KR101557256B1 - 세포 증식 방법 및 세포의 용도 및 치료를 위해 그 세포에 의해 제조되는 조절된 배지 - Google Patents

세포 증식 방법 및 세포의 용도 및 치료를 위해 그 세포에 의해 제조되는 조절된 배지 Download PDF

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Abstract

세포 증식 방법이 제공된다. 이 세포 증식 방법은 태반 또는 지방 조직으로부터 부착 세포를 세포의 증식을 지속시켜 주는 3차원 배양 조건 하에서 배양하는 단계를 포함한다.

Description

세포 증식 방법 및 세포의 용도 및 치료를 위해 그 세포에 의해 제조되는 조절된 배지{Methods For Cell Expansion And Uses Of Cells And Conditioned Media Produced Thereby For Therapy}
본 발명은 세포 증식 방법, 이 방법에 의해 생성된 세포 개체군 및 그 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 (전체 PCT를 따라) 태반 또는 지방조직의 부착 세포를 증식하는 방법 및 그 세포의 치료적 용도(예를 들면, HSC 이식)에 관한 것이다.
발전하고 있는 의학계에서, 세포 이식 및 조직 공학을 위해 대량의 성체 줄기세포에 대한 수요가 점차 증대되고 있다. 또, 성체 줄기세포 치료법은 조혈 질환, 심장 질환, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 뇌경색, 화상, 근디스트로피(muscular dystrophy), 자기면역 질환, 당뇨 및 관절염과 같은 다양한 증상의 치료용으로 지속적으로 개발되고 있다.
골수계 및 임파계 양자의 모든 혈구 유형을 발생시키는 전구 세포이다. 이식된 HSC에 의한 이식 및 조혈 개시는 피제공자 골수(recipient BM) 내에서의 이들 세포의 호밍(homing) 능력 및 증식 능력에 의존한다.
줄기세포는 세포-세포 접촉 또는 단범위 상호작용을 통해 분화 및 자기회복을 종합적으로 조절하는 분자신호(molecular signals)를 제공하는 골수 내의 다수의 불연속적 적소(discrete niches)와 밀접한 관련성이 있다는 것이 널리 받아들여지고 있다. 이들 적소는 골수세포, 즉 매크로파아지, 섬유아세포, 함지방세포 및 내피세포로 구성된 조혈 유도 미세환경(hematopoietic inductive microenvironment; HIM)의 일부분이다. 골수 세포는 세포-세포 접촉을 촉진시키는 세포외 기질 단백질(extra cellular matrix; ECM) 및 기저막을 제공하는 것에 의해 기능적 통합성을 유지한다. 골수 세포는 또 제어된 조혈 세포 분화 및 증식에 필요한 다양한 가용성 사이토카인 또는 상주성(resident) 사이토카인을 제공한다.
HSC 및 기질 사이의 상호작용은 HSC의 생존능력의 보존 및 그 분화의 방지를 위해 필요하다. HSC의 이식 후, 이식된 HSC는 골수(BM) 미세환경 내로 호밍되어야 하고, 조절 줄기세포가 증식 및 분화되기 전 적합한 적소 내에 도입되어야 한다. 호밍 과정 중, 이식된 HSC는 혈류를 이탈하여, 전용의 적소(dedicated niches)에 도달하기 위해 골수의 내피세포벽을 통과하는 케모카인의 구배를 따라 이동한다. 다음에 제공자 HSC는 조혈 적소 내로 호밍되어야 하고, 이곳에서 HSC의 분열을 위해 더욱 유리한 미세환경에 노출되고, 이곳에서 HSC와 간엽세포 사이 및 ECM과 분비된 성장인자 사이에 연속적, 물리적 및 화학적 접촉이 형성될 수 있다. 이들 모든 과정은 사이토카인, 케모카인, 호르몬, 스테로이드, ECM, 성장인자, 세포-세포 상호작용 단백질, 접착 단백질, 및 기질 단백질과 같은 복잡한 분자 배열을 수반한다.
골수 전용의 적소 내에 이식된 총 세포의 수는 HSC 이식의 성공의 기초가 된다. 이식을 달성하기 위해, 혈류 내에 이식되는 제공자 HSC는 피제공자 공구 내에 호밍되어야 하고, 여기서 기능적 조혈 증식소(hematopoiesis foci)를 생성한다. 이들 기능적 조혈 증식소의 수는 수혈된 총 HSC에 이식효율을 곱한 값으로 결정된다.
HSC 이식에 수반되는 중요한 문제점들 중의 하나는 이들 세포의 수용체계(acceptor system) 내에서의 낮은 생존율이다. 정맥주사에 의해 이식된 HSC는 이식 후 수분 내에 혈류로부터 제거되고 골수 내에서 가시화된다는 것이 입증되어 있다. HSC 이식 후 3 내지 5시간 경과 시, 피제공자의 말초혈액 내에서 제공자 세포가 전혀 검출되지 않는다[Askenasy et al 2002 Transplanted hematopoietic cells seed in clusters in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20:301-10]. 이식된 세포의 대부분이 이식된 직후에 파괴된다. 따라서, 피제공자의 골수의 정착(colonization)은 저효율이고, 이식 후 2-3일 경과 시 피제공자의 골수 내에서 이식된 세포의 겨우 1-5%만이 검출된다[Kerre et al 2001 2001 Both CD34+38+ and CD34+38- cells home specifically to the bone marrow of NOD/LtSZ scid/scid mice but show different kinetics in expansion. J Immunol. 167:3692-8; Jetmore et al 2002 2002 Homing efficiency, cell cycle kinetics, and survival of quiescent and cycling human CD34(+) cells transplanted into conditioned NOD/SCID recipients. Blood. 99:1585-93].
간엽 간질세포(Mesenchymal Stromal Cells; MSCs)는 상이한 유형의 간엽 성숙 세포로 분화할 수 있는 불균일 세포 개체군이다. 상기 세포들의 망상 내피세포, 섬유아세포, 함지방세포, 및 골형성 전구세포로의 분화는 다양한 생물활성 인자의 영향에 의존한다.
HSC의 이식을 지지하기 위한 MSC의 용도가 본 기술분야에 공지되어 있다. 다수의 간행물에서 HSC의 이식 효율이 간엽 줄기 세포와 공동 이식되는 경우에 더욱 향상됨이 입증되었다[Gurevitch et al 1999 1999 Transplantation of allogeneic or xenogeneic bone marrow within the donor stromal microenvironment. Transplantation. 68:1362-8; Fan et al 2001 2001 Successful allogeneic bone marrow transplantation (BMT) by injection of bone marrow cells via portal vein: stromal cells as BMT-facilitating cells. Stem Cells. 19:144-50]. 인간-양 이식 모델에서 인간 MSC의 공동 이식에 의해 동물 내의 인간 HSC 키메라 골수(human HSC chimeric BM)의 장기간 이식이 개선된다는 것도 입증되어 있다[Almeida-Porada et al 2000]. 면역전 양의 태아 내에 인간 간질세포 전구체의 공동 이식에 의해 혈류 내에 인간 제공자 세포가 조기에 출현하고, 이식 후의 다수의 시점에서 골수 내에 세포 농도를 증대시켜 준다[Blood. 95:3620-7]. HSC 및 MSC의 동시 주입은 조혈을 촉진시켜 준다는 것이 발견되었다[Zhang et al 2004. Stem Cells 22:1256-62]. 최근, 이들 발견은 보다 유사한 동물 모델-적모원숭이(Rhesus monkey)까지 확장되었다. 단상-동일(haplo-identical) HSC 및 간엽 줄기세포가 공동 이식되는 경우, HSC의 이식이 촉진되는 것이 입증되었다[Liu et al 2005 Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 26:385-8]. 인간 피험체에서 HSC의 이식을 촉진하기 위해 간엽 줄기세포를 이용하는 것도 최근에 보고되었다. [Koc ON, J Clin Oncol. 2000;18:307-316; Lazarus HM, Biol Blood Marrow Transplant. 2005 May;11(5):389-98].
조혈 이식에 대한 MSC의 기여는 HSC의 호밍 및 증식에 필요한 손상된 조혈 미세환경의 재건시 및 이식편대숙주병(Graft vs. Host Disease; GvHD)의 원인이 될 수 있는 제공자 유래의 T세포의 억제 시, 호밍, 자기회복 및 커밋먼트 포텐셜(commitment potential)의 조절 및 밸런싱을 도와주는 HSC를 생성하는 것에 있다[Charbord P., and Moore, K., Ann . N.Y. Acad . Sci 1044: 159-167 (2005); US patent nos. 6,010,696; 6555374]. 예를 들면, 마이트라(Maitra)의 연구[Maitra B, et al, Bone Marrow Transplant. 33(6):597-604. (2004)]에서, 인간 간엽 줄기세포는 비관련 제공자 HSC 및 NOD-SCID 마우스 모델의 억제된 T세포 활성을 지지함으로써 비관련 인간 골수 유래의 간엽 줄기세포가 동종 이식(allogeneic transplantation)의 결과를 향상시킬 수 있다는 것이 발견되었다.
간엽 줄기세포의 사용시의 중대한 장애는 이들 세포의 정상 발생 군체를 다량으로 단리시키는 것이 곤란하다는 것이다. 이것은 기술적으로 곤란하고 부분적으로 한정된 세포의 양에 기인되어 비용이 고가이다. 간엽 줄기세포의 가장 분명한 발생원은 골수이지만 골수 채취시의 상당한 불쾌감과 생체검사의 위험성은 이들 방법의 결점이다. 인간배아 및 태아는 독립된 생명을 구성한다는 광범위한 믿음은 인간배아를 줄기세포의 문제시되는 발생원으로 만들었고, 기존의 윤리적 곤란성에 종교적 및 윤리적 관점이 더해졌다.
줄기세포의 채취를 위한 대안적 근원을 색출하는 연구가 최근에 시도되었다. 이와 같은 대안적 줄기세포의 근원은 예를 들면 지방조직, 모낭, 고환, 인간 후점막, 배아 난황낭, 태반, 청년기 피부, 및 혈액(예, 제대혈 및 심지어 생리혈)이다. 그러나, 대안적 줄기세포의 근원으로부터 치료목적 및 연구목적에 적절한 양의 줄기세포를 채취하는 것은 여전히 한계가 있고, 제공자나 환자로부터 세포 또는 조직의 채취, 인비트로에서 세포의 배양 및/또는 증식, 상세분석 등에 일반적으로 많은 시간과 노력이 필요하다.
태반은 어떤 불쾌감이나 윤리적 구속도 결부되지 않는 가장 접근이 용이한 줄기세포의 근원 중의 하나로 생각된다. 태반 유래의 간엽 줄기세포는 골수 유래의 HSC와 유사한 특성을 가지는 것이 발견되었다. 이들 세포는 플라스틱-어디히어런트(plastic-adherent)성을 가지고, CD105, CD73 및 CD90 세포막 마커를 발현하고, CD45, CD34, CD14, CD19 및 HLA-DR 표면분자의 발현이 결핍된다. 그러나, 골수 유래의 간엽 줄기세포와 달리 인터페론-γ를 이용하여 처리된 태반 유래의 간엽 줄기세포(PD-MSCs)는 HLA-DR을 극소량 업조절(upregulated)하였다. 더욱, 태반 유래의 간엽 줄기세포(PD-MSCs)는 인터페론-γ의 존재 하에서 강화되는 면역억제 특성을 표출한다[Chang CJ, Yen ML, Chen YC, Chien CC, Huang HI, Bai CH, Yen BL. Placenta-derived Multipotent Cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma. Stem Cells. 2006 Nov;24(11):2466-77].
MSC 마커 이외에 PD-MSC는 SSEA-4, TRA-1-61, 및 TRA-1-80의 ESC 표면 마커를 표출한다. 이것은 PD-MSC가 매우 원시적인 세포임을 시사한다[Yen BL, Huang HI, Chien CC, Jui HY, Ko BS, Yao M, Shun CT, Yen ML, Lee MC, Chen YC. Isolation of multipotent cells from human term placenta. Stem Cells. 2005;23(1):3-9]. 더욱, 골수 유래의MSC가 아닌 PD-MSC(태아 기원)는 세포간 인간 백혈구 항원-G(HLA)에 대해 양성이다(Chang CJ, Yen ML, Chen YC, Chien CC, Huang HI, Bai CH, Yen BL. Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma. Stem Cells. 2006 Nov;24(11):2466-77.)
다수의 연구는 PD- MSC의 증식 가능성은 성체 골수 유래의 MSC의 증식 가능성에 비해 상당히 높다는 것을 보여주었다(Yen BL, Huang HI, Chien CC, Jui HY, Ko BS, Yao M, Shun CT, Yen ML, Lee MC, Chen YC. Isolation of Multipotent cells from Human Term Placenta. Stem Cells. 2005;23(1):3-9; M.J.S. de Groot-Swings, Frans H.J. Claas, Willem E. Fibbe and Humphrey H.H. Pieternella S. in 't Anker, Sicco A. Scherjon, Carin Kleijburg-van der Keur, Godelieve. Placenta Isolation of Mesenchymal Stem Cells of Fetal or Maternal Origin from Human. Sem Cells ,2004;22;1338-1345.). 또, 태반 유래의 부착 세포는 골아세포, 함지방세포 및 연골아세포로 분화될 수 있다. 골수 유래의 MSC와 마찬가지로, 태반 유래의 MSC도 제대혈(UCB) 임파구 증식을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 HSC 및 태반 유래의 MSC의 조합된 이식은 피제공자의 이식편대숙주병(GvHD)의 발병의 가능성을 줄여줄 수 있다는 것을 시사한다[Li CD, et al., Cell Res. Jul;15(7):539-47 (2005)], and can enhance hematopoietic support [ZhangYi et al., Chinese Medical Journal117(6): 882-887 (2004)]. 양막 상피세포(amniotic epithelial cells)의 근원으로서 태반을 사용하는 것는 예를 들면 WO 00/73421에 개시되어 있다. 그러나, 이들 세포를 채취하는 것은 여전히 많은 시간과 노력이 필요하고, MSC의 수율로 매우 낮다.
MSC의 제한된 양에 관련된 문제를 해결하기 위한 다른 방법은 상이한 배양조건을 이용한 엑스비보(ex - vivo) 증식이다[예, 미국특허 US 6,326,198; 6,030,836; 6,555,374; 6,335,195; 6,338,942]. 그러나, 상기 방법의 결점은 많은 시간이 소요되고, 특별한 선택 및 단리 수순이 필요하다는 것으로서, 이것은 고비용 및 까다로운 절차의 원인이 된다.
