j ruta de i administración elegida. ¡ Para ' inyección, los ingredientes activos de la composición farmacéutica se pueden formular en soluciones acuosas, de preferencia en soluciones reguladoras fisiológicamente compatibles tales como la soluciónj de Hank, í solución de Ringer, solución reguladora de sal fisiológica, o medio de congelación que contiene criopreservadores .¡ La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está dentro de la capacidad de aquellos expertos en la técnica, especialmente en vista de la descripción i detallada proporcionada en la presente. ; La toxicidad y eficacia terapéutica ' de los ! , \ ingredientes activos descritos en la presente ; se ; puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándares in vitro, en cultivos de células o animales experiméjntales.

Dependiendo de la severidad y responsividad de la I condición que es tratada, la dosificación puede ser de una sola o una pluralidad de administraciones. Sin embargo, la cantidad de una composición que es administrada, por supuesto, será dependiente del sujeto que es trjatad , la I severidad de la aflicción, la manera de administración, el uen juicio del médico que prescribe, etc. \ ! Las composiciones que incluyen la preparación de la invención formulada en un portador farmacéutico compatible ! también se pueden preparar, colocar en un recipiente I apropiado y etiquetar para el tratamiento de una j condición indicada. I ¦ I Las composiciones de la invención, si se ¡ desea, se pueden presentar en un paquete o dispositivo surtidor, tal como un equipo apropiado con FDA, que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contiene el ingrediente activo. El paquete, por ejemplo, puede qomprender lámina delgada de metal o de plástico, tal como un paquete de ampollas. El paquete o dispositivo surtidor puede estar i acompañado de instrucciones para la administración. El i ! paquete o surtidor también se puede adaptar ! por una notificación asociada con el recipiente en una forma prescrita o en una agencia gubernamental que egula la manufactura, uso o venta de sustancias farmacéuticas, la notificación que es reflectiva de la aprobacióii por la agencia de la forma de las composiciones o la administración humana veterinaria. Tal notificación, por ejemplo, ¡puede ser ! la etiquetación aprobada por la U.S. Food 'and Drug i Administration para fármacos de prescripción o de un inserto de producto aprobado. j Se espera que durante la vida de una paítente que cumple de esta solicitud muchos cultivos tridimensionales relevantes sean desarrollados y el alcance del término cultivos tridimensionales se proponen para incluir !todas las nuevas tecnologías a priori. ¡ Como se utiliza en la presente el: término "aproximadamente" se refiere a ± 10%.

I Los términos "comprende", "que ende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus ugados i significan "que incluye pero no limitado a". i El término "que consiste de medios" incluye y limitado a". ¡ El término "que consiste esencialmente de" significa que la composición, método o estructura puede incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solamente si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características bjásicas y i ! novedosas de la composición, método o estructura reclamada.

Como se utiliza en la presente, la forma; singular ! "un", "uno" y "el" incluyen referencias plurales a imenps que i el contexto solamente lo dicte de otra manera. Por¡ ejemplo, i el término "un compuesto" o "por lo menos un compuesto" puede i incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos. j Por toda esta solicitud, varias modalidades de esta invención se pueden presentar en un formato de intérvalo. Se debe entender que la descripción en formato de intervalo es meramente para conveniencia y brevedad y no ¡debe ser considerada como una limitación inflexible en el alcance de i j la invención. Por consiguiente, la descripción de un ! I i intervalo debe ser considerado que tiene específicamente divulgado todos los subintérvalos posibles así como valores i numéricos individuales dentro de este intervalo. Por ejemplo, I la descripción de un intervalo tal como de 1 a ß| debe ser considerado que tiene su intervalo específicamente ¡divulgado tales como de 1 a 3, de 1 a , de 1 a 5, de 2 a , ide 2 a 6, i 1 ; de 3 a 6 etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, y 6. Esto aplica sin considerar la amplitud del intervalo. i Cada vez que un intervalo numérico se indica en la i presente, se propone que incluye cualquiera número citado (fraccionario o entero) dentro del intervalo indicado. La frase "que varía/variante" un primer número indicado 1 y un ¦ I : segundo número indicado y "que varía/varía de" ún primer número indicado "a" uri segundo número indicado se utjilizan en la presente intercambiablemente y se proponen para incluir el primero y el segundo números indicados y todos los números fraccionarios y enteros entre los mismos. j Como se utiliza en la presente el término! "método" se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos' para realizar una tarea dada que incluyen, pero no limitado, a í aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientojs ya sea conocidos, o fácilmente desarrollado de maneras,! medios, ¡ técnicas y procedimientos conocidos por los profesionales de las técnicas químicas, farmacológicas, biiológicas, bioquímicas y médicas. | ? ¡ i Se aprecia que ciertas características de la i invención, que son, por claridad, descritas en el contexto de I modalidades separadas, también se puede proporcionar en combinación en una sola modalidad. A la inversa, varias características de la invención, que son, por ¡brevedad, descritas en el contexto de una sola modalidad, también se pueden proporcionar separadamente o en cualquier subcombinación adecuada o como es adecuado en cualquier otra modalidad descrita de la invención. Ciertas características descritas en el contexto de varias modalidades no j se van a considerar características esenciales de esas modalidades, a encuentran soporte experimental en los siguientes ejjsmplos. i EJEMPLOS ! La referencia ahora se hace a los siguientes i : ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención en un aspecto no limitativo.

Generalmente, la nomenclatura utilizada y los I I procedimientos de laboratorio utilizados en la j- presente invención. incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, ! microbiológicas y de DNA recombinante . Tales técnicas se ¡ I explican completamente en la literatura. Ver, por! ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambroók y colaboradores, (1989) ; "Current Protocols in ¡Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M, ed. (199.4); Áusubel y colaboradores, "Current Protocols in Molecular Biology", John iley and Sons, Baltimore, Maryland(1989) ; Peirbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & í¡Sons:, New York ( 1988') ; Watson y colaboradores, "Recombinant ' DNA", Scientific American Books, New York; Birren y colaboradores (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series",| Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yórk(1998); metodologías como se exponen en las patentes norteamericanas Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272, 057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E, ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes i I-III Coligan J. E, ed.(1994); Stites y colaboradores, (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition) , Appleton & I .

Lange, Norwalk, CT(1994); Mishell and Shiigi (eds), "Seíected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co, New ! York (1980); inmunoensayos disponibles se ' | describen extensivamente en la literatura de patentes y científica, ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos.

I 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; i 3, 867, 517 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; i 3, 996, 345 4,034,074; . 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y j , ¦ 5,281, 5.21 'Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J, éd. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D, and Higgins:S. J, eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames,¡ B. D, y Higgins S. J, Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R.

L, ed. (1986); "Immobilized Células and Enzymes" I¡RL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B, (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317,! Academic I Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990) ; Marshak y colaboradores, "Strategies for Protein Purificación and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL ¡Press (1996) ; todas las cuales se incorporan por referencia como si se expusieran completamente en la presente. Otras referencias generales se proporcionan por todo este documento. Los procedimientos en los mismos se cree que son bien ¡conocidos en la técnica y se proporcionan para la conveniencia del lector. Toda la información contenida en la 'misma es incorporada en la presente por referencia.

EJEMPLO 1 Producción de células adherentes derivadas de placenta por los métodos de WO/2007/108003 Las células adherentes se produjeron j como se describió previamente (ver WO/2007/108003) en un s'istema de biorreactor que contiene portadores 3D para producir células adherentes (designados en la presente como PLX) . j Materiales y Procedimientos Experiméntale Células adherentes derivadas de placenta', - Partes interiores de la placenta de suministro de plazoj completo (Bnei Zion medical center, Haifa, Israel) se cort¡arorí bajo condiciones asépticas, se lavaron 3 veces con solución reguladora de Hank y se incubaron durante 3 horas a¡ 37°C con Colagenasa al 0.1% (1 mg/ml de tejido; Sigma-Aldrich, St. Lewis, MO) . Utilizando el pipeteo leve, las¡ células suspendidas luego se lavaron con D EM suplementado con FCS al 10%, mezcla de Pen-Strep-Nystatin (100 U/ml:100 ug/ml:1.25 un/ral) y L-glutamina 2 mM, se sembraron en matraces j de 75 cm y se incubaron a 37 °C en una incubadora de cultivo jde tejido i bajo condición humidificada con C02 al 5%. | Crecimiento de células bldimensional (2D) j Las células se dejaron adherir a una superficie de plástico durante 48-72 horas después de lo cual elj medio se cambió cada 3-4 días. Después de 2-3 pasajes, las células se I criopreservaron, se congelaron y se sembraron para un crecimiento secundario en matraces. Cuando se alcanzan la i co de se pa re bi de pr 6, porrosivos 3D empacados de 1-100 mi (4 mm en diámetro) hechos de una matriz de tela no tejida de poliéstér. Estos portadores permiten la propagación de números de células grandes en un volumen relativamente pequeño. Los instrumentos de vidrio se diseñaron y se manufacturaron por \ Pluristem I (Pluristem, Haifa, Israel). El biorreactor se mantuvo en una i incubadora de 37 °C, con el gasto de flujo re Igula'do y-monitoreado por una válvula y bomba peristáltica . El biorreactor contiene un punto de muestreo e inyección, permitiendo el sembrado secuencial de las células.! El medio i de cultivo se suministro en pH 6.7-7.4 desde un depósito. El depósito se suministró por una mezcla de gas fiitrado que contiene aire/C02/02 en proporciones diferentes, dependiendo de la densidad de células en el biorreactor. La proporción "de 02 se adaptó al nivel de 02 disuelto en las sajlidas del biorreactor, determinada por un monitor. La mezcla de gas se suministró al depósito por la vía de tubos de silicona o difusor (Degania Bet, Emek Hayarden, Israel). El! medio de i cultivo se pasó a través de un recipiente de separación que i permite la recolección de ' células · no ¦ adherentes en circulación. La circulación del medio se obtuvo mediante una bomba peristáltica. El biorreactor además se equipó con un punto de muestreo adicional y recipientes para el intercambio • i : del medio continuo. ¡ Producción de células adherentes PLX - Los cultivos 52 ' . i ¡ ¦ '' ; i' ! ' de células 2D adherent.es' humanas primarias - no confluentes, cultivadas como, es descrito en lo anterior, se tripsi|nizaron, se lavaron, se resuspendieron en DMEM suplementado con FBS al 10%, mezcla de Pen-Strep-Nystatin (100 U/ml:100 úg!/mi : 1.25 un/ml) y L-glutamina 2 mM, y se sembraron (10 -10 células-/mi) por la via de un punto en inyección sobre los portadores 3D ! en un biorreactor de Flujo Tapón estéril. Antes de la inoculación, el biorreactor se llenó con 1 PBS-Ca-Mg (Biological . Industries, Beit Ha'emek, Israel), se;jcólócó en autoclave (120°C, 30 min) y se lavó con el |medio de crecimiento de Dulbecco que contiene suero de ternero i fetal inactivado con calor al 10% y una mezcla de 'Pen-Strep- Nystatin (100 U/ml:100 ug/ml:1.25 un/ml) . El flujo se mantuvo ¡ en una proporción de 0.1-5 ml/min. El proceso dej sembrado involucró la detención de la circulación durante ' ¡2-48: hrs, ¦ para permitir que las células se , asienten sobré los portadores. El biorreactor se mantuvo bajo temperatura ¦ i ¡ controlada (37 °C) y condiciones de . pH (pH = , ¡ 6.7†7.4 ) ; utilizando una incubadora suministrada con aire estéril: y C02 como sea necesario. El medio de crecimiento se reemplazo 2-3 veces a la semana. El medio de circulación se reeiriplaz'ó con ¦ :¦ ¦ ¦ i medio DMEM fresco, cada 4 hr a 7 dias. Én una densidad de 1 X ' I ¦ 10 -1 X 10 células/ml (después de 12-40 dias de crecimiento) , el volumen medio total se removió del biorreactor ¡ y el biorreactor y los portadores se lavaron 3-5 veces con1 PBS.

