CN109496236A - 改变的粘附基质细胞及其产生和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了改变的粘附基质细胞及其制备和使用方法。

Description

改变的粘附基质细胞及其产生和使用方法
发明领域
本文公开了改变的粘附基质细胞及其产生和使用方法。
发明背景
新兴的研究正检验细胞因子处理对骨髓衍生的间充质干细胞(BM-MSC)的影响(参见Kavanagh DP et al.)。胎盘衍生的粘附基质细胞(胎盘ASC)与BM-MSC不同(Jeon YJ etal)。虽然一篇独立的报道观察到细胞因子处理对胎盘ASC的影响(Li H et al)，但是离体细胞因子处理对这些细胞的影响才刚刚开始被了解。此外，尚未开发出用于细胞因子刺激指数生长的细胞的有效方法(例如在生物反应器中)。
发明概述
如本文所提供的，在含有有效量的炎性细胞因子的培养基中扩增了胎盘ASC。在其它实施方案中，根据两步法扩增(expand)了胎盘ASC，第一步没有加入炎性细胞因子，第二步在存在炎性细胞因子条件下进行。这些细胞呈现出一组独特的特征和性质，其被认为在自然界或者先前已知的人工产生的细胞组合物中均不具有任何对应的特征和性质。在一些实施方案中，它们是由于所述离体处理以产生或者分泌升高量的治疗因子而引发的。在其它实施方案中，它们适用于在远离其位置的组织中施用，或者在其它实施方案中当全身施用时适用。
在某些实施方案中，在所述三维(3D)培养之前，在二维(2D)培养中培养了本文所述的ASC。2D和3D培养条件的非限制性实例在本发明详细描述和实施例中提供。除非另有说明，术语“ASC”在各个实施方案中可以是指在与促炎性细胞因子温育之前或者之后粘附基质细胞。
术语“二维培养”和“2D培养”是指细胞暴露于与细胞生长相容且允许细胞以单层生长的条件下的培养，所述培养单层被称为“二维培养装置”。这种装置典型具有平坦的生长表面，在一些实施方案中包含粘附材料，其可以是平面或者弯曲的。用于2D培养的装置的非限制性实例是细胞培养皿和平板。这个定义包括多层托盘，例如由NuncTM制造的CellFactory TM，条件是每层均支持单层培养。应当理解，即使在2D装置中，当允许细胞变得过度铺满时，细胞也可以在彼此上生长。这不影响所述装置被分类为“二维装置”。
术语“三维培养”和“3D培养”是指细胞暴露于与细胞生长相容且允许细胞相对于彼此以3D方向生长(例如生长至单层平面外部)的条件的培养。术语“三维[或者3D]培养装置”是指在与细胞生长相容且允许细胞相对于彼此以3D方向生长的条件下培养细胞的装置。这种装置通常具有3D生长表面，在一些实施方案中包括粘附材料。适用于扩增粘附基质细胞的3D培养条件的某些非限制性实施方案在PCT申请公开No.WO/2007/108003和WO2010/026575中描述，所述专利内容以其全部内容并入本文作参考。
二选一或另外，所述细胞是间充质样ASC，其表现出与间充质基质细胞(MSC)相似的标志物模式，但在“经典”MSC将分化为骨细胞的条件下不分化为骨细胞。在其它实施方案中，细胞表现出与MSC相似的标志物模式，但在MSC分化为脂肪细胞的条件下不分化为脂肪细胞。在其它实施方案中，所述细胞表现出与MSC相似的标志物模式，但在MSC分化为骨细胞或者脂肪细胞的条件下分别不分化为骨细胞或者脂肪细胞。在一些实施方案中，用于在这些测定中进行比较的MSC是从骨髓(BM)收获并在2D条件下培养的MSC。在其它实施方案中，从BM收获了用于比较的MSC并在2D培养中培养，然后进行3D培养。在更特别的实施方案中，所述间充质样ASC是母源的胎盘细胞。在另一实施方案中，间充质样ASC是胎儿来源的胎盘细胞。在其它实施方案中，间充质样ASC是母体细胞和胎儿细胞的混合物。
除了另有表明，否则本文提及的所有范围均包含端值(inclusive)。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述那些相似或者等同的方法和材料可用于本发明的实践或者检测，但下文描述了合适的方法和材料。如有冲突，以专利说明书，包括定义为准。此外，所述材料、方法和实施例仅是举例说明而不是限制性的。
附图简述
在此仅以举例方式及参考附图描述了本发明。现在详细地参考附图，要强调的是所示的细节是示例性的，及仅出于对本发明实施例的加以举例说明的目的，且是为了提供被认为是最有用和易于理解的本发明原理和概念方面的描述。在这方面，未试图示出更详细地示出本发明的结构细节(与对于理解本发明必要的相比)，根据附图描述使本领域技术人员清楚本发明的几种形式怎样在实践中体现。
在附图中：
图1是可用于制备细胞的生物反应器的示意图。
图2含有ASC上刺激和共刺激分子的表达的图。左上：CD80的表达。右上：CD86的表达。左下：CD40的表达。右下：HLA-A/B/C的表达。用相关的同种型荧光分子制备阴性对照。虚线、细线和粗线分别表示胎盘ASC、骨髓(BM)细胞和单个核细胞(MNC)的标志物的表达。
图3是在不存在或者存在ASC的条件下PBMC分泌IL-10的图。每组的柱从左到右为：1-3：用0、1或者10mcg/ml LPS刺激后的大鼠IL-10；4-6：用0、1或者10mcg/ml LPS刺激后的人IL-10。
图4A-B是示出通过[3H]胸苷掺入测量的淋巴细胞增殖的图。A.在MLR测试中，在存在不同量的ASC条件下用等量的经照射的(3000Rad)PB衍生的MNC(供体B)刺激2×105个外周血(PB)衍生的MNC(供体A)。B.用ConA(1.5mg/ml)刺激的PB衍生的MNC。对于(A)和(B)，每个样品的一式三份进行。
图5A-C是示出ASC调节人MNC(分离自外周血)分泌促炎性细胞因子和抗炎细胞因子的图。A-B示出用ConA刺激的IFN-γ(A)和TNF-α(B)分泌。C示出用LPS刺激后IFN-γ、TNF-α和IL10的分泌(pg/ml)(在每个系列分别为左、中和右)。通过ELISA分析上清。
图6是在常氧或者低氧条件下ASC的分泌谱的图。
图7A-B是示出在两个单独的实验中通过荧光测量的在将ASC与TNF-α+IFN-γ(未填充的柱)或者与对照培养基(实心柱)温育后各种因子的分泌的图。C-D是示出通过荧光测量的在将ASC与单独的TNF-α温育后相对于对照培养基(无细胞因子)的GRO、IL-8、MCP-1和RANTES(C)以及IL-6、MCP-3、血管生成素、胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)、骨桥蛋白和骨保护素(D)的分泌的倍数增加的图。
图8A-B是示出在一些实验中通过ELISA测量的相对于对照培养基(不含有细胞因子)的MCP-1(A)和GM-CSF(B)分泌的倍数增加的图。
图9A-B是示出在存在或者不存在FBS的条件下TNF-α+IFN-γ(A)或者单独的TNF-α(B)的各种因子的分泌的图，以荧光信号单位表示。在(A)中，灰色、白色和黑色柱分别表示TNF-α+IFN-γ、TNF-α+IFN-γ+FBS和对照(无细胞因子或者血清)。在(B)中，灰色、白色和黑色柱分别表示单独的TNF-α、TNF-α+FBS和对照(无细胞因子或者血清)。图9C-E是示出未刺激的细胞(对照；水平虚线阴影)或者用单独的TNF-a(垂直阴影)或者TNF-a+IFN-g(水平实线阴影)刺激的细胞的各种因子的分泌的蛋白质浓度(以pg/ml为单位)的图。
图10是示出在如下样品中RANTES(CCL5)的表达的图，从左到右排序：未用细胞因子处理的胎盘细胞(标示为对照)或者用TNF-α、IFN-γ或者TNF-α+IFN-γ处理的胎盘细胞(分别标示为TNF、INF和TNF-INF)。任意地，将TNF-α+IFN-γ组代表性样品的表达水平指定为1的值。
图11A-I是示出在如下处理的各批次细胞中通过qRT-PCR测量的IDO1(A)、IL18BP(B)、MCP1/CCL2(C)、IL1β(D)、HLA-DR(E)、CD106(VCAM)(F)、MMP3(G)、IGFBP5(H)和RGS4(I)的表达的图，从左至右排序：未用细胞因子处理的胎盘细胞(对照)或者用TNF-α、IFN-γ处理或者用TNF-α+IFN-γ处理的胎盘细胞(分别为TNF、INF和TNF-INF)。任意地，将TNF-INF的代表性样品的表达水平被指定为1的值。
图12A-L是示出未刺激细胞(对照；水平阴影)或者用单独TNF-α(斜线阴影)或者TNF-α+IFN-γ(垂直阴影)刺激的细胞的各种标志物的差异表达的FACS图。
图13是示出在生物反应器中用不同浓度的细胞因子(表13所示)刺激40小时(最左边7组)或者24小时(最右边5组)的细胞中群体倍增时间(PDT；垂直轴)的图。
图14A是示出用各种浓度的细胞因子(在水平轴上标示)刺激40小时(虚线圆)或者24小时(实线圆)的细胞中相对荧光单位(RFU；垂直轴)的变化的图。荧光与DNA量成正比及因此与细胞数目成正比，反映了解冻后的细胞生长。B-C是示出刺激24小时(B)或者40小时(C)后CCL2(水平阴影)、IL1B(垂直阴影)和IL6(未填充)的诱导，以相对于无细胞因子组的倍数变化表示(纵轴)。D是用各种浓度的TNF-a和IFN-g(其各自的浓度显示在横轴上)刺激后的解冻后活力(纵轴)的图。
图15是示出在生物反应器运行期间在不同时间点生物反应器中TNF-α浓度的图，在3个不同的运行设置中，IFN-g和TNF-a均给定10、5或者1ng/ml。数据组如图所示。
图16是仅用于示例目的的细胞培养物相对于时间的相对群体大小的对数的理论图示。μm是最大细胞分裂率，λ表示静止期结束，A是渐近线。
图17A是根据示例实施方案的载体(或者“3D主体”)的透视图。B是根据另一示例实施方案的载体的透视图。C是根据示例实施方案的载体的横截面图。
发明详述
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解本发明的应用不限于以下描述中阐述的或者实施例示例的细节。本发明可以具有其它实施方案或者能以各种方式实践或者实施。也应该理解本文采用的措辞和术语是为了描述的目的，不应该被认为是限制性的。
本发明提供了改变的粘附基质细胞(ASC)及产生、刺激和使用其的方法。ASC可以衍生自例如胎盘、脂肪组织、骨髓、外周血、脐带血、滑液、滑膜、脾、胸腺、粘膜(例如鼻粘膜)、角膜缘基质(limbal stroma)、韧带如牙周韧带、头皮、毛囊、睾丸、胚胎卵黄囊和羊水，已知所有这些均包含粘附基质细胞。在某些实施方案中，ASC的来源是非胎儿来源，例如来自胎盘的母体细胞或者来自儿童或者成人供体的体细胞组织，例如脂肪组织、骨髓、外周血、脐带血、滑液、滑膜和韧带如牙周韧带。在一些实施方案中，ASC是人ASC，而在其它实施方案中，它们可以是动物ASC。在特定的实施方案中，ASC衍生自胎盘组织，或者衍生自脂肪组织。
在另一个实施方案中，提供了产生改性的(modified)ASC的方法，所述方法包括在生长培养基中在三维(3D)培养装置中在温育ASC的步骤，其中已将一或者多种促炎性细胞因子加至生长培养基中，从而产生改性的ASC。在另一个实施方案中，提供了产生改性的ASC的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在第一生长培养基中温育ASC，其中在第一生长培养基中未加入炎性细胞因子；(b)随后在第二生长培养基中在3D培养装置中温育ASC，其中已将一或者多种促炎性细胞因子加入第二生长培养基中，从而产生改性的ASC。每个温育步骤通常进行至少20小时。在一些实施方案中，在第一生长培养基中的温育也在3D培养装置中进行。根据本发明揭示，本领域技术人员将意识到通过简单地将细胞因子加入培养装置中的培养基中或者在其它实施方案中通过从培养装置中除去培养基并代之以含有细胞因子的培养基，而可以将同一3D培养装置用于在第一和第二生长培养基中温育。在其它实施方案中，不同的3D培养装置可用于在存在细胞因子条件下温育，例如在加入含有细胞因子的培养基之前将细胞移动(例如传代)至单独的容器培养器中，或者在其它实施方案中通过将细胞与之结合的载体移动至不同的培养器中。在各个实施方案中，提及的“单独的容器”包括在同一培养器及单独的培养器内的另一容器。根据本公开，本领域技术人员会意识到所述方法中使用的ASC可以从胎盘、脂肪组织或者其它来源提取，如本文所述。
在另一个实施方案中，提供了产生改性的ASC的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在第一生长培养基中扩增ASC，其中在第一生长培养基中未加入炎性细胞因子；(b)随后在指数生长期期间在第二生长培养基中温育ASC，其中在第二生长培养基中已加入一或者多种促炎性细胞因子，从而产生改性的ASC。每个温育步骤通常进行至少20小时。在一些实施方案中，在第一生长培养基和第二生长培养基中的温育是在3D培养装置中进行。根据本发明公开内容，本领域技术人员将意识到可以将同一3D培养装置用于在第一和第二生长培养基中进行温育，通过简单地将细胞因子加入培养装置中的培养基中或者在其它实施方案中从培养装置中除去培养基并代之以含有细胞因子的培养基进行。在其它实施方案中，不同的3D培养装置可用于在存在细胞因子条件下进行温育，例如通过在加入含有细胞因子的培养基之前将细胞移动(例如传代)至不同的培养器中，或者在其它实施方案中通过将细胞与之结合的载体移动至不同的培养器而进行。根据本公开，本领域技术人员将意识到在所述方法中使用的ASC可以从胎盘、脂肪组织或者其它来源提取，如本文所述。
在其它实施方案中，提供了包含所述ASC的组合物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在进一步的实施方案中，赋形剂是渗透保护剂或者冷冻保护剂，保护细胞免受冷冻的破坏作用及免于冰形成的物质，其在一些实施方案中可以是渗透化合物，其非限制性实例是二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、甲酰胺、丙二醇(propanediol)、聚乙二醇、乙酰胺、丙二醇(propylene glycol)和侧金盏花醇；或者在其它实施方案中可以是非渗透性化合物，其非限制性实例是乳糖、棉子糖、蔗糖、海藻糖和d-甘露糖醇。在其它实施方案中，渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂均存在。在其它实施方案中，所述赋形剂是载体蛋白，其非限制性实例是白蛋白。在其它实施方案中，渗透保护剂和载体蛋白均存在；在某些实施方案中，渗透保护剂和载体蛋白可以是相同的化合物。二选一或另外，所述组合物是冷冻的。细胞可以是本文提到的ASC的任何实施方案，每个实施方案均被认为是单独的实施方案。
本领域技术人员会意识到动物血清和其它来源的生长因子通常包含在生长培养基中。在一些情况中，动物血清可含有炎性细胞因子，一般而言，其通常不会大量存在。一些制备使用例如用木炭处理的血清，以除去存在的大部分或者全部细胞因子。在任何情况中，本文提及的“加入的细胞因子”、“含有细胞因子的培养基”等不包括通常包含于培养基中的偶然存在于动物血清中的细胞因子的存在。
在其它实施方案中，提供了包含所述ASC的培养物，或者在其它实施方案中包含所述培养物的生物反应器。除非另有说明，否则术语“生物反应器”是指包括细胞培养室和外部培养基容器(非限制性实例是补料袋)的装置，所述外部培养基容器与细胞培养室可操作地连接以便能在两个区室之间进行培养基交换(灌注)。该术语不包括来自生物体的去细胞化器官和组织。在一些实施方案中，生物反应器进一步包含合成材料，其是3D基质。细胞可以是本文提及的ASC的任何实施方案，其每个均被认为是单独的实施方案。
在其它实施方案中，提供了包含任何所述细胞群的悬浮液。在某些实施方案中，悬浮液包含药学上可接受的赋形剂。在其它实施方案中，悬浮液是药物组合物。在其它实施方案中，悬浮液是冷冻的，及在一些实施方案中进一步包含冷冻保护剂。在其它实施方案中，提供了包含所述悬浮液的组合物。在某些实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在进一步的实施方案中，赋形剂是冷冻保存剂(冷冻保护剂)，或者是载体蛋白。二选一或另外，组合物是冷冻的。在这方面，每个上述细胞群代表一个单独的实施方案。
在各个实施方案中，所述ASC能发挥所述治疗作用，其每一个被认为是单独的实施方案，ASC自身移植或不移植到宿主中。例如，在各个实施方案中，细胞可以发挥治疗效果，其自身不会存活超过3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或者超过14天。