다수의 연구에서 3차원 세포 배양법이 수율에 더욱 효과적이라는 것이 밝혀졌다[Ma T, et al., Biotechnology Progress. Biotechnol Prog 15:715-24 (1999); Yubing Xie, Tissue Engineering 7(5): 585-598 (2001)]. MSC의 자연 환경을 모방한 3차원 배양 수순의 사용은 폴리액티브 폼(Polyactive foams)[Wendt, D. et al., Biotechnol Bioeng 84: 205-214, (2003)]을 수용하는 관류 바이오리액터, 레이디얼 플로우 관류 바이오리액터(Radial-flow perfusion bioreactor) 내에 관형 폴리-L-유산(tubular poly-L-lactic acid; PLLA) 다공질 스캐폴드(scaffolds)[Kitagawa et al., Biotechnology and Bioengineering 93(5): 947-954 (2006)], 및 조혈 줄기세포의 성장 및 증식을 위한 플러그 플로우 바이오리액터(plug flow bioreactor)[미국특허 US 6,911,201] 내에 세포를 접종하는 단계에 기초한다.
간질세포를 부착하는 3차원 프레임워크는 미국특허 US 6,022,743에서 제안되었고, 스펀지 콜라겐은 호세인카니(Hosseinkhani, H) 등[Tissue Engineering 11(9-10): 1476-1488 (2005)]에 의해 3차원 기질로서 제안되었다. 그러나, HSC 이식 후 HSC의 인비보 이식을 지지하기 위한 상기 조건 하에서 성장되는 MSC의 용도는 이들 연구의 어느 것에서도 제안되지 않았다. 또, 다양한 조건(예, 관류 조건)의 최적화를 위한 시간 또는 특수한 세포 유형에 대한 다양한 단리 기술도 필요하다.
MSC의 배양을 위한 3차원 반응기로서의 관류된 분만 후 태만의 용도는 미국특허 US 7045148 및 미국특허출원 US20020123141, US20030032179 및 US2005011871에서 제안되었다. 그러나, 이 방법은 태반의 단리 후 최대 24시간 내에 실시되어야 하며, 관류가 수반되므로 세포의 질량 성장 및 그 장기간 유지가 불가능하다.
따라서, 전술한 한계를 극복하는 새로운 세포의 증식방법, 그 세포의 용도, 및 치료용으로 그 세포에 의해 제조되는 조절된 배지의 필요성이 광범위하게 인식되고 있다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 세포의 증식을 지원하는 3차원 배양 조건 하에서 태반 또는 지방 조직으로부터 유래된 접착 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 증식 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 조절 배지의 생산 방법으로서, 세포의 증식을 허용하는 3차원 배양 조건 하에서 태반 또는 지방 조직으로부터 유래된 접착 세포를 배양하는 단계; 및 상기 증식된 접착 세포의 조절된 배지를 수집하고, 그 결과 상기 조절된 배지를 생산하는 단계를 포함하는 조절 배지의 생산 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 상기와 같은 방법에 따라 생성되는 세포의 개체군이 제공된다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 태반 또는 지방조직의 접착 세포를 포함하는 세포의 단리된 개체군으로서, 상기 접착 세포는 SCF, IL-6, 및 Flt-3으로 구성된 그룹으로부터 선택된 최소 하나 이상의 인자를 2D 배양물 내에서 성장된 태반 또는 지방 조직의 접착 세포에 의해 분비되는 것보다 높은 수준으로 분비하는 세포의 단리된 개체군이 제공된다.
본 발명의 추가의 관점에 따르면, 태반 또는 지방조직의 접착 세포를 포함하는 세포의 단리된 개체군으로서, 상기 접착 세포는 H2A 히스톤 패밀리(H2AF), 알데히드 디하이드로제나아제 X(ALDH X), 진핵성 번역 신장 인자 2(EEEF2), 레티큘로칼빈 3, EF-핸드 칼슘 결합 도메인(RCN2) 및 칼포닌 1 염기성 평활근(CNN1)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 최소 하나 이상의 단백질을 2D 배양물 내에서 성장된 태반 또는 지방 조직의 접착 세포에 의해 발현되는 것보다 높은 수준으로 발현하는 세포의 단리된 개체군이 제공된다.
본 발명의 추가의 관점에 따르면, 태반 또는 지방조직의 접착 세포를 포함하는 세포의 단리된 개체군으로서, 상기 접착 세포는 불균일핵 리보뉴클레오단백질 H1(Hnrph1), CD44 항원 이소형 2 전구체, 3 포스포아데노신 5 포스포설페이트 산타아제 2 이소형 a(Papss2) 및 리보솜 단백질 L7a(rpL7a)로 구성된 그룹으로부터 선택된 최소 하나 이상의 단백질을 2D 배양물 내에서 성장된 태반 또는 지방 조직의 접착 세포에 의해 발현되는 것보다 낮은 수준으로 발현하는 세포의 단리된 개체군이 제공된다.
본 발명의 추가의 관점에 따르면, 태반 또는 지방조직의 접착 세포를 포함하는 세포의 단리된 개체군으로서, 상기 접착 세포는 2D 배양물 내에서 성장된 태반 또는 지방 조직의 접착 세포의 것보다 높은 면역억제 활성을 특징으로 하는 세포의 단리된 개체군이 제공된다.
후술되는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 면역억제 활성은 T세포 증식의 감소를 포함한다.
본 발명의 추가의 관점에 따르면, 상기한 바와 같은 방법에 따라 생성된 세포의 개체군을 하나의 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가의 관점에 따르면, 상기한 바와 같은 방법에 따라 생산된 조절된 배지를 하나의 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가의 관점에 따르면, 상기한 내용에 따른 단리된 세포 개체군을 하나의 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가의 관점에 따르면, 피험체 내의 간질세포의 이식이 유리할 수 있는 증상을 치료하는 방법으로서, 태반 및 지방조직으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 조직의 접착 세포를 치료적으로 유효한 양만큼 상기 피험체에게 투여하는 단계 및 그 결과 상기 피험체 내의 줄기세포 이식이 유리할 수 있는 증상을 치료하는 단계를 포함하는 피험체 내의 간질세포의 이식이 유리할 수 있는 증상을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 관점에 따르면, 피험체 내의 간질세포의 이식이 유리할 수 있는 증상을 치료하는 방법으로서, 태반 및 지방조직으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 조직으로부터 유래되는 접착 세포의 조절된 배지를 치료적으로 유효한 양만큼 상기 피험체에게 투여하는 단계 및 그 결과 상기 피험체 내의 줄기세포 이식이 유리할 수 있는 증상을 치료하는 단계를 포함하는 피험체 내의 간질세포의 이식이 유리할 수 있는 증상을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 관점에 따르면, 피험체 내의 면역 반응을 감소시키는 방법으로서, 피험체의 면역 반응을 감소시키기 위해 제 3 항 내지 제 7 항의 세포의 단리된 개체군을 치료적으로 유효한 양만큼 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 피험체 내의 면역 반응을 감소시키는 방법이 제공된다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 피험체는 세포요법에 의해 치료된다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 치료 방법은 줄기세포를 투여하는 단계를 더 포함한다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 줄기세포는 조혈 줄기세포를 포함한다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 줄기세포는 상기 조절된 배지 또는 접착 세포와 동시에 투여된다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 줄기세포는 상기 조절된 배지 또는 접착 세포의 투여 후에 투여된다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 접착 세포는 3차원 배양으로부터 얻어진다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 접착 세포는 2차원 배양으로부터 얻어진다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 증상은 줄기세포 결핍증, 심장병, 파킨슨병, 암, 알츠하이머병, 뇌경색, 화상, 조직의 상실, 혈액의 상실, 빈혈, 자기면역질환, 당뇨병, 관절염, 다발성 경화(Multiple Sclerosis), 이식편대숙주병(GvHD), 신경변성장해, 자기면역성 뇌척수염(EAE), 전신성 홍반성 낭창(SLE), 류마치스성 관절염, 전신성 경화증, 스요르겐 증후군(Sjorgen's syndrome), 다발성 경화(MS), 중증근무력증(MG), 귈라인-바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome; GBS), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's Thyroiditis; HT), 그레이브스 병(Graves's Disease), 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM) 및 염증성 대장염으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 3차원 배양은 3D 바이오리액터를 포함한다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 바이오리액터는 플러그 플로우 바이오리액터, 연속 교반 탱크 바이오리액터 및 정지상 바이오리액터로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 세포의 배양은 배양 배지의 연속 유동 하에서 수행된다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 3차원 배양물은 폴리에스테르, 폴리알킬렌, 폴리플루오로클로로에틸렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 폴리설폰, 셀룰로오스 아세테이트, 글래스 파이버, 세라믹 입자, 마트리겔(matrigel), 세포외 기질 성분(예, 피브로넥틴(fibronectin), 콘드로넥틴(chondronectin), 라미닌(laminin)), 콜라겐, 폴리 L 유산 및 불활성 금속 파이버로 구성된 그룹으로부터 선택되는 접착 물질을 포함한다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 배양은 최소 3일 동안 수행된다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 배양은 최소 3일 동안 수행된다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 배양은 상기 접착 세포가 최소 60%의 융합에 도달할 때까지 수행된다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 증상은 조혈 줄기세포의 이식의 촉진으로부터 이익을 받을 수 있는 증상이다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 접착 세포는 CD73, CD90, CD29 및 CD105으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 양성 마커 발현 어레이를 포함한다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 접착 세포는 CD45, CD80, HLA-DR, CD11b, CD14, CD19, CD34 및 CD79으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 음성 마커 발현 어레이를 포함한다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 접착 세포는 SCF, Flt-3 및 IL-6으로 구성된 그룹으로부터 선택된 최소 하나 이상의 인자를 2D 배양물 내에서 성장된 태반 또는 지방 조직의 접착 세포에 의해 분비되는 것보다 높은 수준으로 분비한다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 접착 세포는 H2A 히스톤 패밀리(H2AF), 알데히드 디하이드로제나아제 X(ALDH X), 진핵성 번역 신장 인자 2(EEEF2), 레티큘로칼빈 3, EF-핸드 칼슘 결합 도메인(RCN2) 및 칼포닌 1 염기성 평활근(CNN1)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 최소 하나 이상의 단백질을 2D 배양물 내에서 성장된 태반 또는 지방 조직의 접착 세포에 의해 발현되는 것보다 높은 수준으로 발현한다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 접착 세포는 불균일핵 리보뉴클레오단백질 H1(Hnrph1), CD44 항원 이소형 2 전구체, 3 포스포아데노신 5 포스포설페이트 산타아제 2 이소형 a(Papss2) 및 리보솜 단백질 L7a(rpL7a)로 구성된 그룹으로부터 선택된 최소 하나 이상의 단백질을 2D 배양물 내에서 성장된 태반 또는 지방 조직의 접착 세포에 의해 발현되는 것보다 낮은 수준으로 발현한다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 접착 세포 또는 배지는 2D 배양물 내에서 성장된 태반 또는 지방조직의 접착세포의 것보다 높은 면역억제 활성을 특징으로 한다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 면역억제 활성은 T세포 증식의 감소를 포함하는 것을 특징으로 한다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 세포는 간질 줄기세포 표현형을 가지는 세포를 포함하는 것을 특징으로 한다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 간질 줄기세포 표현형은 T세포 억제 활성을 포함한다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 간질 줄기세포 표현형은 조혈 줄기세포 지지 활성을 포함한다.
기술된 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 전술한 세포의 개체군의 용도는 이식이 동정되는 약제의 제조용이다.
본 발명은 본 발명은 신규의 세포 증식 방법 및 그 세포의 용도 및 치료를 위해 그 세포에 이해 생산된 조절된 배지를 제공하는 것에 의해 공지의 구성의 결점을 성공적으로 극복한다.
본 명세서에 사용된 모든 기술용어 및 과학용어는 다른 정의가 없으면 본 발명이 속하는 기술분야의 통상 전문가에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 이용될 수도 있으나, 후술되는 방법 및 물질이 적합하다. 불일치의 경우, 다수의 정의(definitions)를 포함하는 본 명세서가 우선한다. 또, 물질들, 방법들, 및 실시예들은 설명을 위한 것일 뿐이며, 이들이 본 발명을 제한하지 않는다.
본 발명은 새로운 세포 증식 방법 및 세포의 용도 및 줄기세포 관련 치료를 위해 상기 세포에 의해 생성된 조절 배지, 줄기세포 이식 및 HSC 지지체(support)에 관한 것이다.
본 발명의 원리 및 작용은 도면 및 실시예의 설명을 참조하면 더 쉽게 이해될 수 있다.
본 발명의 적어도 하나의 실시예를 설명하기에 앞서, 본 발명은 그 적용분야가 후술하는 기재 내용 또는 실시예에 의해 예시되는 기재 내용에 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 본 발명은 다른 실시예가 가능하거나 다양한 방법으로 실시될 수 있다. 또, 본 명세서에 사용된 용어는 설명을 위한 것으로서 한정적인 용어로서 간주되지 않아야 한다.
발전하고 있는 의료계에서, 임상적 목적 및 연구 목적으로 줄기세포, 특히 간질 줄기세포(간엽 줄기세포라고도 함)의 필요성이 증대하고 있다. MSC는 HSC 이식(transplantation; engraftment)의 지지를 위해 사용되고, 또 예를 들면 심장병, 골수(BM) 결핍증, 신경세포 관련 질병, 및 장기이식 또는 조직이식이 필요한 증상들과 같은 다수의 증상의 치료에 이용된다.
줄기세포를 사용함에 있어 장애물은 줄기세포나 전구세포의 정상 발생 개체군을 다량으로 단리하는 기술상의 곤란성에 있다. 이것은 대부분의 조직 내에 이들 세포의 양이 한정되어 있다는 것과, 현재의 줄기세포의 채취를 위한 과정에 관련된 불쾌감 및 위험성, 기억 B세포 및 조혈 줄기세포의 손실이 그 원인이다. 인간 배아로부터 세포를 채취하는 것은 기존의 기술상의 곤란성에 종교적 관점 및 윤리적 관점을 추가한다.
골수 유래의 줄기세포의 대안적 채취원은 지방 조직 및 태반이다. 그러나, 현재 상기 조직으로부터 줄기세포를 효과적으로 증식시키는 방법이 존재하지 않는다.