Las células adherentes de PLX luego se desunieron de los la presente invención Células adherentes PLX-C se produjeron por la presente invención que exhiben diferentes características que las células adherentes PLX descritas en , lo anterior .

Materiales y Métodos Experimentales ] I Biorreactor de Flujo Tapón Celligen™ - La producción de células adherentes de la presente invención por Celligen™ (células PLX-C) está compuesta de varias etapas i mayores como es ilustrado en la Figura 1. El proceso inicia mediante la recolección de una placenta de una sjección de cesárea planeada en plazo. ' j Las células adherentes luego se aisjlarpn de placentas completas, se cultivaron en matraces de cultivo de tejido (cultivos 2D) se recolectaron y se almacenaron en nitrógeno líquido como Extracto de Células 2D (2DCS) , la cantidad apropiada de 2DCS se congelaron, se lavó y jse sembró en portadores en los biorreactores para la ¡expánsión adicional como cultivo 3D. Después' de 4-12 i días de i crecimiento en los biorreactores, las células se recolectaron 175 cm2 y se incubó a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejido bajo condición humidificada' suplementada con C02 al 5%. Después de 2-3 días, en el cual las células 'se! dejaron : ' I I' adherir. a la superficie del matraz, ellas se lavaron con PBS y el medio 2 D se adicionó. ¡ I Crecimiento de Células Bidimensionales (2D) Antes del primer pasaje, las muestras deí medio de crecimiento de 10% del número de matraces tótales en cuarentena se acumularon y se tomó para la prueba de micoplasma (IPC2). Si las células se encontraron que son negativas para el Micoplasma (equipo de Micoplasma EZ-PCR, Biological Industries, Israel), las células se liberaron de la cuarentena. Después de 1-2 pasajes adicionales utilizando el Medio 2 D suplementado con antibióticos, las élulas se transfirieron al cuarto limpio de producción 2 D (i2 DP ) . Una j : vez en el Cuarto 2DP, el cultivo se continuó durante 3-6 pasajes utilizando el Medio 2 D sin antibióticos. Por todo el i proceso, los cultivos se cultivaron en incubadora de cultivo de tejido bajo condiciones humidificadas con CO ¡ al 5% a 37°C. Después de un total de 6-9 pasajes (9-17 duplicamientos I de células) , las células se recolectaron y se criopreservaron ¡ como el Extracto de Células 2 D ( 2 DCS ) . í El primer pasaje usualmente · sé llevó a cabo después de 7-15 dias. Comenzando en el pasaje 2 y continuando hasta i el pasaje 6-9, las células se hicieron pasar cuando el cultivo alcanzó 70-90% de confluencia, usualmente después de 4-5 dias (1.5-2 duplicamiento) . Las células se desunieron de los matraces utilizando tripsina al 0.25%-EDTA (4 ¡minutos a 37°C) y se sembraron en una densidad dé cultivo de ! 4 ± 0.5 x 103 células/cm2. El tamaño de los matraces de cultivo de j ' tejido se elevó a medida que ' proceden los pasajes. El proceso i ¡ de cultivo inició en el matraz de cultivo de tejido de 175 cm2, continuó al 500 cm2 (matraz Triple) y finaljmente las . i células se sembraron en la charola de Instalación 10 de Células (6320 cm2) . j Antes de la criopreservación, al final del periodo de crecimiento 2DCS, el medio de crecimiento se recolectó y la muestra se preparó para ser enviada a un laboratorio GLP i aprobado para la prueba de Micoplasma (IPC4). \ i Procedimiento de Criopreservación para el Producto de Extracto de Células 2D \ Para la criopreservación 2DCS, lasj células : I cultivadas 2D se recolectaron bajo condiciones j asépticas utilizando tripsina al 0.25%-EDTA. Las células se centrifugaron (1200 RPM, 10', 4°C) se contaron , y se resuspendieron en el Medio 2D. - ! Para la congelación , las suspensiones de ¿élulas se diluyeron 1 : 1 con la Mezcla ' de Congelación 2D (concentraciones finales fueron DMSO al 10%, FBS i al 40% y Medio 2D al 50%). Aproximadamente 1.5 - 2.5 x 109 células se . j ! ! I ; manufacturaron de una placenta. 4 mi de las células se almacenaron en una concentración final de 10 x ;106/ml en frasquitos de polipropileno de criopreservación de- 5 mi. Los frasquitos se etiquetaron y se transfirieron a una congeladora de velocidad controlada para un proceso de i ; reducción de temperatura graduada (l°C/min), después ;de lo cual se transfirieron al almacenamiento de la fase jdé gas de una congeladora de nitrógeno líquido. Este material es referido como el lote de Extracto de Células 2D (2DGS) .

Iniciación de los Procedimientos de Cultivo i Tridimensionales (3D) '.

Para comenzar el cultivo' 3D, una cantidad ¡ apropiada (150 ± 50 x 106) de células de 2DCS se congelaron, en un i cuarto 2DP y se. lavaron con el Medio 3D (DMEM con FBS al 10% y Hepes 20 Mm) para remover el DMSO antes del sembrado en los sistemas de biorreactor preparados , por adelaritadó. El i : contenido de cada frasquito 2DCS se pipeteó y se diluyó 1:9 ! con Medio 3D precalentado (37°C). Las células se centrifugaron (1200 RPM, 10' , 4°C) y se resuspendieron nuevamente en el Medio 3D precalentado de 50-100 mi j (37°C) en una botella estéril de 250 mi. Una muestra se tomó y las i células se contaron utilizando la mancha de Azul de Tripano i con el fin de determinar el número de células y la viabilidad. La suspensión de células se transfirió! bajo una campana de flujo laminar en una botella de sembrado Ide 0.5 L.

I I I Descripción del Biorreactor La fase de crecimiento 3D se realizó utilizando un 1 sistema de biorreactor CelliGen Plus® o BIOFLO 310. automático [(New Brunswick Scientific (NBS ) ] representado en la ¡ Figura 2. i ¡ I · ! El sistema de biorreactor se utilizó para la cultivación del cultivo de células, en el cual las condiciones fueron adecuadas para altas concentraciones de células. El proceso de cultivación se llevó a cabo utilizando un biorreactor en un modo de perfusión. El biorreactor de escala de laboratorio se construyó de dos sistemas principales - el sistema de I control y el biorreactor mismo (recipiente y accesorios) . Los parámetros del proceso se monitorearon y se controlaron mediante una consola de control que incluyó conectjores para sondas, motores y bombas, circuitos : de control; para el Oxígeno Disuelto (DO), pH, perfusión y agitación^ (-con un i i monitoreados por un controlador designado. ! Procedimiento de crecimiento de cultivo de células en los biorreactores Como es mencionado en la sección anteriormente en la presente, 150 ± 50 x 106 células de 2 DCS criopreservados i se congelaron, se lavaron y se sembraron en un biorreactor estéril. El biorreactor contuvo portadores de ¡30-50 gr (discos de FibraCel®, NBS) , hechos de , Pol|iést;,er y Polipropileno y 1.5 ± 0.1 L del Medio 3D. El j medio de crecimiento en el biorreactor se mantuvo en las '. siguientes condiciones: 37°C, 70% de Oxigeno Disuelto (DO) y pM ,7.3. Los gases filtrados (Air3, C02, N2 y 02) se suministraron como es determinado por el sistema de control con el fin de ¡ conservar el valor de DO en 70% y el valor de pH en 7.3. Durante las primeras 24 horas, el medio se agitó en 50 Revoluciones por Minuto (RPM) y se incrementó hasta 200 RPM por el día 2.

Durante los primeros 2-3 días, las células se cultivaron en un modo de lote. La perfusión se inició cuando la concentración de glucosa . media disminuyó por debajo de 550 mg/litro. El medio se bombeó del recipiente de alimentación al biorreactor utilizando tubería de silicona estéril. Todas las conexiones de tubería se realizaron bajo flujjo laminar utilizando conectores estériles. La perfusión se 'ajus!to en una base diaria con el fin de conservar la concentración de glucosa constante en aproximadamente 550 ± 50 mg/ljitro. Una muestra del medio de crecimiento se tomó cada 1-2 días para la glucosa, lactato, glutamina, glutamáto y la determinación de concentración de amonio (analizador BioProfile ; 400 , Nova Biomedical) . La velocidad de consumo de glucosa y la velocidad de formación de lactato del cultivo de células permitieron medir la velocidad de crecimiento de células. Estos parámetros se utilizaron para determinar el jtiempo de recolección basado en los datos experiméntales acumulados .

Recolección de las Células PLX-C Cultivadas 3D del i Biorreactor \ i El proceso de recolección de células inició al final de la fase de crecimiento (4-12 días). Se recolectaron dos muestras del medio de crecimiento. Una muestra se preparó para ser enviada a un laboratorio de GLP aprobado para la prueba de Micoplasma de acuerdo con los estándares! de!uSP y Eu . Esta muestra de medios se consideró como parte ;de la prueba de Micoplasma del producto final y los resultados se consideraron como parte de los criterios para la liberación ! del producto. j i El cultivo cultivado 3D se recolectó en el área laminar Class-100 en 3DP del lugar como sigue: ; El recipiente de biorreactor se vació utilizando gravitación por la vía de la tubería a un recipiente de desecho. El recipiente de biorreactor luego se rejllenó con 1.5 L de PBS pr.ecalentado (37°C). La velocidad de ¡agitación ' ' I ¡ se incrementó a 150 RPM durante' 2 minutos. El PBS^ íse: drenó por la vía de la tubería mediante presión o grayje ad a la botella de desecho. El procedimiento de lavado se repitió dos veces . ; ' , ' Con el fin de liberar las . células de los ' I 1 portadores, 1.5 L de Tripsina-EDTA precalentada a: 37°C (Tripsina 0.25%, EDTA 1 mM) se adicionó al recibiente del biorreactor y los portadores se agitaron durante 1† minutos en 150 RPM, 37°C. 250 mi de FBS se adicionaron al ; recipiente ; i ! de reactor y la suspensión de células se recolectó ¡en un recipiente estéril de 5 L. La suspensión de células se dividió, a tubos de centrífuga estériles de .500 mi que se i 1 centrifugaron (1200 RPM, 10' , 4 °C) y se resuspenjdieron en solución de criopreservación a una concentración d|e 5 30?106 células/ml. Las células se llenaron asépticamente ¡y se criopreservaron como PLX-C.

EJEMPLO 3 I j . ! Comparación de las células adherentes de WO/2007/108003 (PLX) las células adherentes de la presente invención Las células adherentes , producidas '. por WO/2007/108003 (designadas en la presente como PLX), como es descrito en el Ejemplo 1 anteriormente en la pre!sente, se compararon con las nuevas células adherentes de id présente invención (designadas en la presente como PLX-C) .

Materiales y Métodos Experimentales antihumano CD73 conjugado con PE (Bécton Dickinson) , MAb antihumano CD105 conjugado con PE (eBioscience) , MAb antihumano CD90 conjugado con PE (Becton DickirVson)', MAb anti-humano CD45 conjugado con FITC (IQProducts) , MAb anti-humano CD19 PE-conjugado (IQProducts)., MAb anti-humano CD14 conjutado con' PE (IQProducts), MAb antihumarío HLA-DR conjugado con FITC (IQProduct), MAb anti-humano CD34 I : conjugado con PE (IQProducts), MAb anti-humano CD31 j conj ugado (BD) , MAb anti-humano CD86 conjugado con FITC (BD) , ¡MAb¦ anti- i humano CD200 conjugado con PE (BD) , MAb anti-humano CD40 i conjugado con FTTC (BD) , MAb anti-humano HLA-ABC ¡conjugado i con FITC (BD) , FITC Isotipo IgGl conjugado (IQ Products), PE Isotipo IgGl conjugado (IQ Products) .