在本文提及的一或者多种“促炎”细胞因子或者“炎性因子”可互换使用，是指存在介导哺乳动物宿主例如人宿主中炎症反应的至少一种细胞因子。细胞因子非限制性例如是干扰素-γ(IFN-gamma或者IFN-γ；UniProt标识符P01579)、IL-22(UniProt标识符Q9GZX6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α；UniProt标识符P01375)、IFN-α、IFN-β(UniProt标识符P01574)、IL-1α(UniProt标识符P01583)、IL-1β(UniProt标识符P01584)、IL-17(UniProt标识符Q5QEX9)、IL-23(UniProt标识符Q9NPF7)、IL-17A(UniProt标识符Q16552)、IL-17F(UniProt标识符Q96PD4)、IL-21(UniProt标识符Q9HBE4)、IL-13(UniProt标识符P35225)、IL-5(UniProt标识符P05113)、IL-4(UniProt标识符P05112)、IL-33(UniProt标识符O95760)、IL-1RL1(UniProt标识符Q01638)、TNF-β(UniProt标识符P01374)、IL-11(UniProt标识符P20809)、IL-9(UniProt标识符P15248)、IL-2(UniProt标识符P60568)、IL-21(UniProt标识符Q9HBE4)、肿瘤坏死因子样配体(TL1A；a.k.a.TNF配体超家族成员15；UniProt标识符O95150)、IL-12(对于α-和beta亚基，UniProt标识符分别为P29459和P29460)，及IL-18(UniProt标识符Q14116)。其它细胞因子包括(但不限于)：白血病抑制因子(LIF；UniProt标识符P15018)、抑癌蛋白M(OSM；UniProt标识符P13725)、睫状神经营养因子(CNTF(UniProt标识符P26441)，及IL-8(UniProt标识符P10145)。除非另有说明，否则所有Swissprot和UniProt条目均于2014年7月24日存取。
除非另有说明，否则提及细胞因子或者其它蛋白质是指包括蛋白质的所有同种型。例如，IFN-α包括其所有亚型及同种型，例如但不限于IFN-α17，IFN-α4，IFN-α7，IFN-α8和IFN-α110。IFN-α的一些代表性的UniProt标识符是P01571、P05014、P01567、P32881和P01566。本领域技术人员会意识到，即使在人细胞的情况中，上述细胞因子也不必是人细胞因子，因为许多非人(例如动物)细胞因子对人细胞具有活性。相似地，与天然形式具有相似活性的经修饰的细胞因子的使用属于本发明所述方法和组合物的范围。
在某些实施方案中，存在于所述培养基中的细胞因子或者在其它实施方案中存在的细胞因子的至少一种(如果存在多于一种细胞因子的话)，是影响先天免疫应答的炎性细胞因子。在进一步的实施方案中，所述细胞因子是TNF-α、IL-1α、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β或者IFN-γ之一，或者在其它实施方案中是其中多于一种细胞因子。
在其它实施方案中，所述细胞因子或者在其它实施方案中所述细胞因子的至少一种(如果存在多于一种细胞因子的话)是影响适应性免疫应答的炎性细胞因子。在进一步的实施方案中，所述细胞因子是IL-2、IL-4、IL-5、TGF-β、IL-10或者IFN-γ之一，或者在其它实施方案中是其中多于一种细胞因子。
在其它实施方案中，所述细胞因子或者在其它实施方案中所述细胞因子的至少一种(如果存在多于一种的话)是Th1细胞因子。在进一步的实施方案中，所述细胞因子是IFN-γ、IL-22、TNF-α、IL-1α或者IL-1β之一，或者在其它实施方案中是其中多于一种细胞因子。
在其它实施方案中，所述细胞因子或者在其它实施方案中所述细胞因子的至少一种(如果存在多于一种的话)是Th17细胞因子。在进一步的实施方案中，所述细胞因子是IL17、IL-23、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、TNF-α或者粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；UniProt标识符P04141)之一，或者在其它实施方案中是其中多于一种细胞因子。
在其它实施方案中，所述细胞因子或者在其它实施方案中所述细胞因子的至少一种(如果存在多于一种的话)选自Th1细胞因子和Th17细胞因子。
在其它实施方案中，所述细胞因子或者在其它实施方案中所述细胞因子的至少一种(如果存在多于一种的话)是Th2细胞因子。在进一步的实施方案中，所述细胞因子是IL-13、IL-5、IL-4、IL-33、IL-1RL1、TNF-α和TNF-β之一，或者在其它实施方案中是其中多于一种细胞因子。在其它实施方案中，细胞因子是IL-13、IL-5、IL-33、IL-1RL1、TNF-α或者TNF-β之一，或者在其它实施方案中是其中多于一种细胞因子。
在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-11(可能是IL-9、IL-2，我认为IL-21)、白血病抑制因子(LIF)、抑癌蛋白M(OSM)、睫状神经营养因子(CNTF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-8之一，或者在其它实施方案中是其中多于一种细胞因子。在进一步的实施方案中，所述细胞因子是IL-11、LIF、OSM、CNTF、GM-CSF或者IL-8中的一或者多种。
在其它实施方案中，所述细胞因子是TNF-α、IL-1β或者TL1A之一，或者在其它实施方案中是其中多于一种细胞因子。
在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-12、IL-18或者TNF-α之一，或者在其它实施方案中是其中多于一种细胞因子。
在更特别的实施方案中，前述细胞因子在灌注培养基中存在的量是0.1-10ng/ml、0.15-10ng/ml、0.2-10ng/ml、0.3-10ng/ml、0.4-10ng/ml、0.5-10ng/ml、0.7-10ng/ml、1-10ng/ml、1.5-10ng/ml、2-10ng/ml、3-10ng/ml、4-10ng/ml、5-10ng/ml、0.1-5ng/ml、0.2-5ng/ml、0.3-5ng/ml、0.4-5ng/ml、0.5-5ng/ml、0.7-5ng/ml、1-5ng/ml、2-5ng/ml、0.1-3ng/ml、0.2-3ng/ml、0.3-3ng/ml、0.4-3ng/ml、0.5-3ng/ml、0.6-3ng/ml、0.8-3ng/ml、1-3ng/ml、1.5-3ng/ml、0.1-2ng/ml、0.2-2ng/ml、0.3-2ng/ml、0.4-2ng/ml、0.5-2ng/ml、0.6-2ng/ml、0.8-2ng/ml、1-2ng/ml、0.5-1.5ng/ml、0.6-1.5ng/ml、0.6-1.4ng/ml、0.7-1.3ng/ml、0.8-1.2ng/ml、0.1-0.8ng/ml、0.1-0.6ng/ml、0.1-0.5ng/ml、0.1-0.4ng/ml、0.2-1ng/ml、0.2-0.8ng/ml、0.2-0.6ng/ml、0.2-0.5ng/ml、0.2-0.4ng/ml、1-100ng/ml、2-100ng/ml、3-100ng/ml、4-100ng/ml、5-100ng/ml、7-100ng/ml、10-100ng/ml、15-100ng/ml、20-100ng/ml、30-100ng/ml、40-100ng/ml、50-100ng/ml、1-50ng/ml、2-50ng/ml、3-50ng/ml、4-50ng/ml、5-50ng/ml、7-50ng/ml、10-50ng/ml、20-50ng/ml、1-30ng/ml、2-30ng/ml、3-30ng/ml、4-30ng/ml、5-30ng/ml、6-30ng/ml、8-30ng/ml、10-30ng/ml、15-30ng/ml、1-20ng/ml、2-20ng/ml、3-20ng/ml、4-20ng/ml、5-20ng/ml、6-20ng/ml、8-20ng/ml、10-20ng/ml、5-15ng/ml、6-15ng/ml、6-14ng/ml、7-13ng/ml、8-12ng/ml、9-11ng/ml、9.5-10.5ng/ml、1-10ng/ml、1-8ng/ml、1-6ng/ml、1-5ng/ml、1-4ng/ml、2-10ng/ml、2-8ng/ml、2-6ng/ml、2-5ng/ml、2-4ng/ml、10-1000ng/ml、20-1000ng/ml、30-1000ng/ml、40-1000ng/ml、50-1000ng/ml、70-1000ng/ml、100-1000ng/ml、150-1000ng/ml、200-1000ng/ml、300-1000ng/ml、400-1000ng/ml、500-1000ng/ml、10-500ng/ml、20-500ng/ml、30-500ng/ml、40-500ng/ml、50-500ng/ml、70-500ng/ml、100-500ng/ml、200-500ng/ml、10-300ng/ml、20-300ng/ml、30-300ng/ml、40-300ng/ml、50-300ng/ml、60-300ng/ml、80-300ng/ml、100-300ng/ml、150-300ng/ml、10-200ng/ml、20-200ng/ml、30-200ng/ml、40-200ng/ml、50-200ng/ml、60-200ng/ml、80-200ng/ml、100-200ng/ml、50-150ng/ml、60-15ng/ml、60-14ng/ml、70-130ng/ml、80-120ng/ml、10-100ng/ml、10-80ng/ml、10-60ng/ml、10-50ng/ml、10-40ng/ml、20-100ng/ml、20-80ng/ml、20-60ng/ml、20-50ng/ml或者20-40ng/ml。如本文所提供，例如将细胞用含有10ng/ml的IFN-γ和/或TNF-α的培养基灌注过夜。在其它实施方案中，当存在多于一种细胞因子时，每种细胞因子的存在量各自独立地选自上述量，可以自由组合。在各种其它实施方案中，每种促炎性细胞因子的量均在上述范围之一之内。
在某些实施方案中，一或者多种细胞因子是TNF-alpha(在本文中也称为TNF-a)。在更特别的实施方案中，TNF-a可以是存在的唯一细胞因子，或者在其它实施方案中其可以与1、2、3、4、5、6、1-2、1-3、1-4、1-5或者1-6或者多于6种加入的炎性细胞因子一起存在，在某些实施方案中所述加入的炎性细胞因子可以是上述细胞因子之一。在更特别的实施方案中，TNF-α在灌注培养基中的存在量是1-100ng/ml、2-100ng/ml、3-100ng/ml、4-100ng/ml、5-100ng/ml、7-100ng/ml、10-100ng/ml、15-100ng/ml、20-100ng/ml、30-100ng/ml、40-100ng/ml、50-100ng/ml、1-50ng/ml、2-50ng/ml、3-50ng/ml、4-50ng/ml、5-50ng/ml、7-50ng/ml、10-50ng/ml、20-50ng/ml、1-30ng/ml、2-30ng/ml、3-30ng/ml、4-30ng/ml、5-30ng/ml、6-30ng/ml、8-30ng/ml、10-30ng/ml、15-30ng/ml、1-20ng/ml、2-20ng/ml、3-20ng/ml、4-20ng/ml、5-20ng/ml、6-20ng/ml、8-20ng/ml、10-20ng/ml、5-15ng/ml、6-15ng/ml、6-14ng/ml、7-13ng/ml、8-12ng/ml、9-11ng/ml、9.5-10.5ng/ml、1-10ng/ml、1-8ng/ml、1-6ng/ml、1-5ng/ml、1-4ng/ml、2-10ng/ml、2-8ng/ml、2-6ng/ml、2-5ng/ml或者2-4ng/ml。如本文所提供，例如将细胞在含有10ng/ml的TNF-a的培养基中灌注过夜。
在一些实施方案中，TNF-alpha与IFN-gamma(本文也称作IFN-g)一起存在。这两种细胞因子可以是仅有的2种加入的细胞因子，或者在其它实施方案中存在其它促炎性细胞因子。在其它实施方案中，IFN-γ和TNF-α在灌注培养基中的存在量各自独立地选自上述量或者范围之一。每个组合可以被认为是单独的实施例方案。在其它实施方案中，IFN-g和TNF-a在灌注培养基中的存在量均在1-100ng/ml、2-100ng/ml、3-100ng/ml、4-100ng/ml、5-100ng/ml、7-100ng/ml、10-100ng/ml、15-100ng/ml、20-100ng/ml、30-100ng/ml、40-100ng/ml、50-100ng/ml、1-50ng/ml、2-50ng/ml、3-50ng/ml、4-50ng/ml、5-50ng/ml、7-50ng/ml、10-50ng/ml、20-50ng/ml、1-30ng/ml、2-30ng/ml、3-30ng/ml、4-30ng/ml、5-30ng/ml、6-30ng/ml、8-30ng/ml、10-30ng/ml、15-30ng/ml、1-20ng/ml、2-20ng/ml、3-20ng/ml、4-20ng/ml、5-20ng/ml、6-20ng/ml、8-20ng/ml、10-20ng/ml、5-15ng/ml、6-15ng/ml、6-14ng/ml、7-13ng/ml、8-12ng/ml、9-11ng/ml、9.5-10.5ng/ml、1-10ng/ml、1-8ng/ml、1-6ng/ml、1-5ng/ml、1-4ng/ml、2-10ng/ml、2-8ng/ml、2-6ng/ml、2-5ng/ml或者2-4ng/ml范围内。如本文所提供，将细胞在含有10ng/ml的IFN-g和/或TNF-a的培养基中灌注过夜。
在其它实施方案中，灌注培养基中IFN-g和TNF-a的浓度均在1-15ng/ml、1-12ng/ml、1-10ng/ml、1-8ng/ml、1-6ng/ml、1-5ng/ml、2-15ng/ml、2-12ng/ml、2-10ng/ml、3-15ng/ml、3-12ng/ml、3-10ng/ml、5-15ng/ml、5-12ng/ml或者5-10ng/ml之间。在其它实施方案中，灌注培养基中IFN-g和TNF-a的浓度比在1:5-5:1、1:4-4:1、1:3-3:1、1:2-2:1或者1:1.5-1.5:1之间。在其它实施方案中，灌注培养基中IFN-g和TNF-a的浓度均在1-5ng/ml之间，这些浓度比在1:2-2:1之间；灌注培养基中IFN-g和TNF-a浓度均在5-10ng/ml之间，这些浓度比在1:2-2:1之间；灌注培养基中IFN-g和TNF-a浓度均在1-5ng/ml之间，这些浓度比在1:1.1-1.5:1之间；或者灌注培养基中IFN-g和TNF-a浓度均在5-10ng/ml之间，这些浓度比在1:1.5-1.5:1之间。在更特别的实施方案中，将ASC用上述浓度组合之一的IFN-g和TNF-a在生物反应器或者在其它实施方案中在另一类型组织培养装置中如2D培养装置中灌注20-40小时、20-36小时、20-32小时、22-30小时、22-28小时、22-26小时或者23-25小时。
本文提及灌注培养基中的浓度是指在加至细胞之前培养基中的浓度-在一个实施方案中是生物反应器的外部培养基容器。在一些实施方案中，在温育结束时(例如在生物反应器中)观察到的所述培养装置中细胞因子的浓度可以与加至细胞之前培养基中的浓度不同。