본 발명의 실시 중에, 본 발명자들은 태반 조직 또는 지방 조직의 접착 세포는 3D 배양 조건 하에서 효과적으로 증식될 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 상기 세포들은 MSC의 것과 유사한 기능적 특성을 포함하므로 이들 세포 및 이들 세포로부터 생산된 조절된 배지는 이식, 조직 재생 및 인비보 HSC 지지체와 같은 치료적 목적을 위해 사용될 수 있다는 놀라운 사실을 발견하였다.
이하 및 후술되는 실시예란에 설명되어 있는 바와 같이, 본 발명자들은 3D 조건 하에서 간질 줄기세포의 특성을 포함하는 지방 및 태반 유래의 접착 세포를 증식시킬 수 있었다. 이와 같이 증식된 세포는 접착 및 재생 실험(실시예 1 참조)에서 입증되는 바와 같이 동결보존 후 생존능력이 있음이 밝혀졌다. 태반 유래의 접착 세포의 플로우 사이토메트리 분석에 의해 현저한 마커 발현 패턴이 밝혀졌다(도 3의 a 및 b). 2D 또는 3D 조건에서 증식된 지방 및 태반 유래의 접착 세포는 임상에서 간질 줄기세포로서 본 발명의 세포의 용도를 구체화하는 HSC 이식(실시예 2)을 지지할 수 있다는 것이 가장 중요하다.
따라서, 본 발명의 일 관점에 따르면, 세포 증식 방법이 제공된다.
이 세포 증식 방법은 세포 증식을 지지하는 3차원(3D) 배양 조건 하에서 태반 또는 지방조직의 접착세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "증식하는(expanding)" 및 "증식(expansion)"이라는 용어는 세포의 실질적 무분화 유지(differentiationless maintenance) 및 궁극적인 세포 증식, 즉 개체군의 증가에 따른 분화가 없는 세포 개체군의 증가(예, 최소 2배 이상)를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "유지하는(maintaining)" 및 "유지(maintenance)"라는 용어는 실질적 무분화 세포 갱신(differentiationless cell renewal), 즉 정지 상태에 수반되는 분화가 없는 실질적 정지 상태의 세포 개체군을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "접착 세포(adherent cells)"라는 용어는 고정상태(anchorage) 의존성 즉 인비트로에서의 성장을 위해 어떤 표면에 부착되어야 하는 균질 또는 비균질 세포의 개체군을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "지방 조직(adipose tissue)"이라는 용어는 지방세포(fat cells; adipocytes)를 포함하는 연결조직을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "태반 조직(placenta tissue)"이라는 용어는 자궁내벽을 형성함과 동시에 임신 중에 제대(umbilical cord)가 부착된 태아를 감싸고 있는 포유류 자성 기관(mammalian female organ)의 임의의 부위를 의미한다. 출산 후, 태반은 배출된다(그리고, 분만 후 태만이라고 칭해진다).
본 명세서에서 사용된 "3차원 배양 조건(three dimensional culturing conditions)"이라는 문구는 세포를 세포 성장에 적합하고 세포를 일층 이상 성장시킬 수 있는 조건에 배치하는 것을 의미한다. 3차원 구조로서 생체(또는 조직) 내의 세포의 인시츄 환경(in situ environment)은 잘 이해되어 있다. 세포들은 다른 세포들에 의해 둘러싸여 있다. 세포들은 다양한 국부적 미세환경의 확립을 가능케 하는 세포외 기질 나노스케일 섬유의 복잡한 네크워크 내에 유지된다. 세포외 리간드는 기저막에 대한 부착을 매개할 뿐 아니라 다양한 혈관 및 림프관에 대한 접근도 매개한다. 산소, 호르몬, 및 영양소는 세포까지 운반되고, 폐기생성물은 운반된다. 본 발명의 3차원 배양 조건은 이하의 예시와 같은 환경을 모방하도록 설계된다.
따라서, 본 발명의 상기 관점의 접착 세포는 지방 또는 태반조직으로부터 채취된다.
태반 세포는 만기(full-term) 태반 또는 조기(pre-term) 태반으로부터 채취될 수 있다. 태반은 이것이 출혈되기 전의 시점에서 채취하는 것이 바람직하다. 이 태반은 잔류 세포의 제거에 충분한 시간 동안 관류되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 사용되는 "관류하다(perfuse)" 또는 "관류(perfusion)"라는 용어는 장기 또는 조직 상에 또는 이것을 관통하여 유체를 유입 또는 패시징(passaging)하는 행위를 의미한다. 태반 조직은 임의의 포유동물의 태반으로부터 채취되고, 가장 바람직하게는 인간의 태반으로부터 채취된다. 편리한 태반 조직 채취원(source of plancental tissue)은 분만 후 태반(예, 1-6 시간)이지만, 태반 조직 또는 세포의 채취원 또는 태반 조직의 단리방법은 본 발명에 결정적으로 중요한 의미를 가지지 않는다.
태반 유래의 접착 세포는 태반의 태아 부분(즉, 태반의 양막 또는 내부, 실시예 1 참조) 및 모체 부분(즉, 기저탈락막(decidua basalis) 및 벽측탈락막(decidua parietalis))의 양자로부터 채취될 수 있다. 조직 시편은 생리적 완충액[예, 인산완충 생리식염수(PBS) 또는 행크 완충액]으로 세척된다. 단일 세포 현탁액이 상기 조직을 소화 효소(하기 참조)을 이한 조직의 처리 및/또는 나일론 필터를 통한 조직의 민싱(mincing) 및 플러싱(flushing) 또는 세척매체를 이용한 부드러운 피페팅(pipetting)(Falcon, Becton, Dickinson, San Jose, CA)에 의해 제조된다.
지방조직 유래의 접착 세포는 본 기술분야의 전문가에게 공지된 다양한 방법으로 단리될 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 미국특허 US 6,153,432에 개시되어 있다. 지방 조직은 대망(omental)/내장, 유방, 성선(gonadal), 또는 기타 지방조직 부위로부터 유래될 수 있다. 바람직한 지방조직원은 대망지방(omental adipose)이다. 인간의 지방은 통상 지방흡인술에 의해 단리된다.
지방 조직으로부터 단리된 접착 세포는 콜라게나제, 트립신 및/또는 디스파제(dispase)와 같은 소화효소; 및/또는 유효농도의 히알루로니다제(hyaluronidase) 또는 디옥시뉴클레아제(DNAse); 및 에틸렌디아민테트라-아세트산(EDTA)을 이용하여 25 - 50 ℃의 온도에서 10분 내지 3시간 동안 조직을 처리함으로써 유도될 수 있다. 다음에, 상기 세포는 200 마이크론 내지 800 마이크론 사이의 나일론 필터 또는 치즈클로즈 필터(cheesecloth mesh filter)를 통과될 수 있다. 다음에, 상기 세포는 매질이나 Ficoll 또는 Percoll 또는 기타 미립자상 성분 내에서 직접 원심분리된다. 세포는 100 내지 3000 xg 범위의 속도로 1분 내지 1시간 동안 4 - 50 ℃의 온도 범위에서 원심분리 되었다(참조, US 7,078,230).
또 태반 또는 지방조직 유래의 접착 세포에 더하여, 본 발명은 또 간질 줄기세포 표현형(이하, 더욱 상세히 설명됨)을 특징으로 하는 기타 세포원의 접착세포의 용도를 고려한다. 접착세포를 채취할 수 있는 조직원(tissue sources)은 제대혈, 모낭[예, 미국특허출원 US 20060172304], 고환[예, Guan K., et al., Nature. 2006 Apr 27;440(7088):1199-203], 인간 후점막[예, Marshall, CT., et al., Histol Histopathol. 2006 Jun;21(6):633-43], 배아 난황낭[예, Geijsen N, Nature. 2004 Jan 8;427(6970):148-54] 및 양수[Pieternella et al. (2004) Stem Cells 22:1338-1345]를 포함한다(그러나, 이것에 한정되지 않는다). 이들 모두는 간엽 줄기세포를 포함하는 것으로 공지되어 있다.
이들 조직의 근원의 접착 세포는 접착 표면상에서 상기 세포를 배양함으로써 초기의 개체군 내의 다른 세포로부터 접착 세포를 단리시키는 것에 의해 단리가 가능하다.
근원(예, 태반이나 지방 조직)에 무관하게 세포의 채집은 무균 조건 하에서 실시되는 것이 바람직하다. 단리된 세포가 얻어지면, 접착 물질(예, 하나의 표면으로서 구성된 것)에 부착되도록 방치함으로써 접착 세포가 단리되도록 한다. 이 작업은 3D 배양 조건 하에서 배양되기 전에 또는 3D 배양 조건 하의 배양과 병용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "접착 물질(an adherent material)"이라는 용어는 합성 물질, 자연발생 물질 또는 이들 물질과 하나의 표면상에 세포를 유지시킬 수 있는 화학 구조(예, 하전 표면에 노출된 기(groups))를 가지는 비세포독성 물질(즉, 생물학적 적합성을 가지는 물질)의 조합을 의미한다.
본 발명의 상기 관점에 따라 사용될 수 있는 접착 물질의 예는 폴리에스테르, 폴리알킬렌, 폴리플루오로클로로에틸렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 폴리설폰, 셀룰로오스 아세테이트, 글래스 파이버, 세라믹 입자, 마트리겔(matrigel), 세포외 기질 성분(예, 피브로넥틴(fibronectin), 콘드로넥틴(chondronectin), 라미닌(laminin)), 콜라겐, 폴리 L 유산 및 불활성 금속 파이버를 포함한다. 그러나, 이것에 한정되지 않는다.
간질 줄기세포를 정제 또는 부화(enrichment)하기 위한 추가 단계는 본 기술분야에 주지된 방법을 이용하여 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 배양에 유용한 기본 배지(base media)의 비제한적 예는 최소 필수 배지 이글(Minimum Essential Medium Eagle), ADC-1, LPM (무알부민 소 혈청 (Bovine Serum Albumin-free)), F10(HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ 배지(피톤-잭슨 개질(Fitton-Jackson Modification)이 행해지거나 행해지지 않은 배지), 기초 배지 이글(Basal Medium Eagle; 얼리 염 베이스(Earle's salt base)가 추가된BME), 둘베코 개질된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium; 무혈청 DMEM), 야마네(Yamane), IMEM-20, 글라스고우 개질 이글 배지(Glasgow Modification Eagle Medium; GMEM), 레이보비츠(Leibovitz) L-15 배지, 맥코이(McCoy's) 5A 배지, M199배지(얼리 염 베이스(Earle's salt base)를 포함하는 M199E), M199 배지(행크 염 베이스(Hank's salt base)를 포함하는 M199H), 최소 필수 배지 이글(Minimum Essential Medium Eagle; 얼리 염 베이스(Earle's salt base)를 포함하는 MEM-E), 최소 필수 배지 이글(Minimum Essential Medium Eagle; 행크 염 베이스(Hank's salt base)를 포함하는 MEM-H) 및 최소 필수 배지 이글(Minimum Essential Medium Eagle; 비필수 아미노산을 포함하는 MEM-NAA)을 포함하고, 기타 199 배지, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, 윌리암스 (Williams' G), 노먼 앤 티텔(Neuman & Tytell), 히구치(Higuchi), MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153를 포함한다. 본 발명에서 이용하기에 바람직한 배지는 DMEM이다. 이들 배지 및 기타 유용한 배지는 특히 GIBCO사(Grand Island, N.Y., USA) 및 Biological Industries사(Bet HaEmek, Israel)로부터 입수할 수 있다. 이들 배지의 많은 수가 "효소학에서의 방법들(Methods in Enzymology, Volume LVIII, "Cell Culture", pp. 62 72, edited by William B. Jakoby and Ira H. Pastan, published by Academic Press, Inc)" 이라는 문헌에 요약되어 있다.
상기 배지에 필요에 따라 소나 기타의 종의 태아 혈청과 같은 혈청이 보충될 수 있고, 선택 또는 대안으로서 성장 인자, 사이토카인, 호르몬(예, 성장 호르몬), 에리스로포이에틴(erythropoietin), 트롬보포이에틴(thrombopoietin), 인터류킨 3(interleukin 3), 인터류킨 6(interleukin 6), 인터류 킨7(interleukin 7), 매크로파지 콜로니 자극 인자, c-키트 리간드/줄기세포 인자, 오스티오프로테게린 리간드(osteoprotegerin ligand), 인슐린, 인슐린형 성장인자, 상피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 킬러리 신경영양 인자(cilary neurotrophic factor), 혈소판 유래의 성장 인자, 및 골 형태형성 단백질(피코그램/ml 내지 밀리그램/ml의 농도)이 보충될 수 있다
또 상기 배지에 추가 성분들이 첨가될 수 있다. 추가의 성분은 항생제, 항진균제, 알부민, 아미노산, 및 기타 세포 배양 기술분야에 공지된 성분이 될 수 있다. 또, 필요 시 분화 과정을 강화시켜 주기 위한 성분들이 첨가될 수 있다(후술의 설명 참조).
접착세포가 입수되면 이들 세포는 3차원 조건(후술하는 실시예란의 실시예 1을 참조할 것)에 패시징될 수 있다. 그러나, 전술한 바와 같이 당연히 단리 직후 3D 구성된 기질로 이송시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 상기 관점의 접착 물질은 3D 배양을 위해 설정되고, 그 결과 조직(예, 태반)의 기본구조를 모방하도록 간질세포의 접착을 위한 가용 접착표면을 실질적으로 증대시키는 성장 기질을 제공한다.
예를 들면, 0.5 mm 높이의 성장 기질에 대한 성장 기질의 기저부 상의 투사에 의해 계산된 증가량은 최소 5 내지 30배이다. 상기 5 내지 30 배의 증가량은 단위 층(unit layer) 당 증가량이며, 적층에 의해 형성된 다수의 층 또는 스페이서 등에 의해 분리된 다수의 층이 사용되는 경우, 상기 5 내지 30 배의 증가량은 각 구조 당 증가량이 된다. 시트 형태, 바람직하게는 부직포 섬유 시트, 또는 개방 통공 발포체 폴리머(open-pore foamed polymers) 시트의 기질이 이용되는 경우, 시트의 바람직한 두께는 50 내지 1000 μm 이상이고, 이 시트에는 세포 및 영양소의 진입이 가능하고 동시에 폐기생성물의 제거가 가능한 적절한 크기 기공도가 제공된다. 바람직한 실시예에 따르면 상기 통공은 10 μm 내지 100 μm의 유효 직경을 가진다. 이와 같은 시트는 다양한 두께의 섬유로 제조될 수 있고, 바람직한 섬유의 두께 또는 섬유의 직경의 범위는 0.5 μm 내지 20 μm, 더 바람직한 섬유의 직경의 범위는 10 μm 내지 15 μm이다.