Las células se lavaron dos veces con j solución reguladora de citómetro de flujo, se resuspendieron len 500 µ? i de solución reguladora de citómetro de flujo y se analizaron ! mediante la citometría de flujo utilizando el Citómetro de I Flujo FC-500 (Beckman Coulter) . Los controles negativos se prepararon con moléculas de fluorescencia de ij isotipo relevante. : ' j Reacción de Linfocito Mezclado (MLR) \ I ; 2 x 105 MNC ' (del donador .A) derivada de sangre i estructura cónica Mejor ' homogeneidad . ¡ í ' del flujj o delj medio i ' ! Canalización . en el plurix Concentración de 3 x 10s células/gr de 5 x 10s células/gr de Mejor interacción i i , ' células en el portador portador célula a célula sembrado (células/gr las presentes de portadores) enseñanzas Concentración de 0.015 10" 0.1 x 10" células/ml Mejor interacción de células en el células/ml célula. a célula en sembrado (células/ml) las ¡ , presentes enseñanzas Procedimiento de Sembrado en volumen Sembrado en el WO/2007/108003 r : sembrado bajo medio durante 24 volumen de ' trabajo Distribución h seguido por la final mientras que se héterogénica - del I : adición del medio al agita cultivó de ; células , i ! volumen de trabajo dentro! | del lecho " : final portador Volumen | del ¡ medio insuficiente en las j ¡ primeras 24 h de la corrida . Conduciendo condiciones de trabajo adecuadas i temperatura llevó a cabo dentro linea . médiición de una incubadora. Transferencia de precisa| ! de Control de calor por la via dé temperatura ! i ? ? temperatura indirecta la chaqueta de agua. cultivo1. ' I ; (de la cámara Respuesta rápida . incubadora! Tiempo corto para Transferencia de alcanzar el punto de calor la via de ajuste. la interface de aire Monitoreo la Manualmente . Monitoreo directo en Presentes enseñanzas temperatura Monitoreo de la linea - Mejor monitoreo temperatura del agua control! del proceso.

I I indirecto Respuesta rápida mal' funcionamientos Monitoreo de DO Ninguno Monitoreo en linea Presentes enseñanzas - me orj monitoreo y control ¡del proceso. ! i I Respuesta , rápida a ' ! ' mal funcionamientos Control de DO Ninguno. Control directo en Presentes enseñanzas 1 1 Introducción de aire línea de un punto - de - Mejorj control del solamente ajuste específico nivel de DO. '. utilizando Aire, O2 y Mejor ¡mantenimiento N2. de las \ condiciones de trabajó ¡especificadas Monitoreo y control Solamente monitoreo Control y monitoreo Presentes enseñanzas del H visual (rojo de Fenol en linea - Mejor control del i como parte del medio) nivel délipH.; Mejor ] mantenimiento . I de las condiciones de trabajo; especificadas 1 Aireación Esparcido solamente Sobrepuesto WO/2007 108003 - La 1 1 1 (esparcido como una aireación mediante i opción) = esparcido crea espuma ¦.1 1 : que podría dañar las células i Los cambios en el proceso de manufactura dieron por resultado cambios en las características de las células adherentes obtenidas. Estas diferencias se resumen enseguida.

Análisis del ciclo celular de PLX manufacturado por Plurix comparado con PLX-C manufacturado por Celligen. — Las células PLX-C por Celligen se compararon con las células PLX obtenidas por Plurix con el fin de examinar la distribución de las células entre las diferentes fases del cicló celular.