在其它实施方案中，将ASC用足够浓度的IFN-g灌注以实现在温育结束时温育培养基中浓度(最终实际浓度)在0.5-5ng/ml、0.5-4ng/ml、0.5-3ng/ml、0.5-1ng/ml、0.7-5ng/ml、0.7-4ng/ml、0.7-3ng/ml、0.7-2ng/ml、1-5ng/ml、1-4ng/ml、1-3ng/ml、1-2ng/ml或者2-3ng/ml之间。在其它实施方案中，将ASC用足够浓度的TNF-α灌注以实现最终实际浓度在0.5-5ng/ml、0.5-4ng/ml、0.5-3ng/ml、0.5-1ng/ml、0.7-5ng/ml、0.7-4ng/ml、0.7-3ng/ml、0.7-2ng/ml、1-5ng/ml、1-4ng/ml、1-3ng/ml、1-2ng/ml或者2-3ng/ml之间。在其它实施方案中，将ASC用足够浓度的IFN-g和TNF-a灌注以实现最终实际浓度在0.5-5ng/ml、0.5-4ng/ml、0.5-3ng/ml、0.5-1ng/ml、0.7-5ng/ml、0.7-4ng/ml、0.7-3ng/ml、0.7-2ng/ml、1-5ng/ml、1-4ng/ml、1-3ng/ml、1-2ng/ml或者2-3ng/ml之间。在其它实施方案中，灌注培养基中IFN-g与TNF-a的最终实际浓度比在1:5-5:1、1:4-4:1、1:3-3:1、1:2-2:1或者1:1.5-1.5:1之间。在其它实施方案中，灌注培养基中IFN-g与TNF-a的浓度足以实现最终实际浓度均在1-2ng/ml之间，最终实际浓度比在1:2-2:1之间；IFN-g与TNF-a的最终实际浓度均在2-3ng/ml之间，浓度比在1:2-2:1之间；IFN-g与TNF-a的最终实际浓度均在1-2ng/ml之间，浓度比在1:1.1-1.5:1之间；或者IFN-g与TNF-a的最终实际浓度均在2-3ng/ml之间，浓度比在1:1.5-1.5:1之间。在更特别的实施方案中，将ASC在上述条件之一下在生物反应器中或者在其它实施方案中在另一类型组织培养装置如2D培养装置中温育20-40小时、20-36小时、20-32小时、22-30小时、22-28小时、22-26小时或者23-25小时。
如上所述，在一些实施方案中，TNF-a与前述细胞因子之一或者其它实施方案中与2、3、4、5或者多于5种细胞因子一起存在。在其它实施方案中，TNF-a及一种或者在其它实施方案中多于一种其它细胞因子在灌注培养基中的存在量各自独立地选自上述量或者范围之一。每个组合可以被认为是单独的实施方案。在其它实施方案中，TNF-a与其它细胞因子的存在量均在1-100ng/ml、2-100ng/ml、3-100ng/ml、4-100ng/ml、5-100ng/ml、7-100ng/ml、10-100ng/ml、15-100ng/ml、20-100ng/ml、30-100ng/ml、40-100ng/ml、50-100ng/ml、1-50ng/ml、2-50ng/ml、3-50ng/ml、4-50ng/ml、5-50ng/ml、7-50ng/ml、10-50ng/ml、20-50ng/ml、1-30ng/ml、2-30ng/ml、3-30ng/ml、4-30ng/ml、5-30ng/ml、6-30ng/ml、8-30ng/ml、10-30ng/ml、15-30ng/ml、1-20ng/ml、2-20ng/ml、3-20ng/ml、4-20ng/ml、5-20ng/ml、6-20ng/ml、8-20ng/ml、10-20ng/ml、5-15ng/ml、6-15ng/ml、6-14ng/ml、7-13ng/ml、8-12ng/ml、9-11ng/ml、9.5-10.5ng/ml、1-10ng/ml、1-8ng/ml、1-6ng/ml、1-5ng/ml、1-4ng/ml、2-10ng/ml、2-8ng/ml、2-6ng/ml、2-5ng/ml或者2-4ng/ml范围。如本文所提供，例如将细胞用含有10ng/ml的IFN-g和/或TNF-a的培养基灌注过夜。
在某些实施方案中，细胞因子的一或者多种是IFN-g。在更特别的实施方案中，IFN-g可以是存在的唯一细胞因子，或者在其它实施方案中可以与1、2、3、4、5、6、1-2、1-3、1-4、1-5或者1-6或者多于6种加入的细胞因子一起存在。在更特别的实施方案中，灌注培养基中IFN-g的存在量是1-100ng/ml、2-100ng/ml、3-100ng/ml、4-100ng/ml、5-100ng/ml、7-100ng/ml、10-100ng/ml、15-100ng/ml、20-100ng/ml、30-100ng/ml、40-100ng/ml、50-100ng/ml、1-50ng/ml、2-50ng/ml、3-50ng/ml、4-50ng/ml、5-50ng/ml、7-50ng/ml、10-50ng/ml、20-50ng/ml、1-30ng/ml、2-30ng/ml、3-30ng/ml、4-30ng/ml、5-30ng/ml、6-30ng/ml、8-30ng/ml、10-30ng/ml、15-30ng/ml、1-20ng/ml、2-20ng/ml、3-20ng/ml、4-20ng/ml、5-20ng/ml、6-20ng/ml、8-20ng/ml、10-20ng/ml、5-15ng/ml、6-15ng/ml、6-14ng/ml、7-13ng/ml、8-12ng/ml、9-11ng/ml、9.5-10.5ng/ml、1-10ng/ml、1-8ng/ml、1-6ng/ml、1-5ng/ml、1-4ng/ml、2-10ng/ml、2-8ng/ml、2-6ng/ml、2-5ng/ml或者2-4ng/ml。如本文所提供的，例如将细胞用含有10ng/ml的IFN-g的培养基灌注过夜。
如上所述，在一些实施方案中，IFN-g与前述细胞因子之一一起存在。这两种细胞因子可以是仅有的2种加入的细胞因子，或者在其它实施方案中存在另外的促炎性细胞因子。在其它实施方案中，IFN-g和一种细胞因子或者在其它实施方案中与多于一种其它细胞因子的存在量均各自独立地选自上述量或者范围之一。每个组合均可以被认为是单独的实施方案。在其它实施方案中，灌注培养基中IFN-g及其它细胞因子的存在量均在1-100ng/ml、2-100ng/ml、3-100ng/ml、4-100ng/ml、5-100ng/ml、7-100ng/ml、10-100ng/ml、15-100ng/ml、20-100ng/ml、30-100ng/ml、40-100ng/ml、50-100ng/ml、1-50ng/ml、2-50ng/ml、3-50ng/ml、4-50ng/ml、5-50ng/ml、7-50ng/ml、10-50ng/ml、20-50ng/ml、1-30ng/ml、2-30ng/ml、3-30ng/ml、4-30ng/ml、5-30ng/ml、6-30ng/ml、8-30ng/ml、10-30ng/ml、15-30ng/ml、1-20ng/ml、2-20ng/ml、3-20ng/ml、4-20ng/ml、5-20ng/ml、6-20ng/ml、8-20ng/ml、10-20ng/ml、5-15ng/ml、6-15ng/ml、6-14ng/ml、7-13ng/ml、8-12ng/ml、9-11ng/ml、9.5-10.5ng/ml、1-10ng/ml、1-8ng/ml、1-6ng/ml、1-5ng/ml、1-4ng/ml、2-10ng/ml、2-8ng/ml、2-6ng/ml、2-5ng/ml或者2-4ng/ml范围内。如本文所提供的，例如将细胞在含有10ng/ml的IFN-g和/或TNF-a的培养基中灌注过夜。
在某些实施方案中，在细胞已经充分灌注达到靶细胞浓度后，用含有细胞因子的培养基继续灌注，但是调节灌注速率以维持一或者多个其它参数的稳定，例如葡萄糖浓度、pH、溶解氧浓度等。
可以暴露于细胞因子处理的细胞及其来源
在某些实施方案中，暴露于细胞因子处理的细胞是源自胎盘的粘附细胞，在更特别的实施方案中其可以是粘附的基质细胞。除非本文另有说明，术语“胎盘”、“胎盘组织”等是指胎盘的任何部分。在各个实施方案中，源自胎盘的粘附细胞可以来自胎儿，或者在其它实施方案来自胎盘的母体区域，或者在其它实施方案中来自这两个区域；或者细胞可以基本上完全是胎儿细胞或者母体细胞；富含胎儿细胞或者母体细胞；或者主要是胎儿细胞，或者主要是母体细胞。母体来源的更特别的实施方案是底蜕膜和壁蜕膜。胎儿来源的更特别的实施方案是羊膜、绒毛膜和绒毛。在某些实施方案中，将组织样品在生理缓冲液[例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或者Hank's缓冲液]中洗涤。在其它实施方案中，单细胞悬浮液可以通过用消化酶(见下文)处理组织或者/和经物理破坏处理组织而制备，所述物理破坏的非限制性实例是切碎并将组织部分冲洗通过尼龙过滤器或者通过用洗涤介质(Falcon,Becton,Dickinson,San Jose,CA)温和吹打(pipetting)。在一些实施方案中，所述组织处理包括使用DNA酶，其非限制性实例是来自Merck的Benzonase。
在其它实施方案中，随后暴露于细胞因子处理的的细胞的至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或者至少99.9％是源自母体的细胞。在其它实施方案中，至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或者至少99.9％的所述细胞是胎儿细胞。虽然在本文通常示例的是源自母体的细胞，但是也包括使用胎儿细胞如源自足月胎盘的胎儿细胞进行相同或者相似的程序和方法。
在各个实施方案中，胎盘细胞可得自足月或者早产胎盘。在这方面，“足月”胎盘是指胎龄至少为36周的胎盘。在一些实施方案中，在细胞收获之前从胎盘除去残余血液。这可以通过本领域技术人员已知的各种方法完成，例如通过灌注。如本文所用术语“灌注”是指将液体倾倒或者经过器官或者组织的行为。在某些实施方案中，胎盘组织可以来自任何哺乳动物，而在其它实施方案中所述胎盘组织是人胎盘。胎盘组织的便利来源是产后胎盘(例如出生后不到10小时)；然而，技术人员可以考虑多种来源的胎盘组织或者细胞。在其它实施方案中，胎盘在出生后8小时内、6小时内、5小时内、4小时内、3小时内、2小时内或者1小时内使用。在某些实施方案中，在收获细胞之前保持胎盘冷藏(chilled)。在其它实施方案中，使用产前胎盘组织。这种组织可以从例如绒毛膜绒毛取样获得或者通过本领域已知其它方法获得。在某些实施方案中，一旦获得胎盘细胞，使其粘附至粘附材料(例如配置为表面)，从而分离粘附细胞。在一些实施方案中，供体年龄是35岁或者更小，而在其它实施方案中，供体可以是任何育龄妇女。
在一些实施方案中，ASC可以通过使用2D和3D培养条件的组合增殖。在2D和3D培养中增殖粘附基质细胞的条件在下文及随后的实施例部分中进一步描述。
如上所述，在一些实施方案中，ASC的来源是非胎儿来源，例如来自胎盘的母体细胞或者来自小儿或者成人供体的体细胞组织，例如脂肪组织、骨髓、外周血、脐带血、滑液、滑膜和韧带如牙周韧带。根据本发明公开内容，本领域技术人员会意识到可以使用标准技术例如物理的和/或酶促的组织破坏从各种身体组织中提取ASC，在一些实施方案中随后进行基于标志物的细胞分选，然后可以进行本文所述的培养方法。
如上所述，在一些实施方案中，ASC源自脂肪组织。短语“脂肪组织”是指包含脂肪细胞的结缔组织。在各个实施方案中，源于脂肪组织的粘附基质细胞可以通过本领域技术人员已知的多种方法提取，例如并入本文作参考的美国专利No.6,153,432中所述的那些方法。在其它实施方案中，脂肪组织可以来自网膜/内脏、乳腺、性腺或者其它脂肪组织部位。在一些实施方案中，脂肪可以通过抽脂术分离。
在其它实施方案中，ASC可以通过用消化酶(其非限制性实例是胶原酶、胰蛋白酶、分散酶、透明质酸酶或者DNA酶)及乙二胺四乙酸(EDTA)处理组织而衍生自脂肪组织。在一些实施方案中，可以对细胞进行物理破坏，例如使用尼龙或者粗棉布筛网过滤器破坏。在其它实施方案中，将细胞直接在培养基中或者通过FicollTM或者PercollTM或者其它颗粒梯度进行差异离心(参见美国专利No.7,078,230，其并入本文作参考)。
在某些实施方案中，随后暴露于细胞因子处理的ASC是间充质基质细胞(MSC)。在一些实施方案中，这些细胞可以分离自许多成人组织，例如胎盘、骨髓和脂肪组织。在进一步的实施方案中，所述细胞是由国际细胞疗法学会的间充质和组织干细胞委员会(Dominici et al,2006)基于以下3个标准定义的人MSC：1.当在标准培养条件(α最低必需培养基加20％胎牛血清(FBS))下维持时的可塑的粘附。2.表面分子CD105、CD73和CD90的表达，以及CD45、CD34、CD14或者CD11b、CD79α或者CD19和HLA-DR的表达缺失。3.在体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。在一些实施方案中，所述细胞是源自骨髓(BM)的MSC，在更特别的实施方案中是源自人BM的MSC。
二选一或另外，随后暴露于细胞因子处理的ASC是间充质样ASC，其表现出类似于“经典”MSC的标志物模式，但在“经典”MSC分化为骨细胞的条件下不分化为骨细胞。在其它实施方案中，所述细胞表现出类似于MSC的标志物模式，但在MSC分化为脂肪细胞的条件下不分化为脂肪细胞。在其它实施方案中，所述细胞表现出与MSC类似的标志物模式，但在MSC分别分化为骨细胞或者脂肪细胞的条件下不分化为骨细胞或者脂肪细胞。在一个实施方案中，用于在这些测定中进行比较的MSC是从BM收获并在2D培养中培养的MSC。在其它实施方案中，用于比较的MSC从BM收获并在2D培养中培养，然后进行3D培养。
二选一或另外，随后暴露于细胞因子处理的ASC可表达MSC或者间充质样基质细胞特有的一种标志物或者一批标志物(例如表面标志物)。表面标志物例如包括但不限于CD105(UniProtKB登录号No.P17813)、CD29(UniProtKB登录号No.P05556)、CD44(UniProtKB登录号No.P16070)、CD73(UniProtKB登录号No.P21589)和CD90(UniProtKB登录号No.P04216)。预期不存在于基质细胞中的标志物的例子是CD3(UniProtKB登录号No.P09693[γ链]、P04234[δ链]、P07766[ε链]和P20963[ζ链])、CD4(UniProtKB登录号No.P01730)、CD34(UniProtKB登录号No.P28906)、CD45(UniProtKB登录号No.P08575)、CD80(UniProtKB登录号No.P33681)、CD19(UniProtKB登录号No.P15391)、CD5(UniProtKB登录号No.P06127)、CD20(UniProtKB登录号No.P11836)、CD11B(UniProtKB登录号No.P11215)、CD14(UniProtKB登录号No.P08571)、CD79-α(UniProtKB登录号No.B5QTD1)及HLA-DR(UniProtKB登录号No.P04233[γ链]、P01903[α链]及P01911[β链])。这个段落中提及的所有UniProtKB条目均于2014年7月7日存取。本领域技术人员会意识到复合抗原如CD3和HLA-DR的存在可通过识别其任何组成部分的抗体检测，例如但不限于本文所述的那些抗体。
在某些实施方案中，随后暴露于细胞因子处理的ASC的超过90％对于CD29、CD90和CD54呈阳性。在其它实施方案中，超过85％的所述细胞对于CD73和CD105呈阳性；超过65％的所述细胞对CD49呈阳性。在其它实施方案中，少于1％的所述细胞对CD14、CD19、CD31、CD34、CD39、CD45、HLA-DR和GlyA(血型糖蛋白A；CD235A；Uniprot登录号P02724)呈阳性；少于3％的细胞对CD200呈阳性；少于6％的细胞对GlyA呈阳性；少于20％的细胞对SSEA4呈阳性。在更特别的实施方案中，超过90％的所述细胞对CD29、CD90和CD54呈阳性；超过85％的细胞对CD73和CD105呈阳性；超过65％的细胞对CD49呈阳性。在其它实施方案中，超过90％的所述细胞对CD29、CD90和CD54呈阳性；超过85％的细胞对CD73和CD105呈阳性；超过65％的细胞对CD49呈阳性；少于1％的细胞对CD14、CD19、CD31、CD34、CD39、CD45、HLA-DR、GlyA呈阳性；少于3％的细胞对CD200呈阳性；少于6％的细胞对GlyA呈阳性；少于20％的细胞对SSEA4呈阳性。标志物的“阳性”表达是指高于同种型对照直方图的主峰范围的值；这个术语在本文中与鉴定细胞为“表达”/“表达”标志物是同义。标志物的“阴性”表达是指在同种型对照直方图的主峰范围之下的值；这个术语在本文中与鉴定细胞为“不表达”/“不表达”标志物是同义的。
在其它实施方案中，CD73、CD29和CD105中的每一个由超过90％的随后暴露于细胞因子处理的ASC表达。在其它实施方案中，CD44、CD73、CD29和CD105中的每一个由超过90％的所述细胞表达。在其它实施方案中，CD34、CD45、CD19、CD14和HLA-DR中的每一个由少于3％的所述细胞表达。在其它实施方案中，CD73、CD29和CD105中的每一个由超过90％的所述细胞表达，及CD34、CD45、CD19、CD14和HLA-DR中的每一个由少于3％的所述细胞表达。在其它实施方案中，CD44、CD73、CD29和CD105中的每一个由超过90％的细胞表达，及CD34、CD45、CD19、CD14和HLA-DR中的每一个由少于3％的所述细胞表达。
