MX2008012085A - Metodos para expansion de celulas y usos de celulas y medios acondicionados producidos de esta manera para terapia. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un método de expansión de células. El método que comprende cultivar células adherentes de la placenta o tejido adiposo bajo condiciones de cultivo tridimensionales, que soportan la expansión de células.

Description

MÉTODOS PARA EXPANSIÓN DE CÉLULAS Y USOS DE CÉLULAS Y MEDIOS ACONDICIONADOS PRODUCIDOS DE ESTA MANERA PARA TERAPIA CAMPO Y ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a métodos para expansión de células, poblaciones de células producidas de esta manera y usos de las mismas. Específicamente la presente invención se relaciona a métodos para expansión de células adherentes de la placenta o tejidos adiposos (junto con todo el PCT) y usos terapéuticos de las mismas, tales como para el transplante de células madre hematopoyéticas. En el mundo médico en desarrollo existe una necesidad creciente para células madre adultas en cantidades grandes para el propósito de injerto de células y diseño de tejido. Además, la terapia de células madre adultas está continuamente en desarrollo para tratar y curar varias condiciones tales como desórdenes hematopoyéticos , enfermedad del corazón, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, apoplejía, quemaduras, distrofia muscular, desórdenes autoinmunes, diabetes y artritis. Las células madre hematopoyéticas (HSCs) son células precursoras, que dan origen a todos los tipos de células sanguíneas de los linajes tanto mieloide como linfoide. El injerto e iniciación de hematopoyesis mediante las HSCs transplantadas depende de aquella habilidad de las células para albergarse y proliferar dentro del BM recipiente . Es ampliamente aceptado que las células madre están intimamente asociadas in vivo con nichos discretos en la médula, la cual proporciona señales moleculares que colectivamente median su diferenciación y auto-renovación, por la via de contactos de célula-célula o interacciones de intervalo corto. Estos nichos son parte del "microambiente inductivo hematopoyético" (HIM) , compuesto de células de médula, es decir macrófagos, fibroblastos, adipocitos y células endoteliales . Las células de Médula mantienen la integridad funcional del HIM al proporcionar proteínas de matriz extra celular (ECM) y componentes de membrana de basamento que facilitan el contacto de célula-célula. También proporcionan varias citoquinas solubles o residentes necesarias para la diferenciación y proliferación de células hematopoyéticas controlada. Las interacciones entre las HSC y el estroma son requeridas para preservar la viabilidad de las HSCs y prevenir su diferenciación. Después del transplante de las HSCs, las HSCs transplantadas deben albergarse en el microambiente de la médula ósea (BM) y alojarse en los nichos apropiados antes de proliferar y diferenciar. Durante el proceso de albergamiento, las HSCs transplantadas dejan la corriente sanguínea y transmigran al seguir un gradiente de quimioquinas a través de la barrera de célula endotelial de la BM para alcanzar los nichos dedicados. Las HSCs donadoras luego deben albergarse en los nichos hematopoyéticos donde encuentran un microambiente más favorable para la división de HSC, y donde, un continuo, contacto físico o químico puede ser establecido entre las HSCs y las células mesenquimales , la ECM y los factores de crecimiento secretados. Todos estos procesos involucran un arreglo de complejo de moléculas, tales como citoquinas, quimioquinas , hormonas, esteroides, proteínas de matriz extra celular, factores de crecimiento, proteínas de interacción de célula a célula, adhesión proteínas y proteínas de matriz. El número total de células injertadas en los nichos dedicados a la BM subyacentes al éxito de transplante de HSCs. Para lograr injertar, las HSCs donadoras que son transplantadas en la circulación sanguínea deben alojarse en la médula del recipiente donde generan focos de hematopoyesis funcionales . El número de estos focos se incluye como el producto de HSCs transfusionadas multiplicadas por su eficiencia de injerto. Uno de los mayores problemas involucrados con el transplante de HSC es la baja proporción de supervivencia de estas células en el sistema aceptor. Es bien documentado que las HSC transplantadas intravenosamente son aclaradas de la circulación y visualizadas en la BM dentro de minutos después de su transfusión. Tres a cinco horas después del transplante de las HSCs, nada de las células donadoras son detectadas en la sangre periférica de los recipientes [Askenasy y colaboradores, 2002 Transplanted hematopoietic cells seed in clusters in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20:301-10]. La vasta mayoría de las células transplantadas se destruyen brevemente después de que son transíusionadas . Consecuentemente, la colonización de la medula recipiente es de baja eficiencia y solamente 1-5% de las células transfusionadas son detectadas en el post transplante 2-3 días de la MB recipiente [Kerre y colaboradores, 2001 2001 Both CD34+38+ and CD34+38-cells home specifically to the bone marrow of NOD/LtSZ scid/scid mice but show different kinetics in expansión. J Immunol. 167:3692-8; Jetmore y colaboradores, 2002 2002 Homing efficiency, cell cycle kinetics, and survival of quiescent and cycling human CD34 (+) cells transplanted into conditioned NOD/SCID recipients. Blood. 99: 1585-93] . Las Células Estromales Mesenquimales (MSCs) son una población heterogénea de células, capaces de diferenciar en diferentes tipos de células maduras mesenquimales. La diferenciación de estas células a las células endoteliales reticulares, fibroblastos, adipocitos y células precursoras osteogénicas , dependiendo de las influencias de varios factores bioactivos. Es conocido en la técnica el uso de MSCs para el soporte de injerto de HSC. Varias publicaciones han demostrado más altas eficiencias de injerto de HSC cuando son co-transplantadas con células madre mesenquimales [Gurevitch y colaboradores, 1999 1999 Transplantation of allogeneic or xenogeneic bone marrow within the donor stromal microenvironment . Transplantation. 68:1362-8; Fan y colaboradores, 2001 2001 Successful allogeneic bone marrow transplantation (BMT) by injection of bone marrow cells via portal vein: stromal cells as BMT-facilitat ing cells. [Stem Cells. 19:144-50]. También fue demostrado que el co-transplante de células madre mesenquimales humanas en un modelo de injerto de humano-oveja, dando por resultado el aumento de injerto a largo plazo de la B quimérica de HSC humana en los animales [Almeida-Porada y colaboradores, 2000] Co-transplantation of human stromal cell progenitors into preimmune fetal sheep results in early appearance of human donor cells in the circulation and boosts cell levéis in bone marrow at later time points after transplantation [Blood. 95:3620-7]. Se encontró que la inyección simultánea de HSC y hematopoyesis acelerada de células madre mesenquimales [Zhang y colaboradores, 2004. Stem Cells 22:1256-62]. Recientemente, estos descubrimientos fueron extendidos a un modelo animal más cercano - el mono Rhesus. Cuando HSC haplo-idénticas y las células madre mesenquimales fueron co-transplantadas, se demostró HSC de injerto facilitado [Liu y colaboradores, 2005 Zhong ua Xue Ye Xue Za Zhi. 26:385-8]. El uso de células madre mesenquimales para promover el injerto de HSC en sujetos humanos también fue recientemente reportado [Koc ON, J Clin Oncol. 2000; 18:307-316; Lazarus HM, Biol Blood Marrow Transplant. Mayo del 2005; 11 ( 5 ) : 389-98 ] . Aparentemente la contribución de MSCs al injerto hematopoyético se encuentra en la producción de citoquinas soportadas con HSC que ayudan a mediar y balancear el albergamiento , la auto-renovación y los potenciales comprometidos de las HSCs transplantadas , en reconstruir el microambiente hematopoyético dañado necesario para el albergamiento y proliferación de las HSCs y en la inhibición de las células T derivadas donadoras, las cuales pueden causar Enfermedad de Injerto contra Hospedero (GvHD) , [Charbord P. y Moore, K. , Ann . N. Y. Acad. Sci 1044:159-167 (2005); Patentes Norteamericanas Nos. 6,010,696; 6555374]. Por ejemplo, en un estudio mediante Maitra, [Maitra B, y colaboradores, Bone Marrow Transplant. 33 ( 6) : 597-604. (2004)], se encontraron células madre mesenquimales humanas para soportar células madre hematopoyéticos donadores no relacionados y activación de células T suprimidas en modelo de ratones NOD-SCID, mostrando que las MSCs derivadas de la médula ósea humanas no relacionadas, pueden mejorar el resultado del transplante alogénico. Un mayor obstáculo en utilizar las MSCs es la dificultad de aislar grandes cantidades de poblaciones que ocurren normalmente de estas células, que es difícil técnicamente y costosamente, debido en parte, a la cantidad limitada de células. La fuente mucho más obvia de MSCs es la médula ósea, pero la incomodidad significante involucrada en obtener aspirados de médula ósea y el riesgo de la biopsia sirven como desventajas de estos métodos. La creencia ampliamente mantiene que el embrión y el feto humano constituyen vida independiente haciendo el embrión humano una fuente problemática de las células madre, adicionar un aspecto religioso y ético a las ya existentes dificultades logísticas . Las fuentes alternativas encontradas para cosechar células madre, han sido intentadas recientemente. Tales Fuentes alternativas son por ejemplo tejido adiposo, folículos pilosos, testículos, mucosa olfatoria humana, saco vitelino embriónico, placenta, piel de adolescente y sangre (por ejemplo, sangre del cordón umbilical y aun sangre menstrual) . Sin embargo, cosechar células madre de las fuentes alternativas en cantidades adecuadas para propósitos terapéuticos e investigación es aun limitado y generalmente laborioso, que involucra, por ejemplo, cosechar células o tejidos de un sujeto o paciente donador, cultivar y/o propagación de células in vitro, disección, etc. La placenta es considerada ser una de las fuentes mucho más accesibles de células madre que no involucran cualquier incomodidad o restricciones éticas. Las MCSs derivadas de la placenta se encontraron que tienen propiedades similares como MSC derivadas de BM. Existe plástico-adherente, se expresan marcadores de membrana CD105, CD73 y CD90, y carecen de la expresión de moléculas de fuente CD45, CD34, CD14, CD19 y HLA-DR. Sin embargo, distintas MSCs derivadas de MB, las MSCs-(PD) derivadas de la placenta tratadas con interferona-? muy mínimamente regulan hacia arriba HLA-DR. Por otro parte, las células PD-MSCs exhiben propiedades inmunosupresoras que son aumentadas en la presencia de interferona-?. (Chang CJ, Yen L, Chen YC, Chien CC, Huang HI, Bai CH, Yen BL. Placenta-derived Multipotent Cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon- gamma. Stem Cells. Noviembre del 2006;24 (11) :2466-77. Además de las PD-MSCs marcadores de MSC que exhiben marcadores de superficie ESC únicos de SSEA-4, TRA-1-61 y TRA-1-80, que sugieren que estos pueden ser células muy primitivas. (Yen BL, Huang HI, Chien CC, Jui HY, Ko BS, Yao M, Shun CT, Yen ML, Lee MC, Chen YC. Isolation of multipotent cells from human term placenta. Stem Cells. 2005 ; 23 ( 1 ) : 3- 9 ) . Por otro parte, las PD-MSCs de (origen Fetal) , pero no MSC derivadas de la BM son positivas para el antígeno-G de leucocito humano intracelular (HLA) . ? (Chang CJ, Yen ML, Chen YC, Chien CC, Huang HI, Bai CH, Yen BL. Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma . Stem Cells. Noviembre del 2006 ; 2 ( 11 ) : 2 66-77 ) . Estudios han mostrado que el potencial de expansión de PD-MSCs fue significantemente más alto que aquellos de MSCs derivadas de la BM adultas (Yen BL, Huang HI, Chien CC, Jui HY, Ko BS, Yao M, Shun CT, Yen ML, Lee MC, Chen YC . Isolation of Multipotent cells from Human Term Placenta. Stem Cells. 2005; 23 (1) : 3-9; MJ.S. de Groot-Swings , Frans HJ. Claas, Willem E. Fibbe y Humphrey H.H. Pieternella S. in Anker, Sicco A. Scherjon, Carin Kleij burg- van der Keur, Godelieve. Placenta Isolation of Mesenchymal Stem Cells of Fetal or Maternal Origin from Human. Stem Cells, 2004;22; 1338-1345.) Además las células adherentes derivadas de la placenta pueden diferenciar a los osteoblastos , adipocitos y condroblastos . Las MSCs derivadas de la BM similares, las MSCs derivadas de la placenta se encontraron para suprimir la proliferación de linfocito de sangre del cordón umbilical (UCB) sugiriendo que el transplante combinado de HSC y (PD)-MSCs derivadas de la placenta puede reducir la enfermedad de injerto contra hospedero potencial (GvHD) en recipientes [Li CD y colaboradores, Cell Res. Julio; 15 ( ) : 539-47 (2005)] y puede aumentar el soporte hematopouético [Zhang Yi y colaboradores, Chínese Medical Journal 117 ( 6) : 882-887 (2004)]. El uso de la placenta como una fuente para células epiteliales amnióticas se enseña por ejemplo en el Documento WO 00/73421, pero la obtención de estas células es aun laboriosa y el rendimiento de las MSCs es muy bajo. Otra manera de resolver el problema de la cantidad limitada de las MSCs es la expansión ex-vivo de estas células utilizando diferentes condiciones de cultivos [por ejemplo las Patentes Norteamericanas Nos. 6,326,198; 6030836; 6555374; 6,335,195; 6,338,942]. Sin embargo, el desventaja de tales métodos permanece en el consume de tiempo, selección especifica y procedimientos de aislamiento que ellos requieren, la interpretación de estos métodos costosamente y fastidiosos . El cultivo bidimensional (3D) de células se encontró en varios estudios que son más efectivos en rendimiento [Ma T y colaboradores, Biotechnology Progress. Biotechnol Prog 15:715-24 (1999); Yubing Xie, Tissue Engineering 7(5) : 585-598 (2001)]. El uso de procedimientos de cultivo 3D que imita el ambiente natural de las MSCs está basado en sembrar estas células en un biorreactor de perfusión que contiene espumas Poliactivas [Wendt, D. y colaboradores, Biotechnol Bioeng 84:205-214, (2003)] estructuras porosas de ácido poli-L-láctico tubulares (PLLA) en un biorreactor de perfusión de flujo Radial [Kitagawa y colaboradores, Biotechnology and Bioengineering 93 (5) : 947-954 (2006)] y un biorreactor de flujo tapón para el crecimiento y expansión de células madre hematopoyéticos (Patente Norteamericana No. 6,911,201). Una estructura tri-dimensional , que une células estromales, fue sugerida en la Patente Norteamericana No. 6,022,743 y el colágeno de esponja fue sugerido como una matriz 3D en Hosseinkhani , H y colaboradores, [Tissue Engineering 11 ( 9-10 ) : 1 76-1488 (2005)]. Sin embargo, el uso de MSCs, crecidas en estas condiciones para el injerto in vivo de soporte de las HSCs siguiendo el transplante de HSC nunca han sido sugeridas en cualquiera de estos estudios. También, la optimización en el consumo de tiempo de varias condiciones por ejemplo, condiciones de perfusión o varias técnicas de aislamiento para tipos de célula especifica se requirieron . El uso de una placenta de Post-parto prefusionada como un reactor 3D para cultivar MSCs fue sugerida en la Patente Norteamericana No. 7045148 y las Solicitudes de Patentes Norteamericanas Nos. 20020123141 20030032179 y 2005011871. Sin embargo, este procedimiento es limitado por hasta 24 horas después de que la placenta es aislada y se involucra la perfusión, por lo tanto el crecimiento de masa de las células y su mantenimiento para prolongar los periodos de tiempo no es posible. De esta manera existe una necesidad ampliamente reconocida por, y seria altamente ventajoso tener, métodos de expansión de células novedosos y usos de células y medios acondicionados producidos de esta manera para terapia y que estén libres de las limitaciones anteriores. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona un método para expansión de células, el método que comprende cultivar células adherentes de la placenta o tejido adiposo bajo condiciones de cultivo tri-dimensionales , que soportan la expansión de células. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para producir un medio acondicionado, el método que comprende: cultivar células adherentes de una placenta o tejido adiposo en condiciones de cultivo tridimensionales que permite la expansión de células; y recolectar un medio acondicionado de las células adherentes expandidas, para de esta manera producir el medio acondicionado . De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención se proporciona una población de células generadas de acuerdo con el método como en lo anterior. De acuerdo con aun otro aspecto de la presente invención se proporciona una población aislada de células que comprenden células adherentes de la placenta o tejido adiposo, en donde las células adherentes secretan un nivel más alto de por lo menos un factor seleccionado del grupo que consiste de SCF, IL-6 y Flt-3 que aquel secretado por células adherentes de la placenta o tejido adiposo crecido en un cultivo 2D. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una población aislada de células que comprenden células adherentes de la placenta o tejido adiposo, en donde las células adherentes expresan un nivel más alto de por lo menos una proteina seleccionada del grupo que consiste de la familia de histona ?2? (H2AF) , Aldehido deshidrogenasa X (ALDH X) , factor 2 de alargamiento de traducción eucariótica (EEEF2) , reticulocalbina 3, dominio de enlace de calcio de EF-manual (RCN2) y músculo liso básico 1 de calponina (CNN1) que aquella expresada por células adherentes de la placenta o tejido adiposo crecidas en un cultivo 2D. De acuerdo con todavía otro aspecto adicional de la presente invención se proporciona una población aislada de células que comprenden células adherentes de la placenta o tejido adiposo, en donde las células adherentes expresan un nivel más bajo de expresión de por lo menos una proteína seleccionada del grupo que consiste de ribonucleoproteína Hl nuclear heterogénea (Hnrphl), precursor 2 de isoforma de antígeno CD44, isoforma 2 de 3 fosfoadenosina 5 fosfosulfato sintasa (Papss2) y proteína L7a ribosomal (rpL7a) que aquella expresada por las células adherentes de la placenta o tejido adiposo crecidas en un cultivo 2D. De acuerdo con aun un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una población aislada de células que comprenden células adherentes de la placenta o tejido adiposo, en donde las células adherentes se caracterizan por una actividad inmunosupresora más alta que aquellas de las células adherentes de la placenta o tejido adiposo crecidas en un cultivo 2D. De acuerdo con características adicionales en las modalidades preferidas de la invención descritas enseguida la actividad inmunosupresora comprende reducción en la proliferación de célula T. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende, como un ingrediente activo, la población de células generadas de acuerdo con el método como lo anterior. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende, como un ingrediente activo, el medio acondicionado producido de acuerdo con el método como lo anterior. De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende, como un ingrediente activo, la población aislada de células de acuerdo con lo anterior.

De acuerdo con aun un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método para tratar una condición la cual puede beneficiarse del transplante de célula estromal en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de las células adherentes de un tejido seleccionado del grupo que consiste de placenta y tejido adiposo, para de esta manera tratar la condición la cual puede beneficiarse del transplante de células madre en el sujeto. De acuerdo con aun un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método para tratar una condición la cual puede beneficiarse del transplante de célula estromal en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un medio acondicionado de células adherentes derivadas de un tejido seleccionado del grupo que consiste de la placenta y tejido adiposo, para de esta manera tratar la condición la cual puede beneficiarse del transplante de células madre en el sujeto. De acuerdo con aun un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método para reducir una respuesta inmune en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de la población aislada de células de las reivindicaciones 3, 4, 5, 6 o 7, para reducir la respuesta inmune en el sujeto. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas el sujeto se trata con terapia celular. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas el método además comprende administrar células madre. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas las células madre comprenden células madre hematopoyéticos . De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas las células se administran concomitantemente con el medio acondicionado o células adherentes. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas las células se administran después de la administración del medio acondicionado o células adherentes. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas las células adherentes se obtienen de un cultivo tridimensional. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas las células adherentes se obtienen de un cultivo bidimensional .

De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas la condición se selecciona del grupo que consiste de deficiencia de célula madre, enfermedad del corazón, enfermedad de Parkinson, cáncer, enfermedad de Alzheimer, apoplejía, quemaduras, pérdida de tejido, pérdida de sangre, anemia, desórdenes autoinmunes, diabetes, artritis, Esclerosis Múltiple, enfermedad de injerto contra hospedero (GvHD) , desórdenes neurodegenerativos, encefalomielitis autoinmune (EAE) , lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis reumatoide, esclerosis sistémica, síndrome de Sjorgen, esclerosis múltiple (MS) , Myasthenia Grave (MG) , Síndrome de Guillain-Barre (GBS), Tiroiditis de Hashimoto (HT) , Enfermedad de Graves, Diabetes Melitus dependiente de Insulina (IDDM) y Enfermedad de Intestino Inflamatorio. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas el cultivo tridimensional comprende un biorreactor 3D. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas el biorreactor se selecciona del grupo que consiste de un biorreactor de flujo tapón, un biorreactor de tanque agitado continuo y un biorreactor de lecho estacionario. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas el cultivo de las células se efectúa bajo un flujo continuo de un medio de cultivo . De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas el cultivo tridimensional comprende un material adherente seleccionado del grupo que consiste de un poliéster, un polialquileno, un polifluorocloroetileno, un cloruro de polivinilo, un poliestireno , una polisulfona, un acetato de celulosa, una fibra de vidrio, una partícula de cerámica, un matrigel, un componente de matriz extracelular , un colágeno, un ácido láctico poli L y una fibra de metal inerte. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas el cultivo se efectúa durante por lo menos 3 días. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas el cultivo se efectúa durante por lo menos 3 días. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas el cultivo se efectúa hasta que las células adherentes alcanzan por lo menos 60% de confluencia . De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas la condición puede beneficiarse de la facilitación de injerto de célula madre hematopoyético .

De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas las células adherentes comprenden un arreglo de expresión de marcador positivo seleccionado del grupo que consiste de CD73, CD90, CD29 y CD105. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas las células adherentes comprenden un arreglo de expresión de marcador negativo seleccionado del grupo que consiste de CD45, CD80, HLA-DR, CDllb, CD14, CD19, CD34 y CD79. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas las células adherentes secretan un nivel más alto de por lo menos un factor seleccionado del grupo que consiste de SCF, Flt-3 y IL-6 más alto que aquellas secretadas por células adherentes de la placenta o tejido adiposo crecidas en un cultivo 2D. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas las células adherentes expresan un nivel más alto de por lo menos una proteína seleccionada del grupo que consiste de la familia histona H2A (H2AF) , Aldehido deshidrogenasa X (ALDH X) , factor 2 de alargamiento de traducción eucariótico (EEEF2), reticulocalbina 3, dominio de enlace de calcio EF-manual (RCN2) y músculo liso básico 1 de calponina (CNN1) que aquella secretada por las células adherentes de la placenta o tejido adiposo crecido en un cultivo 2D. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas las células adherentes expresan un nivel más bajo de expresión de por lo menos una proteína seleccionada del grupo que consiste de ribonucleoproteína nuclear heterogénea Hl (Hnrphl), precursor 2 de isoforma de antígeno CD44, isoforma 2 de 3 fosfoadenosina 5 fosfosulfato sintasa (Papss2) y proteína L7a ribosomal (rpL7a) que aquella secretada por las células adherentes de la placenta o tejido adiposo crecido en un cultivo 2D. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas las células adherentes o medio se caracterizan por una actividad inmunosupresora más alta que aquella de las células adherentes de la placenta o tejido adiposo crecidas en un cultivo 2D. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas la actividad inmunosupresora comprende reducción en la proliferación de la célula T. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas las células comprenden células que tienen un fenotipo de célula madre estromal. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas el fenotipo de célula madre estromal comprende actividad de supresión de célula T. De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas el fenotipo de célula madre estromal comprende actividad soportada de célula madre hematopoyét ico . De acuerdo con aun características adicionales en las modalidades preferidas descritas el uso de la población de células descritas en lo anterior es para la manufactura de un medicamento identificado para el transplante. La presente invención exitosamente se dirige a la deficiencia de las configuraciones actualmente conocidas al proporcionar métodos novedosos para expansión de células y usos de células y medios acondicionados producidos de esta manera para terapia. A menos de que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es comúnmente entendido por uno de habilidad ordinaria en la técnica al cual esta invención pertenece. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales adecuados son descritos enseguida. En caso de conflicto, la especificación de patente, que incluye definiciones, lo controlará. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solamente y no se proponen ser limitativos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La invención se describe en la presente, a manera de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos acompañantes. Con referencia especifica ahora a los dibujos en detalle, se acentúa que los detalles particulares mostrados son a manera de ejemplo y para propósitos de discusión ilustrativa de las modalidades preferidas de la presente invención solamente, y se presentan con el fin de proporcionar lo que se cree que es la descripción más útil y fácilmente entendida de los principios y aspectos conceptuales de la invención. En este respecto, ningún intento se hace para mostrar detalles estructurales de la invención en más detalle que lo que es necesario para un entendimiento fundamental de la invención, la descripción tomada con los dibujos que hace aparente para aquellos expertos en la técnica en como las diversas formas de la invención se pueden incorporar en la práctica. En los dibujos: Las FIGs. la-g representan el microambiente similar a hueso creado en el sistema de biorreactor que contiene portadores 3-D. Las Figuras la-b son micrografias electrónicas electrón que representan la comparación del hueso natural (Figura la) y la estructura del portador 3D PluriX™ 7 días después de sembrar Células Estromales Adherentes (3D-ASC), imitando el micro-ambiente de hueso (Figura Ib). Las Figuras lc-f son micrografias electrónicas que representan la matriz 3D PluriX™ sembrada con 3D-ASC, producida de médula ósea, 20 días (Figuras lc-d, aumentado X 150 y 250 respectivamente) y 40 dias (Figuras le-f, aumentado X 350 y 500 respectivamente) después del sembrado. La Figura lg es un diagrama del biorreactor de flujo tapón 3D Plurix con partes separadas definidas por números: Depósito de medio de cultivo (1), suministro de mezcla de gas (2), filtro (3), punto de inyección (4), columna en la cual los portadores 3D se colocan (5) monitor de flujo (6), válvula de flujo (6a), contenedor separado (7), analizadores de crecimiento celular (8); bomba peristáltica (9), punto de muestreo (10), electrodo de medición de 02 disuelto (11), electrodo de medición de pH (12), sistema de control (13), medio de crecimiento fresco (14), medio de crecimiento utilizado (15). La FIG. 2 es una gráfica que representa diferentes lotes de producción de células estromales adherentes (3D-ASC; Lotes 5-8) originados de la placenta, crecidas en condiciones de crecimiento 3D dentro de los sistemas de biorreactor. Las ASCs (2 X 106) se sembraron en el biorreactor a una densidad de 10000 - 15000 células/un portador. Después de un cultivo de 12 dias las 3 D-ASCs alcanzaron una densidad de entre 150,000-250,000 células/portador o 22.5-37.5 X 106 en un biorreactor que contiene 150 portadores.