Como es claro de las Figuras 3A-B, las células PLX-C expandidas por Celligen exhibieron el perfil de proliferación típico (distribución de células entre las diferentes 'fases I , : del ciclo celular). Específicamente, 28% de ¡ células estuvieron en las fases S y G2/M ' (Figura 3A) . Estos resultados indicaron que las células se recolectaron durante ! j arginina aminopeptidasa derivada de 13.99 ; 3.88E-06 1 leucocito 1 : pseudogen 27 de queratina 27 ; 12.25 0:000224998 similar a queratina, tipo I 11.83 0:000304949 citoesquelético 18 (Citoquerati receptor · acoplado a proteina G, 10.35 3.39E-05 familia C, grupo 5, miembro A 1 I integrina, alfa 6 9.84 0.0411667 1 receptor 126 acoplado a proteina G 8.73 0.00197635 1 factor III de coagulación 7.36 i 0.012192 ( tromboplastina, factor de tejido) inhibidor de disociación de GDP de 7.36 .00200066 Rho (GDI) beta péptido de señal, domino CUB, 3 7.20 0.0255115 1 similar a EGF proteina inducida con interferona 7.09 !?.0139777 1 1 con repeticiones de . i tetratricopéptido homólogo 1 de dickkopf (Xenopus 7.06 í 3.06E-07 laevis ) NAD(P)H deshidrogenase, quinona 1 6.63 0.!000282423 queratina 18 6.46 0.000514523 1 similar al receptor de factor de 5.96 01.00114551 crecimiento opioide i , mal, similar a la. proteina de 5.95 0:.00664216 111, miembro B quinasa de enlace de PDZ 4.54 Q.00784983 establecimiento de cohesión 1 4.53 0.000773033 homólogo 2 (S. cerevisiae) , 1 proteina 4 de enlace de guanilato 4.47 0. 000215944 lipasa A, ácido lisosomal, 4.42 0.0167385 colesterol esterasa (Wolman dise 1 miembro de familia de quinesina 20A 4.39 0.00582352 KIAA0101 4.28 0.010509 inhibidor 3 de quinasa dependiente 4.25 0. 000732492 de ciclina (dual asociado con CDK2 timidilato sintetasa 4T23 0.00685584 estructura de lectura abierta 3 del 4.18 0. ¡000548296 cromosoma 13 aurora quinasa A 4.16 0.00632571 3 similar a nei endonucleasa VIII 4.14 0.00115606 1 (E. coli) proteina centrosomal 55 kDa 4.13 0.0021952 receptor de lipoproteina de baja 4.11 p.0205198 densidad oxidada (similar a lectina) 1 homólogo denticleless (Drosophila) 4.05 0'.00141153 anillina, proteina de enlace de 4.01 0.010923 actina polipéptido M2 de ribonucleótido 3.98 0|00834059 I reductasa dominio 1 de repetición de anquirina 3.93 0.00911953 (músculo cardiaco) factor de transcripción 19 (SCI) 3.89 Ó .00109627 queratina 18 3.89 0.000112551 complejo I de condensina no de SMC, 3.88 0.00537097 subunidad G 1 ciclina E2 3.87 0.000203389 tripsinógeno C 3.86 Q.00416276 1 ¡ RNA nucleolar pequeño, C 3.81 . |0.0334485 proteina de unión hermética 2 (zona 3.81 0.00012562 1 occludens 2) i miembro de familia de quinesina 18A 3.78 0¡.00134108 miembro de familia de quinesina 2C 3.77 0.0059888 j Í 1 similar a shugoshin (S. pombe) 3.76 0¡.00101318 quinasa 1 similar a polo 3.75 , ¡0.01,40309 ! (Drosophila) 1 timidina quinasa 1, soluble ; 3.73 0!.00124134 1 factor de transcripción 19 (SCI) 3.73 0;.00124327 ' 1 factor de transcripción 19 (SCI) 3.73 Oí 00124327 homólogo de claspina (Xenopus 3.71 0j.00683624 1 laevis ) i 1 subunidad 1 de complejo de GINS 3.69 0.00104515 (homólogo Psfl) 1 glutationa S-transferasa 1 3.67 , ; 0.041701 microsomal'. 1 similar a arilacetamida 3.67 0 : 00090264 5 desacetilasa SPC25, componente de complejo de 3.65 0.00568662 quinetocoro NDC80, homólogo (S. ce integrina, alfa 4 (antigeno CD49D, 3.62 10.0158411 subunidad 4 alfa de VLA-4 catenina (proteina asociada 3.57 7.46E-05 i cadherina) , 1 similar a alfa 1 1 discos, homólogo grande 7 3.56 0.0317074 i (Drosophila) homólogo de oncogén viral de 3.55 ¡0.0043878 mieloblastosis v-myb (avian) -lik serglicina 3.54 0.0443487 proteina N de centrómero 3.53 0.¡000540143 1 : ciclina A2 3.53 Oj. 00965934 proteina 8 de 22 kDa de ' choque 3.52 0.0219583 1 térmico dominio sema, dominio de 3.49 0.008548 inmunoglobulina (Ig) . doma básico corto proteina 11A de activación de GTPasa 3.49 0 .00834174 Rho anemia de fanconi, grupo de 3.43 O Í 00464532 í complementación I ¦ 1 de tipo 1 de trombospondina ' transformación, proteina 3 que 3 .31 0.0014577 contiene el enrollamiento enrollado acidico ciclina Bl 3 .29 ;0.0103092 1 similar a deficiente de tensión 3 .28 0.00488102 1 mitótico MAD2 (levadura) dihidrolato reductasa 3 .28 0.00178879 dominio similar a IPA que contiene 3 .27 0.00164708 ¦ 1 3 ciclo de división celular asociado 3 .26 0.0122226 con 2 enzima de edición de mRNA de 3 .26 J .00308692 apolipoproteina B, polipéptido catalítico ciclina · B2 3 .25 i 0.016544 dominio de endonucleasa que contiene 3 .24 0 . ¡00042 924 5 1 pseudogen de dihidrofolato reductasa 3 .23 OÍ.00141306 ATPasa. Na+ 3 .23 0 . ¡0003,8 14 64 factor de replicación C (activador 3 .23 0.00109668 1)3, 38 kDa dominio de repetición de WD 7 6 3 .22 .0023531 pleckstrin 2 3 .17 ¡D.0304429 ¦ 1 proteína de activación de GTPasa de 3 .17 Oj.00381613 proteína hipotética DKFZp762E1312 3.05 0.00726778 enzima de conjugación de ubicuitina 3.04 0.00118205 E2S 2 similar a hidroxiesteroide 3.03 ! 3.71E-05 deshidrogenasa familia ATPasa, dominio AAA que 3.01 0.00415258 contiene 2 TPX2, microtúbulo asociado, homólogo 3.00 0.0253137 (Xenopus laevis) i agrupación de histona 1, H4d 3;oo Ó.030183 miembro de familia de quinesina 23 2.99 0 .00790585 proteína 2 de 70 kDa de choque 2.99 0.0215102 térmico complejo de reconocimiento de 2.99 0 .00207753 origen, similiar a la subunidad 1 (levadura) dihidrofolato reductasa 2.98 000307793 receptor de motilidad mediado por 2.97 0 .00467816 hialuronano (RHAMM) 3' -fosfoadenosina 5' -fosfosulfato 2.97 1.43E-05 sintasa 2 i 1 ! glicerol 3-fosfato deshidrogenasa 2 2.95 0.00211969 (mitocóndrica) ! proteína 1 asociada con nucleolar y 2.95 0.00520875 i elusillo i I ¡ polipéptido B , i : homólogo RAD51 (homólogo RecA, E. 2.87 0.0,00854739 coli) (S. cerevisiae) ' í 1 cásete de enlace de ATP, subfamilia 2.87 0.'00382491 C (CFTR i familia con similitud de secuencia ; 2.85 id.00111165 29, miembro A j : dominio SH2 que contiene 4 a 2.84 . 0.0323646 proteina de membrana, palmitoilada 2.84 0.¡000396285 ! 1, 55 kDa ; i 1 i : subunidad IB reguladora de proteina 2.84 0.0107391 quinasa CDC28 , 1 i 1 i proteina de interacción de PSMC3 2.84 0¡.00766442 interface 2 . .de microfibrila de 2.84 .0.01¡92072 j i elastina 1 ! topoisomerasa (DNA) II alfa 170 kDa 2.83 0.0321109 proteina de transmembrana 106C 2.82 0.000214223 agrupación de histona 1, H3b 2.80 0.0304598 1 í estructura de lectura abierta 24 de 2.80 OÍ 003¾7442 cromosoma 18 1 i sustrato 8. de ruta de receptor de 2.79 '0.0194949 factor de crecimiento epidérmico i t ; domino .2 de enlace nucleosomal del ! 2.78 0.0030536 grupo de alta movilidad 1 1 I SCL 2.78 Ó.00390288 dominio hect y RLD4 2.78 Ó.00679184 homólogo B de la función 1 2.77 0.00543408 antisilenciamiento ASF1 (S. cerevisiae) interaccionador 13 de receptor de 2.76 , 0.0118319 hormona tiroides ciclo de división celular asociado 8 2.75 0.00619878 miembro de familia de quinesina Cl 2.74 0.00821937 dominio 2 de enlace nucleosomal del 2.73 0.00384071 grupo de alta movilidad ornitina descarboxilada 1 ' 2.73 0.00144868 homólogo de oncogen viral de 2.71 0.00989416 mieloblastosis v-myb (avian) -similar 1 2 ligando KIT 2.70 0j.00641955 ki regulado con tirosina- ( Y) - 2.70 0.0234606 fosforilación de especificidad doble homólogo 80 de transporte 2.70 0.0247286 intraflagelar (Chlamydomonas ) ! ; proteina de transmembrana 48 2.69 Oj.004Í58248 proteina de enlace 2 EBNAl 2.69 0.002:96292 ¦ i : interaccionador ZW10 2.69 ,1.88E-05 exonucleasa 1 2.68 0.00739393 transcetolasa (síndrome de Wernicke- 2.68 ! 1.92E-05 Korsakoff ) ! receptor 1 de somatostatina 2.68 0.0144901 isocitrato deshidrogenasa 3 (NAD+) 2.67 0.00297129 1 alfa proteína 2 asociada con el 2.67 0.0030499 citoesqueleto componente 4 del complejo de 2.67 Q.00342054 mantenimiento de minicromosoma inhibidor del enlace 1 de DNA, 2.66 0.036485 hélice-vuelta-hélice negativo dominante subunidad IB reguladora de proteína 2.66 0.0145263 quinása CDC28 queratina 18 2.66 8.4E-05 molécula CD97 2.66 0 .00994045 estructura de lectura abierta 173 de 2.64 0 .00222408 cromosoma 6 dominio BTB (POZ) que contiene 3 2.62 0.0166824 deafness, autosomal dominante 5 2.62 0 .00235481 proteína KIAA0186 2.62 0 .00130563 anemia de Fanconi, · grupo de 2.61 0.0281405 complementacion D2 quinasa 4 similar a polo 2.60 0 .00209633 (Drosophila) polipéptido MI de ribonucleótido 2.60 0. 000170076 1 reductasa enzima . málica 1, dependiente de 2.59 0.0435444 NADP(+), citosólica complejo I de condensina no.de SMC, 2.59 0.0216752 subunidad H proteína A3 de enlace de calcio SlOO 2.58 0.0324073 enzima de E2L3 de conjugación de 2.57 C .00343347 ubicuitina 1 1 brote de BUB1 no inhibido por el 2.56 ! 0.016047 1 homólogo beta de bencimidazoles 1 glicerol quinasa 2.55 2.66E-05 TAF9B RNA polimerasa II, caja TATA 2.54 0.0170365 de la proteína de enlace (TPB) -as TAF9B RNA polimerasa II, caja TATA 2.54 0.0170365 1 de enlace de proteína (TPB) -as Í agrupación de histona 1, H2bg 2.52 0.'¡000180822 caja 2 de grupo de alta movilidad 2.52 ¡0.0196872 quinasa 2 relacionada con NIMA 2.50 0.00289469 (nunca en el gen mitosis a) rica en prolina 11 2.50 0.0357125 í miopaladina 2.49 (0.0255088 dominio brix que contiene 1 2.49 0.00471977 1 ciclo de visión celular asociado 5 2.49 ! 0.'01021 1 fucosidasa, alfa-L-2-plasma 2.49 0 i.00540929 quinasa 2 dependiente de ciclina 2.49 0 j.00250724 ¡ homólogo de vuelta 4 de mRNA (S. 2.41 0.00373104 cerevisiae) glucosaminil (N-acetil) transferasa 2.41 :0.0197148 1, núcleo 2 (beta-l,6-N-regulador 1 de BMP de transmembrana 2.41 -0.0267285 rica en cisteina (similar a cordina) inhibidor de ruta de factor de 2.40 ¡0.0356227 tejido (lipoproteina asociada estructura de lectura abierta 59 del 2.40 0.00185191 i cromosoma 16 glicogenina 1 2.39 0.0224317 proteina de transmembrana 154 2.39 0.0045589 1 similar al antigeno de nefritis 2.39 0.00510812 tubulointersticial CTP sintasa · 2.38 8.80E-05 fenilalanil-rTNA sintetasa, 2.38 0.000245973 subunidad beta geminina, inhibidor de replicación 2.38 0.00167629 de DNA lámina Bl 2.37 .0477748 SPC24, componente de complejo de 2.36 0|.002:87227 cinetocoro NDC80, homólogo (S. ce glutatina reductasa 2.36 Oj.00353875 proteina ribosomal L22-similar a 1 2.36 0.003,55381 fumarilacetoacetato hidrolasa 2.36 3.8BE-05 i ; i ( fumarilacetoacetasa) ( 1 ' 1 í : RNA nucleolar pequeña, C ' ' ' 2.35 1 .188991 familia con similitud de seucneica 1 2.35 ¦ ! ?'.0019785 i 1 1 ; ' 64, miemro a i. : oncogen de secuencia 2 de i 2.35 0^000571152 transformación de célula epitelial 1 í : . ! i polimesasa (dirigida a DNA) , epsilón ¦ 2.34 '0.00479612 2 (subunidad p59) ' : I1 1 gliceról quinasa 2.34 I 3.37E-06 glutationa S-transferasa M2 2.33 0.0402076 (músculo) j i factor de alargamiento, RNA 2.33 ; 0.0130017 j polimesasa II, 2 I i tioredoxina 2.33 ! 0.0^09636 polimesasa (DNA dirigido) , alfa 2 2.32 '; ¡0.0033903 1 ¡ (subunidad 70 kD) i ; cáncer de mama 2, inicio temprano 2.32 0.005Í86847 similar a ciclo de división celular 2.32 0.00735977 1 i 45 CDC45 (S. cerevisiae) .1 1 . 1 ; 1 ¡ familia de histona H2A, miembro Z 2.32 6.0129697 1 transportador 1, cásete de enlace 2.31 6.016423 . ATP, subfamilia B (MDR ' 1 ! transportador 1, cásete de enlace de 2.31 T .0164234 ATP, subfamilia B (MDR : i.' : transportador 1, cásete de enlace de 2.31 Ó .0164234 ATP, subfamilia B (MDR homólogo 3 asociado con el complejo 2.30 0j 000373346 nucleolar (S. cerevisiae) . ! i ; ATPasa, transporte Ca++, membrana de ; 2.30 |0.023011 plasma 4 componente 7 del complejo de 2.30 0.0457691 mantenimiento de minicromosoma proteina de interacción de TI ELESS 2.29 0.0771062 1 proteina 1 de enlace de von Hippel- 2.28 0.00329061 t Lindau sustrato 2 de toxina de botulinum C3 2.28 '0.0292466 1 i relacionada con C3 (familia rho, sma 1 timopoyetina 2.28 |0.0223176 peptidilprolil isomerasa F 2.28 0.00093846 (ciclofilina F) 1 molécula de adhesión de célula de 2.27 o!.00242163 leucocito activada dedo 5 de anillo de grupo policomb 2.27 0.000294142 proteina 1 de activación de Ran 2.27 9.68E-05 GTPasa' factor de replicación. C (activador 2.26 oj.00164152 1 1) 4, 37 kDa 1 tubulina, beta 2C 2.26 0. 00346744 1 componente 10 del complejo de 2.26 0.0037925 mantenimiento de minicromosoma familia de histona H2B, miembro S 2.25 0.000885505 gamma-glutamil hidrolasa (conjugasa, 2.25 0.0195219 i 1 folilpoligammaglutamilo ¡ factor de terminación de 2.25 0 J 000393489 transcripción, RNA polimerasa II í 1 polimerasa (DNA dirigido), delta 2, 2.25 ¡0.0123823 subunidad reguladora 50 k 1 transportador 1, cásete de enlace de 2.25 ?.00859077 ATP, subfamilia' B (MDR transportador 1, cásete de enlace de 2.25 C .00859077 ATP, subfamilia B (MDR transportador 1, cásete de enlace de 2.25 0 .00859077 ATP, subfamilia B (MDR agrupación de histona 1, H2bf 2.25 0.0124279 factor 1A de iniciación de 2.24 0 ¡.00330183 traducción eucariótico, X-enlazado fosfoglucomutasa 2 2.24 0.00818204 1 D3, D2-enoil-Coa isomerasa 2.24 Oí.00148722 peroxisomal proteina inducida por interferona 2.24 b.0177928 con tetratricopéptido ¦ 1 fase G-2 y Sl expresado 1 2.23 10.021887 componente 2 del complejo de 2.23 Ó.0021347 mantenimiento de minicromosoma familia con similitud, de secuencia 2.23 © .100143248 : 1 < 72 , miembro A 1 1 L RMI1, inestabilidad 1 de genoma 2.23 ¦0. [00294705 1 1 ! i mediado por RecQ, homólogo (S. cerev i ; ' proteina FLJ20105 2.23 ¡01.0127979 deficiencia 2 del factor de 2.22 0.0116892 coagulación múltiple 1 fitoceramidasa, alcalina 2.22 0.0157729 dominio de enrollamiento enrollado 2.22 'C .00227586 que contiene 68 dedicador de citoquénesis 11 2.21 0.00697577 alfa polipéptido de factor de 2.21 'Cj.00176418 1 crecimiento derivado de plaqueta 1 1 N-acilesfingosina amidohidrolasa 2.20 0 .00728536 (ceramia no lisosomal proteina 2 asociada con quinasa fase 2.20 0.00230153 1 i S-2 (p45) ! ! polimerasa (RNA) III (DNA dirigido) 2.20 0.02:98794 polipéptido G (32 kD) proteina 1 de interacción .6 similar, 2.20 0 .001397.45 a factor de ribosilación de ADP i ' : agrupación de histona 1, H2bh 2.19 0.03:77748 complejo de reconocimiento origen 2.19 0.0·49697 similar a la subunidad 5 (levadura) . : i" subunidad 2 reguladora de proteina , 2.19 'p.0128024 i rayos X en Chínese ham proteína de membrana, palmitoilada 5 2.16 Ó.00211873 (MAGUK p55, subfamilia memb carioferina alfa 2 ' (cohort 1 RAG, 2.16 0 J 000650645 alfa 1 de importina) dominio de homología de pleckstrin 2.15 ¡0.0256434 que contiene, familia A (fosfoi I ! similar a la proteína L39 ribosomal 2.15 0.00429384 1 alfa 2 de carioferina (cohort 1 RAG, , 2.15 0.1000700649 importina Alfa 1) enlace de proteína precursora 2.15 0.00201004 amieloide beta (A4), familia B, m componente 3 del complejo de 2.14 0.00118389 j mantenimiento de minicromosoma agrupación de histona 1, H2ai 2.14 0.0129155 estructura de lectura abierta 34 del 2.14 0.000702936 cromosoma 13 homólogo de RAD18 (S. cerevisiae) 2.14 ¡0.0016685 1 repetición WD y proteína 1 de enlace 2.13 :0.0034833 1 1 de DNA de la caja HMG 1 similar, a sulfuro quinona reductasa 2.13 !?.0473641 1 (levadura) í : ¦ i' i estructura de lectura abierta 63 del 2.12 0.;0008|04179 cromosoma 16 fosfoproteína 1 de fase M 2.12 p.0271814 proteina hipotética FLJ40869 2.09 Ó.00444509 1 proteína de enlace de nucleótido de 2.08 Ó.00140559 Í ; guanina ' (proteina G) , gamma 11 ! i proteína de enlace de calciclina 2.08 Ó.00524566 1 cásete de enlace de ???, subfamilia 2.08 0.00454751 E (OABP) , miembro 1 molécula CD44 (grupo de sangre de la 2.08 0.000651436 ! India) 1 : componente de exosoma 8 2.08 0.00132017 familia con similitud de secuencia 2.08 0.025743 102, miembro B agrupación de histona 2, H3d · 2.07 0.0102932 familia con similitud de secuencia 2.07 0. 