在其它实施方案中，CD73、CD29和CD105中的每一个由超过90％的随后暴露于细胞因子处理的ASC表达；所述细胞在用玻连蛋白和胶原蛋白包被的平板中与含有0.1mcM地塞米松、0.2mM抗坏血酸和10mM甘油-2-磷酸的溶液温育17天后不分化为骨细胞。在其它实施方案中，CD34、CD45、CD19、CD14和HLA-DR中的每一个由少于3％的所述细胞表达；所述细胞在上述条件下温育后不分化为骨细胞。在其它实施方案中，CD73、CD29和CD105中的每一个由超过90％的细胞表达，及CD34、CD45、CD19、CD14和HLA-DR中的每一个由少于3％的细胞表达；所述细胞在上述条件下温育后不分化为骨细胞。在其它实施方案中，所述条件是在用玻连蛋白和胶原蛋白包被的平板中与含有10mcM地塞米松、0.2mM抗坏血酸、10mM甘油-2-磷酸和10nM维生素D的溶液一起温育26天。如本领域技术人员所理解的，上述溶液通常含有细胞培养基，例如DMEM+10％血清等。
在其它实施方案中，CD73、CD29和CD105中的每一个由超过90％的随后暴露于细胞因子处理的ASC表达；所述细胞在如下条件下温育后不分化为脂肪细胞，即在第1、3、5、9、11、13、17、19和21天在脂肪生成诱导培养基(即含有1mcM地塞米松、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、10mcg/ml胰岛素和100mcM吲哚美辛的溶液)中温育，及在第7天和第15天更换为脂肪生成维持培养基(即含有10mcg/ml胰岛素的溶液)温育，共25天。在其它实施方案中，CD34、CD45、CD19、CD14和HLA-DR中的每一个由少于3％的细胞表达；所述细胞在上述条件下温育后不分化为脂肪细胞。在其它实施方案中，CD73、CD29和CD105中的每一个由超过90％的细胞表达，CD34、CD45、CD19，CD14和HLA-DR中的每一个由少于于3％的细胞表达；所述细胞在上述条件下温育后不分化为脂肪细胞。在其它实施方案中，使用含有1mcM地塞米松、0.5mM IBMX、10mcg/ml胰岛素和200mcM吲哚美辛的改性的脂肪生成诱导培养基，温育共26天。如本领域技术人员所理解的，上述溶液通常含有细胞培养基，例如DMEM+10％血清等。
二选一或另外，随后暴露于细胞因子处理的ASC表达标志物D7-fib。针对D7-fib的抗体可商购自德国Acris Antibodies，Herford。
在更特别的实施方案中超过50％的、在其它实施方案中超过55％、在其它实施方案中超过60％、在其它实施方案中超过65％、在其它实施方案中超过70％、在其它实施方案中超过75％、在其它实施方案中超过80％、在其它实施方案中超过85％、在其它实施方案中超过90％、在其它实施方案中超过95％、在其它实施方案中超过96％、在其它实施方案中超过97％、在其它实施方案中超过98％、在其它实施方案中超过99％的随后暴露于细胞因子处理的ASC表达选自CD73、CD90、CD29和CD105的标志物，或者在其它实施方案中表达这些标志物的2或者更多种，或者在其它实施方案中表达这些标志物的3或者更多种，或者在其它实施方案中表达所有这4种标志物。
根据一些实施方案，随后暴露于细胞因子处理的ASC表达CD200，或者在其它实施方案中不表达。在其它实施方案中，少于30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％或者2％、1％或者0.5％的粘附细胞表达CD200。在其它实施方案中，超过70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者99.5％的粘附细胞表达CD200。
根据一些实施方案，随后暴露于细胞因子处理的ASC的超过50％不表达选自CD3、CD4、CD45、CD80、HLA-DR、CD11b、CD14、CD19、CD34和CD79-α的标志物，或者在其它实施方案中不表达这些标志物的2或者更多种，或者在其它实施方案中不表达这些标志物的3或者更多种，或者在其它实施方案中不表达这些标志物的4或者更多种，或者在其它实施方案中不表达这些标志物的5或者更多种，或者在其它实施方案中不表达这些标志物的6或者更多种，或者在其它实施方案中不表达这些标志物7或者更多种，或者在其它实施方案中不表达这些标志物的8或者更多种，或者在其它实施方案中不表达这些标志物的9或者更多种，或者在其它实施方案中不表达这些标志物的全部10种。在其它实施方案中超过60％、在其它实施方案中超过65％、在其它实施方案中超过70％、在其它实施方案中超过75％、在其它实施方案中超过80％、在其它实施方案中超过85％、在其它实施方案中超过90％、在其它实施方案中超过95％、在其它实施方案中超过96％、在其它实施方案中超过97％、在其它实施方案中超过98％、在其它实施方案中超过99％的随后暴露于细胞因子处理的ASC具有上述特性之一。
在某些实施方案中，随后暴露于细胞因子处理的ASC表达或者分泌(对于每种蛋白质适当地)c-kit配体/干细胞因子(SCF；Uniprot登录号No.P21583)，受体类型酪氨酸蛋白质激酶FLT3(Flt-3；Uniprot登录号No.P36888)，和/或醛脱氢酶X(ALDH X；Uniprot登录号No.P30837)，其每个代表一个单独的实施方案。在更特别的实施方案中超过50％、在其它实施方案中超过55％、在其它实施方案中超过60％、在其它实施方案中超过65％、在其它实施方案中超过70％、在其它实施方案中超过75％、在其它实施方案中超过80％、在其它实施方案中超过85％、在其它实施方案中超过90％、在其它实施方案中超过95％、在其它实施方案中超过96％、在其它实施方案中超过97％、在其它实施方案中超过98％、在其它实施方案中超过99％的细胞表达或者分泌至少1种、在其它实施方案中至少2种、在其它实施方案中至少3种及在其它实施方案中表达所有4种前述蛋白质。在其它实施方案中，细胞以3D培养中温育，其与仅在2D培养中温育相同细胞类型(例如胎盘、脂肪组织或者骨髓)的ASC表达或者分泌相比，共同表达至少高2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或者甚至12倍的这些蛋白质的至少之一。
另外或二选一，随后暴露于细胞因子处理的ASC分泌或者表达IL-6(UniProt标识符P05231)、真核翻译延伸因子2(EEEF2)、网钙蛋白3、EF-hand钙结合结构域(RCN2)和/或基底平滑肌钙调蛋白1(calponin 1basic smooth muscle)(CNN1)。在更特别的实施方案中超过50％、在其它实施方案中超过55％、在其它实施方案中超过60％,、在其它实施方案中超过65％、在其它实施方案中超过70％、在其它实施方案中超过75％、在其它实施方案中超过80％、在其它实施方案中超过85％、在其它实施方案中超过90％、在其它实施方案中超过95％、在其它实施方案中超过96％、在其它实施方案中超过97％、在其它实施方案中超过98％、在其它实施方案中超过99％的细胞表达或者分泌至少1种、在其它实施方案中至少2种、在其它实施方案中至少3种、在其它实施方案中至少4种、在其它实施方案中全部5种上述蛋白质。如果通过标准方法检测到蛋白质或者因子的存在，则称细胞表达或者分泌蛋白质或者因子，一个示例是使用荧光激活细胞分选(FACS)相对于同种型对照的可检测信号。
另外或二选一，随后暴露于细胞因子处理的ASC表达较低或者不可检测量的不均一性核糖核蛋白H1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1)(Hnrph1)、CD44抗原同种型2前体、3磷酸腺苷5磷酸硫酸合酶2同种型a(Papss2)和/或核糖体蛋白L7a(rpL7a)。在更特别的实施方案中超过50％、在其它实施方案中超过55％、在其它实施方案中超过60％、在其它实施方案中超过65％、在其它实施方案中超过70％、在其它实施方案中超过75％、在其它实施方案中超过80％、在其它实施方案中超过85％、在其它实施方案中超过90％、在其它实施方案中超过95％、在其它实施方案中超过96％、在其它实施方案中超过97％、在其它实施方案中超过98％的细胞不表达或者分泌至少1种、在其它实施方案中至少2种、在其它实施方案中至少3种、在其它实施方案中全部4种上述蛋白质。
在其它实施方案中，随后暴露于细胞因子处理的细胞是胎盘细胞群，其是胎儿和母体细胞的混合物。在更特别的实施方案中，所述混合物含有20-80％的胎儿细胞、30-80％的胎儿细胞、40-80％的胎儿细胞、50-80％的胎儿细胞、60-80％的胎儿细胞、20-90％的胎儿细胞、30-90％的胎儿细胞、40-90％的胎儿细胞、50-90％的胎儿细胞、60-90％的胎儿细胞、20-80％的母体细胞、30-80％的母体细胞、40-80％的母体细胞、50％-80％母体细胞、60-80％母体细胞、20-90％母体细胞、30-90％母体细胞、40-90％母体细胞、50-90％母体细胞或者60-90％母体细胞。
在其它实施方案中，随后暴露于细胞因子处理的细胞可以是同种异体的，或者在其它实施方案中所述细胞可以是自体的。在其它实施方案中，细胞可以是新鲜的，或者在其它实施方案中是冷冻的(例如冷冻保存)。
其它方法特性
在某些实施方案中，所述方法进一步包括通过从3D培养装置中移出ASC而收获ASC的后续步骤(在所述用促炎性细胞因子进行3D温育之后)。在更特别的实施方案中，可以从3D基质中移出细胞，同时所述基质保留在生物反应器内。
二选一或另外，在某些实施方案中，在3D培养步骤之前，所述ASC已在2D粘附细胞培养装置中温育。在一些实施方案中，然后将细胞(在一些实施方案中已经从胎盘、脂肪组织等中提取)进行在2D粘附细胞培养装置中的预先温育步骤，然后进行所述3D培养步骤。
在某些实施方案中，前述步骤(a)的至少一部分以灌注模式进行。在其它实施方案中，步骤(a)的大部分(大部分3D培养时间不存在炎性细胞因子)以灌注模式进行。在其它实施方案中，步骤(a)的所有步骤均以灌注模式进行。在其它实施方案中，步骤(a)的至少部分以分批模式进行。
二选一或另外，步骤(b)的至少一部分以分批模式进行。在其它实施方案中，步骤(b)的大部分(大部分3D培养时间存在炎性细胞因子)以分批模式进行。在其它实施方案中，步骤(b)的所有步骤均以分批模式进行。在其它实施方案中，步骤(b)的至少一部分以灌注模式进行。在其它实施方案中，至少步骤(a)的大部分以灌注模式进行，及至少步骤(b)的大部分以分批模式进行。
在各个实施方案中，“粘附材料”是指合成的材料，或者在其它实施方案中是天然存在的材料，或者在其它实施方案中是这两种材料的组合。在某些实施方案中，所述材料是非细胞毒性的(或者在其它实施方案中是生物学相容的)。二选一或另外，所述该材料是纤维状的，在更特别的实施方案中其可以是织造纤维基质、非织造纤维基质或者任一种。在其它实施方案中，所述材料表现出允许细胞粘附的化学结构，例如带电的表面暴露的基团。可根据这个方面可以使用的粘附材料的非限制性实例包括聚酯、聚丙烯、聚烯烃(polyalkylene)、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒、聚-L-乳酸和惰性金属纤维。其它实施方案包括MatrigelTM、细胞外基质组分(例如纤连蛋白、软骨素、层粘连蛋白)和胶原。在更特别的实施方案中，所述材料可选自聚酯和聚丙烯。合成的粘附材料的非限制性实例包括聚酯、聚丙烯、聚烯烃、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纤维素和聚-L-乳酸、玻璃纤维、陶瓷颗粒和惰性金属纤维，或者在更特别的实施方案包括聚酯、聚丙烯、聚烯烃、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纤维素和聚-L-乳酸。
在其它实施方案中，上述步骤(a)(在不存在炎性细胞因子的条件下温育)进行至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或者至少7天。在其它实施方案中，步骤(a)进行3-4天、3-5天、3-6天、3-7天、4-5天、4-6天、4-7天、5-6天、5-7天或者6-7天。在其它实施方案中，步骤(a)进行至少1次群体倍增、至少2次倍增、至少3次倍增、至少4次倍增、1-2次倍增、1-3次倍增、1-4次倍增、2-3次倍增、2-4次倍增或者3-4次倍增。在一些实施方案中，步骤(a)是3D温育。
二选一或另外，上述步骤(b)(在炎性细胞因子存在下的3D温育)进行6-48小时(hr)、8-48小时、10-48小时、12-48小时、14-48小时、16-48小时、20-48小时、6-36小时、8-36小时、10-36小时、12-36小时、14-36小时、16-36小时、20-36小时、24-36小时、28-36小时、6-24小时、8-24小时、10-24小时、12-24小时、14-24小时、16-24小时、20-24小时、8-18小时、10-18小时、12-18小时或者14-18小时。在某些实施方案中，步骤(b)进行16-28小时、16-26小时、18-28小时、18-26小时、20-26小时、22-26小时、23-25小时、大约24小时或者24小时。如本文所提供，细胞因子温育显著小于40小时例如18-28小时、20-28小时、18-26小时或者20-26小时可导致细胞活力增强。
二选一或另外，步骤(b)在生物反应器中进行，在更特别的实施方案中所述生物反应器是填充床生物反应器。在一些实施方案中，生物反应器包括用于持有培养基的容器和控制装置，用于控制pH、温度和氧水平以及任选其它参数。在更特别的实施方案中，生物反应器还含有3D基质。二选一或另外，所述生物反应器包含用于新鲜培养基和气体的流入和流出的端口。
在某些实施方案中，生物反应器连接至含有所需浓度细胞因子的外部培养基容器(例如用于灌注生物反应器)。二选一或另外，在细胞因子温育开始时，生物反应器中的培养基快速加入(spike)一或者多种细胞因子，以便快速将生物反应器中的细胞因子浓度达到所需浓度。如本文所提供的，生物反应器培养基的快速加入使得在细胞因子存在下的温育时间减少，导致细胞活力增强。在其它实施方案中，步骤(b)包括以下子步骤：(i)向生物反应器中的培养基中加入一次(a bolus of)促炎性细胞因子，从而产生含有炎性细胞因子的生长培养基；及(ii)可操作地将生物反应器中的生长培养基与包含额外量的含有炎性细胞因子的生长培养基外部容器连接。
除非另有说明，术语填充床生物反应器是指这样的生物反应器，其中在生长培养基存在下细胞生长基质通常不从培养容器的底部浮起(lifted)。例如，基质可以具有足够的密度以防止被浮起和/或可以通过机械压力填充以使其不被浮起。所述基质可以是单体或者多体。通常，在生物反应器的标准灌注速率期间，基质基本上保持在合适位置。在某些实施方案中，这个定义不排除基质可以以异常快的灌注速率提升，例如大于200rpm。
在其它实施方案中，在一些实施方案中，其可以与先前的温育时长和快速加入的实施方案组合，当培养物处于指数生长期时开始步骤(b)。在更特别的实施方案中，当培养物处于指数生长期的后半部分时开始步骤(b)。在一些实施方案中，培养物在步骤(b)结束时仍处于指数生长期。在其它实施方案中，培养物在步骤(b)结束时处于后指数生长期。在一些实施方案中，细胞处于生物反应器中，在更特别的实施方案中所述生物反应器是填充床生物反应器。如本文所提供的，指数期ASC的细胞因子处理产生具有蛋白质表达谱的细胞。
除非另有说明，否则术语“指数期”和“指数生长期”是指细胞分裂速率处于或者接近特定系统的最大值的时间段，其中表达细胞分裂的速率以相对群大小的对数表示(ln(N/N0，其中N＝细胞数，N0＝接种时的细胞数)。在更特别的定义中，细胞分裂的速率为最大细胞分裂速率的至少70％。最大细胞分裂速率可以定义为相对群大小的对数与时间的对数图的切线斜率。仅用于示例目的的理论图如图16所示。
本领域技术人员意识到，当将细胞接种到培养系统(例如生物反应器)中时，通常存在延滞期，在此期间细胞分裂相对较慢。延滞期结束可以在数学上定义为前述切线的X轴截距。延滞期之后是指数期。当环境因素变得有限时，细胞分裂速率开始明显减慢。例如，细胞分裂速率可以减慢到小于其最大值的60％。这个阶段有时被称为“后指数期”或者“后指数生长期”。在更特别的定义中，在后指数生长期期间的细胞分裂速率在最大细胞分裂速率的30％-60％之间。最后，培养物达到稳定期，期间细胞数量没有明显的净增加。