Las FIGs . 3a-b son gráficas de barrass que representan diferencia en los niveles de expresión de los marcadores de membrana expresados en la placenta derivados de 3D-ASC (púrpura oscuro) como es comparado con los marcadores de membrana en células de la placenta cultivadas en condiciones de cultivo 2D convencionales (púrpura claro) . Las células adherentes se cultivaron durante 4-6 semanas en frasquitos (2D) o durante 2-3 semanas en el sistema de biorreactor, sobre portadores de poliestireno (3D). Después de cosechar de ya sea los frasquitos o portadores, las células se incubaron y se enlazaron a un panel de anticuerpos monoclonales (MAb) , los cuales reconocen los marcadores de membrana característicos de MSCs (Figura 3a) o células hematopoyéticas (Figura 3b). Notar que la expresión significantemente más alta de marcadores de membrana MSC en células cultivadas 2D como se muestra por marcadores de membrana CD90, CD105, CD73 y CD29, comparados con marcadores de membrana MSC expresados en células adherentes cultivadas 3D, especialmente CD105 que mostró 56% de expresión en células cultivadas 3D contra 87% en las células cultivadas 2D (Figura 3a) . ASCs de ambos cultivos 2D como 3D, no expresaron cualquiera de los marcadores de membrana hematopoyéticos ( Figura 3b) . Las FIGs. 4a-d son gráficas de barras que representan una comparación de niveles de proteina en ASCs producidas del cultivo de la placenta bajo Condiciones 2D y 3D o medios acondicionados del mismo. Las Figuras 4a-c representan niveles de ligando Flt-3 (Figura 4a), IL-6 (Figura 4b) y SCF (Figura 4c) en pg/ml, normalizado por 1 X 106 células/ml, como es analizado mediante ELISA, en el medio acondicionado de ASCs cultivado 2D y 3D. Los resultados representan uno de tres experimentos independientes. La Figura 4d muestra los niveles de expresión de diferentes proteínas celulares, como es analizado mediante la espectrometría de masas con muestras de proteína marcadas con reactivos iTRAQ comparadas entre las mismas. Las muestras de proteína se tomaron de ASCs cultivadas bajo condiciones 2D (barras blancas) y 3D (barra grises) . La figura representa uno de dos experimentos de replica. Notar la diferencia en el nivel de expresión de algunas de las proteínas en células y medios acondicionados de condiciones de cultivo 2D y 3D. Las FIGs . 5a-d son micrografías que representan la capacidad de diferenciación in vitro de la placenta derivada de 3D-ASC a osteoblastos . La placenta humana derivada de ASC se cultivaron en un medio de inducción osteogénico (D EM que contiene FCS al 10%, dexametasona 100 nM, 2-fosfato de ácido ascórbico 0.05 mM, B-glicerofosfato 10 mM) durante un período de 3 semanas. Las Figuras 5a-b muestran células que expresan matriz calcificada, como es indicado por el manchado de Rojo S Alizzarin. Las Figuras 5c-d muestran células de control, las cuales no se trataron con medio de inducción osteogénico y mantuvieron un fenotipo similar a fibroblasto y no demuestran minerali zación . La FIG. 6 es una gráfica que representa el porcentaje de células CD45+ humanas detectadas en la médula ósea (BM) de ratones NOD-SCID, tratados con quimioterapia (inyecciones intraperitoneales de busulfan de 25 mg/kg durante dos semanas consecutivas) 3.5 semanas después del transplante. Las células CD34+ (100,000) purificadas de las células derivadas de sangre del cordón mononuclear, se transplantaron solas (5 ratones, a) o se co-transplantaron con 0.5 X 106 células adherentes derivadas de la placenta cultivadas en condiciones 2D (2D-ASC; 2 ratones, b) , o las células adherentes derivadas de la placenta cultivadas en condiciones 3D (3D-ASC), en el biorreactor pluriX™ (5 ratones, c) . La BM luego se recolectó de los fémures y tibias de los ratones. Las células humanas en la BM se detectaron mediante la citometria de flujo. El porcentaje de CD45 que expresan células humanas se determinó al incubar células con CD45-FITC anti-humano. Notar que el porcentaje más alto de células humanas (hCD45+) en la médula ósea de los ratones co-transplantados con 2D-ASC (b) asi como con 3D-ASC (c) en comparación con el porcentaje de células humanas en los ratones tratados con HSCs solas (a) . El injerto más alto observado en los ratones tratados con células cultivadas 3D- ASC en comparación con los ratones tratados con células cultivadas 2D-ASC indican una ventaja terapéutica más alta única a las ASCs cultivadas 3D. Las FIGs. 7a-b son análisis de FACS de células CD45+ de injerto humanas en ratones transplantados con células CD34 + solamente (Figura 7a) en comparación con células CD34+ junto con ASCs derivadas del tejido adiposo. (Figura 7b). Notar que el porcentaje significantemente más alto de la población hematopoyética humana (hCD45+) (7a -29%) en un ratón co-transplantado con ASC derivadas del tejido adiposo en comparación con un ratón tratado con CD34+ humanas solas (7b -12%) . La FIG. 8 es una gráfica de barras que representa una reacción de linfocito mezclada conducida entre las células mononucleares de sangre del cordón umbilical humana (CB) , y cantidades iguales de células de sangre de cordón umbilical irradiadas (3000 Rad) (iCB) , monocitos derivados de la sangre periférica humana (PBMC), ASCs de la placenta cultivados 2D (2D) o cultivados 3D (3D) o una combinación de PBMC y ASCs de la placenta cultivados 2D y 3D (PBMC+2D y PBMC+3D) . El tamaño de la población de célula CB se representa por la captación de 3H-timidina (medida en CPM) la cual se midió durante al menos 18 horas del cultivo. La elevación en la proliferación celular de CB estimulada indica una respuesta inmune de un nivel más alto. Notar que el nivel más bajo de la respuesta inmune exhibida por células incubadas con células adherentes, y, en particular, la reducción de la respuesta inmune de CB a PBMCs cuando son coincubadas con células adherentes. Tres replicados se hicieron de cada reacción. DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención es de métodos novedosos para expansión de células y usos de células y medios acondicionados producidos de esta manera, para la terapia relacionada con células madre, el injerto de células madre y soporte de HSC. Los principios y operación de la presente invención pueden ser mejor entendidos con referencia a los dibujos y descripciones acompañantes. Antes de explicar por lo menos una modalidad de la invención en detalle, se va a entender que la invención no es limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificada por los Ejemplos. La invención es capaz de otras modalidades o de ser practicada o llevada a cabo de varias maneras. También, se va a entender que la fraseología y terminología empleada en la presente es para el propósito de descripción y no debe ser considerada como limitativa. En el mundo médico en desarrollo, existe una necesidad en crecimiento por células madre, y más específicamente por las células madre estromales (también llamadas "células madre mesenquimales" ) , para propósitos clínicos y de investigación. La MSCs se utilizan para el soporte de transplante e injerto de HSC y también para curar un número en crecimiento de condiciones por ejemplo, enfermedades del corazón, deficiencias de la BM, enfermedades relacionadas neuronales y condiciones que requieren transplante de órgano o tejido. Los obstáculos en utilizar células madre se encuentra en la dificultad técnica de aislar grandes cantidades de poblaciones que ocurren normalmente de células madre o progenitoras , debido a que la cantidad limitada de estas células en la mayoría de los tejidos, la incomodidad y riesgo involucrado en los procedimientos para obtener células madre y la pérdida acompañante de células B de la memoria y células madre hematopoyéticas con procedimientos de cosecha presentes. Obtener células del embrión humano adiciona un aspecto religioso y ético a las ya existentes dificultadas técnicas . Las fuentes alternativas para las células madre derivadas de la médula ósea incluyen tejidos adiposos y placenta. Sin embargo, actualmente no existen métodos para la expansión eficiente de células madre de tales tejidos. Mientras que la reducción de la presente invención a la práctica, los presentes inventores han descubierto que las células adherentes de la placenta o tejido adiposo pueden ser eficientemente propagadas en condiciones de cultivo 3D. De manera sorprendente, los presentes inventores descubrieron que tales célula comprenden propiedades funcionales que son similares a aquellas de MSCs y por lo tanto estas células y los medios acondicionados producidos de los mismos, se pueden utilizar para propósitos terapéuticos tales como transplante, regeneración de tejido y soporte HSC in vivo. Como se ilustra en la presente enseguida y en la sección de Ejemplos que siguen, los presentes inventores fueron capaces de expandir células adherentes derivadas del tejido adiposo y la placenta que comprenden propiedades de células madre estromales en colocación 3D. Las células expandidas por consiguiente se encontraron viables, después de la crio-preservación, como es evidenciado por ensayos de adherencia y re-población (ver Ejemplo 1). El análisis de citrometria de flujo de células adherentes derivadas de la placenta descubren un patrón de expresión de marcador distinto y (ver Figuras 3a-b) . Mucho más importantemente, las células adherentes derivadas del tejido adiposo y la placenta propagadas sobre la colocación 2D o 3D fueron capaces de soportar injerto HSC (ver Ejemplo 2), sustanciar el uso de las células de la presente invención, como células madre estromales, en la clínica. Así, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para expansión de células . El método que comprende cultivar células adherentes de la placenta o tejido adiposo bajo condiciones de cultivo tri-dimensionales (3D) que soportan la expansión de células. Como se utiliza en la presente los términos "expandir" y "expansión" se refieren a sustancialmente menos diferenciación de mantenimiento de las células y últimamente el crecimiento celular, es decir, incremento de una población de células (por ejemplo, por lo menos 2 veces) sin diferenciación acompañante de tal incremento. Como se utiliza en la presente los términos "mantener" y "mantenimiento" se refieren a sustancialmente menos diferenciación de renovación de células, es decir, sustancialmente población de células estacionarias sin la diferenciación acompañante de tal estacionalidad. Como se utiliza en la presente la frase "células adherentes" se refiere a una población homogénea o heterogénea de células que son dependientes del fijado, es decir, requieren unirse a una superficie para crecer in vi tro . Como se utiliza en la presente la frase "tejido adiposo" se refiere a un tejido conectivo que comprende células de grasa ( adipocitos ) . Como se utiliza en la presente el término "tejido de la placenta" se refiere a cualquier porción del órgano femenino mamífero que recubre la pared uterina y durante el embarazo envuelve al feto, a lo cual se une por el cordón umbilical. Después del nacimiento, la placenta se expulsa (y es referida como una placenta de post parto) . Como se utiliza en la presente la frase "condiciones de cultivo tridimensionales" se refiere a disponer de las células a condiciones que son compatibles con el crecimiento de células mientras que evita que las células crezcan en más de una capa. Es bien apreciado que el ambiente in situ de una célula en un organismo viviente (o un tejido) como una arquitectura tridimensional. Las células son circundadas por otras células. Se mantienen en una red de complejo de fibras de nanoescala de matriz extracelular que evita el establecimiento de varios microambientes locales. Sus ligandos extracelulares median no solamente la unión a la membrana basal sino también accedan a una variedad de vasos vasculares y linfáticos. El oxígeno, hormonas y nutrientes se llevan a las células y los productos de desechos son portados de otra manera. Las condiciones de cultivo tridimensionales de la presente invención son diseñadas para imitar tal ambiente como es ejemplificado además enseguida. Así, las células adherentes de este aspecto de la presente invención se recuperan de un tejido adiposo o placental .