000318673 33, miembro A anemia de Fanconi, grupo de 2.07 0. 000255109 complementación B' miembro' de familia de quinesina 22 2.07 0.0192406 1 agrupación de histona 1, H2ai 2.07 ¡0.0161621 quinasá" relacionada con vaccinia 1 2.06 0.0233182 subunidad 7 del complejo integrador 2.06 0. '000841371 endonucleasa 1 específica de la 2.06 í 0.006882 estructura de aleta i 1 I proteína hipotética FLJ25416 2.06 0.|0001'77531 sitio de integración viral . 2.06 0.0171408 ecotrópico 2B retinitis pigmentosa 2 (recesivo 2.05 0.0264185 enlazado a X) 1 proteína de centrómero L 2.05 0J000880856 cofactor reguerido para ¦ la 2.04 Ó.00141809 activación transcripcional Spl, subu estructura de lectura abierta 121 2.04 jo.0146323 del cromosoma 29 i' i familia con similitud de secuencia 2.04 0.00162905 1 72, miembro A 1 familia con similitud de secuencia 2.04 0.00165234 t 1 12, miembro A factor de iniciación de traducción 2.04 0.00520549 eucariótico 1A, X-enlazado factor .. de alargamiento, RNA 2.03 0.0458007 1 polimerasa II, 2 ATPasa, Na+ 2.03 ,0.0189108 agrupación de histona 1, H3a 2.03 0.0244273 dominio brix que contiene 1 2.03 0.00981178 1 dominio suchi que contiene 1 2.03 ;0.0258164 1 ectonucleósido trifosfato 2.03 0.00423628 difosfohidrolasa 6 (putativ fructosamina 3 quinasa 2.03 Oj.00470372 síndrome de Bloom 2.02 ?.0209259 1 tubulina, alfa 1 c 2.01 0.008:62586 factor 2 de transcripción E2F 2.01 ¡3.04¡96479 componente 2 de exosoma 2.01 Ó.00649147 miembro 22 de familia de quinesina 2.01 ! 0.0242075 homólogo de LTV1 (S. cerevisiae) 2.01 3. C08112652 dihidrolipoamida S-acetiltransferasa 2.01 Ó. '00179011 (componente E2 de pyruv homólogo B de oncogén viral de 2.01 0.012225 leucemia de simio viral (relacionado con ras ; i i dedo de anillo y dominio 3 de 2.01 ¡0, 0013797 1 ; repetición WD 1 1 anexina Al 2.01 ¡0.0173578 homólogo 2 de elaC (E. coli) 2.00 0.00266504 j familia de aldehido deshidrogenasa 2.00 0.00911609 9, miembro Al tubulina, alfa 4a 2.00 0.0435427 proteína de interacción de complejo -2.00 0.00111223 de poro nuclear . i : i oculomedina -2.01 0j.00778869 1 similar a quinasa relacionada con • -2.01 0.0356628 i PI-3 quinasa SMG-1 autoantígeno de golgi, subfamilia de -2.01 0.00770626 í : golgi, pseudogen similar a 1 1 espectrina de repetición que -2.01 0|.00438469 1 contiene, envoltura nuclear 1 ! 1 proteína de interacción de complejo -2.01 0.00117582 ! i ! proteína de activación de GTPasa de -2.06 Ó .00705186 Rho homeobox B6 -2.06 1OL 0031714 proteína de interacción de complejo * 1 ' -2.07 0.00032839 de poro nuclear 1 j i 1 ! receptor 1 de fosfolipasa A2, 180 i -2.07 0 1 .00069343 kDa proteína de interacción de complejo -2.08 0.|000352007 ·' 1 ¡ de poro nuclear homólogo de ranura 3 ( Drosophila ) -2.08 j 0 J02844 proteína de interacción de complejo -2.09 .Ó0044309 de poro nuclear '. i. , ; quinasa 6 dependiente de ciclina -2.09 -.1 ¡Oi, i 0456892 dinamina 1 -2.09 0 .00139674 j.umonji, dominio IB interactivo rico ' -2.09 0 .008;61002 en AT enlace de calcio y dominio 1 del -2.09 0.00370041 ? · enrollamiento enrollado i , ; receptor de factor 1 de crecimiento -2.09 01.00114467 ¡ ¦ S similar a insulina ¦1 : proteína de interacción de complejo -2.10 0.000377834 ; i. de poro . nuclear • 1¦ 1 i ¦ , molécula CD82 -2.10 0.0175517 i' : bromodominio adyacente al dominio -2.10 '. 9.88E-05 del dedo de zinc, 2B i1. , <l dominio de jumonji que contiene Ia -2.20 (3.0188513 proteina quinasa 1 deficiente de -2.21 1.57E-05 lisina WNK beta 14 de protocadherina -2.21 0 01003892 Proteina de enlace cortactina 2 -2.21 2.28E-05 regulador 1 de transcripción que -2.22 ( ).0379899 contiene el dominio W ciclina Ll -2.22 0 00831474 factor nuclear de células T -2.22 0 007 86451 activadas, citoplásmico, calcina homólogo 1 de pellino (Drosophila) -2.23 0L 009 39357 autoantigeno de golgi, subfamilia de -2.24 0 00603583 golgi a similar a pseudogen estructura de lectura abierta 10 del -2.26 • 0 00738442 cromosoma 7 autoantigeno de . golgi, subfamilia de -2.27 0 00320764 golgi a similar a pseudogen RNA 17 especifico del cuerpo de -2.27 ( ).0301336 Cajal pequeño proteína de enlace de beta del -2.29 4.0E-05 factor ' de crecimiento de transformación latente 2 autoantigeno de'- golgi, subfamilia de -2.29 ( 3.0111179 golgi a, 8a inhibina, beta A (activina A, -2.29 0 00877271 activina alfa AB de polipéptido) familia- portadora de soluto 41/ -2.30 0.00453672 miembro 2 1 caja forkhead Pl -2.30 0.04163138 metalopeptidasa 14 de matriz -2.31 1.93E-05 (insertado en membrana) i factor de transcripción 4 -2.31 0.0367869 oncogén jun , -2.32 7.2¡lE-05 gen de transformación de célula -2.33 0.0109689 i¦ neuroepitelial 1 asporina -2.33 0.000659873 homólogo de oncogén viral de -2.35 ¡3.0138624 osteosarcoma de murino FBJ v-fos efrina-B2 -2.36 0.00611474 1 repetición WD y 1 que contiene la -2.36 0¡.038,7851 I ¡ caja SOCS similar a dJ402H5.2 (similar a la -2.36 0 ¡00621503 i proteína novedosa a wo dominio PX que contiene serina -2.38 0.000927628 1 colágeno tipo VII, alfa 1 -2.38 0.|?0109233 1 (epidermólisis bulosa, dystr 1 i proteína 1 de enlace de AE -2.39 0.000105628 homólogo de peroxidasina -2.40 0J00219049 ( Drosophila ) i 1 canal de calcio, dependiente de -2.41 01.0189661 voltaje, tipo L, alfa 1C sub región 1 de cromosoma de síndrome de -2.45 0 .0415526 prader-Willi línea media 1 (Opitz -2.45 0'. 00130803 proteína de interacción de complejo -2.45 0. 00354416 de poro nuclear estructura de lectura abierta 54 del -2.47 0 .0186089 cromosoma 1 proteína de trarismembrana 16A -2.48 0 .0481085 dominio de hélice-vuelta-hélice -2.49 0. 00270257 básico que contiene, clase B, 2 proteína de interacción de complejo -2.50 0. 00316496 de poro nuclear factor ' 1 de transcripción -2.50 0. D00307387 relacionado con runt (leucemia i mieloide aguda) . proteína 292 de dedo de zinc -2.50 Q.029832 1 proteína 2 de transmembrana rica en -2.51 Ol 0135122 • leucina de fibronectina proteína de interacción de complejo -2.51 0.100283418 de poro nuclear canal de compuerta de voltaje de -2.54 0.024,4306 i : potasio, subfamilia G, miembro 1 : 1 interleucina 19 -2.54 0 .0310328 factor de crecimiento de -2.54 0 .0287865 transformación, beta 3 dihidropirimidinasa-similar 3 -2.55 0.0165203 autoantigeno de golgi, subfamilia de -2.56 O;.0121417 ! i golgi a, 8B proteina hipotética PRO2012 -2.57 0 J00756704 SATB homeobox 2 -2.57 0.039781 t-complejo 11 (ratón) similar 2 -2.57 0.0324227 proteina de dedo de anillo 122 -2.57 0¡.0236621 estructura de lectura abierta 57 del -2.59 0.00261522 cromosoma 8 1 ' ADAM metalopeptidasa con la porción -2.60 0.0113968 de tipo 1 de trombospondina ! sushi, tipo A de factor de von -2.63 2.23E-05 Wilebrand, EGF y pentraxin dom i ST6 beta-galactosamida alfa-2, 6- -2.64 0.0216987 ¦ 1 : sialiltransferasa 2 receptor 2 que contiene dominio -2.65 0.C0936311 í VPS10 relacionado con sortilina i beta 9 de protocadherina -2.66 0¡.0285124 1 estructura de lectura abierta 13 del -2.67 0.j004100172 1 cromosoma 6 1 enah -2.68 0.007,7547 dominio de descarboxilasa -2.69 0 ii 00683647 ! dependiente de piridoxal que i 1 1 contiene 2 similar a la proteina de interacción -2.70 0.0187322 de complejo de núcleo . de poro ¡ 1 nuclear proteina de interacción de complejo -2.70 0.00368967 ¡ : ¦ 1 de poro nuclear j 1 proteina de transmembrana 119 -2.70 0^00801387 estructura de lectura abierta 37 del -2.70 ib24530.0 1 cromosoma 14 I proteina que contiene la repetición -2.71 0.0253856 1 sushi-X-enlazado 2 dedo de ANILLO 3 que contiene -2.71 0.¡00931014 I dominio PDZ 1 1 colágeno, tipo XII, alfa 1 -2.72 0.000204664 i ; relación de matriz asociada 5 -2.72 0.Q00317637 colágeno, tipo V, alfa 1 -2.72 .01,66427 proteina relacionada con distrofina -2.72 D.0137557 2 cásete de enlace de ATP, subfamilia -2.73 0. 00131361 A (ABC1) , miembro 1 trofinina -2.77 0. 00298044 homólogo 3 de cornichon (Drosophila) -2.78 0 .0261738 similar a la proteina 1 de enlace de -2.78 0. 00290401 formina. cerebro y leucemia aguda, -2.78 0.0476919 citoplásmica í 1 ! homólogo B de oncogé'n. viral de -3.54 01 0025573 osteosarcoma dé murino- FBJ ' similar a RIKEN cDNA 1110018M03 -3.59 0j.00516476 respuesta de crecimiento temprana 2 -3.62 01.00821813 (homólogo Krox-20, ¡ 1 Drosophila) dachsous 1 (Drosophila) : -3.63 0.00697244 miembro de familia de quinesina 26B , -3.64 0!.003:63199 homeobox 5 menor distal -3.66 0.p006'40157 similar a la Proteina KIAA0220 ; -3.69 0.0302619 receptor de factor 1 de crecimiepto -3.71 3. 2E-05 similar a insulina proteina de tirosina fosfatasa, tipo -3.77 ¦ 0.0294569 1¦ de receptor, N 1 : ; KIAA1641 -3.85 0.01:91782 proteina que · contiene repetición -3.85 0.00370941 .. i 1 . . sushi, X-enlazada 1 i proteina 2 asociada con -3.91 ¡OÍ 0152901 . 1 microfibrilar 1 1 componente 1 de suplemento, -3.97 0 0395863 subcomponente s 1 ! molécula CD24 -3.99 ¦ 0¿ 0340122 homeobox B3 -4.02 ¡0:03.54368 síndrome de tricorinofalangeo 1 -4.02 0.005:57712 secuencia de síndrome de Kallmann 1 -4.04 0.000548703 repetición rica en leucina que -4.09 3.0263961 contiene 17 dominio de plexina que contiene 2 . -4.32 0.031799 proteina de tirosina quinasa PTK7 7 -4.42 0. 300116114 supervillina -4.43 3.0412717 proteina de dedo de zinc 521 -4.58 0 .00668815 calbindina 2, 29 kDa ( calretinina ) -4.77 D.0290743. familia del gen homólogo ras, -4.79 0 .00197982 miembro J integrina, alfa 11 -4.80 0. 3003T0317 odz, odd OZ -5.05 0 .00172671 proteina F-box 32 -5.52 3.0212957 miembro de familia de raftlina 2 -5.72 3.0260454 clusterina -5.74 3.0303973 neurotrimina -5.79 3.7BE-06 proteina 1 de ruta de señalización -5.86 0. 300672342 inducible WNT1 proteina 5 de enlace de factor de -6.34 0.011614 crecimiento similar a insulina sulfatasa 2 -6.34 5.88E-05 proteina 4 asociada a microfibrilar -6.93 0 .00155578 molécula de adhesión juncional 2 -7.07 0.03106758 dominio de fibronectina tipo III que -7.29 0.03Í34696. contiene 1 sarcoglicano, glicoproteina asociada -7.37 0. 000881984 I La expresión de marcadores celulares sobre células i PLX-C - los antigenos de superficie expresados por PLX-C se examinaron utilizando anticuerpos monoclonales . : Los resultados indicaron que las. células PLX-C se caracterizaron por los marcadores positivos: CD73, CD29 y CD105 y los marcadores negativos: CD34, CD45, CD19, !CD14, CD200 jy HLA-DR. En algunos experimentos, las especificaciones de paniebla del fenotipo inmune se ajustaron como: =90% para tjodos los marcadores positivos y =3% para todos los marcadores ' ' ¡ I negativos. ! j | Además, como se muestra en las Figuras jÁ-B, ' los cultivos de PLX-C no expresaron marcadores endotelijales como I : es mostrado por el manchado negativo para los dos marcadores endoteliales CD31 y KDR. Sin embargo, la expresión; de PLX-C de un marcador típico de fibroblasto fue evidente (¡expresión de D7-fib, Figura 4C) . Además, como se muestra en ¡la Figura 4D, las células PLX-C negativamente expresan CD200. ¡ Propiedades de izwmnogenicidad e inmunomoduladoras de las células PLX-C - como PLX-C está comprendido dé células adherentes derivadas de la placenta, sé espera quej expresen HLA tipo I, que es expresado por todas las células del cuerpo y se sabe que induce una respuesta inmune aloreaetivai. Las moléculas HLA tipo II y otras moléculas coestimul.adoras son típicamente expresada.s solamente sobre, la superficie de las Células que Presentan Antígeno (APCs) . ! Con el fin de examinar la irimunogenicidajd dé las células PLX-C obtenidas, la expresión de las moléculas co- i estimuladoras sobre la superficie de estas membjranas de célula se realizó. El análisis de FACS demostró láj ausencia de CD80, CD86 y CD40 sobre las membranas de células PLX-C (Figuras 5A-C) . Por otra parte, PLX-C expresó bajos niveles de HLA clase I como es detectado por el manchado ¡para HLA A/B/C (Figura 5D) . La expresión de moléculas estimuladoras y coestimuladoras fue similar a las MSCs derivadas · de médula ósea (BM) (como se muestra en las Figuras 5A-D) . ! í Para investigar adicionalmente la inmunogenicidad ! : así como las propiedades de inmunomodulación de las células ¡ ? PLX-C, se realizaron prueba's de reacción de ¡linfocito mezclado (MLR) . Como se ' muestra en la Figura 6A-B, las células PLX-C ambas se escapan del aloreconocimiento y i ¦ reducen la respuesta de célula T, como es medidjo por la incorporación de Timidina. Además, la reducción en la ! proliferación de linfocitos (evaluado por la mediciqn de CPM) fue más alta ya que el número de células PLX-C se incrementó (de una manera dependiente de la dosis) . PLX-C también' redujo la proliferación de linfocitos después de ¡estímulos mitogénicos, tal como Concavalina A (Con A, Figura 6B) y Fitohemaglutinina (PHA), y la estimulación no específica mediante anti-CD3, anti-CD28 (datos no mostrados) . ! Con el fin de investigar el mecanismo cíe acción mediante el cuál PLX-C inmunomodula ' la proliferación de ! linfocitos, y para ver si esta acción es mediada ppr la via de la interacción de célula a célula o la secreción de citoquinas, células Mononucleares (MNCs) derivadas j de PB se I estimularon mediante PHA utilizando el método transwell (que i previene el contacto de célula a célula pero permite la difusión de citoquinas entre los dos compartimientos) . Los resultados mostraron que la inhibición de la proliferación se mantuvo aun cuando el contacto de célula a célula fue inhibido (datos no mostrados) . ¡ Secreción de citoquinas - como es representado anteriormente en la presente, PLX-C reduce la velocidad de proliferación de linfocitos, probablemente a través de factores solubles. La investigación' adicional ¡ de las citoquinas secretas por linfocitos en ^respuesta a i PLX-C se realizó para poner en claro el mecanismo de acción Jde PLX-C. Como se representa en las Figuras 7A-B, el cultivo de células i mononucleares con PLX-C ligeramente reduce la secreqión de la citoquina proinflamatoria INFy y reduce notablemente la secreción de TNFa (aun en la presencia de bajas cantidades de PLX-C) . Además, después dé la estimulación, de lipopolisacárido (LPS) , la secreción de MNCs derivabas de PB de IL-10 se incrementó en la presencia de PLX-C, miejntras que I el nivel de secreción de TNFa disminuyó, de una manera dependiente de la dosis (Figura 7C) EJEMPLO 4 .