본 발명의 구조물은 치수 안정성 및 물리적 강도를 구비하는 다공성 지지 시트(porous support sheet) 또는 스크린에 의해 지지되거나 심지어 이들 시트나 스크린에 양호하게 부착될 수 있다.
이 같은 기질 시트는 또 절단, 펀칭가공 또는 세장형 절단에 의해 동일 두께(약 50 내지 1000 μm)의 약 0.2 mm2 내지 약 10 mm2 정도의 투영면적(projected area)을 가지는 입자를 제공할 수 있다.
본 발명의 실시예 사용된 성장 기질의 제작, 용도 및/또는 이점에 대한 더욱 상세한 내용은 미국특허 US 5,168,085 및 특히 US 5,266,476에 기술되어 있다. 이들 양 특허는 본 명세서에 참조문헌으로서 도입되었다.
상기 접착 표면은 사각형, 환형, 디스크형, 및 십자형으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 형상을 가질 수 있다.
대량생산을 위해, 배양은 3D 바이오리액터에서 수행되는 것이 바람직하다.
이와 같은 바이오리액터의 예는 플러그 플로우 바이오리액터(plug flow bioreactor), 연속 교반 탱크 바이오리액터(continuous stirred tank bioreactor) 및 정지상 바이오리액터(stationary-bed bioreactor)를 포함한다. 그러나, 이들 바이오리액터에 한정되지 않는다.
실시예란의 실시예1에 개시된 바와 같이, 3차원(3D) 플러그 플로우 바이오리액터(미국특허 US 6911201)는 간질세포의 성장 및 장기간의 유지를 지지할 수 있다. 이 바이오리액터에서, 간질세포는 폴리에스테르 부직포 기질로 제작된 다공성 캐리어 상에 접종되고, 글라스 컬럼(glass column) 내에 적층됨으로써 비교적 작은 체적 내에서 대량의 세포가 증식될 수 있다.
플러그 플로우 바이오리액터에서 사용되는 기질은 시트 형태, 부직포 시트, 또는 개방 통공 발포체 폴리머로 구성될 수 있고, 시트의 바람직한 두께는 50 내지 1000 μm 이상이고, 이 시트에는 세포 및 영양소의 진입이 가능하고 동시에 폐기생성물의 제거가 가능한 적절한 크기 기공도가 제공된다.
본 발명에 사용될 수 있는 기타 3D 바이오리액터는 배지가 바이오리액터 내에 연속적으로 공급되고, 생성물이 연속적으로 배출됨으로써 리액터 내에서 시정수 정상상태(time-constant steady state)를 유지하는 연속 교반 탱크 바이오리액터, 예를 들면 뉴 브룬스윅 사이언티픽사(New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)로부터 입수할 수 있는 섬유상 바스켓(fibrous bed basket)을 구비하는 교반 탱크 바이오리액터, 정지상 바이오리액터(stationary-bed bioreactor), 공기가 기포를 형성하면서 중앙 통풍관의 저부에 공급되고 컬럼의 상부에서 배기가스가 배출되는 에어-리프트(air-lift) 바이오리액터, 폴리액티브 폼(foams)을 구비하는 세포 접종 관류 바이오리액터[참조, Wendt, D. et al., Biotechnol Bioeng 84: 205-214, (2003)], 레이디얼-플로우 관류 바이오리액터(Radial-flow perfusion bioreactor) 내의 관형 폴리-L-유산(PLLA) 다공질 스캐폴드[참조, Kitagawa et al., Biotechnology and Bioengineering 93(5): 947-954 (2006)]이 포함된다. 그러나, 이들 바이오리액터에 한정되지 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 기타 바이오리액터들은 미국특허 US 6,277,151, US 6,197,575, US 6,139,578, US 6,132,463, US 5,902,741 및 US 5,629,186에 기재되어 있다.
세포 접종은 100,000-1,500,000 세포/mm로 수행되는 것이 바람직하다.
세포는 제어되지 않은 분화 및 노화를 회피함과 동시에 최소 약 40%의 융합(confluence), 60%의 융합 또는 80%의 융합에 도달한 시점에서 채취되는 것이 바람직하다.
배양은 최소 약 2일, 3일, 5일, 10일, 20일, 1개월 또는 그 이상의 기간동안 실시된다. 바이오리액터 내에서의 배양에 의해 상기 배양기간을 연장할 수 있다. 패시징(passaging)은 세포수의 증대를 위해 실시될 수도 있다.
본 발명의 접착 세포는 최소 하나 이상의 "간질 줄기세포 표현형(stromal stem cell phenotype)"을 포함하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용되는 "간질 줄기세포 표현형"이라는 용어는 골수 유래의 간질(즉, 간엽) 줄기세포의 전형적인 구조적 또는 기능적 표현형을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "줄기세포(stem cell)"는 최종 분화되지 않은 세포를 의미한다.
따라서, 이들 세포는 예를 들면 방추 형상을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로 상기 세포는 간질 줄기세포에 전형적인 하나의 마커 또는 다수의 마커(예, 표면 마커)의 집합을 표현할 수 있다. 간질 줄기세포 표면 마커(양성 및 음성)의 예는 CD105+, CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD34-, CD45-, CD80-, CD19-, CD5-, CD20-, CD11B-, CD14-, CD19-, CD79-, HLA-DR-, 및 FMC7-을 포함한다. 그러나 이것에 한정되지 않는다. 다른 간질 줄기세포 마커는 티로신 히드록실라제(tyrosine hydroxylase), 네스틴(nestin) 및 H-NF를 포함한다.
간질 줄기세포의 전형적인 기능적 표현형의 예는 T세포 억제 활성(T세포를 자극하지 않고 역으로 이것을 억제함), 조혈 줄기세포 지원 활성(support activity), 지질생성 분화, 간유래 분화, 골생성 분화 및 신경성 분화를 포함한다. 그러나, 이것에 한정되지 않는다.
이들 구조적 기능적 특징은 모두 본 발명의 세포에 자격을 부여하는데 사용될 수 있다(후술하는 실시예란의 실시예1 및 실시예 2 참조).
본 발명의 교시에 따라 생성된 세포의 개체군은 실시예란의 실시예1에 개시된 바와 같이 독특한 단백질 발현 프로파일(profile)을 특징으로 한다. 따라서, 예를 들면, 본 발명의 교시에 따라 생성된 태반 또는 지방조직의 접착세포는 고농도의 선택 인자의 발현 및/또는 분비(secreting)가 가능하다. 예를 들면, 이와 같은 세포들은 SCF, Flt-3, H2AF 또는 ALDH X를 2D 배양에서 성장된 태반 또는 지방조직의 접착세포에 의해 발현 또는 분비된 것보다 최소 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11배 또는 바람직하게는 12배 이상 발현하거나 분비한다. 추가적으로 또는 대안으로서 본 발명의 세포의 개체군은 2D 배양에서 성장된 태반 또는 지방조직의 접착세포에 의해 발현 또는 분비된 것보다 최소 2, 3 또는 5배 이상의 농도로 IL-6, EEEF2, RCN2 또는 CNN1을 분비 또는 발현한다. 추가적으로 또는 대안으로서 본 발명의 세포의 개체군은 2D 배양된 세포에 비해 다양한 기타 단백질의 저농도 발현을 특징으로 한다. 따라서, 예를 들면, 2D 배양에서 성장된 태반 또는 지방조직의 접착세포에 의해 발현되거나 분비된 Hnrph1, CD44 항원 이소형(antigen isoform) 2 전구체, Papss2 또는 rpL7a의 발현수준인 0.6, 0.5, 0.25 또는 0.125의 미만의 수준으로 분비 또는 발현한다.
본 발명의 실시 중에 본 발명자들은 접착 간질세포 특히 3D-ASC는 면역억제 활성을 보인다는 것을 명확하게 이해하였다. 후술하는 실시예란의 실시예 3에 개시된 바와 같이, 접착세포 특히 3D-ASC는 MLR 분석에 의해 인간 제대혈 단핵 세포의 면역반응을 억제하는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 세포는 임상에서 우선적으로 사용될 수 있는 생물학적 활성(예, T세포 억제 활성, 조혈 줄기세포 지원활성)을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 실시 중에 본 발명자들은 본 발명의 세포의 조절된 배지는 임상에서 우선적으로 사용될 수 있는 생물학적 활성(예, T세포 억제 활성, 조혈 줄기세포 지원활성)을 포함할 수 있다는 것을 명확하게 이해하였다
따라서, 본 발명은 또한 일군의 조절된 배지 및 그 상태로의 용도 또는 본 기술분야의 주지된 방법을 이용한 추가의 농축, 부화 또는 분별(fractionation) 단계 후의 용도를 구상한다. 본 발명의 조절된 배지는 고도의 생존성 미드-로그(mid-log) 세포 배양물로부터 얻는 것이 바람직하다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 세포 및 조절된 배지는 간질 줄기세포를 특징으로 하고, 이와 같은 줄기세포의 사용하는 것이 유익한 임의의 연구 및 임상 적용에 이용될 수 있다.
이식된 HSC에 의한 이식 및 조혈의 개시는 호밍(homing), 내피세포벽을 통하여 골수에 이르기까지 농도 구배의 팔로윙(following), 및 이식된 세포, ECM 및 적소의 간엽세포 사이에 물리적 접촉이 형성되는 적소(appropriate niches) 내의 로징(lodging)를 포함하는 복잡한 과정에 의존한다. 이들 모든 과정은 사이토카인, 호르몬, 스테로이드, 세포외 기질 단백질, 성장 인자들, 세포-세포 상호작용 및 접착 단백질, 및 기질 단백질과 같은 복잡한 배열의 분자들을 필요로 한다.
이식 후 2-3일 경과 시 수혈된 HSC 중 1-5%만이 피제공자 골수 내에서 검출된다고 알려져 있다[Kerre et al., J Immunol. 167:3692-8. (2001); Jetmore et al., Blood. 99:1585-93 (2002)].
조혈 이식(hematopoietic engraftment)에 대한 MSC의 기여의 일부는 이식편대숙주병의 원인인 제공자 유래의 T세포 생성의 억제에 의한 것이고[GvHD, Charbord P., and Moore, K., Ann . N.Y. Acad . Sci . 1044: 159-167 (2005); Maitra B, et al., Bone Marrow Transplant. 33(6):597-604. (2004); US patent nos. 6,010,696; 6555374]; 일부는 조혈 줄기세포(HSC) 지지(즉, 조혈 줄기세포의 증식, 성숙 및/또는 호밍의 지지(sustaining) 및 지원(aiding))를 제공하는 것에 의한 것이다.
놀라운 것은 후술하는 실시예란의 실시예 2에 개시된 바와 같이, 태반 및 지방조직 유래의 접착세포는 심지어 화학요법 후에도 HSC 이식을 지지하는 것으로 밝혀진 것이다.
이들 결과를 전제로 하면, 본 발명의 세포 또는 배지는 간질 줄기세포 이식이 사용되는 임의의 임상 적용에 사용될 수 있다고 생각될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 관점에 따르면, 간질 줄기세포의 이식이 유리한 피험체의 병상(예, 병리학, 질환, 증상)의 치료방법이 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 "치료(treating)"라는 용어는 병상 발달의 억제 또는 구속 및/또는 병상의 축소, 완화, 또는 퇴화를 의미한다. 본 기술분야의 전문가들은 병상 발달을 평가하기 위해 다양한 방법론 및 분석법이 사용될 수 있다는 것과 마찬가지로 병상의 축소, 완화 또는 퇴화를 평가하기 위해 다양한 방법론 및 분석법이 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. "치료(treating)"라는 용어는 암 질환과 관련된 증상을 완화 또는 축소시키는 것을 의미한다. 치료는 의학적 증상과 관련된 증상을 치료하는 것, 예를 들면 실질적으로 제거하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용되는 "간질 줄기세포 이식이 유리한 의학적 증상(a medical condition which may benefit from stromal stem cell transplantation)"이라는 표현은 본 발명의 세포/배지의 투여에 의해 완화될 수 있는 임의의 의학적 증상을 의미한다.
"이식(transplantation)", "세포 치환(cell replacement)" 또는 "이식(grafting)"이라는 용어 또는 문구는 본 명세서에서 상호 교환하여 사용될 수 있는 것으로서, 본 발명의 세포를 표적 조직에 도입하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "피험체(subject)"라는 용어는 임의의 대상(예를 들면, 포유동물), 바람직하게는 인간 피험체를 의미한다.
상기 관점의 본 발명의 방법은 피험체에게 치료적으로 유효한 양의 본 발명의 세포 또는 배지(전술한 것)를 투여하는 단계, 그 결과 간질 줄기세포의 이식이 유리할 수 있는 피험체 내의 의학적 증상을 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 상기 관점에 따라 투여될 수 있는 세포는 2차원 또는 3차원 조건 하에서 배양될 수 있는 전술한 접착세포 및 이 세포의 부분적으로 또는 최종적으로 분화된 간엽 및 비간엽 유도체를 포함한다.
본 발명의 간질 줄기세포로부터 계통 특이적 세포(lineage specific cells)를 유도하는 방법은 본 기술분야에 주지된 것이다. 주지의 기술은 예로서 미국특허 US 5,486,359, US 5,942,225, US 5,736,396, US 5,908,784 및 US 5,902,741을 들 수 있다.
세포는 순수한 것이거나 해당 계통을 유도하기 위해 유전적으로 개질된 것일 수 있다(참조, 미국특허출원 US 20030219423).
세포 및 배지는 자가 원(autologous) 또는 비자가 원(non-autologous source)(즉, 동종 또는 이종)의 신선하거나 냉동된(즉, 냉동보존된) 제제일 수 있다.
의학적 증상에 따라, 피험체에는 추가의 화학약품(예, 면역조절제, 화학요법 등) 또는 세포가 투여될 수 있다.
따라서, 예를 들면, 줄기세포 이식을 향상(예, 피제공자 골수 내의 생존성 HSC의 수의 증가시키는 것 및 정상 백혈구의 수를 최적으로 개선하는 것)시키기 위해, 본 발명의 세포/배지는 HSC의 이식 전, 이식과 동시, 또는 이식 후에 투여될 수 있다.
HSC 및 간질세포는 공통의 HLA 항원을 공유하는 것이 바람직하다. HSC 및 간질세포는 단일 개체(single individual)로부터 유래되는 것이 바람직하다. 대안으로서, HSC 및 간질세포는 상이한 개체들로부터 유래된다.