JJ Las células placentarias se pueden obtener de una placenta de plazo completo o pre-plazo. La placenta de preferencia es recolectada una vez que ha sido ex sangrada. La placenta de preferencia se perfusiona durante un periodo de tiempo suficiente para remover las células residuales. El término "perfusionar" o "perfusión" utilizado en la presente se refiere al acto de vaciar o pasar un fluido sobre o a través de un órgano o tejido. El tejido placentario puede ser de cualquier mamífero; mucho más de preferencia el tejido placentario es humano. Una fuente conveniente de tejido placentario es de una placenta post parto (por ejemplo, 1-6 horas), sin embargo, la fuente de tejido placentario o células o el método de aislamiento del tejido placentario no es crítico a la invención. Las células adherentes derivadas de la placenta se pueden obtener de partes tanto fetales (es decir, partes de amnios o interior de la placenta, ver el Ejemplo 1) como maternales (es decir, decidua basalis y decidua parietalis) de la placenta. Los especímenes de tejido se lavan en una solución reguladora fisiológica [por ejemplo, solución salina regulada con fosfato (PBS) o solución reguladora de Hank) . Las suspensiones de células individuales se hacen al tratar el tejido con una enzima digestiva (ver enseguida) o/y picar y enjuagar las partes del tejido a través de un filtro de nylon o al pipetear suavemente (Falcon, Becton, Dickinson, San José, CA) con medio de lavado. Las células adherentes derivadas del tejido adiposo se pueden aislar por una variedad de métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, tales métodos son descritos en la Patente Norteamericana No. 6,153,432. El tejido adiposo se puede derivar de sitios omentales/viscerales , mamarios, gonadales u otro tejido adiposo. Una fuente preferida del tejido adiposo omental. En humanos, el tejido adiposo es típicamente aislado mediante liposucción. Las células adherentes aisladas del tejido adiposo se pueden derivar al tratar el tejido con una enzima digestiva tal como colagenasa, tripsina y/o dispasa; y/o concentraciones efectivas de hialuronidasa o DNAsa; y ácido etilendiaminetetra-acético (EDTA) ; a temperaturas entre 25 -50°C, durante período de entre 10 minutos a 3 horas. Las células luego se pueden pasar a través de un filtro de nylon 0 malla de estopilla de entre 20 mieras a 800 mieras. Las células luego se someten a la centrifugación diferencial directamente en el medio o sobre un Ficoll o Percoll u otro gradiente particulado. Las células se centrifugan a velocidades de entre 100 a 3000 x g durante períodos de entre 1 minuto a 1 hora a temperaturas de entre 4-50°C (ver la Patente Norteamericana No. 7,078,230). Además de las células adherentes derivadas de la placenta o tejido adiposo, la presente invención también visualiza el uso de células adherentes de otras fuentes de células las cuales se caracterizan por fenotipo de células madre estromales (como será además descrito en la presente enseguida) . Las fuentes de tejido de las cuales las células adherentes se pueden recuperar incluyen, pero no están limitadas a, sangre del cordón umbilical, folículos pilosos [por ejemplo como es descrito en la Solicitud de Patente Norteamericana No. 20060172304], testículos [por ejemplo, como es descrito en Guan K. y colaboradores, Nature. 27 de Abril del 2006; 440 (7088 ): 1199-203] , mucosa olfatoria humana [por ejemplo, como es descrito en Marshall, CT . y colaboradores, Histol Histopathol. Junio del 2006 ; 21 ( 6 ) : 633-43], saco vitelino embriónico [por ejemplo, como es descrito en Geijsen N, Nature. 8 de Enero del 2004 ; 427 ( 6970 ): 1 8-54 ] y fluido amniótico [Pieternella y colaboradores, (2004) Stem Cells 22:1338-1345], todas de las cuales son conocidas para incluir células madre mesenquimales . Las células adherentes de estas fuentes de tejido se pueden aislar al cultivar las células sobre una superficie adherente, de esta manera aislar las células adherentes de otras células en la población inicial . No obstante el origen de (por ejemplo, la placenta o tejido adiposo), recuperación de la células es de preferencia efectuada bajo condiciones estériles. Una vez que las células aisladas son obtenidas, se dejan adherir a un material adherente (por ejemplo, configurado como una superficie) para de esta manera aislar las células adherentes. Esto se puede efectuar antes de (ver el Ejemplo 1) o concomitante con cultivar en condiciones de cultivo 3D. Como se utiliza en la presente "un material adherente" se refiere a un material sintético, que ocurre naturalmente o una combinación del mismo de un material no citotóxico (es decir, biológicamente compatible) que tiene una estructura química (por ejemplo, grupos expuestos en la superficie cargados) que pueden retener las células sobre una superficie . Ejemplos de materiales adherentes que se pueden utilizar de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, un poliéster, un polialquileno, un polifluorocloroetileno, un cloruro de polivinilo, un poliestireno, una polisulfona, un acetato de celulosa, una fibra de vidrio, una partícula de cerámica, un matrigel, un componente de matriz extracelular (por ejemplo, fibronectina , condronectina , laminina) , un colágeno, un ácido láctico poli L y una fibra de metal inerte. Las etapas adicionales de purificación o enriquecimiento para células madre estromales se pueden efectuar utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica (tales como mediante FACS utilizando la expresión de marcador de célula madre estromal, como además es descrito en la presente enseguida) . Ejemplos no limitativos del medio de base útiles en el cultivo de acuerdo con la presente invención incluyen Medio Esencial Mínimo Eagle, ADC-I, LPM (libre Albúmina de Suero Bovino), FIO (HAM) , F12 (HAM) , DCCM1, DCCM2 , RPMI 1640, Medio BGJ (con y sin Modificación de Fitton-Jackson) , Aguila de Medio Basal (BME-con la adición de base de sal de Earle) , Medio de Águila Modificado de Dulbecco (DMEM- sin suero), Yamane, IMEM-20, Medio Eagle de Modificación de Glasgow (GMEM) , Medio L-15 de Leibovitz, Medio 5A de McCoy, Medio M199 (M199E- con base de venta de Earle) , Medio M199 (M199H-con base de sal de Hank) , Medio Esencial Mínimo Eagle (MEM-E-con base de sal de Earle) , Águila de Medio Esencial Mínimo (MEM-H-con base de sal de Hank) y Medio Esencial Mínimo de Eagle (MEM-NAA con aminoácidos no esenciales), entre otros numerosos, que incluyen medio 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153. Un medio preferido para el uso en la presente invención es DMEM. Estos y otros medios útiles son disponibles de GIBCO, Grand Island, N. Y., EUA and Biological Industries, Bet HaEmek, Israel, entre otros. Un número de estos medios se resumen en Methods in Enzymology, Volumen LVIII, "Cell Culture", páginas 62, 72, editado por William B.

Jakoby y Ira H. Pastan, publicada por Academic Press, Inc. El medio puede ser suplementado tal como con suero tal como suero fetal de bovino u otras especies, y opcionalmente o alternativamente, factores de crecimiento, citoquinas y hormonas (por ejemplo, hormona de crecimiento, eritropoyetina , trombopoyetina, interleucina 3, interleucina 6, interleucina 7, factor estimulante de colonia de macrófago, factor de ligando/célula madre de equipo c, ligando de osteoprotegerina, insulina, factores de crecimiento similares a insulina, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblasto, factor de crecimiento de nervio, factor neurotrófico cilar, factor de crecimiento derivado de plaquetas y proteina morfogenética de hueso a concentraciones de entre niveles de pigogramo/ml a miligramo/ml . Además se reconoce que los componentes adicionales se pueden adicionar al medio de cultivo. Tales componentes pueden ser antibióticos, antimicóticos , albúmina, aminoácidos y otros componentes conocidos a la técnica para el cultivo de células. Adicionalmente , los componentes se pueden adicionar para aumentar el proceso de diferenciación cuando es necesario (ver además enseguida) . Una vez que las células adherentes están en las manos se pueden pasar a las colocaciones tridimensionales (ver el Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos que siguen) . Será apreciado aunque, aquellas células se pueden transferir a una matriz configurada 3D inmediatamente después del aislamiento (como es mencionado anteriormente en la presente) . Asi, el material adherente de este aspecto de la presente invención se configura para cultivos 3D de esta manera proporcionando una matriz de crecimiento que sustancialmente incrementa la superficie unida disponible para la adherencia de las células estromales para imitar la infraestructura del tejido (por ejemplo, la placenta). Por ejemplo, para una matriz de crecimiento de 0.5 mm en peso, el incremento es por un factor de por lo menos de 5 a 30 veces, calculado por proyección sobre una base de la matriz de crecimiento. Tal incremento por un factor de aproximadamente 5 a 30 veces, es por unidad de capa, y si una pluralidad de tales capas, ya sea apilada o separada por espaciadores o los similares, se utiliza, el factor de 5 a 30 veces aplicado por cada una de tal estructura. Cuando la matriz se utiliza en forma de lámina, de preferencia las laminas de fibra no de tejido, o láminas de polímeros de espuma de poro abierto, los espesores preferidos de la lámina es aproximadamente 50 a 1000 m o más, habiendo proporcionado porosidad adecuada para la entrada de células, la entrada de nutrientes y para la remoción de productos de desechos de la lámina. De acuerdo con una modalidad preferida los poros tienen un diámetro efectivo de 10 µ?? a 100 µp? Tales láminas se pueden preparar de fibras de varios espesores, los espesores de fibra preferidos o intervalo de diámetro de fibra que es de aproximadamente 0.5 µta a 20 µ?t?, fibras aun más preferidas están en el intervalo de 10 m a 15 µp? en diámetro . Las estructuras de la invención se pueden soportar por, o aun mejor enlazar a, una lámina o pantalla de soporte porosa proporcionada para la estabilidad dimensional y resistencia física. Tales láminas de matriz también se pueden cortar, perforar o destrozar para proporcionar partículas con área proyectada del orden de aproximadamente 0.2 mm2 a aproximadamente 10 mm2, con el mismo orden de espesores (aproximadamente 50 a 1000 ym) . Detalles adicionales relacionados a la fabricación, uso y/o ventajas de la matriz de crecimiento la cual se utilizó para reducir la presente invención a la práctica son descritas en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,168,085 y en particular, 5,266,476, ambas son incorporadas en la presente por referencia. La superficie adherente puede tener una forma seleccionada del grupo que consiste de cuadrados, anillos, discos y cruciformas. Para la alta producción a escala, El cultivo es de preferencia efectuado en un biorreactor 3D.

Ejemplos de tales biorreactores incluyen, pero no están limitados a, un biorreactor de flujo tapón, un biorreactor de tanque de agitado continuo y un biorreactor de lecho estacionario. Como se muestra en el Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos, un biorreactor de flujo tapón tridimensional (3D) (como es descrito en la Patente Norteamericana No. 6911201) es capaz de soportar el crecimiento y el mantenimiento prolongado de las células estromales. En este biorreactor, las células estromales se siembran sobre portadores corrosivos hechos de una matriz de tela no tejida de poliéster, empacado en una columna de vidrio, para de esta manera permitir la propagación de grandes números de células en un volumen relativamente pequeño. La matriz utilizada en el biorreactor de flujo tapón puede ser de forma laminar, láminas de fibra.no tejida o láminas de polímeros de espuma de poro abierto, el espesor preferido de la lámina es aproximadamente 50 a 1000 pm o más, haciendo proporcionar porosidad adecuada para la entrada de células, entrada de nutrientes y para la remoción de productos de desecho de la lámina. Otros biorreactores 3D que se pueden utilizar con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, un biorreactor de tanque agitado continuo, donde un medio de cultivo es continuamente alimentado en el biorreactor y un producto es continuamente retirados, para mantener un estado de estudio constante de tiempo dentro del reactor] . Un biorreactor de tanque agitado con una canasta de lecho fibrosa es disponible por ejemplo en New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ) . Un biorreactor de lecho estacionario, un biorreactor de aire elevado, donde el aire es típicamente alimentado en el fondo de un tubo de corriente de aire central fluyente hacia arriba mientras que se forman burbujas y el gas de escape se desacopla en la parte superior de la columna] , un biorreactor de prefusión de sembrado de células con espumas Poliactivas [como es descrito en endt, D. y colaboradores, Biotechnol Bioeng 84:205- 214, (2003)] estructuras porosas de ácido poli-L-láctico tubulares (PLLA) en un biorreactor de perfusión de flujo Radial [como es descrito en Kitagawa y colaboradores, Biotechnology and Bioengineering 93 ( 5 ): 947-954 (2006). Otros biorreactores que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención son descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,277,151, 6,197,575, 6,139,578, 6,132,463, 5 , 902 , 741 y 5 , 629, 186. El sembrado de células es de preferencia efectuado 100,000-1,500,000 células/mm en el sembrado. Las células son de preferencia cosechadas una vez que alcanzan por lo menos aproximadamente 40% de confluencia, 60% de confluencia o 80% de confluencia mientras que de preferencia evita la diferenciación y senescencia no controlada . El cultivo se efectúa durante por lo menos aproximadamente 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 20 dias, un mes o aun más. Será apreciado que el cultivo en un biorreactor puede prolongar este periodo. El pasaje también puede ser efectuado para incrementar el número de células. Las células adherentes de la presente invención de preferencia comprenden por lo menos un "fenotipo de célula madre estromal". Como se utiliza en la presente "un fenotipo de célula madre estromal" se refiere a un fenotipo estructural o funcional típico de una célula madre estromal derivada de la médula ósea (es decir, mesenquimal) . Como se utiliza en la presente la frase "célula madre" se refiere a una célula la cual no es térmicamente diferenciada . Así por ejemplo, las células pueden tener una forma de eje. Alternativamente o adicionalmente las células pueden expresar un marcador o una colección de marcadores (por ejemplo marcador de superficie) típico a las células madre estromales. Ejemplos de marcadores de superficie de células madre estromales (positivo y negativo) incluyen pero no están limitados a CD105+, CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD34-, CD45-, CD80-, CD19-, CD5-, CD20-, CD11B-, CD14-, CD19-, CD79-, HLA-DR- y FMC7-. Otros marcadores de células madre estromales incluyen pero no están limitados a tirosina hidroxilasa, nestina y H-NF. Ejemplos de fenotipos funcionales típicos de células madre estromales incluyen, pero no están limitados a, actividad de supresión de célula T (no estimular las células T e inversamente suprimir las mismas), actividad de soporte de célula madre hematopoyética , así como diferenciación adipogénico, hepatogénico, osteogénico y neurogénico. Cualquiera de estas características estructurales o funcionales se pueden utilizar para calificar las células de la presente invención (ver los Ejemplos 1-2 de la sección de Ejemplos que siguen). Las poblaciones de células generadas de acuerdo con la presente enseñanza se caracterizan por un perfil de expresión de proteína único como se muestra en el Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos. Así por ejemplo, las células adherentes de la placenta o tejido adiposo generadas de acuerdo con la presenta enseñanza, son capaces de expresar y/o secretar los niveles altos de factores seleccionados. Por ejemplo, tales células expresan o secretan SCF, Flt-3, H2AF o ALDH X por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o de preferencia 12 veces más alto que aquellas expresadas o secretadas por las células adherentes de la placenta o tejido adiposo crecidas en un cultivo 2D. Adicionalmente o alternativamente, la población de células de la presente invención secretan o expresan IL-6, EEEF2, RCN2 o CNN1 a un nivel al menos 2, 3 o 5 veces más alto que aquellas expresadas o secretadas por las células adherentes de la placenta o tejido adiposo crecidas en un cultivo 2D. Adicionalmente o alternativamente, la población de células de la presente invención se caracterizan por el nivel más bajo de expresión de varias otras proteínas como es comparado con células cultivadas 2D. Así por ejemplo, secretar o expresar menos de 0.6, 0.5, 0.25 o 0.125 del nivel de expresión de Hnrphl, precursor 2 de isoforma de antígeno CD44, Papss2 o rpL7a expresado o secretado por las células adherentes de la placenta o tejido adiposo cultivadas en un cultivo 2D. Mientras que además de reducir la presente invención a la práctica los presentes inventores se han dado cuenta que las células madre adherentes, y particularmente 3D-ASCs, mostraron actividad inmunosupresora . Como se muestra en el Ejemplo 3 de la sección de Ejemplos que sigue, las Células estromales adherentes y particularmente 3D-ASCs, se encontraron para suprimir la reacción inmune de las células mononucleares de sangre del cordón umbilical humana en un ensayo MLR. Así, las células de la presente invención pueden comprender actividades biológicas que pueden ser preferencialmente utilizadas en la clínica (por ejemplo, actividad de supresión de célula T, actividad de soporte de célula madre hematopoyética) .