Comparación de la diferenciación de Osteocito de células adherentes 2D de la presente invención y células dé médula ósea j Las nuevas células adherentes de la ; presente invención (de origen de placenta) se cultivaron bajo condiciones de estimulación de diferenciación de osteocito en su etapa de célula adherente 2D en comparación a las células derivadas de médula ósea.

Materiales y Métodos Experimentales Osteogénesis La osteogénesis se llevó a cabo de acuerdo con el alícuotas de 5 mi y se conservó a -20°C hasta el uso;.

Recubrimiento de placas de cultivo de tejido de 24 cavidades Una mezcla de recubrimiento que comprende 12 : g/ml I : : de citronectina y 12 pg/ml de colágeno (ambos incluidos en el equipo)¦ se preparó al diluir cada uno con 1 x PBS . ¡ La mezcla de recubrimiento luego se adicibnó a las cavidades para cubrir la superficie de la cajvidad (5 i cavidades por 2 placas se prepararon) . Las placas se incubaron durante la noche a temperatura ambiente.. La mezcla I 1 de recubrimiento luego se removió y las cavidades . se i enjuagaron una vez con PBS. Las placas se ¡aspiraron I correctamente antes del uso. ¡ Crecimiento Celular ; Las células derivadas de placenta (plcll-3-1) o í células derivadas de médula ósea (BMÍ08) se colocaron en G i placas (200,000 células por cavidad) en 1 mi de j medio de crecimiento que comprende DMEM (Invitrogen, Gibco)1, FCS al 10% (Invitrogen, Gibco), L-glutamina 2 mM (Sigma-Aldrich) , 45 pg/ml de Gentamicina-IKA (Teva Medical) y 0.25 : pg/ml de Fungizona (Invitrogén, Gibco) . Las células derivadas de placenta (4 cavidades x 2 placas) o células derivadas de médula ósea 1 cavidad x 2 placas) se cultivaron hasta 100% de ! confluencia (típicamente durante la noche) antes de iniciar la diferenciación osteogénica.

Cuando las células alcanzaron 100% de confluencia, el medio de crecimiento se aspiró y se reemplazó con 1 mi de medio de inducción de osteogénesis (dia 'de diferenciación 1) . El medio de inducción de osteogénesis se reemplazó icón medio fresco cada 2-3 días durante un total de 14-17 días.; luego se fijaron al incubar en etanol al 70% enfriado con i hielo durante 1 hora a temperatura ambiente. El alcohol luego se aspiró cuidadosamente y las células se enjuagaron dos veces con agua (5-10 minutos cada lavada) . El agua ¡ luego se aspiró y la solución roja de alizarin (500-100Q µ?) se adicionó a las células. Las células se incubaroi¡i con la solución roja' de alizarin a temperatura ambiente durante 30 minutos. El rojo de alizarin se removió y las células se lavaron 4 veces con 1 mi de agua y se ' aspiraron después de cada lavado. Finalmente, 1-1.5 mi de agua se adicionó a cada cavidad para prevenir al secado de la célula. Las placas se visualizaron microscópicamente por un microscopio ¡invertido Nikon.

Resultados experimentales La diferenciación de osteocito de las¡ células adherentes derivadas de placenta o de médula ósea en; el medio de inducción osteogénico dio por resultado la diferenciación de arriba de 50% de las células de médula ósea,' como es demostrado por el manchado de rojo de alizarin ¡ positivo (Figura 8B) . Por el contrario, ninguna de lasj células derivadas de placenta de la presente invención mostraron cualquiera de los signos de diferenciación osteogénica (ver i la Figura 8E y Tabla 4, enseguida) . ¡ Tabla 4 : Resumen de diferenciación 1 EJEMPLO 5 Comparación de la diferenciación de osteocito de las células adherentes 2D de la presente invención y las células de I 1 médula ósea en el medio de crecimiento modificado ¡ Las células adherentes de la presente invención (de origen de placenta, en su etapa de célula adherente 2D) o células derivadas de médula ósea , se cultivaron bajo condiciones de estimulación de diferenciación de osteocito en un medio osteogénico modificado que comprende Vitamina D y concentraciones- más altas de dexametasona . ! Materiales y Métodos Experimentales Medio de inducción de osteogenesis Vitamina D (Sigma) 10 µ? 10 uL 10 nM Gentamicina · (Biological X 100 100 µ? X .1 j Industries, Bet Haemek, i Israel) Un frasquito de suero de 50 ral. se inactivo con calor, se dividió en alícuotas de 5 mi y se conservó a -20°C hasta el uso. ; I Recubrimiento de placas de cultivo de tejido de 48 cavidades Una mezcla de recubrimiento que comprende' 12 ,' g/ml de vitronectina y 12 µ?/p?? de colágeno (ambos de Chemicon) se prepararon al diluir cada uno con 1 x PBS . ! La mezcla de recubrimiento luego se adicionó a las cavidades para cubrir las superficies de la cavidad (5 cavidades x 2 placas se prepararon). Las placas se jincubaron durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de recubrimiento luego se removió y las cavidades se enjuagaron una vez con PBS. Las placas se aspiraron correctamente antes del uso.