"이식(transplantation)", "세포 치환(cell replacement)" 또는 "이식(grafting)이라는 용어 또는 문구는 본 명세서에서 상호 교환하여 사용될 수 있는 것으로서, 본 발명의 세포를 표적 조직에 도입하는 것을 의미한다. 세포는 피제공자로부터 유래되거나 동종 또는 이종의 제공자로부터 유래될 수 있다.
비자가 세포(non-autologous cells)는 체내에 투여시 면역반응을 유발할 가능성이 있으므로, 종래부터 비자가 세포의 거부반응의 가능성을 감소시키기 위한 다수의 방법이 개발되어왔다. 이들 방법은 피제공자의 면역체계를 억압하거나 면역방지성(immunoisolating)의 반투과막으로 이식하기 전의 상기 비자가 세포를 캡슐화(encapsulating)하는 것을 들 수 있다.
봉입 기법은 크게 소형의 구형 운반체를 이용하는 마이크로캡슐화(microencapsulation) 및 대형의 평평한 시트 및 중공 섬유 막을 이용하는 매크로캡슐화(macroencapsulation)로 분류된다.
마이크로캡슐의 제조방법은 본 기술분야에 공지된 것으로서, 예를 들면 루 엠지 등[Lu MZ, et al., Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly(allylamine) Biotechnol Bioeng. 2000, 70: 479-83], 창 티엠 및 프라카쉬 에스[Chang TM and Prakash S. Procedures for microencapsulation of enzymes, cells and genetically engineered microorganisms. Mol Biotechnol. 2001, 17: 249-60], 및 루 엠지 등[Lu MZ, et al., A novel cell encapsulation method using photosensitive poly(allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetate). J Microencapsul. 2000, 17: 245-51]에 의해 개시된 것을 예로 들 수 있다.
예를 들면, 마이크로캡슐은2-히드록시에틸 메틸아크릴레이트(2-hydroxyethyl methylacrylate; HEMA), 메타크릴산(methacrylic acid; MAA) 및 메틸 메타크릴레이트(methyl methacrylate; MMA)의 터폴리머(terpolymer) 쉘을 이용하여 개질 콜라겐을 착화하여 2-5 μm의 캡슐 두께를 가지도록 제조될 수 있다. 상기 마이크로캡슐은 음으로 하전된 매끈한 표면을 부여함과 동시에 혈장단백질(plasma protein)의 흡수(Chia, S.M. et al. Multi-layered microcapsules for cell encapsulation Biomaterials. 2002 23: 849-56)를 최소화하기 위해 추가의 2-5 μm 터폴리머 쉘을 이용하여 더욱 캡슐화될 수 있다.
기타의 마이크로캡슐은 알긴산염, 마린 폴리사카라이드(marine polysaccharide)(Sambanis, A. Encapsulated islets in diabetes treatment. Diabetes Technol. Ther. 2003, 5: 665-8) 또는 그 유도체에 기초한다. 예를 들면, 마이크로캡슐은 칼슘 클로라이드의 존재 하에서 다가음이온 폴리(메틸렌-코-구아니딘) 하이드로클로라이드를 이용한 다가음이온 소디움 알긴산염 및 소디움 셀룰로오스 설페이트 사이의 고분자전해질 착체형성(polyelectrolyte complexation)에 의해 제조될 수 있다.
세포의 캡슐화는 소형 캡슐을 이용하는 경우에 개선되는 것이 정당하다. 따라서, 캡슐 크기가 1 mm로부터 400 μm로 축소된 경우 품질 제어, 기계적 안정성, 확산 특성, 및 캡슐화된 세포의 인비트로 활성이 향상되었다(Canaple L. et al., Improving cell encapsulation through size control. J Biomater Sci Polym Ed. 2002;13:783-96).
더욱, 나노 다공성 바이오캡슐(nanoporous biocapsules)로서, 크기가 7 nm로 양호하게 제어된 기공, 조정된 표면 화학조성 및 정밀한 미세구조를 가지는 나노 다공성 바이오캡슐은 세포의 미세환경에 성공적으로 면역방지를 부여하는 것이 발견되었다(Williams D. Small is beautiful: microparticle and nanoparticle technology in medical devices. Med Device Technol. 1999, 10: 6-9; Desai, T.A. Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation. Expert Opin Biol Ther. 2002, 2: 633-46).
면역억제제의 예는 메토트렉세이트(methotrexate), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시클로스포린(cyclosporine), 시클로스포린 A(cyclosporin A), 클로로킨(chloroquine), 히드록시클로로킨(hydroxychloroquine), 설파살라진(sulfasalazine; sulphasalazopyrine), 금염(gold salts), D-페니실라민(D-penicillamine), 레프루노미드(leflunomide), 아자티오프린(azathioprine), 아나킨라(anakinra), 인플릭시맙(infliximab; REMICADE), 에타네르셉트(etanercept), TNF 알파 블로커(TNF.alpha. blockers), 염증성 사이토카인을 표적으로 하는 생물학 제제, 및 비스테로이드계 항염증성 약제(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug; NSAIDs)를 포함한다. 그러나, 이것에 한정되지 않는다. 비스테로이드계 항염증성 약제(NSAID)의 예는 아세틸 살리실산, 클로린 마그네슘 살리실레이트(choline magnesium salicylate), 디퓨니살(diflunisal), 마그네슘 살리실레이트(magnesium salicylate), 살사레이트(salsalate), 소디움 살리실레이트(sodium salicylate), 디클로페낙(diclofenac), 에토돌락(etodolac), 페노프로펜(fenoprofen), 플러비프로펜(flurbiprofen), 인도메타신(indomethacin), 케토프로펜(ketoprofen), 케토로락(ketorolac), 메클로페나메이트(meclofenamate), 나프록센(naproxen), 나부메톤(nabumetone), 페닐부타존(phenylbutazone), 피록시캄(piroxicam), 설린닥(sulindac), 톨메틴(tolmetin), 아세타미노펜(acetaminophen), 이부프로펜(ibuprofen), 콕스-2 억제제(Cox-2 inhibitors) 및 트라마돌(tramadol)을 포함한다. 그러나, 이것에 한정되지 않는다.
본 명세서에 기술된 임의의 방법에서 세포 또는 배지는 그 자체가 투여되거나 바람직하게는 약학적으로 허용되는 담체(carrier)를 더 포함하는 약학 조성물의 일부로서 투여될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "약학 조성물(pharmaceutical composition)"이라는 용어는 약학적으로 적합한 담체 또는 부형제와 같은 기타의 화학 성분들을 구비하는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 화학적 복합체 조제물을 의미한다. 약학 조성물의 목적은 피험체에 화합물의 투여를 촉진하기 위한 것이다.
이하, "약학적으로 허용할 수 있는 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"라는 용어는 피험체에게 상당한 자극을 유발하지 않고 생물학적 활성 및 투여된 화합물의 특성을 무효화하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 생리식염수, 유기용매와 물의 에멀젼 및 혼합물을 포함한다. 그러나, 이것에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 "부형제(excipient)"라는 용어는 화합물의 투여를 더욱 촉진하기 위해 약학 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 의미한다. 부형제의 예는 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 다양한 당류 및 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물유 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 그러나, 이것에 한정되지 않는다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 약학적 담체는 생리식염수 수용액이다.
약의 조제 및 투여 방법은 본 명세서에 참조문헌으로서 도입되는 레밍톤 약학 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition)을 참조할 수 있다.
상기 약학 조성물은 (전술한 바와 같이) 전신 투여법에 의해 투여될 수 있다. 또는 상기 약학 조성물은 국부 투여법, 예를 들면, 약학 조성물을 환자의 조직 부위에 직접 주입법에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 예를 들면, 공지의 혼합 공정, 용해 공정, 조립 공정(granulating), 당의정 제조 공정, 분말화 공정(levigating), 유화 공정(emulsifying), 캡슐화 공정(encapsulating), 봉입 공정(entrapping) 또는 동결건조 공정(lyophilizing)과 같은 본 기술분야에 주지된 공정에 의해 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 용도의 약학 조성물은 부형제 및 활성 성분으로부터 약학적으로 이용될 수 있는 제제의 제조를 촉진하는 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리적으로 허용이 가능한 담체를 이용하는 공지의 방법으로 조제될 수 있다. 적합한 제형(formulation)은 투여 경로에 의존하여 결정된다.
주입 투여용의 경우, 약학 조성물의 활성 성분은 수용액으로 제제될 수 있고, 바람직하게는 행크 용액(Hank's solution), 링거 용액, 또는 생리적 염 완충액과 같은 생리적 적합성 완충액으로 제제될 수 있다. 점막 투여용의 경우, 침투 대상의 벽에 적합한 침투제가 제제 내에 사용될 수 있다. 이와 같은 침투제는 본 기술분야에 일반적으로 공지되어 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 제제를 위해, 약학적으로 유효한 양 또는 투여량은 초기에 인비트로 및 세포 배양 분석법에 의해 평가될 수 있다. 투여량은 소망의 농도 또는 적정량(titer)을 달성하기 위해 동물 모델에서 처방될 수 있다. 이 같은 정보를 사용하여 인간에게 유효한 투여량을 더욱 정확하게 결정할 수 있다.
본 명세서에 기술된 활성 성분의 세포독성 및 치료적 효능은 인비트로, 세포 배양 또는 실험동물에서의 표준 약학 수순에 의해 결정될 수 있다.
이들 인비트로, 세포 배양 또는 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에 대한 투여량 범위를 처방하는데 이용될 수 있다. 투여량은 투여 형태 및 투여 경로에 따라 변화할 수 있다. 정확한 제형(formulation), 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 개별 의사에 의해 선택될 수 있다(참조예, Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1). 예를 들면, 파킨슨병 환자는 치료에 대해 양성 반응을 나타내는 운동능력에 대한 임상증상이 감시될 수 있다.
주입 투여용의 경우, 약학 조성물의 활성 성분들은 수용액 형태, 바람직하게는 행크 용액(Hank's solution), 링거 용액, 또는 생리적 염 완충액과 같은 생리적 적합성을 가지는 완충액으로 제제할 수 있다.
투여량 및 투여간격은 각각 이식된 세포에 의한 신경전달물질 합성을 효과적으로 조절하는데 충분한 활성 성분의 수준까지 조절될 수 있다. 소망의 효과를 달성하는 데 필요한 투여량은 개인의 특성 및 투여 경로에 의존한다. 검출 분석을 사용하여 혈장 농도를 결정할 수 있다.
치료 대상의 증상의 중증도(severity) 및 반응성에 따라, 투여는 단일회 투여 또는 다수회 투여로 할 수 있고, 질병 상태의 축소가 달성될 때까지 치료 과정은 수일 내지 수주간 지속될 수 있다.
물론 조성물의 투여량은 치료 대상의 개인, 질환의 중증도, 투여 방법, 처방의사의 판단 등에 따라 달라질 수 있다. 투여량 및 투여시간은 개인의 증상 변화의 세심하고 연속적인 감시에 대응할 수 있다. 예를 들면, 치료되는 파킨슨병 환자는 감시한 내용(monitoring indication)에 기초하여 질환의 증상을 완화하는데 충분한 양의 세포가 투여된다.
이식 후, 본 발명의 세포는 일정한 기간(예, 최소 6개월) 동안 질병 부위 내에서 생존하여 치료 효과가 관찰되도록 하는 것이 바람직하다.
적합성을 가지는 약학 담체에 의해 조제된 본 발명의 조제물을 포함하는 조성물이 제조될 수 있고, 적절한 용기 내에 투입될 수 있고, 표시된 증상의 치료용이라는 라벨이 부착될 수 있다.
본 발명의 조성물은 필요에 따라 활성 성분을 포함하는 하나 이상의 단위 투여량 형태를 수용하는 팩이나 FDA 승인 키트(FDA approved kit)와 같은 분주 장치(dispenser device) 내에 제공될 수 있다. 상기 팩은 예를 들면 금속 포일 또는 블리스터 팩(blister pack)과 같은 플라스틱 포일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치에는 투약 설명서가 첨부될 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 또 약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부기관에 의해 규정된 형태로 용기에 관련된 고지(notice)가 수용되어 있을 수 있다. 이 고지는 조성물의 형태, 인체 또는 동물에의 투여를 정부기관이 승인한다는 것이 반영되어 있다. 이와 같은 고지는 예를 들면 처방약에 대한 미국 FDA의 승인 라벨 또는 승인된 생성물이라는 삽입통지문(insert)으로 구성될 수 있다.
본 발명에 따른 세포 증식 방법은 3차원 배양 조건 하에서 태반 또는 지방조직의 부착 세포를 효과적으로 증식시킬 수 있다.
도 1의 a 내지 g는 3차원 캐리어를 포함하는 바이오리액터 장치 내에 형성된 골형상 미세환경을 보여주는 도면이다. 도 1의 a 및 b는 접착 간질세포(Adherent Stromal Cells; 3D-ASC)의 접종 후 7일 경과시의 자연골(natural bone; a)과 골 미세환경을 모방한 PluriX 3D 캐리어의 구조(b)의 전자현미경사진이다 도 1의 c 내지 f는 골수로부터 생성된 3D-ASC가 접종된 PluriX 3D 기질의 접종후 20일 경과시(c 및 d; 각각 150배 및 250배) 및 접종 후 40일 경과시(e 및 f; 각각 350배 및 500배)의 전자현미경사진이다. 도 1의 g는 PluriX 3D 플러그 플로우 바이오리액터의 다이어그램으로서, 배양액 탱크(1), 혼합 기체 공급원(2), 필터(3), 주입 지점(4), 3D 캐리어가 설치도는 컬럼(column; 5), 플로우 모니터(low monitor; 6), 플로우 밸브(6a), 분리 용기(7), 세포 성장 분석장치(8); 유동펌프(peristaltic pump; 9), 샘플채취 지점(10), 용해 O2 측정 전극 (11), pH 측정 전극(12), 제어장치(13), 신선한 성장 배지(14), 사용된 성장 배지(15)을 포함한다.
도 2는 바이오리액터 장치 내의 3D 성장 조건 하에서 성장된 태반 기원의 접착 간질세포(3D-ASC; 랏 5-8)의 상이한 다수의 생산 랏(production lots)을 도시한 그래프이다. ASC(2 × 106)는 바이오리액터 내에 10000 - 15000 세포/캐리어의 밀도로 접종되었다. 12일간의 배양 후 3D-ASC의 밀도는 150,000-250,000 세포/캐리어 또는 150개의 캐리어를 포함하는 바이어리액터 내에 22.5-37.5 × 106에 도달하였다.