在其它实施方案中，步骤(a)进行3-7天，步骤(b)进行12-48小时；步骤(a)进行3-6天，步骤(b)进行12-48小时；步骤(a)进行4-7天，步骤(b)进行12-48小时；步骤(a)进行4-6天，步骤(b)进行12-48小时；步骤(a)进行3-7天，步骤(b)进行12-36小时；步骤(a)进行3-6天，步骤(b)进行12-36小时；步骤(a)进行4-7天，步骤(b)进行12-36小时；步骤(a)进行4-6天，步骤(b)进行12-36小时；步骤(a)进行3-7天，步骤(b)进行16-36小时；步骤(a)进行3-6天，步骤(b)进行16-36小时；步骤(a)进行4-7天，步骤(b)进行16-36小时；步骤(a)进行4-6天，步骤(b)进行16-36小时；步骤(a)进行3-7天，步骤(b)进行16-36小时；步骤(a)进行3-6天，步骤(b)进行16-36小时；步骤(a)进行4-7天，步骤(b)进行16-36小时；或者步骤(a)进行4-6天，步骤(b)进行16-36小时。在其它实施方案中，步骤(a)进行4-7天，步骤(b)进行16-28小时、16-26小时、18-28小时、18-26小时、20-26小时、22-26小时、23-25小时、大约24小时或者24小时。在其它实施方案中，步骤(a)进行4-6天，步骤(b)进行16-28小时、16-26小时、18-28小时、18-26小时、20-26小时、22-26小时、23-25小时、大约24小时或者24小时。
根据其它实施方案，所述3D培养(步骤(a)和步骤(b))进行至少4次倍增、至少5次倍增、至少6次倍增、至少7次倍增、至少8次倍增、至少9次加倍或者至少10次加倍。在某些实施方案中，当培养物达到约70-90％汇合时，通常在3-5天后(例如1-3次倍增)，细胞典型地传代。
在其它实施方案中，3D培养的总长度为至少4天、4-12天、在其它实施方案中为4-11天、在其它实施方案中为4-10天、在其它实施方案中为4-9天、在其它实施方案在5-9天、在其它实施方案中为5-8天、在其它实施方案中为6-8天或者在其它实施方案中为5-7天。
在某些实施方案中，3D培养可以在生物反应器中进行。在一些实施方案中，生物反应器包括用于持有培养基及基质沉积于其中的3D附件(载体)以及用于控制pH、温度和氧水平及任选其它参数的控制装置。在更特别的实施方案中，3D基质在填充床配置中。二选一或另外，生物反应器包含用于新鲜培养基和气体的流入和流出的端口。
生物反应器例如包括但不限于持续搅动的罐式生物反应器、生物反应器系统(New Brunswick Scientific(NBS)及BIOFLO 310生物反应器系统(New BrunswickScientific(NBS)。
如本文所提供的，在某些实施方案中，生物反应器在受控条件(例如pH、温度和氧水平)及在灌注生长培养基条件下能在3D基质上扩增ASC，在一些实施方案中所述灌注是恒定灌注，在其它实施方案中被调节以维持葡萄糖或者其它组分的靶定水平。此外，可以直接监测细胞培养物中葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、谷氨酸盐和铵的浓度。在一些实施方案中，粘附细胞的葡萄糖消耗速率和乳酸形成速率使得能够测量细胞生长速率和确定收获时间。
在一些实施方案中，使用连续搅动罐式生物反应器，其中将培养基连续进料至生物反应器中并不断抽出产物，以便在反应器内保持一定时间恒定的稳定状态。具有纤维床篮的搅动罐式生物反应器可例如得自New Brunswick Scientific Co.,Edison,NJ。在一些实施方案中，可以使用的其它生物反应器是固定床生物反应器，及空气提升生物反应器，其中空气通常被供给至中心导管底部流动同时形成气泡，并在柱的顶部排出废气。其它可能性是具有多活性泡沫的细胞接种灌注生物反应器[如Wendt,D.et al.,Biotechnol Bioeng84:205-214,(2003)所述]及含有管状聚L乳酸(PLLA)有孔支架的径流灌注生物反应器[如Kitagawa et al.,Biotechnology and Bioengineering 93(5):947-954(2006)所述]。可以使用的其它生物反应器在美国专利No.6,277,151、6,197,575、6,139,578、6,132,463、5,902,741和5,629,186中描述，所述专利并入本文作参考。
另一个示例的生物反应器CelliGen 310生物反应器，如图1所示。在所述实施方案中，纤维床篮(16)装有聚酯盘(10)。在一些实施方案中，通过外部端口(1[在其它实施方案中也可以使用这个端口用于细胞收获])为容器填充去离子水或者等渗缓冲液，然后任选地高压灭菌。在其它实施方案中，在灭菌后，将液体用生长培养基替换以使所述盘床饱和，如(9)中所示。在进一步的实施方案中，在接种之前设定温度、pH、溶解氧浓度等。在更进一步的实施方案中，使用缓慢搅动的初始速率来促进细胞附着，然后增强搅动。二选一或另外，通过经由外部端口(2)加入新鲜培养基开始灌注。如果需要，可以从篮子(8)上方从无细胞培养基中收获代谢产物。在一些实施方案中，叶轮的旋转在导流管(18)中产生负压，拉动无细胞流出物从贮存容器(15)通过引流管，然后通过叶轮端口(19)，从而导致培养基在连续的环中中均匀地循环(12)。在进一步的实施方案中，管(6)的调节控制液体水平；在一些实施方案中，这个管的外部开口(4)用于收获。在其它实施方案中，环形喷萨器(不可见)位于叶轮通气室(11)内，通过从的外部端口(3)，其可保持在壳(5)内，和喷洒线(7)加入的气体对流经叶轮的培养基进行充氧。二选一或另外，限制在远端容器中的喷射气体被营养培养基吸收，其流过(wash over)固定的细胞。在其它实施方案中，存在水套(17)，其具有移动水套水进(13)和出(14)的端口。
在某些实施方案中，使用灌注的生物反应器，其中灌注室包含载体。在更特别的实施方案中，载体可以选自大载体、微载体或者任一种。可商购的微载体的非限制性实例包括基于藻酸盐(GEM，Global Cell Solutions)、基于葡聚糖(GE Healthcare)、基于胶原(Percell Biolytica)和基于聚苯乙烯(SoloHill Engineering)的微载体。在某些实施方案中，微载体包装在灌注的生物反应器内。
在一些实施方案中，将灌注的生物反应器中的载体包装例如形成填充床，其浸没在营养培养基中。二选一或另外，所述载体可包含粘附材料。在其它实施方案中，所述载体的表面包含粘附材料，或者载体的表面是粘附性的。在其它实施方案中，所述材料呈现出允许细胞粘附的化学结构，例如带电荷的表面暴露的基团。根据这个方面可以使用的粘附材料的非限制性实例包括聚酯、聚丙烯、聚烯烃、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒、聚-L-乳酸和惰性金属纤维。在更特别的实施方案中，所述材料可选自聚酯和聚丙烯。在各个实施方案中，“粘附材料”是指合成的材料，或者在其它实施方案中是指天然存在的材料，或者在其它实施方案中是这些材料的组合。在某些实施方案中，所述材料是非细胞毒性的(或者在其它实施方案中是生物学相容的)。合成的粘附材料的非限制性实例包括聚酯、聚丙烯、聚烯烃、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纤维素和聚-L-乳酸、玻璃纤维、陶瓷颗粒和惰性金属纤维，或者在更特别的实施方案是聚酯、聚丙烯、聚烯烃、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纤维素和聚-L-乳酸。其它实施方案包括MatrigelTM，细胞外基质组分(例如纤连蛋白，软骨素，层粘连蛋白)和胶原。
二选一或另外，粘附材料是纤维状的，在更特别的实施方案中可以是织造纤维基质、非织造纤维基质或者任一种。在其它实施方案中，所述材料呈现出允许细胞粘附的化学结构，例如带电荷表面基团，例如聚酯、聚丙烯、聚烯烃、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纤维素和聚L-乳酸。在更特别的实施方案中，所述材料可选自聚酯和聚丙烯。
二选一或另外，所述载体包含纤维材料，任选粘附的纤维材料，在更特别的实施方案中可以是织造纤维基质、非织造纤维基质或者任一种。所述纤维载体的非限制性实例是New Brunswick Scientific载体，可商购自德国Eppendorf AG，由聚酯和聚丙烯制成；及BioNOC II载体，可商购自CESCO BioProducts(Atlanta，GA)，由PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)制成。在某些实施方案中，所述纤维基质包含聚酯、聚丙烯、聚烯烃、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或者聚砜。在更特别的实施方案中，所述纤维基质选自聚酯和聚丙烯。
在其它实施方案中，使用填充床旋转瓶生产细胞。在更特别的实施方案中，填充床可包括旋转瓶和磁性搅拌器。在一些实施方案中，旋转瓶可以装配有填充床装置，在更特别的实施方案中，填充床装置可以是纤维基质、非织造纤维基质、包含聚酯的非织造纤维基质、或者包含至少大约50％聚酯的非织造基质。在更特别的实施方案中，所述基质可以类似于CelliGenTM Plug Flow生物反应器，在某些实施方案中其是用Fibra(或者在其它实施方案中用其它载体)包装的。在某些实施方案中，旋转器是分批进料的(或者在其它可选实施方案中通过灌注进料)，装配有一或者多个灭菌过滤器，并置于组织培养器中。在进一步的实施方案中，通过将细胞悬浮在培养基中并将培养基导入所述装置中而将细胞接种到支架上。在更进一步的实施方案中，搅拌速度逐渐增加，例如通过以40RPM开始搅拌4小时，然后逐渐将速度增加至120RPM。在某些实施方案中，可以定期(即每天)检测培养基的葡萄糖水平，调节灌注速度以维持可接受的葡萄糖浓度，在某些实施方案中，所述葡萄糖浓度在400-700mg/L、450-650mg/L、475-625mg/L、500-600mg/L或者在525-575mg/L之间。在其它实施方案中，在培养过程结束时从填充床中除去载体，及在一些实施方案中用等渗缓冲液洗涤，将细胞通过搅动和/或酶消化处理或者从载体中除去。
在某些实施方案中，生物反应器的接种浓度为10,000–2,000,000个细胞/ml培养基，在其它实施方案中为20,000-2,000,000个细胞/ml、在其它实施方案中为30,000-1,500,000个细胞/ml、在其它实施方案中为40,000-1,400,000个细胞/ml、在其它实施方案中为50,000-1,300,000个细胞/ml、在其它实施方案中为60,000-1,200,000个细胞/ml、在其它实施方案中为70,000-1,100,000个细胞/ml、在其它实施方案中为80,000-1,000,000个细胞/ml、在其它实施方案中为80,000-900,000个细胞/ml、在其它实施方案中为80,000-800,000个细胞/ml、在其它实施方案中为80,000-700,000个细胞/ml、在其它实施方案中为80,000-600,000个细胞/ml、在其它实施方案中为80,000-500,000个细胞/ml、在其它实施方案中为80,000-400,000个细胞/ml、在其它实施方案中为90,000-300,000个细胞/ml、在其它实施方案中为90,000-250,000个细胞/ml、在其它实施方案中为90,000-200,000个细胞/ml、在其它实施方案中为100,000-200,000个细胞/ml、在其它实施方案中为110,000-1,900,000个细胞/ml、在其它实施方案中为120,000-1,800,000个细胞/ml、在其它实施方案中为130,000-1,700,000个细胞/ml、在其它实施方案中为140,000-1,600,000个细胞/ml。
在其它实施方案中，种植1-20×106个细胞/g(gr)载体(基质)，或者在其它实施方案中为1.5-20×106个细胞/gr载体，或者在其它实施方案中为1.5-18×106个细胞/gr载体，或者在其它实施方案中为1.8-18×106个细胞/gr载体，或者在其它实施方案中为2-18×106个细胞/gr载体，或者在其它实施方案中为3-18×106个细胞/gr载体，或者在其它实施方案中为2.5-15×106个细胞/gr载体，或者在其它实施方案中为3-15×106个细胞/gr载体，或者在其它实施方案中为3-14×106个细胞/gr载体，或者在其它实施方案中为3-12×106个细胞/gr载体，或者在其它实施方案中为3.5-12×106个细胞/gr载体，或者在其它实施方案中为3-10×106个细胞/gr载体，或者在其它实施方案中为3-9×106个细胞/gr载体，或者在其它实施方案中为4-9×106个细胞/gr载体，或者在其它实施方案中为4-8×106个细胞/gr载体，或者在其它实施方案中为4-7×106个细胞/gr载体，或者在其它实施方案中为4.5-6.5×106个细胞/gr载体。
在某些实施方案中，当生物反应器中至少约10％、在其它实施方案中至少12％、在其它实施方案中至少14％、在其它实施方案中至少16％、在其它实施方案中至少18％、在其它实施方案中至少20％、在其它实施方案中至少22％、在其它实施方案中至少24％、在其它实施方案中至少26％、在其它实施方案中至少28％、或者在其它实施方案中至少30％的细胞处于S期和G2/M期(总共)时，可以从生物反应器中进行收获，所述时期可以通过本领域已知的各种方法测定，例如FACS检测。通常，在FACS的情况中，S和G2/M期的细胞的百分比表示为在例如使用正向散射/侧向散射门进行活细胞门控后的活细胞百分比。本领域技术人员意识到这些时期的细胞百分比与正在增殖的细胞的百分比相关。
在其它实施方案中，ASC的温育可以包含微载体，所述微载体在某些实施方案中可以在生物反应器内。微载体是本领域技术人员熟知的，在例如并入本文作参考的美国专利No.8,828,720、7,531,334、5,006,467中描述。微载体也可以商购，例如CytodexTM(得自Pharmacia Fine Chemicals,Inc.,)、Superbeads(商购自Flow Labs,Inc.,)和DE-52和DE-53(商购自Whatman,Inc.)。在某些实施方案中，在微载体中温育之前，ASC可以在2D装置中温育，例如在组织培养板或者培养皿中温育。在其它实施方案中，在微载体中温育之前ASC不在2D装置中温育。在某些实施方案中，微载体包装在生物反应器内。
在某些实施方案中，可以进行进一步的ASC的纯化或者富集的步骤。这种方法包括但不限于使用ASC标志物和/或在各个实施方案中使用MSC或者间充质样基质细胞进行细胞分选。
在本文中，细胞分选是指基于其一或者多种标志物的表达、缺乏一或者多种标志物的表达或者其组合而选择细胞的任何程序，无论是手动还是自动选择。本领域技术人员意识到来自一或者多种标志物的数据在分选过程中可以单独使用或者组合使用。
在其它实施方案中，所述ASC温育包含微载体，在某些实施方案中所述微载体可以在生物反应器内。微载体为本领域技术人员熟知，在例如并入本文作参考的美国专利No.8,828,720、,531,334、5,006,467中描述。微载体也是可商购的，例如CytodexTM(得自Pharmacia Fine Chemicals,Inc.,)、Superbeads(商购自Flow Labs,Inc.,)及DE-52和DE-53(商购自Whatman,Inc.)。在某些实施方案中，在微载体中温育之前，ASC可以在2D装置例如组织培养板或者培养皿中温育。在其它实施方案中，ASC在微载体中温育之前不在2D装置中温育。在某些实施方案中，微载体包装在生物反应器内。
在一些实施方案中，参考图17A-B所示及并入本文作参考的2014年3月13日公开的WO/2014/037862所述，带槽载体30用于ASC的增殖和/或温育。在各个实施方案中，载体可以在2D温育(例如在培养板或者培养皿上)之后使用，或者在没有先前2D温育的情况下使用。在其它实施方案中，在载体上温育之后可以在生物反应器中的3D基质上温育，其可以是例如填充床基质或者微载体；或者在载体上温育之后可以不在3D基质上温育。