Crecimiento celular Las células derivadas de placenta (células fetales PLC 8-2-1, PLC 15 3-4-2 o PLC 19-4-3-1) se coljocaron en placas (100, 000. células por cavidad) en 0.5 mi dej medio de crecimiento que comprende DMEM (Invitrogen, Gibco) , FCS al 10% (Invitrogen, Gibco), L-glutamine 2 mM (Sigma-Aldrich) , 45 Cuando las células alcanzaron 100% de corífluencia , el medio de crecimiento se aspiró y se reemplazó con 0.5 mi • . 1 del medio de inducción de osteogénesis (día de diferenciación 1) . El medio de la inducción de osteogénesis se reemplazo con i medio fresco cada 2-3 días durante un total de 26 días. i Como un control, una de las dos placas (parai cada i i uno de los tipos de células) no se incubó con el i medio de ¡ diferenciación de osteogénesis sino más bien con el I med1io de crecimiento (descrito anteriormente en la presente) . j En el día 26, los osteocitos se fijaron y se ! mancharon con Solución Roja de Alizarin como es representado ! en detalle enseguida. j Protocolo de Manchado ¡ I El manchado de osteocito se realizó ¦ al primero aspirar cuidadosamente el medio de cada i cavidad i (cuidadosamente para no aspirar las células) . Las células i luego se fijaron al incubar en etanol ' al 70% enfriado con i ' hiego durante 1 hora a temperatura ambiente. El alcohol luego se aspiró cuidadosamente y las células se enjuagaron dos . . ! veces con agua (5-?0 minutos, cada lavado) . El agual luego se ! .1 aspiró y la solución roja de alizarin (500-1000 µ?) se i ' adicionó a las -células. Las células se incubaron con la solución roja de alizarin a temperatura ambiente djurante 30 minutos. El rojo de alizarin se removió y las células se lavaron 4 veces con 1 mi de agua y se aspiraron después de I cada lavado. Finalmente, 1-1.5 mi de agua se adicionó a cada cavidad para prevenir el secado de la célula. Las placas se visualizaron microscópicamente por un microscopio ¡invertido ' I Nikon. ! Resultados experimentales j La diferenciación osteogénica de las j células adherentes derivadas de placenta o de médula ósea sje realizó i mediante la modificación del . protocolo descrito en ejl Ejemplo 4, anteriormente en la presente, de acuerdo ¡ con las enseñanzas previas [Parloni y colaboradores, (2Q08) Stem I Células' 26 ( 2 ) : 300-11 ] . La diferencia media eijitre las condiciones de crecimiento presentadas én el Ejemplo 4 y los resultados presentados en la presente fue la adición de la ' 1 vitamina D al medio de diferenciación y las concentraciones i ! más altas de' dexametasona . Como es evidente j en; los I resultados, arriba de 50% de las células de médula ósea se sometieron a diferenciación en osteocitos, como es demostrado por el manchado de rojo de alisaron positivo (ver ¡la Figura 9B) . Sin embargo, ninguna de las placentas de las células derivadas placenta de la presente- invención mostraron cualquiera de los signos de diferenciación osteogénica (ver la Figura 9E y Tabla 4, anteriormente en la presente;).

EJEMPLO 6 Comparación de la diferenciación de adiposito en las células adher ntes 2D de la presente invención y las células de médula ósea ; Las nuevas células adherentes de la I présente invención (de origen de placenta) se cultivaron bajo ! condiciones de estimulación de diferenciación de adiposito en su etapa de célula adherente 2D en comparación a las células i derivadas de médula ósea. i Materiales y Métodos Experimentales Adipogénesis La adipogénesis se llevó a cabo de acuerdo con equipo de adipogénesis Chemicon (equipo de adipogénesis Chemicon, cat no. scr020, Millipore, MA, USA) ·> Medio de inducción de adipogénesis Los medios de inducción o mantenimiento de i : adipogénesis se prepararon frescamente antes ¡de ,' cada intercambio del medio utilizando los componentes ' j representados en la Tablas 6 y 7, enseguida. ¡ Tabla 6 : Componentes del medio de inducción de adipogénesis µ?/p?? de Gentamicina-IKA (Teva Medical) y 0.25 jpg/ml de i Fungizone (Invitrogen, Gibco) . Las células derivadas de placenta (4 cavidades x 2 placas) o 'Células derivadas de médula ósea (1 cavidad x 2 placas) se cultivaron hjasta 100% de confluencia¦ (típicamente durante la noche) antes de la ! iniciación de la diferenciación de adipogénesis . j i Cuando las células alcanzaron 100% de confluencia, el medio de crecimiento se aspiró y se reemplazó cojn 1 mi de medio de inducción de El medio de inducción fresco cada 2-3 días representado en deta presente) . Como es notable, las monocapas de células adipogénicas fueron extremadamente frágiles y podrían ser fácilmente desalojadas de las placas, por lo tanto, los cambios del medio se realizaron con cambios del ¡medio I ; moderados para evitar el rompimiento de las gotitas de lpipido. , ] Como un control, una de las dos placas (para cada I uno de los tipos de célula) no se incubó con el¡ medio de diferenciación de adipogénesis sino más bien con el medio de I crecimiento (descrito anteriormente en la presente) .¡ < Tabla 8 : Programa de difrenciación de adipogénesis Dia Medio 1 Medio de Inducción de Adipogénesis j 3 Medio de Inducción de Adipogénesis 5 Medio de Inducción de Adipogénesis ¡ 7 Medio de Mantenimiento de Adipogénesis j 9 Medio de Inducción de Adipogénesis ] 11 Medio de Inducción de Adipogénesis j 13 Medio de Inducción de Adipogénesis i 15 Medio de Mantenimiento de Adipogénesis 17 Medio de Inducción de Adipogénesis ¡ i 19 Medio de Inducción de Adipogénesis J 1 21 Medio de Inducción de Adipogénesis j En el día 25, los adipocitos se fijaron ;y se mancharon con solución roja de aceite como es representado en detalle enseguida. ~ ' Protocolo de Manchado i El manchado de adipocito se realizó álj primero aspirar cuidadosamente el medio de cada ¡ cavidad (cuidadosamente para no aspirar las células) . Las células luego se fijaron al incubar en paraformaldehido al 4i¡¾ durante 30-40 minutos a temperatura ambiente. El fijador jluego se aspiró cuidadosamente y las células se enjuagaron tires veces con PBS (5-10 minutos cada lavada) . Enseguida, el PBS se aspiró y las células se enjuagaron dos veces en aguaj.' El; agua . I luego se aspiró y la solución roja de aceite (500-1000 µ?) se i adicionó a las células. Las células se incubaron con la ¡ solución roja, de aceite a temperatura ambiente durante 50 i minutos. La solución roja de aceite se removió y lás células se lavaron 4 veces con 1 mi de agua y se aspiraron después de cada lavado. Finalmente, 1-1.5. mi de agua se adicionó a cada cavidad para prevenir el secado de la célula. Las placas se visualizaron microscópicamente mediante un microscopio invertido Nikon. I Preparación la solución roja de aceite ', El extracto de 0.25 g de rojo de aceite ('Sigma) se utilizó el cual se disolvió en 50 mi de isopropanól al incubar 10-15 min en un baño a 37°C. - ¡ ' Para el uso, 30 mi de la tintura de extracto se mezcló con 20 mi de DDW (dejado reposar durante 10 ¡minutos y luego filtrar con papel filtro de café). La solución roja' de aceite se preparó fresca para cada uso. ¡ Resultados experimentales \ La diferenciación de adipocito de lasj células adherentes derivadas de placenta o de médula ósea en| el :medio de inducción de adipocito dio por resultado la diferenciación de arriba de 50% de las células derivadas de médula ¡ósea (ver la Figura 8C)., como es demostrado por el manchado rojo de aceite positivo y por los cambios morfológicos típicos (por ejemplo, acumulación de gotitas de aceite del citopljasma) . En contraste, ninguna de las células derivadas de placenta 'de la presente invención se diferenciaron en adipocitosj (ver la Figura 8F y Tabla 4,. anteriormente en la presente). ! EJEMPLO 7 Comparación de la diferenciación de adipocito en las células adherentes 2D de la presente invención y las células de médula ósea en el medio de crecimiento modificado Las células adherentes de la presente invención (de origen de placenta, en su etapa de célula adherente 2D) o células de médula ósea se estimularon para diferenciarse en adipocitos en un medio de adipocito modificado que 'comprende i ; un nivel más alto de Indometacina . ¡ j Materiales y Métodos Experimentales j Meido de inducción de adipogenesis El medio de inducción de adipogénesis se preparó frescamente antes de cada intercambio del medio utilizando los componentes . representados en la Tabla 9, enseguida Tabla 9 : Componentes del medio de inducción de adipogénesis Componente con de Cantidad ? con extracto final DMEM baja en glucosa 4.4 mi 90%; Suero (inactivado con calor) 0.5 mi io%; Dexametasona (Sigma) " 1 mM 5 µ? ; 1 µ? IBMX (Sigma) 0.5 M 5 µ? 0.5 mM Insulina (Sigma) 10 mg/ml 5 pL : 10 g/ml Indometacina (Sigma) 10 mM 200 µ? ! 100 µ? 1 Gentamicina (Biological 10 µ? ¡ Industries ) Crecimiento Celular Las células derivadas de placenta (células fetales PLC 8-2-1, PLC 15 3-4-2 o .PLC 19-4-3-1) se colócarón en placas (100,000 células por cavidad) en 0.5 mi de i medio de crecimiento que comprende DMEM (Invitrogen, Gibco)!, FCS al I 10% (Invitrogen, Gibco), L-glutamina 2 Mm (Sigma-Aldrich) , 45 g/ml de Gentamicina-IKA (Teva Medical) y 0.25 ¡ g/ml de Fungizona (Invitrogen, Gibco) (5 cavidades x 2 placas) . · Las ¦ células derivadas de médula ósea (BM109) se colocaron en places (100,000 células por cavidad) en 0.5 mi de medio de crecimiento que comprende DMEM (Invitrogen, Gibco),-- FCS al 10% (Invitrogen, Gibco), L-glutamina 2 Mm (Sigma-Aldrich) , 45 µg/ml de Gentamicina-IKA (Teva Medical) y 0.25 µg/ml de Fungizona (Invitrogen, Gibco) (4 cavidades x 2 ! ¡ placas) . Las células se cultivaron hasta 100% de cdnfluencia (típicamente durante la noche) antes dé la iniciación de la diferenciación de adipogénesis . ¡ ¦¦ . . . í Cuando las células alcanzaron 100% de confluencia, el medio de crecimiento se aspiró y se reemplazó con 0.5 mi del medio de inducción de adipogénesis (día de diferenciación 1) . El medio de inducción de adipogénesis se reemplazó con I ¦ medio fresco cada 2-3 días durante un total de 3-4 semanas. i Como un control, uno de las dos placas (para cada uno de los tipos de célula) no se incubó con el ¡medio de diferenciación de adipogénesis sino más bien con el; medio de crecimiento (descrito anteriormente en la presente)., I En el dia 26, los adipocitos' se fijaron . y se mancharon con solución roja de aceite como es representado en detalle enseguida. ! .