Mientras que además de reducir la presente invención a la práctica los presentes inventores se han dado cuenta que el medio acondicionado de las células de la presente invención puede comprender actividades biológicas que pueden ser preferencialmente utilizadas en la clínica (por ejemplo, actividad de supresión de célula T, actividad de soporte de célula madre hematopoyético) . Así, la presente invención además concibe la recolección del medio acondicionado y su uso . como es o siguiendo la etapas adicionales de concentración, enriquecimiento o fraccionamiento utilizando métodos que so bien conocidos en la técnica. De preferencia un medio acondicionado de la presente se obtiene de un cultivo logarítmico medio de alta viabilidad de células. Como es mencionado anteriormente en la presente, las células y el medio acondicionado de la presente invención se caracterizan por un fenotipo de célula madre estromal y como tal se puede utilizar en cualquier investigación y aplicación clínica que puede beneficiarse del uso de tales células . El injerto y la iniciación de hematopoyesis mediante HSCs transplantadas dependen de los procesos de complejo que incluyen albergamiento, después de un gradiente de quimioquinas a través de la barrera celular endotelial, a la médula ósea y alojado en los nichos apropiados, mientras que establecen contactos físicos entre las células transplantadas , el ECM y las células mesenquimales de los nichos. Todos estos procesos involucran un arreglo de complejo de moléculas, tales como citoquinas, hormonas, esteroides, proteínas de matriz extracelular , factores de crecimiento, interacción de célula a célula y proteínas de adhesión y proteínas de matriz. Se conoce que solamente 1-5% de HSCs transíusionadas son detectadas en la BM recipiente 2-3 días del post transplante [Kerre y colaboradores, J Immunol . 167:3692-8. (2001); Jetmore y colaboradores, Blood. 99:1585-93 (2002)]. La contribución de MSCs al injerto hematopoyético es en parte mediante la inhibición de la producción de célula derivadas del donador, que causan enfermedad de injerto contra hospedero [GvHD, Charbord P. y Moore, K. , Ann . KY. Acad. Sci 1044:159-167 (2005); aitra B y colaboradores, Bone Marrow Transplant. 33 ( 6) : 597-60 . (2004); las Patentes Norteamericanas Nos. 6,010,696; 6555374]; y parte al proporcionar un soporte de célula madre hematopoyético (HSC) (es decir, sostener y ayudar a la proliferación, saturación y/o albergamiento de células madre hematopoyéticas ) . Como se muestra en el Ejemplo 2 de la sección de Ejemplos que sigue, las células adherentes derivadas de la placenta y tejido adiposo se encontraron sorprendentemente que son suportivas de injerto de HSC aun después de la quimioterapia . Dados estos resultados es concebible que las células o medio de la presente invención se puede utilizar en cualquier aplicación clínica para que el transplante de célula madre estromal sea utilizado. Así, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para tratar una condición médica (por ejemplo, patología, enfermedad, síndrome) que puede beneficiarse del transplante de célula madre estromal en un sujeto en necesidad del mismo. Como se utiliza en la presente el término "tratar" se refiere a inhibir o detener el desarrollo de una patología y/o causar la reducción, remisión o regresión de una patología. Estos de habilidad en la técnica entenderán que varias metodologías y ensayos se pueden utilizar para estimar el desarrollo de una patología, y similarmente , varias metodologías y ensayos se pueden utilizar para estimar la reducción, remisión o regresión de una patología. De preferencia, el término "tratar" se refiere a aliviar o disminuir un síntoma asociado con una enfermedad cancerosa. De preferencia, tratar curas, por ejemplo, sustancialmente eliminar, los síntomas asociados con la condición médica. Como se utiliza en la presente "una condición médica que puede beneficiarse del transplante de célula madre estromal" se refiere a cualquier condición médica que se puede aliviar mediante la administración de células/medio de la presente invención. El término o frase "transplante", "reemplazo celular" o "injerto" se utilizan intercambiablemente en la presente y se refieren a la introducción de las células de la presente invención al tejido objetivo. Como se utiliza en la presente el término "sujeto" se refiere a cualquier sujeto (por ejemplo, mamífero), de preferencia un sujeto humano. El método de este aspecto de la presente invención comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de las células o medio de la presente invención (descritas anteriormente en la presente) , para de esta manera tratar una condición médica que puede beneficiarse del transplante de célula madre estromal en el sujeto. Las células que se pueden administrar de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen las células adherentes descritas anteriormente que se pueden cultivar en ya sea configuraciones bio-dimensionales o tridimensionales así como derivados diferenciados parcialmente o térmicamente mesenquimales o no mesenquimales de los mismos. Los métodos para derivar células específicas de linaje de las células madre estromales de la presente invención son bien conocidas en la técnica. Ver por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,486,359, 5,942,225, 5,736,396, 5,908,784 y 5,902,741. Las células pueden ser naive o genéticamente modificadas tales como para derivar un linaje de interés (ver la Solicitud de Patente Norteamericana No. 20030219423) . Las células y el medio pueden ser de fuente autóloga o no autóloga (es decir, alogénica o xenogénica) de preparaciones frescas o congeladas (por ejemplo, crio-preservadas) . Dependiendo de la condición médica, el sujeto puede ser administrado con fármacos químicos adicionales (por ejemplo, inmunomoduladores, quimioterapia etc.) o células. Así, por ejemplo, para mejorar el injerto de célula madre (por ejemplo, incrementar el número de HSC viables en la B recipiente y óptimamente mejorar el conteo celular de sangre blanca) las células/medio de la presente invención se pueden administrar antes de, concomitantemente con o después del transplante de HSC. De preferencia las HSCs y las células estromales comparten antígenos de HLA comunes. De preferencia, las HSCs y células estromales son de un individuo individual. Alternativamente, las HSCs y las células estromales son de individuos diferentes. El término o frase "transplante", "reemplazo celular" o "injerto" se utilizan intercambiablemente en la presente y se refieren a la introducción de las células de la presente invención al tejido objetivo. Las células se pueden derivar del recipiente o de un donador alogeneico o xenogeneico . Puesto que las células no autólogas son similarmente para inducir una reacción cuando son administradas al cuerpo varios procedimientos se han desarrollado para reducir la probabilidad de rechazo de células no autólogas. Estas incluyen ya sea suprimir el sistema inmune de recipiente o encapsular las células no autólogas en membranas de inmunoaislamiento, semipermeables antes del transplante. Las técnicas de encapsulación generalmente se clasifican como microencapsulación, que involucran vehículos esféricos pequeños y la macroencapsulación, que involucra membranas de lámina plana y fibra hueca más grandes (Uludag, H. y colaboradores, Technology of mammalian cell encapsulation . Adv Drug Deliv Rev. 2000; 42:29-64). Los métodos para preparar microcápsulas se conocen en las técnica e incluyen por ejemplo aquellos divulgados por Lu MZ y colaboradores, Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly (allylamine) .

Biotechnol Bioeng. 2000, 70:479-83, Chang TM y Prakash S. Procedures for microencapsulation of enzymes, cells and genetically engineered microorganisms . Mol Biotechnol. 2001, 17: 249-60 y Lu MZ y colaboradores, A novel cell encapsulation method using photosensitive poly (allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetate ) . J Microencapsul . 2000, 17:245-51. Por ejemplo, las microcápsulas se preparan al hacer complejo de colágeno modificado con una lámina de ter-polimero de metilacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA) , ácido metacrilico (MAA) y metacrilato de metilo (MMA) , dando por resultado un espesor de cápsula de 2-5 pm. Tales microcápsulas pueden ser además encapsuladas con láminas de ter-polimero de 2-5 µ?? adicionales para impartir una superficie lisa negativamente cargada y para minimizar la absorción de proteina de plasma (Chia, S.M. y colaboradores, Multi-layered microcapsules for cell encapsulation Biomaterials. 2002 23:849-56). Otras microcápsulas están basadas en alginato, un polisacárido marino (Sambanis, A. Encapsulated islets in diabetes treatment. Diabetes Technol . Ther. 2003, 5:665-8) o sus derivados. Por ejemplo, las microcápsulas se pueden preparar mediante la complej ación de polielectrolito entre los polianiones de alginato de sodio y sulfato de celulosa de sodio con el policatión de clorhidrato de poli (metilen-co-guanidina) en la presencia de cloruro de calcio. Será apreciado que la encapsulación celular se mejora cuando se utilizan las cápsulas más pequeñas. Asi, el control de calidad, estabilidad mecánica, propiedades de difusión y actividades in vitro de células encapsuladas mejoran cuando el tamaño de la cápsula se redujo de 1 mm a 400 pm (Canaple L. y colaboradores, Improving cell encapsulation through size control. J Biomater Sci Polym Ed. 2002;13:783-96). Por otra parte, las biocápsulas nanoporosas con tamaño de poro bien controlado tan pequeño como 7 nm, se encontraron químicas de superficie adaptada y microarquitecturas precisas a microambientes exitosamente inmunoaislados para las células (Williams D. Small is beautiful: microparticle and nanoparticle technology in medical devices. Med Device Technol. 1999, 10:6-9; Desai, T.A. Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation. Expert Opin Biol Ther. 2002, 2:633-46). Ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen, pero no están limitados a, metotrexato, ciclofosfamida , ciclosporina , ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina , sulfasalazina (sulfasalazopirina), sales de oro, D-penicilamina , leflunomida, azatioprina, anakinra, infliximab (REMICADE) , etanercept, TNF.alfa. bloqueadores , un agente biológico que se dirige a una citoquina inflamatoria y Fármaco Anti-Inflamatorio no Esferoidal (NSAIDs) . Ejemplos de NSAIDs incluyen, pero no están limitados a ácido acetil salicílico, salicilato de magnesio de colina, diflunisal, salicilato de magnesio, salsalato, salicilato de sodio, diclofenac, etodolac, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina , cetoprofeno, cetorolac, meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tolmetin, acetaminofeno, ibuprofeno, inhibidores de Cox-2 y tramadol . En cualquiera de los métodos descritos en la presente, las células o el medio se pueden administrar ya sea per se o, de preferencia como una parte de una composición farmacéutica que además comprende un portador farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en la presente una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más de los conjugados químicos descritos en la presente, con otros componentes químicos tales como portadores y excipientes farmacéuticamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un sujeto. Después en la presente, el término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador o un diluyente que no causa irritación significante a un sujeto y no anula la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Ejemplos, sin limitaciones, de portadores son propilenglicol , solución salina, emulsiones y mezclas de solventes orgánicos con agua. En la presente el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte adicionada a una composición farmacéutica para facilitar además la administración de un compuesto. Ejemplos, sin limitaciones, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles . De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el portador farmacéutico es una solución acuosa de solución salina. Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en "Remington' s Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co . , Easton, PA, última edición, la cual es incorporada en la presente por referencia. Se puede administrar la composición farmacéutica de una manera sistémica (como es detallada anteriormente en la presente) . Alternativamente, uno puede administrar la composición farmacéutica localmente, por ejemplo, por la vía de inyección de la composición farmacéutica directamente en una región del tejido de un paciente. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden manufacturar mediante procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de mezclado convencional, disuelto, granulado, fabricación de grageas, levigación, emulsificado, encapsulado, atrapamiento o procesos de liofilización .

Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la presente invención asi se pueden formular de manera convencional utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en las preparaciones que, se pueden utilizar farmacéuticamente. La formulación propia es dependiente de la ruta de administración seleccionada. Para inyección, los ingredientes activos de la composición farmacéutica se pueden formular en soluciones acuosas, de preferencia en soluciones reguladoras fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o solución reguladora de sal fisiológica. Para la administración transmucosal , los penetrantes apropiados para la barrera que es permeada se utilizan en la formulación. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica. Para cualquier preparación utilizada en los métodos de la invención, la cantidad o dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente de ensayos in vitro y cultivo celular. De preferencia, una dosis es formulada en un modelo animal para lograr una concentración o titulo deseado. Tal información se puede utilizar para determinar más exactamente dosis útiles en humanos. La toxicidad y eficacia terapéutica de los ingredientes activos descritos en la presente se pueden determinar por procedimiento farmacéuticos estándar in vitro, en cultivos celulares o animales experimentales. Los datos obtenidos de estos ensayos in vitro y cultivo celular y estudios de animal se pueden utilizar en formular un intervalo de dosificación para uso en humanos. La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. La formulación exacta, ruta o administración y dosificación se pueden seleccionar por el médico individuo en vista de las condiciones del paciente, (ver por ejemplo, Fingí y colaboradores, 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics" , Capitulo 1, página 1). Por ejemplo, el paciente de Parkinson se puede monitorear sintomáticamente para mejorar las funciones motoras que indican la respuesta positiva al tratamiento. Para inyección, los ingredientes activos de la composición farmacéutica se pueden formular en soluciones acuosas, de preferencia en soluciones reguladoras fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o solución reguladora de sal fisiológica. La cantidad e intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente a los niveles del ingrediente activo que son suficientes para regular efectivamente la síntesis de neurotransmisor por las células implantadas. Las dosificaciones necesarias para lograr el efecto deseado dependerá de las características individuales y ruta de administración. Los ensayos de detección se pueden utilizar para determinar las concentraciones de plasma. Dependiendo de la severidad y sensibilidad de la condición a ser tratada, la dosificación puede ser de una individual o una pluralidad de administraciones, se logra con el curso de duración del tratamiento de varios días a varias semanas o la disminución del estado de enfermedad. La cantidad de una composición a ser administrada será, por supuesto, dependiente del individuo que es tratado, la severidad de la aflicción, la manera de administración, el juicio del médico que prescribe, etc. La dosificación y el tiempo de administración será responsiva a un cuidadoso y continuo monitoreo de la condición de cambio del individuo. Por ejemplo, un paciente de Parkinson tratado será administrado con una cantidad de células las cuales es suficiente para aliviar los síntomas de la enfermedad, basados en las indicaciones monitoreadas . Después del transplante, las células de la presente invención de preferencia sobreviven en el área de enfermedad durante un período de tiempo (por ejemplo por lo menos 6 meses), tal que un efecto terapéutico es observado. También se pueden incluir composiciones que incluyen la preparación de la presente invención formuladas en un portador farmacéutico compatible, colocadas en un contenedor apropiado y etiquetas para el tratamiento de una condición indicada. Las composiciones de la presente invención pueden ser, si es deseado, presentadas en un dispositivo de paquete o dispensador, tal como un equipo aprobado por la FDA, la cual puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. El paquete puede, por ejemplo, comprender hoja de metal o plástico, tal como un paquete de ampollas. El dispositivo de paquete o dispensador puede estar acompañado de instrucciones para la administración. El paquete o dispensador también puede ser acomodado por un aviso asociado con el contenedor en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la manufactura, uso o venta de productos farmacéuticos, el aviso el cual es reflexivo de aprobación por la agencia de la forma de las composiciones o administración humana o veterinaria. Tal aviso, por ejemplo, puede ser de etiquetado aprobado por la Administración de Alimentos y Fármaco de Estados Unidos para fármacos de prescripción o de un inserto de producto aprobado . EJEMPLOS La referencia ahora se hace a los siguientes ejemplos, los cuales junto con las descripciones anteriores ilustran la invención en un modo no limitativo.

Generalmente, la nomenclatura utilizada en la presente y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de DNA recombinante . Tales técnicas son explicadas ampliamente en la literatura. Ver, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook y colaboradores, (1989) ; "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M . , ed. (1994); Ausubel y colaboradores, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley y Sons, Baltimore, Maryland (1989) ; Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988) ; Watson y colaboradores, "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren y colaboradores, , (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); las metodologías expuestas en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994) ; "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994) ; Stites y colaboradores, (eds) , "Basic and Clinical Immunology" (8- Edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) ; Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co . , Nueva York (1980) ; inmunoensayos disponibles son extensivamente descritos en la literatura de patentes y científica, ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, . J. , ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D. y Higgins S. J., eds . (1985) ; "Transcription and Translation" Hames, B. D. y Higgins S. J. , Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. L, ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986) ; "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Volúmenes 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y colaboradores, "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todas de la cuales son incorporadas por referencia como si completamente se expusieran en la presente. Otras referencias generales se proporcionan por todo este documento. Los procedimientos en las mismas se creen que son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para la conveniencia del lector. Toda la información contenida en las mismas es incorporada en la presente por referencia. EJEMPLO 1 Producción y cultivo de células estrórnales ad erentes (ASC) de la médula ósea, la placenta y tejidos adiposos Las células adherentes se cultivaron en un sistema de biorreactor que contiene portadores 3D para producir células 3D-ASC, caracterizado por un perfil de expresión de marcador celular especifico. La eficiencia del crecimiento se probó a través del conteo celular. La capacidad de diferenciación de estas células se probó al cultivar en un medio de diferenciación. MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Células estromales de la medula ósea - Las células estromales de la médula ósea ( B ) se obtuvieron de la médula del esternón aspirada de donadores hematológicamente sanos a someterse a cirugía a corazón abierto o biopsia de BM. Los aspirados de médula se diluyeron 3 veces en Solución de Sal Balaceada de Hank (HBSS; GIBCO BRL/Invitrogen, Gaithersburg MD) y se sometieron a la centrifugación de gradiente de densidad Ficoll-Hypaque (Robbins Scientific Corp. Sunnyvale, CA) . Después, las células mononucleares de la médula (<1.077 gm/cm3) se recolectaron, se lavaron 3 veces en HBSS y se resuspendieron en medio de crecimiento [DMEM (Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel) suplementado con FCS al 10% (GIBCO BRL) , mercaptoetanol 10"4 M (Merck, White House Station, NJ) , mezcla de Pen-Strep-Nistatina (100 U/ml:100 ug/ml:1.25 un/mi; Beit Ha'Emek), L-glutamina 2 mM (Beit Ha'Emek)]. Las células de donadores individuales se incubaron separadamente en matraces de cultivo de tejido (Corning, Acton, MA) a 37 °C (C02 al 5%) con cambio semanalmente de medio de cultivo. Las células se dividieron cada 3-4 días utilizando tripsina al 0.25%-EDTA (Beit Ha'Emek). Después de 2-40 pasajes, cuando alcanzan 60-80% de confluencia, las células se recolectaron para el análisis o para el cultivo en biorreactores . Células estromales derivadas de la placenta - Las partes inertes de una placenta de suministro de plazo completo (Bnei Zion medical center, Haifa, Israel) se cortaron bajo condiciones estériles, se lavaron 3 veces con Solución Reguladora de Hank y se incubaron durante 3 h a 37°C con Colagenasa al 0.1% (1 mg/ml de tejido; Sigma-Aldrich, St. Lewis, MO) . Utilizando el pipeteo suave, las células suspendidas luego se lavaron con DMEM suplementado con FCS al 10%, mezcla de Pen-Strep-Nistatina (100 U/ml:100 ug/ml:1.25 un/mi) y L-glutamin a 2 mM, se sembraron en matraces de 75 cm2 y se incubaron a 37°C en un incubador de cultivo de tejido bajo condición humidificada con C02 al 5%. Después, las células se dejaron adherir a una superficie de plástico durante 72 horas después de lo cual el medio se cargó cada 3 - 4 dias. Cuando alcanza 60-80% de confluencia (usualmente 10-12 dias), las células se desprendieron del matraz de crecimiento utilizando tripsina al 0.25%-EDTA y se sembraron en matraces nuevos. Las células cultivadas después se recolectaron para el análisis o para el cultivo en biorreactores . Células estromales derivadas del tejido adiposo — Las células estromales se obtuvieron del tejido adiposo humano de procedimientos de liposucción (Rambam Haifa, Israel). El tejido adiposo se lavó extensivamente con volúmenes iguales de PBS y se digirieron a 37°C durante 30 min con colagenasa (20 mg/ml) . Las células luego se lavaron con DMEM que contiene FCS al 10%, mezcla de Pen-Strep-Nistatina (100 U/ml:100 ug/ml:1.25 un/ml) y L-Glutamina y se centrifugaron a 1200 rpm durante 10 min a RT, se resuspendieron con solución de lisado (1:10; Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel, para descartar células de sangre roja) se centrifugaron y se resuspendieron con DMEM que contiene FCS al 10%, mezcla de Pen-Strep-Nistatina (100 U/ml:100 ug/ml:1.25 un/ml) y L-Glutamina. Las células lavadas luego se sembraron en matraz de medio de cultivo de tejido estéril a 3-10 X 107 células/matraz. Al siguiente día las células se lavaron con PBS para remover RBC residual y células muertas. Las células se conservaron a 37°C en un incubador de cultivo de tejido bajo condición humidificada con C02 al 5%. El medio se cargó cada 3 a 4 días. En 60-80% de confluencia, las células se desprendieron del matraz de crecimiento utilizando tripsina al 0.25%-EDTA y se sembraron en matraces nuevos. Después de 2-40 pasajes, cuando las células alcanzaron 60-80% de confluencia, las células se recolectaron para el análisis o para el cultivo en biorreactores . Biorreactor de Flujo Tapón PluriX™ - El biorreactor de Flujo Tapón PluriX™ (Pluristem, Haifa, Israel; como es ilustrado en la Figura lg, ver también la Patente Norteamericana No. 6,911,201), se cargó con portadores corrosivos 3D empacado de 1-100 mi (4 mm en diámetro) hechos de una matriz de tela no tejida de poliéster. Estos portadores permiten la propagación de números de células grandes en un volumen relativamente pequeño. El articulo de vidrio se diseñó y se manufacturó por Pluristem. El biorreactor se mantuvo en un incubador de 37°C, con gasto de flujo regulado y monitoreado por una válvula (6a en la Figura lg) y bomba peristáltica (9 en la Figura lg) . El biorreactor contiene un muestreo y punto de inyección (4 en la Figura lg) , que permite el sembrado secuencial de células. El medio de cultivo se suministró a pH 6.7-7.4 de un depósito (1 en la Figura lg) . El depósito se suministró mediante una mezcla de gas filtrado (2,3 en la Figura lg) , que contiene aire /C02/02 a proporciones diferidas, dependiendo de la densidad celular en el biorreactor. La proporción de 02 fue adecuada al nivel de 02 disuelto en la salida del biorreactor, determinado por un monitor (6 en la Figura lg) . La mezcla de gas se suministró al depósito por la vía de tubos de silicona o difusor (Degania Bet, Emek Hayarden, Israel). El medio de cultivo se paró a través de un contenedor de separación (7 en la Figura lg) que permite la recolección de células no adherentes, circulante. La circulación del medio se obtuvo mediante una bomba peristáltica (9 en la Figura lg) . El biorreactor además se equipó con un punto de muestreo adicional (10 en la Figura lg) y contenedores para el intercambio medio continúo. Producción de células estromales adherentes 3D (3D-ASC) - Los cultivos de células 2D adherentes de humano primarios no confluentes, crecidas como es descrito anteriormente, se tripsinizaron, se lavaron, se resuspendieron en DMEM suplementado con FBS al 10%, mezcla de Pen-Strep-Nistatina (100 U/ml:100 ug/ml:1.25 un/ml) y L-glutamina 2 mM y se sembraron (103-10 células/ml) por la via de un punto de inyección sobre los portadores 3D en un biorreactor de Flujo Tapón estéril (ver la Figura lg) . Antes de la inoculación, el biorreactor se llenó con PBS-Ca-Mg esterilizado en el autoclave (Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel), (120°C, 30 min) y se lavó con medio de crecimiento de Dulbecco que contiene suero de becerro fetal inactivado con calor al 10% y una mezcla de Pen-Strep-Nistatina (100 U/ml:100 ug/ml:1.25 un/ml). El flujo se conservó a una proporción de 0.1-5 ml/min. El proceso de sembrado