参考图17A，载体30可包括从载体30外部朝向载体30内部延伸的多个二维(2D)表面12。如图所示，所述表面由隔开以形成开口16一组肋状结构(rib)14构成，其尺寸在使用期间允许细胞和培养基(未示出)流动。参考图17C，载体30还可以包括多个2D表面12，其从载体30的中心载体轴18延伸且通常延伸垂直于以一定间隔形成开口16的肋状结构14，从而产生多个2D表面12。在其它实施方案中，开口16具有基本上为半圆弧形的横截面形状(参见图17A)。在其它实施方案中，中央载体轴18是将球体平分的平面25，及开口16从支架的表面延伸到所述平面的近侧表面。在其它实施方案中，开口16从载体30的表面20延伸到所述平面的近侧表面，且具有基本上为半圆弧形的横截面形状。在其它实施方案中，载体30基本上是球形的，且具有最大直径4-10毫米(mm)，或者4-9mm、4.5-8.5mm、5-8mm、5.5-7.5mm、6-7mm、6.1-6.9mm、6.2-6.8mm、6.3-6.7mm、6.4-6.6mm或者基本上6.5mm。在前述载体的某些实施方案中，肋状结构14基本上是平的且彼此平行地延伸。在更特别的实施方案中，存在3-7个、4-6个或者5个平行肋状结构(不包括最外面的肋状结构19)，在平面25的每侧形成6个开口16。二选一或另外，肋状结构14的宽度15和开口17的宽度17是肋状结构宽度15除以(肋状结构宽度15+开口宽度17)的比率在0.4-0.8、0.45-0.75、0.5-0.7、0.5-0.8、0.5-0.75、0.55-0.65、0.58-0.62或者大致0.6。
在其它实施方案中，载体30是“3D体”，如WO/2014/037862所述，所述专利关于3D体的内容在此并入本文作参考。
如上所述，载体30可具有多种形状，包括但不限于球形、圆柱形、立方形、超矩形、椭圆形和多面体和/或不规则多面体形状。在一些实施方案中，载体30的最小包围球的直径(例如在球形的情况下载体的直径)可以在1-50mm的范围内。在其它实施方案中，外部最大尺寸可以在2-20mm、3-15mm或者4-10mm的范围。在其它实施方案中，载体30的一般弦长范围为0.5-25mm、1-10mm、1.5-7.5mm、2-5mm或者2.5-4mm。如本领域技术人员已知的，一般弦长在Li et al,Determination of non-spherical particle size distribution fromchord length measurements.Part 1:Theoretical analysis.Chemical EngineeringScience 60(12):3251–3265,2005)中描述。
根据载体30的整体尺寸，肋状结构14和开口16可以具有不同的尺寸。例如，肋状结构14的厚度范围可以是0.1-2mm或者0.2mm-1mm。特别地，肋状结构14的厚度可以是0.4-0.6mm、0.5-0.7mm或者0.6-0.8mm。开口16的宽度范围可以是0.01-1mm或者0.1-0.5mm。特别地，开口16的宽度可以是0.25-0.35mm、0.35-0.45mm或者0.45-0.55mm。
在优选的实施方案中，载体提供2D表面，用于在多个2D表面12、22的至少大部分或者全部表面区域上附着和单层生长。二选一或另外，载体的表面积与体积比在3-1000cm2/cm3之间、3-500cm2/cm3之间、3-300cm2/cm3之间、3-200cm2/cm3之间、3-100cm2/cm3之间、3-50cm2/cm3之间、3-30cm2/cm3之间、5-20cm2/cm3之间或者10-15cm2/cm3之间。
如图17A-B所示，在各个实施方案中，载体30可以是基本上球形的，且具有形成载体的最大尺寸的直径。在一些实施方案中，载体30的直径可以在1-50mm的范围内。在其它实施方案中，直径可以为2-20mm、3-15mm或者4-10mm。参考图17B，根据载体30的整体尺寸，肋状结构24和开口26可以具有不同的尺寸。例如，肋状结构24的厚度范围可以为0.1-2mm或者0.2-1mm。特别地，肋状结构24的厚度可以是0.45-0.55mm、0.55-0.65mm或者0.65-0.75mm。在一些实施方案中，开口26的最小宽度可以在0.01-1mm、0.05-0.8mm或者0.1-0.5mm的范围内。特别地，开口26的最小宽度可以是0.25-0.35mm、0.3.5-0.45mm或者0.45-0.55mm。在其它实施方案中，开口26的最大横截面尺寸可以在0.1-5mm、0.2-3mm或者0.5-2mm的范围内。更特别地，开口26可具有0.7.5-0.85mm、0.95-1.05mm或者1.15-0.25mm的最大横截面尺寸。此外，载体30包括延伸通过载体中心并形成另外的表面32的开口36，其可以支持真核细胞的单层生长。
在图17A所示的实施方案中，肋状结构14基本上是平的且彼此平行延伸。在其它实施方案中，肋状结构是其它结构。例如，图17B示出具有由不同结构的肋状结构24形成的多个二维表面22的载体30。特别地，肋状结构24的形状构成围绕载体30圆周的有间隔的开口26，由此开口26通常可以是楔形的。肋状结构24可以从载体30的中心载体轴18放射状地延伸到载体30的外周表面。载体30还可以包括从载体30的中心载体轴18延伸且大致垂直于肋状结构24延伸的一或者多个侧向平面，如图17C所示，这是图17A的载体30的某些实施方案的横截面图。
在其它实施方案中，形成多个2D表面的材料包含至少一种聚合物。在更特别的实施方案中，所述聚合物选自聚酰胺、聚碳酸酯、聚砜、聚酯、聚缩醛和聚氯乙烯。
在各个实施方案中，用于制备所述载体的材料可包括金属(例如钛)、金属氧化物(例如氧化钛膜)、玻璃、硼硅酸盐、碳纤维、陶瓷、可生物降解材料(例如胶原，明胶，PEG，水凝胶)和/或聚合物。合适的聚合物可包括聚酰胺如TR 55(EMS-Grivory,Sumter,SC)；聚碳酸酯如(Sabic,Pittsfield,MA)和(Bayer)；聚砜如PPSU(Solvay)和PSU(Solvay)；聚酯如(Polyone)、(聚对苯二甲酸丁二酯)、(聚对苯二甲酸丁二酯)及HX312C；聚缩醛如(Ticana)以及聚氯乙烯。在某些实施方案中，所述载体由无孔材料构成，或者如果存在孔则其不大于20微米，在其它实施方案中为10微米，在其它实施方案中为5微米，在其它实施方案中为3微米，在其它实施例为2微米，或者在其它实施例中为1微米。
在更特别的实施方案中，细胞培养载体由或者的注塑表面处理形成，具有光滑的表面纹理，在或者载体上使用生长培养基蛋白和/或聚赖氨酸；细胞培养载体由注塑的制成，表面粗糙，与生长培养基蛋白预温育。在其它实施方案中，使用未处理的或者表面。
在其它实施方案中，至少部分载体可以使用聚苯乙烯聚合物形成。聚苯乙烯可以通过使用电晕放电、气体等离子体(滚瓶和培养管)或者其它类似方法进一步修饰。这些处理可以产生高能氧离子，其接枝到表面聚苯乙烯链上，使得所述表面在加入培养基时变得亲水并带负电。此外，任何载体均可至少部分地由所述材料的组合制成。对所述载体材料可以进一步包被或者处理以支持细胞附着。这种包被和/或预处理可包括使用胶原蛋白I、胶原蛋白IV、明胶、聚-d-赖氨酸、纤连蛋白、层粘连蛋白、胺和羧基。
在各个实施方案中，所述载体有一或者多层涂层包被。在一些实施方案中，可以选择合适的包被以控制细胞附着或者细胞生物学参数。合适的包被可包括例如肽、蛋白质、碳水化合物、核酸、脂质、多糖、糖胺聚糖、蛋白聚糖、激素、细胞外基质分子、细胞粘附分子、天然聚合物、酶、抗体、抗原、多核苷酸、生长因子、合成聚合物、聚赖氨酸、药物和/或其它分子或者这些包被物的组合或者片段。
此外，在各个实施方案中，可以对本文所述载体的表面进行处理或者以其它方式改变以控制细胞附着和/或其它生物学特性。处理表面的选项包括化学处理、等离子体处理和/或电晕处理。此外，在各个实施方案中，可以对材料进行处理以将官能团导入材料内或者之上，包括含有烃、氧和/或氮的基团。另外，在各个实施方案中，可以产生或者改变所述材料以具有促进细胞沉淀或者控制其它细胞性质的质地。例如，在一些实施方案中，用于产生细胞培养载体的材料具有纳米或者微米级的粗糙度，其有助于细胞沉淀和/或控制其它细胞性质。
收获
在其它实施方案中，所述改性的ASC通过包括振动或者搅动的方法从生物反应器中收获，例如在此并入本文作参考的PCT国际申请公开No.WO2012/140519所述。在某些实施方案中，在收获的过程中，在用蛋白酶、任选也包含钙螯合剂处理期间或者在其它实施方案中在所述处理期间和之后将细胞以0.7-6Hertz搅动，或者在其它实施方案中以1-3Hertz搅动。在某些实施方案中，含有细胞的载体以0.7-6Hertz搅动，或者在其它实施方案中以1-3Hertz搅动，同时浸没在包含蛋白酶任选进一步包含钙螯合剂的溶液或者培养基中。蛋白酶加钙螯合剂的非限制性实例是胰蛋白酶(或者具有相似活性的另一种酶，任选与另一种酶组合，其非限制性实例是I型、II型、III型和IV型胶原酶)和EDTA。与胰蛋白酶具有相似活性的酶为本领域熟知，其非限制性实例是TrypLETM(一种真菌胰蛋白酶样蛋白酶)，及I型、II型、III型和IV型胶原酶，可商购自Life Technologies。与胶原酶具有相似活性的酶为本领域熟知，其非限制性实例是分散酶I和分散酶II，可商购自Sigma-Aldrich。在其它实施方案中，通过包括任选洗涤步骤随后与胶原酶一起温育、然后与胰蛋白酶温育的方法收获细胞。在各个实施方案中，前述步骤中的至少一个、至少两个或者所有三个步骤均包括搅动。在更特别的实施方案中，用蛋白酶加钙螯合剂处理期间和/或之后的总搅动持续时间为2-10分钟，在其它实施方案中为3-9分钟，在其它实施方案中为3-8分钟，在其它实施方案中为3-7分钟。在其它实施方案中，在加入蛋白酶和钙螯合剂之前，在洗涤步骤期间，将细胞以0.7-6Hertz搅动，或者在其它实施方案中以1-3Hertz搅动。
本领域技术人员会意识到许多等渗缓冲液可用于洗涤细胞和相似应用。Hank’s平衡盐溶液(HBSS，Life Technologies)只是可以使用的许多缓冲液之一。
可用于2D和3D培养的基本培养基的非限制性实例包括最小基本培养基Eagle、ADC-1、LPM(无牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培养基(有和无Fitton-Jackson改性)、Basal Medium Eagle(BME-添加Earle’s盐基底(saltbase))、Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM-无血清)、Yamane、IMEM-20、GlasgowModification Eagle Medium(GMEM)、Leibovitz L-15培养基、McCoy’s 5A培养基、培养基M199(M199E-具有Earle’s sale base)、培养基M199(M199H-具有Hank’s salt base)、最小基本培养基Eagle(MEM-E-具有Earle’s盐基底)、最小基本培养基Eagle(MEM-H-具有Hank’s盐基底)及最小基本培养基Eagle(MEM-NAA具有非必需氨基酸)等等，包括培养基199、CMRL1415、CMRL 1969、CMRL 1066、NCTC 135、MB 75261、MAB 8713、DM 145、Williams’G、Neuman&Tytell、Higuchi、MCDB 301、MCDB 202、MCDB 501、MCDB 401、MCDB 411、MDBC 153。在某些实施方案中，使用DMEM。这些及其它可用的培养基得自GIBCO,Grand Island,N.Y.,USA和Biological Industries,Bet HaEmek,Israel等。
在一些实施方案中，基本培养基可以补加其它物质。这种物质的非限制性实例是血清，在一些实施方案中是奶牛或者其它物种的胎儿血清，在一些实施方案中，其是培养基体积的5-15％。在一些实施方案中，培养基含有1-5％、2-5％、3-5％、1-10％、2-10％、3-10％、4-15％、5-14％、6-14％、6-13％、7-13％、8-12％、8-13％、9-12％、9-11％或者9.5％-10.5％血清，其可以是FBS，或者在其它实施方案中是另一种动物血清。在其它实施方案中，培养基不含血清。
二选一或另外，基本培养基可以补加生长因子、维生素(例如抗坏血酸)、盐(例如B-甘油磷酸盐)、类固醇(例如地塞米松)和激素例如生长激素、促红细胞生成素、血小板生成素、巨噬细胞集落刺激因子、c-kit配体/干细胞因子、骨保护素配体、胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、睫状神经营养因子、血小板衍生生长因子和骨形态发生蛋白。
应意识到可将其它成分加入培养基中。这些成分可以是抗生素、抗真菌剂、白蛋白、氨基酸及本领域已知用于细胞培养的其它成分。
本文描述的各种培养基，即2D生长培养基，如果适用，则第一3D生长培养基和第二3D生长培养基可以单独地选自与培养基组成相关的每个所述实施方案。在某些实施方案中，第一和第二3D生长培养基之间的唯一差别是加入的细胞因子的存在。在其它实施例中，第一和第二3D生长介质在其它方面是不同的。在各个实施方案中，可以使用适于生物反应器中细胞生长的任何培养基。
还应意识到在某些实施方案中，当所述ASC意在用于给人对象施用时，所述细胞和培养基(例如具有上述培养基添加剂)基本上是无异源体系(xeno-free)，即没有任何动物污染物，例如支原体。例如，可以为培养基补加血清替代物、人血清和/或合成或者重组产生的因子。
细胞因子处理的细胞的特性
在一些实施方案中，用细胞因子处理的细胞(下文称为“细胞因子处理的细胞”)在“经典的”间充质干细胞会分化为骨细胞的条件下不分化为骨细胞。在一些实施方案中，所述条件是与含有0.1微摩尔(mcM)地塞米松、0.2mM抗坏血酸和10mM甘油-2-磷酸的溶液在用玻连蛋白和胶原蛋白包被的平板中温育17天。在其它实施方案中，所述条件是与含有10mcM地塞米松、0.2mM抗坏血酸、10mM甘油-2-磷酸和10nM维生素D的溶液在用玻连蛋白和胶原蛋白包被的平板中温育26天。如本领域技术人员所理解的，上述溶液通常含有细胞培养基，例如DMEM+10％血清等。
如上所述，在其它实施方案中，所述细胞因子处理的细胞在间充质干细胞会分化为脂肪细胞的条件下不分化为脂肪细胞。在一些实施方案中，如本文所提供，所述条件是在第1、3、5、9、11、13、17、19和21天加入脂肪生成诱导培养基温育，所述培养基即是含有1mcM地塞米松、0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、10mcg/ml胰岛素和100mcM吲哚美辛的溶液，当在第7天和第15天时将所述培养基更换为脂肪生成维持培养基，即含有10mcg/ml胰岛素的溶液，共温育25天。在其它实施方案中，如本文所提供的，使用含有1mcM地塞米松、0.5mM IBMX、10mcg/ml胰岛素和200mcM吲哚美辛的改性的脂肪生成诱导培养基，温育共26天。如本领域技术人员所理解的，上述溶液通常含有细胞培养基，例如DMEM+10％血清等。
在某些实施方案中，所述细胞因子处理的ASC在体外刺激内皮细胞增殖(ECP)，或者在另一个实施方案中抑制T细胞增殖，或者在另一个实施方案中发挥这两种活性。在其它实施方案中，所述细胞在体内刺激血管生成，或者在另一个实施方案中表现出免疫抑制活性(在一些实施方案中特别针对T细胞应答)，和/或在另一个实施方案中支持造血干细胞(HSC)植入，或者在其它实施方案中呈现上述任二个体内特性，或者在其它实施方案中出现上述全部3种体内特性。每种组合均被认为是单独的实施方案。在某些实施方案中，如本文所提供，当将750个人脐带内皮细胞(HUVEC)在常氧条件下在37℃在ASC层上温育4天时，HUVEC细胞的增殖与不存在ASC时观察到的水平相比增强，例如增强至少120％、至少125％、至少130％、至少140％、至少150％、及至少160％，或者至少180％。
根据一些实施方案，所述细胞因子处理的ASC能抑制对象中的免疫反应。确定细胞群的免疫抑制能力的方法为本领域技术人员熟知。例如，可以进行混合淋巴细胞反应(MLR)。在示例性的非限制性MLR测定中，将脐带血(CB)单个核细胞(例如人细胞或者来自另一物种的细胞)与经辐射的脐带血细胞(iCB)、外周血衍生的单个核细胞(PBMC，例如人PBMC或者另一物种的PBMC)在存在或者不存在待检测细胞群的条件下温育。与免疫应答强度相关的CB细胞复制可以通过本领域已知的多种方法测量，例如通过3H-胸苷摄取测量。当与检测细胞共温育时CB细胞复制的减少表明免疫抑制能力。或者，可以用外周血(PB)衍生的MNC代替CB细胞进行类似的测定。二选一或另外，可以在存在或者不存在ASC的条件下，测量当在刺激时(例如通过与非匹配细胞温育，或者与非特异性刺激物如PHA温育)由血细胞群(例如CB细胞或者PBMC)分泌的促炎和抗炎细胞因子。在某些实施方案中，例如在人ASC的情况下，如本文所提供，当将150,000个ASC与50,000个同种异体PBMC共温育48小时，然后用1.5mcg LPS刺激5小时，由PBMC分泌的IL-10与在不存在ASC条件下用LPS刺激观察到的量相比增多至少120％、至少130％、至少150％、至少170％、至少200％或者至少300％。