Protocolo de Manchado ! El manchado de adipocito se realizó al primero aspirar cuidadosamente el medio de cada | cavidad (cuidadosamente para no aspirar las células) . Las células luego se fijaron al incubar en paraformaldehido al 4% durante 30-40 minutos a temperatura ambiente. El fijador J luego se I aspiró cuidadosamente y las células se enjuagaron tres veces con PBS (5-10 minutos cada lavado) . Enseguida, el PBS se aspiró y las células se enjuagaron dos veces en agua. El agua ¡ luego se aspiró y la solución roja de aceite (500-1000 µ?) se i i adicionó a las células. Las células se incubaron con solución roja de aceite a temperatura ambiente durante 50 minutos. La ' I solución roja de aceite se removió y las células se ¡lavaron 3 veces con 1 mi de destilada doble y se aspiraron después de cada lavado. Finalmente, 1-1.5 de agua se adicionó a cada cavidad para prevenir el secado de la célula. Las ¡placas se i visualizaron microscópicamente mediante un microscopio invertido Nikon. , j I ¡ Preparación de la solución roja de aceite j I Extracto de 0.25 g de rojo de aceite (¡Sigma) se utilizó el cual se disolvió en 50 mi de isopropanol al i incubar 10-15 min en un baño a 37 C. ¡ Para el uso, 30 mi de la pintura de extracto se mezcló con 20 mi de DDW (dejar reposar durante 10 ¡minutos y luego se filtró con papel de filtro de café) . La! solución roja de aceite se preparó fresca para cada uso.

Resultados experimentales La diferenciación de adipocito de las células adherentes derivadas de placenta de médula ósea s¡e realizó i mediante la modificación del protocolo en el¦ Ejemplo 6, i anteriormente en la presente, de acuerdo con las enseñanzas previas [Parloni y colaboradores, (2007), supra] . La diferencia principal entre las condiciones de crecimiento I presentadas en el Ejemplo 6 y los resultados presentados aquí fue la concentración más alta de Indometacina . i Com;o es evidente en los resultados, arriba' de 50% de las células ' ' i i derivadas de médula ósea se sometieron a diferendiáción en I adipocitos (ver la Figura 9C) , como es, demostrado por el manchado de rojo de aceite positivo y por los cambios morfológicos típicos (por ejemplo, acumulación de gotitas de I I aceite de citoplasma) . En contraste, ninguna de las células derivadas de placenta de la presente invención exhibieron cambios morfológicos típicos de adipocitos (ver la ¡Figura 9F i ! y Tabla 4, anteriormente en la presente) . ! I EJEMPLO 8 j Biodistribución de PLX-C ! Materiales y Métodos Experimentales i Transfección de células PLX-rC con el vector de expresión de Lucif rasa I Las células PLX-C se infectaron establémente con una construcción lentiviral que expresa el gen .iuciferasa bajo el promotor C V (Figura 10). j Producción del virus de infección ' Las células productoras 293TN se cultivaron en el medio DMEM (Gibco) suplementario con suero y antibióticos durante 2-3 días (50-70% de confluencia) antes de la transfección. Una mezcla de 10 g del plásmido de i empaquetamiento y 2 µ? de construcción de expresión y 20 µ? del Reactivo Plus™ (Invitrogen) se adicionaron a 400 µ? de DMEM sin suplementos. La mezcla se incubó durante 15 min temperatura ambiente (RT) y Lipofectamina™ (30 µ? diluida en 400 µ? de DMEM se adicionaron) . La mezcla se incubó a RT durante 15 min. Las células 293TN se lavaron y se I transfirieron al medio de suero al 2% y se adicionó !la mezcla i de transfección. Las células se incubaron en incubadora de C02 a 37 °C durante la noche y el medio se recolectó a 24-60 hrs de. post-infección . La producción de virus picoj se logró después de 48 hrs. El medio se recolectó, y se centrifugó a 3000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos para formar en pelotillas los restos celulares. Después. de la I I centrifugación,¦ el sobrenadante se filtró a través de filtros PVDF de 0.45 µp\ Millex-HV (Millipore, Cat . #SLHVR25L|S) .

Infección de PLX-C Las células PLX-C se sembraron en una placa de 24 cavidades a una densidad de 0.6-1 x 105 células por cavidad en el medio complete 24 horas antes de la infección viral. Después, de 24 hrs, 0.5 mi de la suspensión de virus (diluida en el medio completo con Polybrene en una concentración final de 5-8 g/ml) se adicionó. Las células se incubaron durante i ; 24 hrs, luego el medio se reemplazo por el medio! DMEM completo y las células se incubaron a 37 °C con C02 !al 5% I durante la noche. En el día 4, el cultivo alcanzó la I I confluencia y se dividió por 1:3 a 1:5, las células se i dejaron cultivando durante 48 horas en el DMEM completo luego las células se analizaron para la expresión de Luciferasa.

Las velocidades de eficiencia de infección fueron i cercanas a 100%. La evaluación de luminiscencia en las células vivientes y en ratones vivientes se realizó utilizando el sistema de formación de Imagen IVIS Lúmina, que incluyó una cámara CCD altamente sensible que capturó la señal de luminiscencia de luciferasa. | Dos . semanas de post-infección 2 x 106 cjélulas se inyectaron IM o IV en ratones SCID/Beige, NOD/SCl'p,' SCID y i Balb/C. Las células inyectadas se monitorearon utilizando el ! sistema' IVIS descrito. i Resultados experimentales Como es evidente a los resultados, las células PLX-C continuaron dividiéndose después de' la infección, y los niveles de expresión de Luciferasa en las células en crecimiento permanecieron fuertes y estables (Figura 11).

Una vez que las células pLX-C se inyectaron en ratones Balb/C, se examinó el patrón de biodistribución. Como es evidente a los resultados, las células desaparecieron 72 i ¦ hrs de post-inyección I (datos no mostrados) . Sin 'embargo, las célul expresión (datos no i inyectadas IM en ratones SCID/Beige los ¡ ratones inmunodeficientes retenidos hasta 5 dias en el sitio de ? inyección y no se observaron después. Las células PLX-C inyectadas IV en ratones SCID/Beige migraron después de 24 hrs a los pulmones, luego al sitio de , inyección I (presumiblemente albergándose al sitio de la lesión) . Después de que las células desaparecen gradualmente |y no se observaron después de 3-4 semanas. ; Aunque la invención se ha descrito en conjunción i . ' con modalidades especificas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones serán evidentes para aquellos expertos en lá técríica. Por consiguiente, se propone abarcar todas de tales alternativas, modificaciones y variaciones que caen dentro del espíritu y i alcance amplio de las . reivindicaciones adjuntas. ; 1 ? ' Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación se incojrporan en la presente en su totalidad por referencia; en la especificación, al mismo grado como si cada publicación individual, patente o solicitud de patentje fuera específicamente e individualmente indicada que es incorporada i : en la presente por referencia. Además, la- ¡ cita o I ·. identificación de cualquier referencia en esta sol'icitud no I debe ser considerada como una admisión de que tal referencia está disponible como la técnica previa para la! presente invención. Al grado que los encabezados de sección se ! utilizan, ellos no se deben considerar como necesariamente i limitantes . ! 1

Claims (16)

REIVINDICACIO ES \

1. Un . método para cultivar células adhererites , de un tejido de placenta o adiposo, el método caracterizado porque comprende cultivar las células adherentes del tejido de placenta o adiposo bajo condiciones de ! cultivo tridimensionales (3D) que permiten la expansión celular, las condiciones que comprenden perfusión, en donde la perfusión se ajusta de acuerdo con la concentración de glucosa del medio de cultivo. " ¡ I

2. El método de conformidad con la reivindicación i 1, caracterizado porque el medio de cultivo se cambia en la concentración de glucosa de aproximadamente 550 mg/L!.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las condiciones de cultivo 3D i ; comprenden una de : ¡ (i) cultivar la población de células adherentes :en un biorreactor que tiene un lecho empacado de cilinjdro ': y el medio de cultivo se fluye a través del lecho empacad'p; (ii) cultivar la población de células , adherentes en una i fase de crecimiento que mantiene el volumen de traba|jo de por ! lo menos aproximadamente 1,500 mi; ! (iii) sembrar las células en una concentración de sembrado de por lo menos aproximadamente O.lxl'O6 células/ml; o i ! (iv) cultivar la población de células adherentes en el I 136 ¡ ; I : biorreactor que tiene un portador de por lo menos ¡30 gramos i de peso. ¡

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las condiciones de cultivo 3¡D: (a) comprenden un biorreactor 3D; y/o ! j (b) comprenden un material adherente seleccionado del grupo que consiste de vidrio, ¡plástico, poliéster y polipropileno, poliestireno, dextrano y colágeno; y/o ; (c) se efectúan durante por lo menos 3 días.

5. El método de conformidad con la reivindicación i 1, caracterizado porque el cultivo de las células se efectúa hasta que por lo menos 10% de las células están prol'iferando . i

6. Una población de células, caracterizada porque se genera de conformidad con cualquiera i de las reivindicaciones 1-5. i

7. La población de células de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque por lo menos 10% de las células adherentes están en una fase proliferativa . I

8. La población de células de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque las células adherentes son capaces de suprimir una reacción inmune. ¡

9. La población de células de conformidad con la i reivindicación 6, caracterizada porque las células adherentes comprenden: i (a) una expresión marcadora positiva seleccionada del grupo que consiste de CD73, CD90, CD29, CD105 y D7-fib; y/o ! (b) una expresión marcadora negativa seleccionada del grupo que consiste de CDllb, CD3 , HLA-DR, CD14, CD19, CD45, CD31, CD200 y KDR. !

10. La población de células de conformidad con la ¡ reivindicación 6, caracterizada, porque las células adherentes comprenden un perfil de expresión génica esencialmente como es descrito en la presente.

11. La población de células de conformidad con la i reivindicación 6, caracterizada porque las | células I adherentes: j (a) son menos comprometidas a un! linaje osteogénico como es comparado con lds células adherentes de la médula ósea cultivadas y dejadas diferenciar bajo las' mismas' condiciones; o ; I I (b) son menos comprometidas a un linaje adipogénico como es comparado con las células adherentes de la médula ósea cultivadas y I dejadas . diferenciar bajo lasj mismas condiciones. | I

12. ,Una población de células, caracterizada aporque ! comprende un perfil de expresión génica esencialmente como es cáncer, pre-cáncer, cáncer de hueso, osteosarcoma, metástasis de hueso, fractura de hueso, herida por¦ quemadura, defecto de cartílago articular, sanación de herida, herida ¡profunda,

I 1 sanación de herida retardada, sanación de úlcera retardada, quiste de hueso subcóndrico, osteoporosis , osteoartritis , hueso degenerado, daño de cartílago, defecto de ; cartílago articular, tendones lesionados, enfermedad autdinmune y

I enfermedad inflamatoria. j

15. La población de células de conformidad con la i reivindicación 13, caracterizada porque la condición se i selecciona del' grupo que consiste de enfermedad de j intestino inflamatorio (IBD) y enfermedad de Crohn. ¡ i

16. Las células adherentes de conformidad con las reivindicaciones 1-12, caracterizadas porque es paira el uso para inducir tolerancia y/o inmunosupresion en un ¡sujeto en necesidad del mismo. ' ¡