도 3의 a 및 b는 종래의 2D 배양 조건(명자색; light purple) 하에서 배양된 태반 세포 내의 세포막 마커에 대비되는 태반 유래의 3D-ASC(암자색; dark purple) 내에서 발현된 세포막 마커의 발현 수준을 도시한 막대그래프이다. 접착 세포는 플라스크(2D) 내에서 4-6주간 또는 바이오리액터 장치 내의 폴리스티렌 캐리어(3D) 상에서 2-3주간 성장되었다. 플라스크 또는 캐리어로부터 채취된 셀은 배양되고 모노클로날 항체(monoclonal antibodies; MAb)의 패널에 고정되었다. 이 패널은MSC(a) 또는 조혈세포(b)의 세포막 마커 특성을 인식한다. 3D 배양된 접착 세포(특히, CD105) 내에서 발현된 MSC 세포막 마커에 비해, CD90, CD105, CD73 및 CD29 세포막 마커에 대해 도시된 2D 배양 세포 내의 MSC 세포막 마커 발현이 상당히 높다(3D 배양세포 내의 56%의 발현 대 2D 배양세포 내의 87%의 발현(a)). 2D 및 3D 배양의 ASC는 모두 어떤 조혈 세포막 마커도 발현하지 않았다(b).
도 4a 내지 도 4d는 2D 및 3D 조건 하에서 또는 이들의 조절된 배지에서 배양된 태반으로부터 생성된 ASC 내의 단백질 수준을 비교한 막대그래프이다. 도 4a 내지 도 4c는 ELISA에 의해 분석된 2D 및 3D 배양된 ASC의 조절된 배지 내의 Flt-3 리간드(도 4a), IL-6(도 4b) 및 SCF(도 4c)의 농도(단위는 1 × 106 세포/ml의 표준화된 농도 단위인 pg/ml)를 도시한다. 분석결과는 3종의 독립된 실험 중의 하나를 나타낸다. 도 4d는 iTRAQ 시약 표지 단백질 샘플의 질량분석에 의한 상이한 세포 단백질의 발현 수준을 보여준다. 단백질 샘플은 2D(백색막대) 및 3D(회색막대)의 조건 하에서 성장된 ASC로부터 채취되었다. 도면은 2개의 복제 실험 중의 하나를 나타낸다. 세포 및 2D 및 3D 배양 조건의 조절된 배지 내의 단백질의 발현 수준은 상이하다.
도 5의 a 내지 d는 인비트로(in vitro)에서 태반 유래의 3D-ASC의 골아세포로의 분화 능력을 보여주는 현미경사진이다. 인간 태반 유래의 ASC는 골형성 유도 배지(10 % FCS, 100 nM 덱사메타손, 0.05 mM 아스코르빈산 2-인산염, 10 mM B-글리세로인산염을 함유하는 DMEM) 내에서 3주간 배양되었다. 도 5의 a 및 b는 알리자린 레드 에스 염색법(Alizzarin Red S staining)에 의해 표시되는 석회화 기질(calcified matrix)을 발현하는 세포를 보여준다. 도 5의 c 및 d는 골형성 유도 배지로 처리되지 않고 섬유아세포형 표현형을 유지하는 대조 세포로서 석화(mineralization)가 없는 것이 입증된다.
도 6은 이식 후 3.5주 동안 화학요법(연속 2주 동안 25 mg/kg의 부설판(busulfan) 복강내 투여함)으로 처리된 NOD-SCID 마우스의 골수 내에서 검출되는 인간 CD45+ 세포의 백분율을 보여주는 그래프이다. 단핵 제대혈 유래의 세포로부터 정제된 CD34+ 세포(100,000)는 단독 이식(5개체의 마우스, a) 또는 2D에서 배양된 0.5 × 106개의 태반 유래의 접착 세포와 공동 이식(2D-ASC; 2개체의 마우스, b) 또는 pluriXTM 바이오리액터 내에서 3D 조건(3D-ASC)에서 배양된 태반 유래의 접착 세포와 공동 이식(5 개체의 마우스, c)되었다. 다음에 마우스의 대퇴골(femurs) 및 경골(tibias)로부터 골수가 채취되었다. 이 골수 내의 인간 세포가 플로우 사이토메트리(flow cytometry)에 의해 검출되었다. 항인간(anti-human) CD45-FITC를 이용한 세포 배양에 의해 인간 세포를 발현하는 CD45의 백분율이 결정되었다. 2D-ASC(b) 및3D-ASC(c)로 공동 이식된 마우스의 골수 내의 인간 세포(hCD45+)의 백분율이 HSC 단독 처리된 마우스(a) 내의 인간 세포의 백분율에 비해 더 높게 나타났다. 2D-ASC 배양된 세포로 처리된 마우스 내의 이식에 비해 3D-ASC 배양된 세포로 처리된 마우스 내의 이식이 3D 배양된 ASC 특유의 더 높은 치료적 장점을 나타낸다.
도 7의 a 및 b는 CD34+ 세포 및 지방 조직 유래의 ASC(b)에 대비되는 CD34+ 세포 단독 이식(a)된 마우스 내의 인간 이식 CD45+ 세포의 FACS 분석도이다. 인간 CD34+ 단독 처리된 마우스(7b -12 %)에 비해 지방 조직 유래의 ASC와 공동 이식된 마우스 내의 인간 조혈 개체군의 백분율이 상당히 더 높다.
도 8은 인간 제대혈 단핵 세포(CB), 및 동량의 방사선이 조사된(3000 라드(Rad)) 제대혈 세포(iCB), 인간 말초혈 유래의 단핵백혈구(PBMC), 2D 배양되거나 3D 배양된 태반 ASC, 또는 PBMC 및 2D와 3D 배양된 태반 ASC의 조합(PBMC+2D 및 PBMC+3D) 사이에서 실시된 혼합 임파구 반응을 도시한 막대그래프이다. CB 세포 개체군의 크기는 배양의 최후의 18시간 동안에 측정된 3H-티미딘 흡수량(CPM으로 측정)에 의해 표시된다. 자극된 CB 세포 증식이 증대하는 것은 고수준의 면역 반응을 나타낸다. 접착 세포를 이용하여 배양된 세포에 의해 발휘되는 면역 반응은 저수준이고, 특히 접착 세포와 공동 배양된 경우의 PBMC에 대한 CB 면역 반응은 감소한다. 각 반응은 3회 실시되었다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명한다. 도면의 상세 내용은 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하기 위한 예시에 불과한 것으로서, 본 발명의 원리 및 개념의 이해를 위해 가장 유용하고도 용이한 것으로 생각되는 것을 도시한 것이다. 이러한 점에서 본 명세서에서는 본 발명의 기본적 이해에 필요한 것 이상으로 본 발명의 구조적 세부를 설명하지는 않았고, 본 기술분야의 전문가 도면을 참조한 설명으로부터 본 발명의 다수의 실시형태를 구현할 수 있을 것이다.
하기 실시예를 참조하여 본 발명에 대해 설명한다. 그러나, 본 발명은 이 실시예에 한정되지 않는다.
일반적으로 본 명세서에서 사용된 용어 및 본 발명에서 사용된 실험 과정은 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이와 같은 기법은 다음의 문헌들에 충분히 설명되어 있다. 참고문헌의 예는 다음과 같다. "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologies as set forth in U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); available immunoassays are extensively described in the patent and scientific literature, see, for example, U.S. Pat. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 and 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). 이들 모든 문헌은 참조로서 본 명세서에 도입되었다. 기타 일반적인 참조문헌은 본 명세서를 통해 제공된다. 본 명세서의 실험 과정은 본 기술분야에서 주지된 것으로 생각되고, 독자의 편의를 위해 제공된다. 본 명세서에 기술된 모든 정보는 참조로서 도입된 것이다.
실시예 1
골수, 태반 및 지방조직으로부터 접착 간질세포( ASC )의 생산 및 배양
3D 캐리어를 포함하는 바이오리액터 장치 내에서 접착세포가 배양되었고, 특이적 세포 마커 발현 프로파일을 특징으로 하는 3D-ASC 세포가 생산되었다. 성장 효율은 세포의 계수(cell count)를 통해 평가되었다. 이들 세포의 분화 능력은 분화 배지 내에서의 배양에 의해 평가되었다.
물질 및 실험 과정
골수 간질세포( Bone marrow stromal cells ) - 골수 간질세포는 심장절개수술 또는 골수 생검을 받는 조혈적으로 건강한 제공자의 흉골수(sterna marrow)를 흡인하여 얻었다. 골수 흡인물(marrow aspirates)은 행크 평형 염류 용액(Hank's Balanced Salts Solution; HBSS; GIBCO BRL/Invitrogen, Gaithersburg MD)으로 3배 희석되고, 피콜-하이패크(Ficoll-Hypaque)(Robbins Scientific Corp. Sunnyvale, CA) 밀도 구배 원심법(density gradient centrifugation)이 수행되었다. 다음에, 골수 단핵세포(<1.077 gm/cm3)가 채취되고, HBSS 내에서 3회 세척되고, 성장 배지 내에서 재현탁되었다[DMEM (Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel) supplemented with 10 % FCS (GIBCO BRL), 10-4 M mercaptoethanol (Merck, White House Station, NJ), Pen-Strep-Nystatin mixture (100 U/ml:100 ug/ml:1.25 un/ml; Beit Ha'Emek), 2 mM L-glutamine (Beit Ha'Emek)]. 개개의 제공자의 세포는 조직 배양 플라스크(Corning, Acton, MA) 내에서 매주마다 배양 배지를 변경하여 37 ℃ (5 % CO2)의 온도에서 개별적으로 배양되었다. 세포는 0.25 % 트립신(trypsin)-EDTA(Beit Ha'Emek)를 이용하여 매 3-4일 마다 분리되었다. 2-40회의 패시징 후, 60-80 %의 융합에 도달했을 때, 분석 또는 바이오리액터 내에서의 배양을 위해 세포가 채취되었다.
태반 유래의 간질세포( Placenta derived stromal cells ) - 만기출산 태반(Bnei Zion medical center, Haifa, Israel)의 내측 부분이 무균 상태 하에서 절단되고, 행크 완충액(Hank's Buffer)을 이용하여 3회 세척되고, 3 시간 동안 37 ℃의 온도에서 0.1 % 콜라게나제(Collagenase)(1 mg/ml tissue; Sigma- Aldrich, St. Lewis, MO)를 이용하여 배양되었다. 부드러운 피펫작업(pipeting)을 통해, 현탁된 세포는 10 % FCS, 펜-스트렙-니스타틴 혼합물(Pen-Strep-Nystatin mixture)(100 U/ml:100 ug/ml:1.25 un/ml) 및 2 mM L-글루타민이 보충된 DMEM을 이용하여 세척되고, 75 cm2 플라스크 내에서 접종되고, 5 % CO2의 분위기 및 가습 조건 하에서 조직배양 인큐에이터 내에서 37 ℃의 온도에서 배양되었다. 다음에, 세포는 72시간 동안 플라스틱 표면에 접착되는 것이 허용되었고, 그 후 배지는 3-4일 마다 교환되었다. 60-80 % 융합에 도달했을 때(일반적으로 10-12일 후), 세포는 0.25 % 트립신(trypsin)-EDTA를 이용하여 성장 플라스크로부터 분리된 후 새로운 플라스크 내에 접종되었다. 다음에 배양된 세포는 분석 또는 바이오리액터 내에서의 배양을 위해 채취되었다.
지방 유래의 간질세포( Adipose derived stromal cells ) - 인간 지방 조직의 지방흡인술(Rambam Haifa, Israel)에 의해 간질세포가 채취되었다. 지방조직은 동일한 체적의 PBS를 이용하여 충분히 세척되었고, 콜라게나제(20 mg/ml)를 이용하여 37 ℃의 온도에서 30분간 분해되었다. 다음에 세포는 10 % FCS, 펜-스트렙-니스타틴 혼합물(Pen-Strep-Nystatin mixture)(100 U/ml:100 ug/ml:1.25 un/ml) 및 L-글루타민을 함유하는 DMEM을 이용하여 세척되었고, 1200 rpm에서 10분간 원심분리되었고, 용해 용액(lysing solution)(1:10; Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel, in order to discard red-blood cells)을 이용하여 재현탁되었고, 10 % FCS, 펜-스트렙-니스타틴 혼합물(Pen-Strep-Nystatin mixture)(100 U/ml:100 ug/ml:1.25 un/ml) 및 L-글루타민을 함유하는 DMEM을 이용하여 재현탁되었다. 다음에 세척된 세포는 3-10 × 107 세포/플라스크의 농도로 살균 조직 배양 배지 플라스크 내에 접종되었다. 다음날 세포는 PBS를 이용하여 세척하여 잔류 RBC 및 죽은 세포를 제거하였다. 세포는 5 % CO2의 분위기 및 가습 상태 하에서 세포 배양 인큐베이터 내에 37 ℃의 온도로 유지되었다. 배지는 3-4일마다 교환되었다. 60-80 %의 융합에 도달한 시점에서, 세포는0.25 % 트립신(trypsin)-EDTA를 이용하여 성장 플라스크로부터 분리되었고, 새로운 플라스크 내에 접종되었다. 2-40회의 패시징 후, 60-80 %의 융합에 도달했을 때, 분석 또는 바이오리액터 내에서의 배양을 위해 세포가 채취되었다.
PluriX 플러그 플로우 바이오리액터 ( Plug Flow bioreactor ) - PluriX 플러그 플로우 바이오리액터(Pluristem, Haifa, Israel; 도 1의 g 및 미국특허 US 6,911,201 참조)에 폴리에스테르 부직포 기질로 제조된 1-100 ml 충전된 3D 다공성 캐리어(4 mm의 직경)가 장착되었다. 이들 캐리어는 비교적 소체적 내에서 대량의 세포를 증식시킬 수 있다. 유리제품은 플루리스템사(Pluristem)에 의해 설계되고 제작된 것이다. 상기 바이오리액터는 인큐베이터 내에서 37 ℃의 온도로 유지되었고, 유량은 밸브(6a; 도 1의 g 참조) 및 유동펌프(peristaltic pump; 9)(도 1의 g 참조)에 의해 조절 및 감시되었다. 바이오리액터는 세포의 순차적인 접종(seeding)을 가능하게 하는 샘플채취 지점 및 주입 지점(4; 도 1의 g 참조)를 포함한다. 배양 배지는 배양액 탱크(1; 도 1의 g 참조)로부터 pH 6.7-7.4로 공급되었다. 배양액 탱크에는 바이오리액터 내의 세포 밀도에 따라 비율이 달라지는 공기/CO2/O2를 함유하는 여과된 기체 혼합물(2,3; 도 1의 g 참조)이 공급되었다. 상기 O2의 비율은 모니터(6; 도 1의 g 참조)에 의해 결정된 바이오리액터의 출구의 O2의 용해농도에 적합되었다. 기체 혼합물은 실리콘 튜브 또는 확산기(diffuser)(Degania Bet, Emek Hayarden, Israel)를 통해 배양액 탱크에 공급되었다. 배양 배지는 순환하는 비접착 세포를 수집할 수 있는 분리 용기(separating container; 7)(도 1의 g 참조)를 통과되었다. 배지의 순환은 유동펌프(peristaltic pump; 9)(도 1의 g 참조)에 의해 달성되었다. 상기 바이오리액터에는 추가의 샘플채취 지점(10; 도 1의 g 참조) 및 연속 배지 교환을 위한 용기가 더 구비되었다.