involucrado cesó de la circulación durante 2-48 hrs, para de esta manera permitir que la células se asienten sobre los portadores. El biorreactor se conservó bajo temperatura controlada (37°C) y condiciones de pH (pH = 6.7-7.4); utilizando un incubador suministrado con aire estéril y CO2 como sea necesario. El medio de crecimiento se reemplazó 2-3 veces a la semana. El medio de circulación se reemplazó con medio DMEM fresco, cada 4 hr a 7 días. A una densidad de 1 X 106-1 X 107 células/ml (después de 12-40 días de crecimiento) , el volumen de medio total se removió del biorreactor y el biorreactor y los portadores se lavaron 3-5 veces con PBS. Las células 3D-ASC luego se desprendieron de los portadores con Tripsina-EDTA; (Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel; 3-15 minutos con agitación suave, 1-5 veces) y después se resuspendieron en DMEM y se criopreservaron. Ensayos biológicos de calidad 3D-ASC - Las células eD-ASC criopreservadas se descongelaron y se contaron. Para la evaluación de viabilidad celular, 2 X 105 células se sembraron en un matraz de cultivo de tejido de 150 era2 y su capacidad de adherencia y repoblación se evaluó dentro de 7 días después del sembrado. Después, el fenotipo de marcador de membrana 3D-ASC se analizó utilizando un citómetro de flujo de anticuerpos monoclonales de fluorescencia (Beckman Coulter, Fullerton, CA) . Comparación entre el perfil de marcador de membrane celular de células adherentes cultivadas 3D y 2D utilizando ensayos de citometría de flujo 100,000 - 200,000 células adherentes de cultivos 2D y cultivos de sistema de flujo 3D se suspendieron en 0.1 mi de medio de cultivo en un tubo de 5 mi y se incubaron (4°C, 30 min, condiciones oscuras) con concentraciones de saturación de cada uno de los siguiente MAbs:CD90 anti-humano conjugadas con FITC (Chemicon International Inc. Temecula, CA) , CD73 anti humano conjugadas con PE (Bactlab Diagnostic, Ceasarea, Israel), CD105 anti humano conjugadas con PE ( eBioscience , San Diego, CA) , CD29 anti humano conjugadas con FITC (eBioscience, San Diego, CA) , CD45 anti-humano conjugadas con Cy7-PE (eBiosience) , CD19 anti-humano conjugadas con PE (IQProducts, Groningen, The Netherlands) , CD14MAb anti humano conjugadas con PE (IQProducts), CDllb anti humano conjugadas con FITC (IQProducts) y CD34 anti humano conjugadas con PE (IQProducts) o con HLA-DR MAb anti humano conjugadas con FITC (IQProducts) . Después de la incubación las células se lavaron dos veces en PBS enfriado con hielo que contiene FCS inactivado con calor al 1%, se resuspendieron en 500 µ? de formaldehido al 0.5% y se analizaron utilizando el citómetro de flujo FC-500 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) . Comparación entre el perfil de proteína de células adherentes cultivadas 3D y 2D utilizando análisis de espectrometría de masa - Las ASCs de procedimientos de cultivo derivadas de 2D y 3D se produjeron de la placenta como es descrito anteriormente. En breve, los cultivos 2D se produjeron al cultivar 0.3-0.75 X 106 células en matraces de 175 cm2 durante 4 días bajo atmósfera de C02 al 5% humidificada a 37°C, hasta que alcanza 60 - 80% de confluencia. Los cultivos 3D se produjeron al sembrar 2-10 X 106 células/gramo en un biorreactor que contiene 2000 portadores, y al cultivar durante 18 días. Después del cosechado, las células se lavaron (X 3) para remover todo el suero, las pelotillas y se congelaron. Las proteínas se aislaron de las pelotillas [utilizando el equipo Reactivo Tri (Sigma, Saint Louis, EUA) y se digirieron con tripsina y se etiquetaron con reactivo iTRAQ (Applied Biosciences, Foster City, CA) ] , de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. En breve, los reactivos iTRAQ son reactivos etiquetados isobáricos, no poliméricos. Los péptidos dentro de cada muestra se etiquetan con una de cuatro etiquetas de código isótopo, isobárico por la vía de su N-terminal y/o cadenas laterales de lisina. Las cuatro muestras marcadas se mezclan y los péptidos se analizan con espectrometría de masa. Hasta que la fragmentación de péptido, cada etiqueta libera un ión reportero de masa distinto; la relación de los cuatro reporteros por lo tanto dan abundancias relativas del péptido dado en una muestra, (información en: http : //docs . appliedbiosystems . com/pebiodocs/ 00113379. pdf ) . Los análisis proteómicos de cultivo 2D contra cultivo 3D de ASCs derivadas de la placenta se realizó en el centro proteómico Más Pequeño (departamento de Biología, Technion, Haifa, Israel) utilizando LC-MS/MS sobre QTOF-Premier (Waters, San Francisco, CA) , con identificación y análisis final mediante el software Pep-Miner [Beer, I. y colaboradores, Proteomics, 4, 950-60 (2004)] contra la parte humana de los datos de base nr. Las proteínas analizadas fueron: ribonucloproteína nuclear heterogénea Hl (Hnrphl No. de Acceso de GeneBank NP_005511) , familia de histona H2A (H2AF, No. de Acceso de GeneBank NP_034566.1 ) , factor 2 de alargamiento de traducción eucariótico (EEEF2, No. de Acceso de GeneBank NP_031933.1 ) , reticulocalbina 3, dominio de enlace de calcio de EF-manual (RCN2, No. de Acceso de GeneBank NP 065701) , precurso 2 de isoforma de antígeno CD44 (No. de Acceso de GeneBank NP_001001389, músculo liso básico de calponina 1 (CNN1, No. de Acceso de GeneBank NP_001290), isoforma 2 de 3 fosfoadenosina 5 fosfosulfato sintasa una (Papss2, No. de Acceso de GeneBank NP_004661), proteína ribosomal L7a (rpL7a, No. de Acceso de GeneBank NP_000963) y Aldehido deshidrogenasa X (ALDH X, No. de Acceso de GeneBank P47738). Cada experimento se realizó dos veces. Debido a la naturaleza del análisis, cada proteína se analizó de acuerdo con el número de péptidos de los cuales aparecen en una muestra (2-20 apariencias de una proteína en cada análisis) . Comparación entre proteínas secretadas en células adherentes cultivadas 3D y 2D utilizando ELISA - Las ASCs de procedimentos de cultivo derivados de 2D y 3D producidas de la placenta, se produjeron como es descrito anteriormente, con cultivos 3D para la duración de 24 dias. Los medios acondicionados después se recolectaron y se analizaron por el ligando Flt-3, IL-6, Trombopoyetina (TPO) y factor de célula madre (SCF) , utilizando ELISA (R&D Systems, Minneapolis, N) , en tres experimentos independientes. Los resultados se normalizaron por 1 X 106 células/ml. Medio de diferenciación de osteohlasto - La diferenciación osteogénica se estimó mediante el cultivo de células en un medio de diferenciación de osteoblasto que consiste de D EM suplementado con FCS al 10%, dexametasona 100 nM, 2-fosfato de ácido ascórbico 0.05 mM, B-glicerofosfato 10 mM, durante un periodo de 3 semanas. La matriz calcificada se indicó por el manchado de Rojo S Alizzarin y la fosfatasa Alcalina se detectó por el equipo de ensayo de fosfatasa Alcalina (todos los reactivos de Sigma-Aldrich, St . Lewis, MO) . RESULTADOS El Sistema de Biorreactor PluriX™ crea un microambiente similar fisiológico . Para hacer las condiciones de cultivo eficientes para células adherentes, un ambiente similar fisiológico (representado en la Figura la) se creó artificialmente, utilizando el Biorreactor PluriX (Pluristem, Haifa, Israel; el portador se ilustra en la Figura lg y se muestra antes del sembrado en la Figura Ib) . Como se muestra en las Figuras lc-f, las células 3D-ASC producidas de la médula ósea se cultivaron exitosamente y se expandieron sobre la matriz 3D, 20 días (Figuras lb-c, magnificada X 150 y 250 respectivamente) y 40 días (Figuras lc-d, magnificada X 350 y 500 respectivamente) después del sembrado. Las células cultivadas en el sistema de Biorreactor PluriX significantemente se expandieron - Las pérdidas de producción diferentes de las células 3D-ASC derivadas de la placenta se cultivaron en los sistemas de biorreactor PluriX. La densidad de sembrado fue 13,300 células/portador (a un total de 2 X 106 células) . Catorce días después del sembrado, la densidad células multiplicada por 15 veces, que alcanza aproximadamente 200,000 células/portador (Figura 2) o 30 X 106 en un biorreactor de 150 portadores. En un experimento a diferente, las células se sembraron en el biorreactor a densidad de 1.5 X 104 células/ml y 30 días después del sembrado los portadores contuvieron un número celular más alto 50 veces arriba, es decir aprox. 0.5 X 106 células/portador, o 0.5 X 107 células/ml. La densidad celular sobre los portadores en varios niveles de la columna de crecimiento fue consistente, indicando una transferencia homogénea de oxigeno y nutrientes a las células. El sistema de cultivo 3D asi se probó para proporcionar condiciones de soporte para el crecimiento y mantenimiento prolongado de cultivos celulares mesenquimales de alta densidad, que se pueden crecer eficientemente a una cantidad suficiente para el propósito de soportar injerto y transplante exitoso. 3D-ASCs muestran características de marcador de membrana únicas - Para definir la diferencia en el perfil de secreción de moléculas solubles y producción de proteina, efectuado por el procedimiento de cultivo 3D imitando el ambiente de hueso, se efectuaron los análisis de FACs . Como se muestra en la Figura 3a, los análisis de FACS de marcadores celulares representan que 3D-ASCS exhiben un patrón de expresión de marcador diferente que las células adherentes crecidas en condiciones 2D. Las células cultivadas 2D expresaron significantemente niveles más altos de marcadores de membrana positivos CD90, CD105, CD73 y CD29 de marcadores de membrana como es comparado con células cultivadas 3D. Por ejemplo, CD105 mostró un 56% de expresión en células cultivadas 3D contra 87% en células cultivadas 2D. Las ASCs de cultivos de placenta de tanto 2D como 3D, no expresaron cualquiera de los marcadores de membrana hematopoyéticos (Figura 3b). 3D-ASCs muestran un perfil único de factores solubles - El nicho hematopoyético incluyó células soportadoras que producen una abundancia de citoquinas, quimioquinas y factores de crecimiento. Para definir además la diferencia entre las ASCs cultivadas 2D y 3D, el perfil de la cuatro principales proteínas secretadas hematopoyéticas en el medio acondicionado de cultivos ASC de 2D y 3D se efectuó mediante ELISA. Las Figuras 4a-c muestran que las células crecidas en condiciones 3D produjeron el medio de condición con niveles más altos de ligando Flt-3 (Figura 4a), IL-60 (Figura 4b) y SCF (Figura 4c), mientras que los niveles bajos de IL-6, y cerrado al nivel cero del ligando Flt-3 y SCF, se detectaron en el medio de condición de cultivos 2D. La producción de Trombopoyetina (TPO) fue muy bajo e igual en ambos cultivos. 3D-ASCs muestra un perfil de proteína único en el análisis de espectrometría de masa - Para definir además la diferencia entre ASCs cultivadas 2D y 3D, el perfil de proteína de estas células se analizó mediante la espectrometría de masa. La Figura 4d muestra que ASCs cultivadas 2D y 3D muestran un perfil de expresión de proteína remarcablemente diferente. Como se muestra en la Tabla 1 enseguida, las células cultivadas 3D muestran un nivel de expresión mucho más alto de H2AF y ALDH X (más de 9 y 12 veces más alto, respectivamente) y un nivel más alto e las proteínas EEEF2, RCN2 y CNN1 (ca. 3, 2.5 y 2 veces, respectivamente) . Además, las células cultivadas 3D muestran ca . la mitad de los niveles de expresión de las proteínas Hnrphl y precursor de isoforma 2 de antígeno CD44 tercero de los niveles de expresión de Papss2 y rpL7a. Tabla 1 3D-ASCs tienen la capacidad para diferenciarse en osteoblastos - Para caracterizar además 3D-ASCs, las células se cultivaron en un medio de diferenciación de osteoblasto durante un periodo de 3 semanas. Después, la precipitación de calcio se efectuó. Las células diferenciadas se mostraron para producir calcio (representadas en rojo en las Figuras 5a-b) mientras que las células de control mantuvieron un fenotipo similar a fibroblasto y no demostraron mineralización (Figuras 5c-d) . Estos resultados muestran que 3D-ASC derivadas de la placenta tienen la capacidad para diferenciar células in vitro a osteoblastos . EJEMPLO 2 Estimación de la Habilidad de 3D-ASC derivadas de la placenta para mejorar el injerto HSC El soporte 3D-ASC de injerto HSC se evaluó por el nivel de células hematopoyéticas humanas (hCD45+) detectadas en ratones NOD-SCID inmune deficientes pretratados con quimioterapia o sub letalmente irradiados. MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Aislamiento de células CD34+ - Las muestras de sangre del cordón umbilical se tomaron bajo condiciones estériles durante el suministro (Bnei Zion Medical Center, Haifa, Israel) y las células mononucleares se fraccionaron utilizando la centrifugación de gradiente de densidad Lymphoprep (Axis-Shield PoC As, Oslo, Norway) y se criopreservaron . Las células mononucleares descongeladas se lavaron y se incubaron con anticuerpos anti-CD34 y se aislaron utilizando MACS midi (Miltenyl Biotech, Bergish Gladbach, Alemania) . Las células de más de una muestra se combinaron para lograr la cantidad deseada (50,000-100,000 células) . Detección de células transplantadas en ratones irradiados - Ratones NOD-SCID machos y hembras de siete semanas de edad (N0D-CB17-Prkdcscid/J; Harlan/Weizmann Inst., Rehovot Israel) se mantuvieron en jaulas de sistema abierto estériles, dando dietas estériles y agua acidica de autoclave. Los ratones se irradiaron sub letalmente (350 cGy) y después (48 hr de post irradiación) se transplantaron con 50,000-100,000 hCD34+ células, con o sin ASCs adicionales (0.5 X 106 - 1 X 106) derivadas de la placenta o tejido adiposo (3-7 ratones en cada grupo) , mediante la inyección intravenosa a una vena de la cola lateral. Cuatro a seis semanas después del transplante los ratones se sacrificaron por dislocación y la BM se recolectó al enjuagar tanto los fémures como las tibias con solución reguladora de FACS (50 mi de PBS, 5 mi de FBS, 0.5 mi de azida de sodio al 5%). Las células humanas en la BM de los ratones se detectaron mediante citometria de flujo y el porcentaje de las células que expresan marcador celular hematopoyético CD45 murino y humano en los ratones NOD-SCID tratados se efectuó al incubar células con CD45-FITC anti-humano (IQ Products, Groningen, Los Países Bajos). El umbral más bajo para el injerto humano inequívoco se diseñó a 0.5%. Detección de células transplantadas en ratones tratados con quimioterapia - Ratones NOD-SCID mchos de 6.5 semanas de edad (NOD. CB17/JhkiHsd-scid; Harían, Rehovot Israel) , se mantuvieron como es descrito anteriormente en la presente para ratones irradiados, se inyectaron intraperitonealmente con Busulfan (25 mg/kg- durante 2 días consecutivos) . Dos días después de la segunda inyección de Busulfan, los ratones se inyectaron con células CD34+ solas junto con 0.5 X 106 ASCs, producidas de la placenta. 