在其它实施方案中，CD73、CD29和CD105中的每个由超过90％的所述细胞因子处理的细胞表达；以及在用含有0.1mcM地塞米松、0.2mM抗坏血酸和10mM甘油-2-磷酸的溶液在用玻连蛋白和胶原蛋白包被的平板中温育17天后，所述细胞不分化为骨细胞。在其它实施方案中，CD34、CD19和CD14中的每个由少于3％的细胞表达；以及在上述条件下温育后，所述细胞不分化为骨细胞。在其它实施方案中，CD73、CD29和CD105中的每个由超过90％的细胞表达，CD34、CD19和CD14中的每个由少于3％的细胞表达；以及在上述条件下温育后所述细胞不分化为骨细胞。在其它实施方案中，所述条件是用含有10mcM地塞米松、0.2mM抗坏血酸、10mM甘油-2-磷酸和10nM维生素D的溶液在用玻连蛋白和胶原蛋白包被的平板中温育26天。如本领域技术人员所理解的，上述溶液通常含有细胞培养基，例如DMEM+10％血清等。
在其它实施方案中，CD73、CD29和CD105中的每个由超过90％的所述细胞因子处理的细胞表达；及在第1、3、5、9、11、13、17、19和21天在脂肪生成诱导培养基(即含有1mcM地塞米松、0.5mM IBMX、10mcg/ml胰岛素和100mcM吲哚美辛的溶液)中温育，以及在第7天和第15天将所述培养基更换为脂肪生成维持培养基(即含有10mcg/ml胰岛素的溶液)，共温育25天后，所述细胞不分化为脂肪细胞。在其它实施方案中，CD34、CD19和CD14中的每个由少于3％的细胞表达；在上述条件下温育后，所述细胞不分化为脂肪细胞。在其它实施方案中，CD73、CD29和CD105中的每个由超过90％的细胞表达，每个CD34、CD19和CD14均由少于3％的细胞表达；以及在上述条件下温育后，所述细胞不分化为脂肪细胞。在其它实施方案中，使用含有1mcM地塞米松、0.5mM IBMX、10mcg/ml胰岛素和200mcM吲哚美辛的改良的脂肪生成诱导培养基，并且温育共26天。如本领域技术人员所理解的，上述溶液通常含有细胞培养基，例如DMEM+10％血清等。
在其它实施方案中，CD73、CD29和CD105中的每个由超过90％的所述细胞因子处理的细胞表达；且所述细胞刺激ECP。在其它实施方案中，CD34、CD19和CD14中的每个由少于3％的细胞表达；且所述细胞刺激ECP。在其它实施方案中，CD73、CD29和CD105中的每个由超过90％的细胞表达，CD34、CD19和CD14中的每个由少于3％的细胞表达；且所述细胞刺激ECP。
在其它实施方案中，CD73、CD29和CD105中的每个由超过90％的所述细胞因子处理的细胞表达；且所述细胞抑制T细胞增殖。在其它实施方案中，CD34、CD19和CD14中的每个由小于3％的细胞表达；且所述细胞抑制T细胞增殖。在其它实施方案中，CD73、CD29和CD105中的每个由超过90％的细胞表达，CD34、CD19和CD14中的每个由少于3％的细胞表达；且所述细胞抑制T细胞增殖。
在其它实施方案中，所述细胞因子处理的细胞当在2D培养时呈现出纺锤形。
在其它实施方案中，提供了培养物，其包含具有上述特征组之一的细胞因子处理的ASC，或者在其它实施方案中提供了包含所述培养物的生物反应器。在一些实施方案中，所述生物反应器进一步包含合成的3D基质。在其它实施方案中，提供了包含ASC的组合物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在进一步的实施方案中，所述赋形剂是冷冻保护剂，或者是载体蛋白。二选一或另外，所述组合物是冷冻的。在其它实施方案中，提供了包含任何上述细胞群的悬浮液。在某些实施方案中，悬浮液包含药学上可接受的赋形剂。在其它实施方案中，悬浮液是药物组合物。在其它实施方案中，悬浮液是冷冻的，且在一些实施方案中进一步包含冷冻保护剂。在这方面，每个上述ASC群均代表一个单独的实施方案。
在某些实施方案中，细胞因子处理的细胞已经用一或者多种治疗因子转染，在某些实施方案中，所述治疗因子可以是促血管生成因子或者抗炎因子。在其它实施方案中，细胞未用任何外源遗传物质转染。
在其它实施方案中，细胞因子处理的细胞是胎盘细胞群，其是胎儿细胞和母体细胞的混合物。在更特别的实施方案中，所述混合物含有20-80％的胎儿细胞、30-80％的胎儿细胞、40-80％的胎儿细胞、50-80％的胎儿细胞、60-80％的胎儿细胞；20-90％的胎儿细胞、30-90％的胎儿细胞、40-90％的胎儿细胞、50-90％的胎儿细胞、60-90％的胎儿细胞、至少50％的胎儿细胞、至少60％的胎儿细胞、至少70％的胎儿细胞、至少80％的胎儿细胞、至少90％的胎儿细胞、至少95％的胎儿细胞、20-80％的母体细胞、30-80％的母体细胞、40-80％的母体细胞、50-80％的母体细胞、60-80％的母体细胞、20-90％的母体细胞、30-90％的母体细胞、40-90％的母体细胞、50-90％的母体细胞、60-90％的母体细胞、至少50％的母体细胞、至少60％的母体细胞、至少70％母体细胞、至少80％母体细胞、至少90％母体细胞、至少95％母体细胞。在其它实施方案中，所述细胞基本上全部是胎儿细胞，或者基本上全部是母体细胞。在本文中，“基本上全部”是指通过标准荧光激活细胞分选测定法检测没有可检测的其它细胞类型(分别为母体细胞或者胎儿细胞)的存在。
在其它实施方案中，所述细胞相对于未处理的细胞产生或者分泌增加量的治疗因子。在某些实施方案中，所述治疗因子是抗炎因子，或者在其它实施方案中是促炎性因子，或者在其它实施方案中是血管生成因子。
在其它实施方案中，提供了ASC群，在一些实施方案中，提供了源自胎盘的ASC，其分泌升高水平的血管内皮生长因子(VEGF)。在一些实施方案中，在从生物反应器中移出细胞后测量VEGF分泌。在某些实施方案中，VEGF的分泌是在没有加入细胞因子条件下制备的细胞的至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍或者至少5倍。在某些实施方案中，如本文所提供，通过在标准条件下将1×106ASC温育24小时，然后将培养基更换为EBM-2培养基并在低氧条件(1％O2)下温育24小时，由此测量VEGF分泌。在更特别的实施方案中，所述细胞在在这些条件下每24小时分泌至少180皮克(pg)、至少190pg、至少200pg、至少250pg、至少300pg、至少400pg、至少500pg、至少600pg、至少800pg、至少1000pg、至少1200pg、至少1500pg、至少2000pg、至少3000pg、至少4000pg、至少5000pg、50-2000pg、75-2000pg、100-1500pg、150-1400pg、200-1400pg、250-1300pg、300-1200pg或者400-1000pg的VEGF。在其它实施方案中，提供了包含分泌VEGF的ASC的培养物，或者在其它实施方案中提供了包含所述培养物的生物反应器。在一些实施方案中，所述生物反应器进一步包含合成的3D基质。在其它实施方案中，提供了包含分泌VEGF的ASC的组合物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在进一步的实施方案中，所述赋形剂是冷冻保护剂，或者是载体蛋白。二选一或另外，所述组合物是冷冻的。
在其它实施方案中，提供了ASC群，在一些实施方案中提供了源自胎盘的ASC，其分泌升高水平的白细胞介素-6(IL-6；UniProt No.P05231)。在一些实施方案中，在从生物反应器中移出细胞后测量IL-6分泌。在某些实施方案中，IL-6分泌是没有加入细胞因子制备的细胞的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、或者至少8倍、或者至少10倍。在某些实施方案中，如本文所提供，通过在标准条件下将1×106ASC温育24小时，然后将培养基更换为EBM-2培养基并在低氧条件(1％O2)或常氧条件(5％O2)下温育24小时而测量IL-6分泌。在更特别的实施方案中，所述细胞在这些条件下每24小时分泌至少20皮克(pg)、至少30pg、至少50pg、至少70pg、至少100pg、至少150pg、至少200pg、至少300pg、至少400pg、至少500pg、至少700pg、至少1000pg、至少2000pg、50-2000pg、75-2000pg、100-1500pg、150-1400pg、200-1400pg、250-1300pg、300-1200pg、400-1000pg、1000-20,000pg、1500-18,000pg、1700-17,000pg、1800-16,000pg、1900-15,000pg、2000-14,000pg、2100-13,000pg、2200-14,000pg、2300-13,000pg、2400-12,000pg、2500-10,000pg、2500-8,000pg、2500-6,000pg或者2500-4,000pg的IL-6。在其它实施方案中，提供了包含分泌IL-6的ASC的培养物，或者在其它实施方案中提供了包含所述培养物的生物反应器。在一些实施方案中，所述生物反应器进一步包含合成的3D基质。在其它实施方案中，提供了包含分泌IL-6的ASC的组合物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在进一步的实施方案中，所述赋形剂是冷冻保护剂，或者是载体蛋白。二选一或另外，所述组合物是冷冻的。
在其它实施方案中，提供了ASC群，在一些实施方案中提供了源自胎盘的ASC，其分泌升高水平的MCP-1(单核细胞趋化蛋白1；UniProt No.P13500)。在一些实施方案中，如本文提供的，在生物反应器中温育的最后一天期间测量MCP-1分泌。在某些实施方案中，MCP-1分泌是不存在加入的细胞因子的条件下制备的细胞的至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍或者至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少70倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少300倍、至少500倍、至少700倍或者至少1000倍。在某些实施方案中，如本文所提供，通过将1×106ASC在标准条件下温育24小时，然后将培养基更换为EBM-2培养基并在常氧条件(5％O2)下温育24小时以测量MCP-1分泌。在更特别的实施方案中，所述细胞在这些条件下每24小时分泌至少20pg、至少30pg、至少50pg、至少70pg、至少100pg、至少150pg、至少200pg、至少300pg至少400pg、至少500pg、至少700pg、至少1000pg、至少2000pg、50-2000pg、75-2000pg、100-1500pg、150-1400pg、200-1400pg、250-1300pg、300-1200pg、400-1000pg、1000-20,000pg、1500-18,000pg、1700-17,000pg、1800-16,000pg、1900-15,000pg、2000-14,000pg、2100-13,000pg、2200-14,000pg、2300-13,000pg、2400-12,000pg、2500-10,000pg、2500-8,000pg、2500-6,000pg或者2500-4,000pg的MCP-1。在其它实施方案中，提供了包含分泌MCP-1的ASC的培养物，或者在其它实施方案中提供了包含所述培养物的生物反应器。在一些实施方案中，所述生物反应器进一步包含合成的3D基质。在其它实施方案中，提供了包含分泌MCP-1的ASC的组合物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在进一步的实施方案中，所述赋形剂是冷冻保护剂，或者是载体蛋白。二选一或另外，所述组合物是冷冻的。
在其它实施方案中，提供了ASC群，在一些实施方案中提供了源自胎盘的ASC，其分泌升高水平的GM-CSF。在一些实施方案中，如本文提供的，在生物反应器中温育的最后一天期间测量GM-CSF分泌。在某些实施方案中，GM-CSF分泌是在不存在加入的细胞因子条件下制备的细胞的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍或者至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍或者至少30倍。在其它实施方案中，提供了包含分泌GM-CSF的ASC的培养物，或者在其它实施方案中提供了包含所述培养物的生物反应器。在一些实施方案中，所述生物反应器进一步包含合成的3D基质。在其它实施方案中，提供了包含分泌GM-CSF的ASC的组合物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在进一步的实施方案中，所述赋形剂是冷冻保护剂，或者是载体蛋白。二选一或另外，所述组合物是冷冻的。
在其它实施方案中，提供了ASC群，在一些实施方案中提供了源自胎盘的ASC，其分泌升高水平的RANTES(C-C基序趋化因子5；UniProt No.P13501)。在一些实施方案中，在从生物反应器中移出细胞后测量RANTES分泌。在某些实施方案中，RANTES分泌是在不存在加入细胞因子条件下制备的细胞的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、或者至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少70倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少300倍、至少500倍、至少700倍或者至少1000倍。在某些实施方案中，如本文所提供，通过将5×105ASC在标准条件下温育24小时，然后将培养基更换为血清培养基并在含氧量正常的条件下再温育24小时来测量RANTES分泌。在更特别的实施方案中，所述细胞在这些条件下每24小时分泌至少20pg、至少30pg、至少50pg、至少70pg、至少100pg、至少150pg、至少200pg、至少300pg、至少400pg、至少500pg、至少700pg、至少1000pg、至少1500pg、至少2000pg、至少3000pg、至少4000pg、至少5000pg、至少6000pg、至少8000pg、至少10,000pg、至少15,000pg、至少20,000pg、1000-20,000pg、1500-18,000pg、1700-17,000pg、1800-16,000pg、1900-15,000pg、2000-14,000pg、2100-13,000pg、2200-14,000pg、2300-13,000pg、2400-12,000pg、2500-10,000pg、2500-8,000pg、2500-6,000pg、2500-4,000pg、2000-15,000pg、2500-14,000pg、3000-14,000pg、3500-12,000pg、4000-10,000pg、4500-8,000pg、5,000-7,000pg、10,000-200,000pg、15,000-180,000pg、17,000-170,000pg、18,000-160,000pg、19,000-150,000pg、20,000-140,000pg、22,000-140,000pg、24,000-120,000pg、26,000-100,000pg、28,000-90,000pg、30,000-80,000pg、32,000-75,000pg、34,000-70,000pg、36,000-6 5,000pg、37,000-62,000pg、38,000-60,000pg、39,000-58,000pg、40,000-56,000pg、41,000-54,000pg、42,000-52,000pg、40,000-50,000pg、38,000-48,000pg或者40,000-46,000pg的RANTES。在其它实施方案中，提供了包含分泌RANTES的ASC的培养物，或者在其它实施方案中提供了包含所述培养物的生物反应器。在一些实施方案中，所述生物反应器进一步包含合成的3D基质。在其它实施方案中，提供了包含分泌RANTES的ASC的组合物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在进一步的实施方案中，所述赋形剂是冷冻保护剂，或者是载体蛋白。二选一或另外，所述组合物是冷冻的。