3D-접착 간질세포(3D- ASC )의 생산 - 전술한 바와 같이 성장된 비융합성(non-confluent) 프라이머리 인간 접착성 2D 세포 배양물은 트립신처리(trypsinized)되었고, 10 % FBS, 펜-스트렙-니스타틴 혼합물(Pen-Strep-Nystatin mixture)(100 U/ml:100 ug/ml:1.25 un/ml) 및 2 mM L-글루타민이 첨가된 DMEM에 의해 재현탁되었고, 주입 지점을 통해 무균 플러그 플로우 바이오리액터 내의 3D 캐리어 상에 접종(103-105 세포/ml) 되었다(도 1의 g 참조). 접종 전, 바이오리액터는 PBS-Ca-Mg(Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel)로 충전되었고, 고압증기에 멸균되었고(120 ℃, 30 분간), 10 %의 가열불활성화 소의 태아 혈청 및 펜-스트렙-니스타틴 혼합물(Pen-Strep-Nystatin mixture)(100 U/ml:100 ug/ml:1.25 un/ml)을 함유하는 둘베코 성장 배지(Dulbecco's growth medium)를 이용하여 세척되었다. 유속은 0.1-5 ml/분으로 유지되었다. 접종 과정 중 2-48시간 동안 순환을 정지시킴으로써 캐리어 상에 세포가 침전될 수 있도록 하였다. 바이오리액터는 무균 공기 및 필요에 따라 CO2가 공급되는 인큐베이터를 사용하여 제어된 온도(37 ℃) 및 pH 조건(pH = 6.7-7.4) 하에 유지되었다. 성장 배지는 1주일에 2-3회 교체되었다. 순환 배지는 4시간 내지 7일 마다 새로운 DMEM 배지로 교체되었다. 1 × 106-1 × 107 세포/ml의 세포밀도(성장 후 12-40일 경과시)에서, 바이오리액터로부터 전체 배지가 제거되었고, 바이오리액터 및 캐리어는 PBS를 이용하여 3-5회 세척되었다. 다음에 3D-ASC 세포가 트립신(Trypsin)-EDTA(Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel; 부드러운 교반 상태 하에서 3-15 분간, 1-5 회)을 이용하여 분리되었고, 그 후 DMEM 내에 재현탁된 후 동결보존되었다.
3D- ASC 품질의 생물학적 분석 - 동결보존된 3D-ASC 세포는 해동된 후 세포수가 계수(count)되었다. 세포의 생존능력 평가를 위해, 2 × 105 개의 세포가 150 cm2의 조직배양 플라스크 내에 접종되었고, 접종 후 7일 내에 이들 세포의 접착 능력 및 재생이 평가되었다. 그 후, 형광 모노클로날 항체 플로우-시토메터(fluorescence monoclonal antibodies flow-cytometer; Beckman Coulter, Fullerton, CA)를 이용하여 3D-ASC 세포막 마커 표현형이 분석되었다.
플로우 시토메트리 분석을 이용한 3D 및 2D 배양된 접착 세포의 세포막 마커의 프로파일의 비교 - 2D 배양 및 3D 유동 시스템 배양의 100,000 - 200,000 개의 접착 세포가 5ml의 튜브 내의 0.1 ml의 배양배지 내에 현탁되었고, 하기의 각 Mab의 포화농도를 이용하여 배양되었다(4 ℃, 30 분, 암상태(dark conditions)): FITC-접합 항-인간(anti-human) CD90(Chemicon International Inc. Temecula, CA), PE-접합 항-인간 CD73(Bactlab Diagnostic, Ceasarea, Israel), PE conjugated anti human CD105 (eBioscience, San Diego, CA), FITC-접합 항-인간 CD29(eBioscience, San Diego, CA), Cy7-PE-접합 항-인간 CD45(eBiosience), PE-접합 항-인간 CD19(IQProducts, Groningen, The Netherlands), PE-접합 항-인간 CD14 MAb(IQProducts), FITC-접합 항-인간 CD11b(IQProducts), 및 PE-접합 항-인간 CD34(IQProducts), 또는 FITC-접합 항-인간 HLA-DR MAb(IQProducts). 접종 후, 1 %의 가열 불활성화된 FCS를 함유하는 얼음처럼 차가운 PBS 내에서 2회 세척되었고, 500 μl의 포름알데히드 0.5 % 내에 재현탁되었고, FC-500 플로우-시토미터(Beckman Coulter, Fullerton, CA)를 이용하여 분석되었다.
질량분석법을 이용한 3D 및 2D 배양된 접착 세포의 단백질 프로파일의 비교 - 2D 및 3D 유래의 배양 과정에서 전술한 바와 같이 태반으로부터 ASC가 생산되었다. 간결하게, 상기 2D 배양물은 37 ℃의 온도의 가습상태의 5 % CO2 분위기 하에서 175 cm2의 플라스크 내에서 0.3-0.75 × 106 개의 세포를 60 - 80 % 융합이 달성될 때까지 4일간 배양하여 생산되었다. 상기 3D 배양물은 2000개의 캐리어를 포함하는 바이오리액터 내에서 2-10 × 106 세포/g의 농도로 접종하고 18일간 배양함에 의해 생산되었다. 채취된 세포는 모든 혈청을 제거하기 위해 3회 세척되었고, 펠릿(pellet)으로 제조된 후 냉동되었다. 제조회사의 프로토콜에 따라, 펠릿으로부터 단백질이 트리 리에이전트 키트(Tri Reagent kit; Sigma, Saint Louis, USA)를 사용하여 단리되었고, 트립신(trypsin)을 이용하여 분해되었고, iTRAQ 시약(Applied Biosciences, Foster City, CA)을 이용하여 표지(labeled) 되었다. 간결하게, iTRAQ 시약은 비중합체인 동중량 표식 시약(isobaric tagging reagents)이다. 각 샘플 내의 펩티드는 이 펩티드의 N-단말 및/또는 리신 측쇄(lysine side chains)를 통해 4개의 동중량(isobaric), 동위원소 코드된 태그(isotope-coded tags) 중의 하나를 이용하여 표지되었다. 4개의 표지된 샘플은 혼합되고, 펩티드는 질량분석법에 의해 분석되었다. 펩티드 프래그멘테이션(peptide fragmentation)시, 각 태그(tag)는 명확한 질량 레포터 이온(mass reporter ion)을 방출하고; 따라서 4개의 레포터의 비율은 샘플 내의 주어진 펩티드의 상대존재비(relative abundances)를 부여한다(정보 출처: http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/00113379.pdf).
스롤러 프로테믹 센터(Smoler proteomic center; department of Biology, Technion, Haifa, Israel)에서 펩-마이너 소프트웨어(Pep-Miner software)[Beer, I., et al., Proteomics, 4, 950-60 (2004)]에 의해 수행되는 nr 데이터베이스의 인간 부분에 대한 동정 및 분석을 이용하여 QTOF-Premier(Waters, San Francisco, CA) 상에서 LC-MS/MS를 이용하여 태반 유래의 ASC의 2D 배양물 대 3D 배양물의 프로테오믹스 분석(Proteomics analysis)이 수행되었다. 분석된 단백질은 다음과 같다: 불균일핵 리보뉴클레오단백질 H1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1; Hnrph1 GeneBank 수탁번호 NP_005511), H2A 히스톤 패밀리(H2A histone family; H2AF, GeneBank 수탁번호 NP_034566.1), 진핵성 번역 신장 인자 2(eukaryotic translation elongation factor 2; EEEF2, GeneBank 수탁번호 NP_031933.1), 레티큘로칼빈 3(reticulocalbin 3), EF-핸드 칼슘 결합 도메인(EF-hand calcium binding domain; RCN2, GeneBank 수탁번호 NP_065701), CD44 항원 이소형 2 전구체(CD44 antigen isoform 2 precursor; GeneBank 수탁번호 NP_001001389), 칼포닌 1 염기성 평활근(calponin 1 basic smooth muscle; CNN1, GeneBank 수탁번호 NP_001290), 3 포스포아데노신 5 포스포설페이트 산타아제 2 이소형 a(3 phosphoadenosine 5 phosphosulfate synthase 2 isoform a; Papss2, GeneBank 수탁번호 NP_004661), 리보솜 단백질 L7a(ribosomal protein L7a; rpL7a, GeneBank 수탁번호 NP_000963) 및 알데히드 디하이드로제나아제 X(Aldehyde dehydrogenase X; ALDH X, GeneBank Accession No. P47738). 모든 실험은 2회 실시되었다. 분석의 특성상, 모든 단백질은 샘플에 나타나는 펩티드의 개수에 따라 분석되었다(각 분석에서 2-20회의 단백질 출현).
ELISA 를 이용한 3D 및 2D 배양된 접착 세포의 분비 단백질의 비교 - 2D 및 3D 유래의 배양 과정에서 태반으로부터 생산된 ASC가 전술한 바와 같이 3D 배양물을 이용하여 24일의 기간 동안에 생산되었다. 그 후 조절된 배지가 수집되고, 3개의 독립된 실험에서 ELISA(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 Flt-3 리간드, IL-6, 트롬보포이에틴(Trombopoietin; TPO) 및 줄기세포 인자(stem cell factor; SCF)에 대해 분석되었다. 결과는 1 × 106 세포/ml에 대해 표준화되었다.
골아세포 분화 배지 - 10 % FCS, 100 nM 덱사메타손(dexamethasone), 0.05 mM 아스코르빈산 2-인산염, 10 mM B-글리세로인산염이 보충된 DMEM으로 구성된 골아세포 분화 배지 내에서의 3주간의 세포 배양에 의해 골형성 분화가 평가되었다. 석회화 기질(calcified matrix)은 알리자린 레드 S 염색법(Alizzarin Red S staining)에 의해 표시되었고, 알칼리성 포스파타아제(Alkaline phosphatase)는 알칼리성 포스파타아제 분석 키트(시약 입수처: Sigma-Aldrich, St. Lewis, MO)에 의해 검출되었다.
결과
PluriX TM 바이오리액터 장치는 생리적 유사 미세환경(a physiological - like microenvironment)을 형성하였다.
접착 세포를 위한 효과적인 배양조건을 부여하기 위해, PluriXTM 바이오리액터(Pluristem, Haifa, Israel; 캐리어는 도 1의 g에 도시되어 있고, 접종 전의 캐리어는 도 1의 b에 도시되어 있다)를 이용하여 생리적 유사 환경(도 1의 a 참조)가 인공적으로 형성되었다. 도 1의 c 내지 f에 도시된 바와 같이, 골수 생성 3D-ASC 세포는 성공적으로 배양되었고, 접종 후 20일(도 1의 b 및 c 참조, 각각 X150 및 X250의 배율) 및 접종 후 40일(도 1의 c 및 d 참조, 각각 X350 및 X500의 배율) 경과시 3D 기질 상에서 증식되었다.
PluriX 바이오리액터 장치 내에서 성장된 세포는 상당량 증식되었다 - 바이오리액터 장치 내에서 태반 유래의 3D-ASC 세포의 상이한 생산 랏(production lots)이 성장되었다. 접종 밀도는 13,300 세포/캐리어(총 2 × 106 세포)였다. 접종 후 14일 경과시, 세포의 밀도는 15배 증가되어, 약 200,000 세포/캐리어(도 2 참조), 또는 150개의 캐리어로 구성되는 1개의 바이오리액터 내에 30 × 106 개의 세포가 되었다. 다른 실험에서, 세포는 바이오리액터 내에 1.5 × 104 세포/ml의 밀도로 접종되었고, 접종 후 30일 경과시 캐리어는 50배 이상의 세포수(즉, 약 0.5 × 106 세포/캐리어, 또는 0.5 × 107 세포/ml의 세포수)를 포함하였다. 성장 컬럼의 다양한 수준에서 캐리어 상의 세포 밀도는 일정하였다. 이것은 세포에 산소 및 영양소가 균일하게 이동한 것을 나타낸다.
따라서, 3D 배양 시스템은 고밀도 간엽 세포 배양의 성장 및 장기간 유지를 위한 호조건(supporting conditions)을 제공하는 것이 입증되었다. 상기 간엽 세포는 이식의 지원 및 성공적인 이식을 위해 충분한 양만큼 효과적으로 성장될 수 있다.
3D- ASC 는 독특한 세포막 마커 특성을 보인다 - 골 환경을 모사한 3D 배양 과정에 의해 유발되는 가용성 분자 및 단백질 생산의 분비 프로파일(secretion profile)의 차를 결정하기 위해 FACS 분석이 실시되었다. 도 3의 a에 도시된 바와 같이, 세포 마커의 FACS 분석에 의해3D-ASC는 2D 조건 하에서 성장된 접착 세포와 다른 마커 발현 패턴을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 2D 배양된 세포는 3D 배양된 세포에 비해 양성 세포막 마커(CD90, CD105, CD73 및 CD29)의 수준이 상당히 높게 발현되었다. 예를 들면, CD105는 3D 배양 세포에서는 56 %의 발현인데 비해 2D 배양 세포에서는 87 %의 발현을 보였다. 2D 및 3D 태반 배양물의 ASC는 어떤 조혈 세포막 마커도 발현하지 않았다(도 3의 b 참조).