3.5 semanas después del transplante, los ratones se sacrificaron y la presencia de células hematopoyéticas humanas se determinó como es descrito anteriormente en la presente para ratones irradiados. RESULTADOS Injerto mejorado de 3D-ASC de HSC en ratones irradiados - Células hematopoyéticas CD34 + humanas y 3D-ASC derivadas de la placenta o tejido adiposo se co-transplantaron en ratones NOD-SCID irradiados. La eficiencia de injerto se evaluó 4 semanas después del co-transplante y se comparó con ratones transplantados con HSC solo. Como se muestra en la Tabla 2 y la Figura 6, el co-transplante de células 3D-ASC y UCB CD34+ dio por resultado proporciones de injerto considerablemente más altas y niveles más altos de células humanas en la BM de ratones de recipiente comparados con ratones tratados con células UCB CD34+ solas. Tabla 2 Células transplantadas h-CD45 promedio STDEV CD34 3.8 7.9 CD34+3D-ASC de la placenta 5.1 12.2 CD34+3D-ASC del te ido 8.7 9.6 adiposo Injerto mejorado 3D-ASC de HSC en ratones tratados con quimioterapia - Las células hematopoyéticas CD34+ humanas Se co-transplantaron con 500 , 000-2D-ASC o 3D-ASC derivadas de la placenta, en ratones NOD-SCID pretratados con quimioterapia. La eficiencia de injerto se evaluó 3.5 semanas después del co-transplante y se comparó con ratones transplantados con HSC solos. Como se muestra en la Tabla 3, el co-transplante de células CD34 + de ASC y UCB dio por resultado niveles de injerto más altos en la BM de los ratones de recipiente se compararon con células CD34 + de UCB solas. Además, como se muestra en la Tabla 3, el nivel promedio de injerto fue más alto en ratones co-transplantados con células adherentes derivadas de la placenta crecidas en el sistema de biorreactor PluriX (3D-ASC) que en los ratones de co-transplante con células del mismo donador, crecidas en las condiciones de cultivo 2D estáticas convencionales (matraz) . Tabla 3 Células transplantadas h-CD45 Promedio STDEV CD34 0.9 1.1 CD34 + cultivos 2d 3.5 0.2 convencionales de la placenta CD34 + 3D-ASC de la 6.0 7.9 placenta Los resultados de análisis de FACS mostrados en las Figuras 7a-b demuestran que la ventaja de ASC de co-transplante con hHSCs (Figura 7b) y la habilidad de ASC para mejorar la recuperación del sistema hematopoyético después del transplante de HSC. Tomados conjuntamente, estos resultados muestran que ASCs puede servir como células de apoyo para mejorar la recuperación hematopoyética después del transplante de HSCs (autólogo o alogénico) . La habilidad de las 3D-ASCs para aumentar el injerto de célula madre hematopoyética y/o progenitora después del transplante de HSCs puede resultar de la habilidad 3D-ASC para secretar citoquinas de apoyo de HSC que pueden mejorar el albergamiento, la habilidad de auto-renovación y proliferación de las células transplantadas , o de la habilidad de aquellas células para reconstruir el daño del microambiente hematopoyético necesario para el albergamiento y proliferación de las HSCs transplantables. EJEMPLO 3 La supresión de respuesta de linfocxto mediante ASCs cultivadas 2D y 3D Las células estromales adherentes y particularmente 3D-ASCs, se encontraron para suprimir la reacción inmune de células mononucleares de sangre del cordón umbilical humanas en un ensayo MLR. MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Ensayo de reacción de linfocito mezclado (MLR) - Las propiedades inmunosupresoras e inmunoprivilegiadas de procedimientos de cultivo derivados de 2D y 3D de ASCs producidas de la placenta, se efectuaron mediante el ensayo MLR, que mide la histocompatibilidad en el sitio HLA, como es efectuado mediante la proporción de proliferación de linfocitos incompatibles en cultivos mezclados de células responsivas (proliferación) y estimulación (no proliferativas ) . Las células mononucleares de sangre del cordón umbilical humanas (CB) (2 X 105) se utilizaron como células responsivas y se estimularon por ser co-cultivadas con cantidades iguales (105) de Monocitos derivados de sangre periférica humana irradiada (PBMC) (3000Rad), o con células adherentes cultivadas 2D o 3D, producidas de la placenta, o una combinación de células adherentes y PBMCs . Cada ensayo se replicó tres veces. Las células se co-cultivaron durante 4 días en medio RPMI 1640 (que contiene FBS al 20% bajo atmósfera de C02 al 5% humidificada a 37°C) , en una placa de 96 cavidades. Las placas se pulsaron con 1 yC 3H-timidina durante las últimas 18 hr de cultivo. Las células luego se cosecharon sobre filtros de fibra de vidrio y la captación de timidina se cuantificó con un contador de centelleo. RESULTADOS La Figura 8 muestra la respuesta inmune de las células CB como es representado por la proliferación elevada de estas células cuando se estimularon con PBMCs, las cuales, sin que sean unidas por la teoría, probablemente está asociada con la proliferación de célula T en respuesta a la incompatibilidad de HLA. Sin embargo, un nivel considerablemente más bajo de respuesta inmune se exhibió mediante estas células cuando se incubaron con células adherentes de la presente invención. Además, la respuesta inmune de CB a PBMCs se redujo sustancialmente cuando se coincubó con estas células adherentes. Así, de una manera similar para MSCs, las ASCs se encontraron que tienen la habilidad potencial para reducir la proliferación de la célula T de células donadoras, típicas de GvHD. Aunque ambos cultivos, 2D y 3D, redujeron la respuesta inmune de los linfocitos, y la línea con las otras ventajas de 3D-ASCs descritas anteriormente en la presente, las ASCs 3D fueron más inmunosupresoras . Es apreciado que ciertas características de la invención, las cuales son, por claridad, descritas en el contexto de modalidades separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una modalidad individual. A la inversa, varias características de la invención, las cuales son, por claridad, descritas en el contexto de una modalidad individual, también se pueden proporcionar separadamente o en cualquier subcombinación adecuada. Aunque la invención se ha descrito en conjunción con modalidades especificas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones serán aparentes para aquellos expertos en la técnica. Por consiguiente, se propone abarcar todas de tales alternativas, modificaciones y variaciones que caen dentro del espíritu y amplio alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente y números de Acceso de GenBank mencionados en esta especificación son incorporados en la presente en su totalidad por referencia en la especificación, al mismo grado como si cada publicación individual, patente o solicitud de patente o número de Acceso de GenBank fuera específicamente e individualmente indicado para ser incorporado en la presente por referencia. Además, la cita o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no será considerada como una admisión de que tal referencia esté disponible como la técnica previa a la presente invención.

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para expansión de células, el método caracterizado porque comprende cultivar células adherentes de la placenta o tejido adiposo bajo condiciones de cultivo tridimensionales que soportan la expansión de células. 2. Un método para producir un medio acondicionado, el método caracterizado porque comprende (a) cultivar células adherentes de una placenta o tejido adiposo en condiciones de cultivo tridimensionales que permiten la expansión de células; y (b) recolectar un medio acondicionado de las células adherentes expandidas, para de esta manera producir el medio acondicionado. 3. Una población aislada de células que comprende células adherentes de la placenta o tejido adiposo, en donde las células adherentes se caracterizan por al menos uno de: (i) secreción de un nivel más alto de por lo menos un factor seleccionado del grupo que consiste de SCF, IL-6 y Flt-3 que aquel secretado por células adherentes de la placenta o tejido adiposo cultivadas en un cultivo 2D; (ii) expresión de un nivel más alto de por lo menos una proteina seleccionada del grupo que consiste de la familia de histona H2A (H2AF) , Aldehido deshidrogenasa X (ALDH X) , factor 2 de alargamiento de traducción eucariótica (EEEF2), reticulocalbina 3, dominio de enlace de calcio EF-manual
2. (RCN2) y músculo liso básico 1 de calponina (CNN1) que aquella expresada por células adherentes de la placenta o tejido adiposo cultivadas en un cultivo 2D; y (iii) expresión de un nivel más bajo de por lo menos una proteina seleccionada del grupo que consiste de ribonucleoproteina Hl nuclear heterogénea (Hnrphl), precursor de isoforma 2 de antigeno CD44, isoforma 2 de 3 fosfoadenosina 5 fosfosulfato sintasa
3. (Papss2) y proteina L7a ribosomal (rpL7a) que aquella expresada por las células adherentes de la placenta o tejido adiposo cultivadas en un cultivo 2D. (iiii) una actividad inmunosupresora más alta que aquella de las células adherentes de la placenta o tejido adiposo cultivadas en un cultivo 2D.
4. 4. Una población aislada de células de conformidad ivindicación 3, caracterizada porque la actividad inmunosupresora comprende reducción en la proliferación de células T.
5. 5. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende, como un ingrediente activo, la población de células generadas de conformidad con la reivindicación 1.
6. 6. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende, como un ingrediente activo, la población aislada de células de la reivindicación 3.
7. 7. Uso de células adherentes de una placenta o un tejido adiposo, caracterizado porque es para la manufactura de un medicamento identificado para transplante.
8. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el cultivo tridimensional comprende un biorreactor 3D.
9. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el cultivo se efectúa por al menos 3 días.
10. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el cultivo se efectúa hasta que las células adherentes alcanzan por lo menos 60% de confluencia.
11. 11. El método, población de células o uso de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3 o 7, caracterizado porque las células adherentes comprenden un arreglo de expresión de marcador positivo seleccionado del grupo que consiste de CD73, CD90, CD29 y CD105.
12. 12. El método, población de células o uso de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3 o 7, caracterizado porque las células adherentes comprenden un arreglo de expresión de marcador negativo seleccionado del grupo que consiste de CD45, CD80, HLA-DR, CDllb, CD14, CD19, CD34 y CD79.
13. 13. El método, población de células o uso de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3 o 7, en donde las células adherentes o el medio se caracterizan por una actividad inmunosupresora más alta que aquella de las células adherentes de la placenta o tejido adiposo cultivadas en un cultivo 2D.
14. 14. El método, población de células o uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 o 7, caracterizado porque las células comprenden células que tienen un fenotipo de célula madre estromal.
15. 15. El uso de conformidad con la reivindicación 7, en donde las células adherentes se caracterizan por al menos uno de : (i) secreción de un nivel más alto de por lo menos un factor seleccionado del grupo que consiste de SCF, IL-6 y Flt-3 que aquel secretado por células adherentes de la placenta o tejido adiposo cultivadas en un cultivo 2D; (ii) expresión de un nivel más alto de por lo menos una proteina seleccionada del grupo que consiste de la familia de histona H2A (H2SF) , Aldehido deshidrogenasa X (ALDH X) , factor 2 de alargamiento de traducción eucariótica (EEEF2), reticulocalbina 3, dominio de enlace de calcio de EF-manual (RCN2) y músculo liso básico 1 de calponina (CNN1) que aquella expresada por células adherentes de la placenta o tejido adiposo cultivadas en un cultivo 2D; (iii) expresión de un nivel más bajo de por lo menos una proteina seleccionada del grupo que consiste de ribonucleoproteina Hl nuclear heterogénea (Hnrphl), precursor de isoforma 2 de antigeno CD44, isoforma 2 de 3 fosfoadenosina 5 fosfosulfato sintasa (Papss2) y proteina L7a ribosomal (rpL7a) que aquella expresada por las células adherentes de la placenta o tejido adiposo cultivadas en un cultivo 2D; y (iiii) una actividad inmunosupresora más alta que aquella de las células adherentes de la placenta o tejido adiposo cultivadas en un cultivo 2D.
16. 16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque las células adherentes se obtienen de un cultivo tridimensional.
17. 17. El uso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque las células adherentes se obtienen de un cultivo bidimensional .
18. 18. El uso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el transplante se utiliza para una condición seleccionada del grupo que consiste de deficiencia de células madre, enfermedad del corazón, enfermedad de Parkinson, cáncer, enfermedad de Alzheimer, apoplejía, quemaduras, pérdida de tejido, pérdida de sangre, anemia, desórdenes autoinmunes, diabetes, artritis, Esclerosis Múltiple, enfermedad de injerto contra hospedero (GvHD) , desórdenes neurodegenerativos, encefalomielitis autoinmune (EAE) , lupus eritematoso sistémico (SLE) , artritis reumatoide, esclerosis sistémica, síndrome de Sjorgen, esclerosis múltiple (MS) , Miastenia Grave (MG) , Síndrome de Guillain-Barré (GBS ) , Tiroiditis de Hashimoto (HT) , Enfermedad de Graves, Diabetes Mellitus dependiente de Insulina ( IDDM) y Enfermedad de Intestino Inflamatorio.