3D- ASC 는 독특한 가용성 인자( soluble factor )의 프로파일을 보인다 - 조혈 적소(hematopoietic niche)는 다량의 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자를 생산하는 서포터 세포(supporter cell)를 포함한다. 2D 및 3D 배양된 ASC 사이의 차이를 더욱 명확히 보이기 위해, 2D 및 3D의 ASC 배양물로 된 조절된 배지 내의 4종의 주요 조혈 분비 단백질의 프로파일이 ELISA에 의해 수행되었다. 도 4a 내지 도 4c는 3D 조건에서 성장된 세포는 고농도의 Flt-3 리간드(도 4a), IL-60(도 4b), 및 SCF(도 4c)를 구비하는 조절 배지를 생산하는데 비해, 2D 배양물로 된 조절 배지 내에서는 저농도의 IL-6 및 0에 접근하는 농도의 Flt-3 리간드 및 SCF가 검출되었다. 트롬보포이에틴(TPO)의 생산량은 양 배양물 공히 극히 낮았다.
3D- ASC 는 질량분석법에서 독특한 단백질 프로파일( protein profile )을 보인다 - 2D 및 3D 배양된 ASC 사이의 차이를 더욱 명확히 보이기 위해, 질량분석을 통해 이들 세포의 단백질 프로파일이 분석되었다. 도 4d는 2D 및 3D 배양된 ASC가 현저하게 다른 단백질 발현 프로파일을 보이는 것을 보여준다. 다음의 표 1는 3D 배양된 세포는 H2AF 및 ALDH X의 발현 수준이 상당히 높은 것(각각 9배 및 12배 높은 발현 수준)을 보여주고, EEEF2, RCN2 및 CNN1 단백질의 발현 수준이 높은 것(각각 약 3배, 2.5배 및 2배)을 보여준다. 또, 3D 배양된 세포는 단백질 Hnrph1 및 CD44 항원 이소형(antigen isoform) 2 전구체의 발현 수준의 약 1/2을 나타내고, Papss2 및 rpL7a의 발현 수준의 약 1/3을 나타낸다.
단백질 (iTRAQ 레포터 기에 대비되는) 단백질 농도
3D 배양된 ASC 2D 배양된 ASC
Av SD Av SD
Hnrph1 1.434493 0.260914 0.684687 0.197928
H2AF 0.203687 0.288058 1.999877 0.965915
EEEF2 0.253409 0.130064 0.799276 0.243066
RCN2 0.54 0.25 1.34 0.26
CD44 항원 이소형 2 전구체 1.68 0.19 0.73 0.17
CNN1 0.77 0.15 1.55 0.17
Papss2 1.48352 0.314467 0.45627 0.137353
rpL7a 1.22 0.24 0.43 0.05
ALDH X 0.15847 0.22411 1.986711 0.212851
3D- ASC 는 조골아세포로 분화되는 능력을 가진다 - 3D-ASC에 더욱 특징 부여하기 위해, 조혈아세포 분화 배지 내에서 3주 동안 세포가 배양되었다. 그 후, 칼슘 침전이 발생되었다. 분화된 세포는 칼슘을 생산(도 5의 a 및 b의 적색 부분)하는데 비해, 대조 세포는 섬유아세포형 표현형(fibroblast like phenotype)을 유지함과 동시에 석화(mineralization)가 입증되지 않았다(도 5의 c 및 d). 이들 결과는 태반 유래의 3D-ASC는 인비트로에서 조골아세포로 분화되는 능력을 가진다는 것을 보여준다.
실시예 2
HSC 이식을 개선하기 위한 태반 유래의 3D- ASC 의 능력의 평가
아치사량 방사선조사(sublethally irradiated)되거나 화학요법 전처리된 면역결핍 NOD-SCID 마우스 내의 인간 조혈세포(hCD45+)의 농도에 의해 HSC 이식의3D-ASC 지지체가 평가되었다.
물질 및 실험 과정
CD34 + 세포의 단리 - 출산 중에 무균 상태에서 제대혈 샘플이 채취되었고, 림포프렙(Lymphoprep; Axis-Shield PoC As, Oslo, Norway) 밀도 구배 원심분리에 의해 단핵 세포가 분별(fractionated)된 후 냉동보존되었다. 해동된 단핵세포는 세척된 후 항 CD34 항체를 이용하여 배양되고, midi MACS(Miltenyl Biotech, Bergish Gladbach, Germany)를 이용하여 단리되었다. 소망의 양의 세포(50,000-100,000개의 세포)를 얻기 위해 하나 이상의 샘플로부터 채취된 세포들을 취합하였다.
방사선 조사된 마우스 내의 이식된 세포의 검출 - 7주령의 수컷 및 암컷 NOD-SCID 마우스(NOD-CB17-Prkdcscid/J; Harlan/ Weizmann Inst., Rehovot Israel)이 무균 개방 시스템 케이지(sterile open system cages) 내에 유지되고, 무균 사료 및 가열멸균 산성수가 급식되었다. 이들 마우스에 아치사량의 방사선(350 cGy)이 조사된 다음, (방사선 조사후 48시간 경과시) 태반 또는 지방조직에서 유래된 추가의 ASC(0.5 × 106 - 1 × 106)를 사용하거나 사용하지 않은 상태에서 외측 꼬리 정맥 내의 정맥주사에 의해 50,000-100,000 hCD34+ 세포가 이식되었다. 이식 후 4 내지 6주 경과시, 마우스들은 디스로케이션(dislocation)에 의해 희생되었고, 대퇴골(femurs) 및 경골(tibias)에 FACS 완충액(50 ml PBS, 5 ml FBS, 0.5 ml 소디움 아지드(sodium azid) 5 %)을 주입함으로써 골수가 채취되었다. 마우스 골수 내의 인간세포가 플로우 사이토메트리(flow cytometry)에 의해 검출되었고, 처리된 NOD-SCID 마우스 내에서 인간 및 쥐과동물 CD45 조혈세포 마커 발현 세포의 백분율이 항인간(anti-human) CD45-FITC(IQ Products, Groningen, The Netherlands)를 이용한 세포 배양에 의해 결정되었다. 명확한 인간 이식을 위한 최저의 역치는 0.5 %에서 나타났다.
화학요법으로 처리된 마우스 내의 이식 세포의 검출 - 6.5 주령의 수컷 NOD-SCID 마우스(NOD.CB17/JhkiHsd-scid; Harlan, Rehovot Israel)가 전술한 방사선 조사된 마우스와 동일하게 유지되고, 부설판(Busulfan; 25 mg/kg, 연속 2일간)이 복강내 투여되었다. 2차 부설판 주입 후 2일 경과시, 마우스들은 CD34+ 세포만 주입되거나 CD34+ 세포 및 태반으로부터 생산된 0.5 × 106 ASC가 동시에 주입되었다. 이식 후 3.5주 경과시, 마우스는 희생되었고, 인간 조혈 세포의 존재가 전술한 방사선 조사된 마우스에서 기술된 것과 같이 측정되었다.
결과
3D- ASC 는 방사선 조사된 마우스 내에서 HSC 의 이식을 향상시켜준다 - 인간 CD34+ 조혈세포 및 태반이나 지방으로부터 유래된 3D-ASC가 방사선 조사된 NOD-SCID 마우스들에게 공동 이식되었다. 이식 효율은 공동 이식 후 4주 경과시 평가되었고, HSC만 이식된 마우스와 비교되었다. 표 2 및 도 6에 개시된 바와 같이, 3D-ASC 및 UCB CD34+ 세포의 공동 이식의 결과 이식율이 상당히 높아지고, UCB CD34+ 세포만으로 처리된 마우스에 비해 피제공자 마우스의 골수 내의 인간 세포의 농도가 높아진다.
이식된 세포 평균 h-CD45 STDEV
CD34 3.8 7.9
태반의 CD34+3D-ASC 5.1 12.2
지방의 CD34+3D-ASC 8.7 9.6
3D- ASC 는 화학요법으로 처리된 마우스 내의 HSC 의 이식을 향상시켜 준다 - 인간 CD34+ 조혈세포가 태반 유래의 500,000 개의 2D-ASC 또는 3D-ASC와 공동으로 화학요법으로 처리된 NOD-SCID 마우스 내에 이식되었다. 이식 효율은 공동 이식 후 3.5주 경과시 평가되었고, HSC만 이식된 마우스와 비교되었다. 표 3에 표시된 바와 같이, ASC 및 UCB CD34+ 세포의 공동 이식의 결과 UCB CD34+만 이식된 마우스에 비해 피제공자 마우스의 골수 내의 이식농도가 더 높았다. 더욱 표 3에 표시된 바와 같이, PluriX 바이오리액터 장치(3D-ASC) 내에서 성장된 태반 유래의 접착 세포와 공동 이식된 마우스의 평균 이식 수준이 종래의 정적인 2D 배양 조건(플라스크) 내에서 성장된 동일 제공자의 세포와 공동 이식된 마우스의 평균 이식 수준에 비해 더 높았다.
이식된 세포 평균 h-CD45 STDEV
CD34 0.9 1.1
CD34 + 공지의 2D 배양(태반유래) 3.5 0.2
CD34 +3D-ASC(태반유래) 6.0 7.9
도 7의 a 및 b에 개시된 FACS 분석 결과는 ASC와 hHSCs의 공동 이식의 장점(도 7의 b) 및 이식 후의 조혈계(hematopoietic system)의 회복을 향상시키는 ASC의 능력을 입증해 준다.
종합하면 이들 결과는 ASC는 HSC의 이식(자가이식 즉 동종이식) 후 조혈 회복을 향상시켜 주는 지원 세포로서의 역할을 할 수 있다는 것을 보여준다. HSC 이식 후 조혈 줄기세포 및/또는 전구체 세포의 이식을 향상시키는 3D-ASC의 능력은 이식된 세포의 호밍, 자기복제 및 증식능력을 향상시킬 수 있는 HSC 지원 사이토카인을 분비하는 3D-ASC의 능력으로부터 유래되거나 이식된 HSC의 호밍 및 증식을 위해 필요한 손상된 조절 미세환경을 복구시키는 3D-ASC의 능력으로부터 유래될 수 있다.
실시예 3
2D 및 3D 배양된 ASC 에 의한 임파구 반응의 억제
MLR 분석 결과, 접착 간질세포, 및 특히 3D-ASC는 인간 제대혈 단핵 세포의 면역 반응을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
물질 및 실험 과정
혼합된 임파구 반응( Mixed lymphocyte reaction ; MLR ) 분석 - 응답세포(responsive cells; 증식하는 세포) 및 자극세포(stimulating cells; 증식하지 않는 세포)의 혼합 배양에서 비적합성 임파구의 증식율에 의해 결정되는 HLA 유전자자리(locus)의 조직적합성을 측정하는 MLR 분석법에 의해 태반으로부터 생산된 2D 및 3D 유래의 배양 과정의 ASC의 면역억제특성 및 면역특권특성(immunoprivileged properties)이 분석되었다. 응답세포로서 인간 제대혈(CB) 단핵세포(2 × 105)가 사용되었고, 이 단핵세포는 동량(105)의 방사선 조사(3000 라드)된 인간 말초혈 유래의 단핵백혈구(peripheral blood derived Monocytes; PBMC), 또는 태반으로부터 생산된 2D 또는 3D 배양된 접착 세포, 또는 접착 세포와 PBMC의 조합과 공동 배양되는 것에 의해 자극이 부여되었다. 각 분석실험은 3회 반복되었다. 세포들은 96개의 웰 플레이트(well plate)의 RPMI 1640 배지(20 % FBS를 함유; 가습된 5 % CO2 분위기; 37 ℃) 내에서 4일간 공동 배양되었다. 상기 플레이트들은 배양의 마지작 18시간 동안 1 μC 3H-티미딘(thymidine)을 이용하여 맥동(pulse)이 부여되었다. 다음에 파이버글래스 필터 상의 세포가 채취되었고, 신틸레이션 카운터(scintillation counter)를 이용하여 티미딘 흡수량이 측정되었다.
결과
PBMC에 의해 자극되었을 경우의 제대혈(CB) 세포의 향상된 증식에 의해 표시되는 제대혈 세포의 면역 반응을 보여주는 것으로서, 이 면역 반응은 이론에 구애받음이 없이 아마도 HLA 비적합성에 응답하는 T세포 증식에 관련되는 것으로 생각된다. 그러나, 이들 세포의 면역 반응은 본 발명의 접착 세포와 함께 배양되는 경우 상당히 낮은 수준을 나타낸다. 더욱, PBMC에 대한 제대혈 면역 반응은 이들 접착 세포와 공동 배양시 상당히 감소되었다. 따라서, MSC에 대한 것과 유사한 방법에서, ASC는 제공자 세포(통상 GvHD)의 T세포 증식을 감소시키는 잠재적 능력을 가지는 것이 밝혀졌다. 비록 2D 및 3D의 양 배양물이 임파구의 면역 반응을 감소시키지만 전술한 3D-ASC의 기타의 장점에 따라 3D의 ASC의 면역억제성이 더 컸다.
명확화를 위해 별도의 실시예들에서 기술된 본 발명의 어떤 특징들은 단일 실시예 내에 조합될 수 있다. 반대로, 간략화를 위해 단일의 실시예에서 기술된 본 발명의 다양한 특징들은 별개의 적절한 실시예에 분리하여 제공될 수 있다.
이상에서 본 발명은 특정의 실시예에 관련하여 기술되었으나, 본 기술분야의 전문가는 많은 변경례 및 개조례를 실시할 수 있다. 따라서, 첨부된 청구항의 정신 및 범위 내에 속하는 모든 변경례 및 개조례는 본 발명에 포함된다. 본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허출원 및 GenBank 수탁번호는 참조로서 도입된 것이다. 또, 본 명세서의 참조문헌의 인용 및 확인은 상기 참조문헌을 본 발명의 종래기술로서 승인하는 것으로 해석되지 않는다.

Claims (10)

  1. 조혈 질환을 앓고 있는 개체에서 조혈 줄기세포의 이식을 촉진하는데 사용하기 위한, 태반 조직으로부터 유래하는 접착 간질세포의 치료학적 유효량을 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 접착 간질세포가 세포 증식을 지지하는 3차원 배양 시스템에서 배양되었던 것이고, 상기 3차원 배양 시스템이 부직포 기질(non-woven fabric matrix)로 만들어진 캐리어를 포함하는 것인 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조혈 줄기세포의 이식을 촉진하는 것이 개체의 조혈세포의 개수를 증가시키는 것을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조혈 줄기세포의 이식을 촉진하는 것이 추가로 CD45+ 마커를 발현하는 조혈세포의 개수를 증가시키는 것을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 개체가 방사선이 조사되었던 것인, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 개체가 화학요법으로 인해 면역결핍인 것인, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 배양된 접착 간질세포가 Flt-3 리간드, IL-6 및 SCF를 분비하는 것인, 약학적 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 캐리어가 다공성 캐리어인 것인, 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 부직포 기질이 합성 물질로 만들어진 것인, 약학적 조성물.
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