在其它实施方案中，提供了ASC群，在一些实施方案中提供了源自胎盘的ASC，其分泌升高水平的G-CSF(粒细胞集落刺激因子；UniProt No.P09919)。在一些实施方案中，在从生物反应器中移出细胞后测量G-CSF分泌。在某些实施方案中，G-CSF分泌是在不存在细胞因子条件下制备的细胞的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍或者至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少70倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少300倍、至少500倍、至少700倍或者至少1000倍。在某些实施方案中，如本文所提供的，通过将5×105ASC在标准条件下温育24小时，然后将培养基更换为血清培养基并再温育24小时来测量G-CSF分泌。在更特别的实施方案中，所述细胞在这些条件下每24小时分泌至少20pg、至少30pg、至少50pg、至少70pg、至少100pg、至少150pg、至少200pg、至少300pg、至少400pg、至少500pg、至少700pg、至少1000pg、至少1500pg、至少2000pg、50-2000pg、75-2000pg、100-1500pg、150-1400pg、200-1400pg、250-1300pg、300-1200pg或者400-1000pg的G-CSF。在其它实施方案中，提供了包含分泌G-CSF的ASC的培养物，或者在其它实施方案中提供了包含所述培养物的生物反应器。在一些实施方案中，所述生物反应器进一步包含合成的3D基质。在其它实施方案中，提供了包含分泌G-CSF的ASC的组合物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在进一步的实施方案中，所述赋形剂是冷冻保护剂，或者是载体蛋白。二选一或另外，所述组合物是冷冻的。
在其它实施方案中，提供了ASC群，在一些实施方案中提供了源自胎盘的ASC，其分泌升高水平的IL-8。在一些实施方案中，在从生物反应器中移出细胞后测量IL-8分泌。在某些实施方案中，IL-8分泌是在不存在加入的细胞因子条件下制备的细胞的至少为2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、或者至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少70倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少300倍、至少500倍、至少700倍或者至少1000倍。在某些实施方案中，如本文所提供，通过将5×105ASC在标准条件下温育24小时，然后将培养基更换为血清培养基并再温育24小时来测量IL-8分泌。在更特别的实施方案中，所述细胞在这些条件下每24小时分泌至少20pg、至少30pg、至少50pg、至少70pg、至少100pg、至少150pg、至少200pg、至少300pg、至少400pg、至少500pg、至少700pg、至少1000pg、至少1500pg、至少2000pg、至少3000pg、50-3000pg、75-2500pg、100-2200pg、150-2000pg、200-1800pg、250-1600pg、300-1500pg或者400-1400pg的IL-8。在其它实施方案中，提供了包含分泌IL-8的ASC的培养物，或者在其它实施方案中提供了包含所述培养物的生物反应器。在一些实施方案中，所述生物反应器进一步包含合成的3D基质。在其它实施方案中，提供了包含分泌IL-8的ASC的组合物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在进一步的实施方案中，所述赋形剂是冷冻保护剂，或者是载体蛋白。二选一或另外，所述组合物是冷冻的。
在其它实施方案中，提供了ASC群，在一些实施方案中提供了源自胎盘的ASC，其分泌升高水平的IL-15(白细胞介素-15；UniProt No.P40933)。在一些实施方案中，在从生物反应器中移出细胞后测量IL-15分泌。在某些实施方案中，IL-15分泌是在不存在加入的细胞因子条件下制备的细胞的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍或者至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少70倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少300倍、至少500倍、至少700倍或者至少1000倍。在某些实施方案中，如本文所提供，通过将5×105ASC在标准条件下温育24小时，然后将培养基更换为血清培养基并再温育24小时来测量IL-15分泌。在更特别的实施方案中，所述细胞在这些条件下每24小时分泌至少20pg、至少30pg、至少50pg、至少70pg、至少100pg、至少150pg、至少200pg、至少300pg、至少400pg、至少500pg、至少700pg、至少1000pg、至少1500pg、至少2000pg、50-2000pg、75-2000pg、100-1500pg、150-1400pg、200-1400pg、250-1300pg、300-1200pg或者400-1000pg的IL-15。在其它实施方案中，提供了包含分泌IL-15的ASC的培养物，或者在其它实施方案中提供了包含所述培养物的生物反应器。在一些实施方案中，所述生物反应器进一步包含合成的3D基质。在其它实施方案中，提供了包含分泌IL-1的ASC的组合物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在进一步的实施方案中，所述赋形剂是冷冻保护剂，或者是载体蛋白。二选一或另外，所述组合物是冷冻的。
在其它实施方案中，提供了ASC群，在一些实施方案中提供了源自胎盘的ASC，其分泌升高水平的IL-16(白细胞介素-16；UniProt No.Q05BE6)。在一些实施方案中，在从生物反应器中移出细胞后测量IL-16分泌。在某些实施方案中，IL-16分泌是在不存在加入的细胞因子条件下制备的细胞的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍或者至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少70倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少300倍、至少500倍、至少700倍或者至少1000倍。在某些实施方案中，如本文所提供，通过将5×105ASC在标准条件下温育24小时，然后将培养基更换为血清培养基并再温育24小时来测量IL-16分泌。在更特别的实施方案中，所述细胞在这些条件下每24小时分泌至少20pg、至少30pg、至少50pg、至少70pg、至少100pg、至少150pg、至少200pg、至少300pg、至少400pg、至少500pg、至少700pg、至少1000pg、至少1500pg、至少2000pg、50-2000pg、75-2000pg、100-1500pg、150-1400pg、200-1400pg、250-1300pg、300-1200pg或者400-1000pg的IL-16。在其它实施方案中，提供了包含分泌IL-16的ASC的培养物，或者在其它实施方案中提供了包含所述培养物的生物反应器。在一些实施方案中，所述生物反应器进一步包含合成的3D基质。在其它实施方案中，提供了包含分泌IL-16的ASC的组合物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在进一步的实施方案中，所述赋形剂是冷冻保护剂，或者是载体蛋白。二选一或另外，所述组合物是冷冻的。
在其它实施方案中，提供了ASC群，在一些实施方案中提供了源自胎盘的ASC，其分泌升高水平的MIP-1-α(C-C基序趋化因子3；UniProt No.P10147)。在一些实施方案中，在从生物反应器中移出细胞后测量MIP-1-α分泌。在某些实施方案中，MIP-1-α分泌是在不存在加入细胞因子条件下制备的细胞的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍或至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少70倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少300倍、至少500倍、至少700倍或至少1000倍。在某些实施方案中，如本文所提供的，通过将5×105ASC在标准条件下温育24小时，然后将培养基更换为血清培养基并在含氧量正常的条件下再温育24小时来测量MIP-1-α分泌。在更特别的实施方案中，所述细胞在这些条件下每24小时分泌至少20pg、至少30pg、至少50pg、至少70pg、至少100pg、至少150pg、至少200pg、至少300pg、至少400pg、至少500pg、至少700pg、至少1000pg、30-1500pg、40-1400pg、50-1200pg、60-1000pg、70-800pg、90-700pg、100-600pg、150-500pg或200-400pg的MIP-1-α。在其它实施方案中，提供了包含分泌MIP-1-α的ASC的培养物，或在其它实施方案中提供了包含所述培养物的生物反应器。在一些实施方案中，所述生物反应器进一步包含合成的3D基质。在其它实施方案中，提供了包含分泌MIP-1-α的ASC的组合物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在进一步的实施方案中，所述赋形剂是冷冻保护剂，或是载体蛋白。二选一或另外，所述组合物是冷冻的。
在其它实施方案中，提供了ASC群，在一些实施方案中提供了源自胎盘的ASC，其分泌升高水平的MIG(C-X-C基序趋化因子9；UniProt No.Q07325)。在一些实施方案中，在从生物反应器中移出细胞后测量MIG分泌。在某些实施方案中，MIG分泌是在不存在加入细胞因子条件下制备的细胞的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、或至少8倍、至少10倍。至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少70倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少300倍、至少500倍、至少700倍或至少1000倍。在某些实施方案中，如本文所提供，通过将5×105ASC在标准条件下温育24小时，然后将培养基更换为血清培养基并在含氧量正常的条件下再温育24小时来测量MIG分泌。在更特别的实施方案中，所述细胞在这些条件下每24小时分泌至少20pg、至少30pg、至少50pg、至少70pg、至少100pg、至少150pg、至少200pg、至少300pg、至少400pg、至少500pg、至少700pg、至少1000pg、至少1500pg、至少2000pg、至少3000pg、至少4000pg、至少5000pg、至少6000pg、至少8000pg、至少10,000pg、至少15,000pg、至少20,000pg、2000-15,000pg、2500-14,000pg、3000-14,000pg、3500-12,000pg、4000-10,000pg、4500-8,000pg或5,000-7,000pg的MIG。在其它实施方案中，提供了包含分泌MIG的ASC的培养物，或在其它实施方案中，提供了包含所述培养物的生物反应器。在一些实施方案中，所述生物反应器进一步包含合成的3D基质。在其它实施方案中，提供了包含分泌MIG的ASC的组合物。在某些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂。在进一步的实施方案中，所述赋形剂是冷冻保护剂，或是载体蛋白。二选一或另外，所述组合物是冷冻的。
在其它实施方案中，提供了ASC群，在一些实施方案中提供了源自胎盘的ASC，其分泌升高水平的ICAM1(细胞间粘附分子1/CD54；UniProt No.P05362)。在一些实施方案中，在从生物反应器中移出细胞后测量ICAM1分泌。在某些实施方案中，ICAM1分泌是在不存在加入细胞因子条件下制备的细胞的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、或至少8倍、至少10倍。至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少70倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少300倍、至少500倍、至少700倍或至少1000倍。在某些实施方案中，如本文所提供，通过将5×105ASC在标准条件下温育24小时，然后将培养基更换为血清培养基并在含氧量正常的条件下再温育24小时来测量ICAM1分泌。在更特别的实施方案中，所述细胞在这些条件下每24小时分泌至少5000pg、至少7000pg、至少10,000pg、至少15,000pg、至少20,000pg、至少30,000pg、至少40,000pg、至少50,000pg、至少70,000pg、至少100,000pg、至少150,000pg、至少200,000pg、至少300,000pg、至少400,000pg、至少500,000pg、20,000-1,500,000pg、30,000-1,250,000pg、40,000-1,000,000pg、50,000-800,000pg、70,000-700,000pg、100,000-600,000pg、150,000-500,000pg、200,000-500,000pg或250,000-450,000pg的ICAM1。在其它实施方案中，提供了包含分泌ICAM1的ASC的培养物，或在其它实施方案中提供了包含所述培养物的生物反应器。在一些实施方案中，所述生物反应器还包含合成的3D基质。在其它实施方案中，提供了包含分泌ICAM1的ASC的组合物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在进一步的实施方案中，所述赋形剂是冷冻保护剂，或是载体蛋白。二选一或另外，所述组合物是冷冻的。
如本文所提供的，可以在标准条件下温育所述细胞以测量其细胞因子或其它因子的分泌。标准条件的实例如下：将0.5×106个细胞接种在6孔平板(表面积约9.5cm2)中，并在4毫升(ml)/孔DMEM+10％FBS中温育24小时。除去培养基并任选地用等渗溶液洗涤，向每个孔中加入1ml DMEM(不含FBS)，并将细胞在含氧量正常的条件下再培养24小时。在该温育结束时，除去培养基，测量细胞因子水平。
在某些实施方案中，细胞表达或分泌上述细胞因子或其它蛋白质之一，并且如本文所述在“经典的”MSC分化为骨细胞的条件下不分化为骨细胞。在其它实施方案中，细胞表达或分泌上述细胞因子或其它蛋白质之一，并且如本文所述在MSC分化为脂肪细胞的条件下不分化为脂肪细胞。在其它实施方案中，细胞表达或分泌上述细胞因子或其它蛋白质之一，并且在MSC分化为骨细胞或脂肪细胞的条件下分别不分化为骨细胞或脂肪细胞。
本文还提供了通过所述方法产生的细胞群。在某些实施方案中，细胞群保留在所述生物反应器内。在其它实施方案中，细胞群已从生物反应器中移出(“收获”)。
在另一个实施方案中，提供了细胞群，其中所述细胞群大多数对于表达CD10(脑啡肽酶；UniProtKB登录号No.P08473)、CD29、CD38(ADP-核糖基环化酶；UniProtKB登录号No.P28907)和CD40(UniProtKB登录号No.P25942)是阳性的(在群水平上)。任选地，大多数细胞也表达CD90。二选一或组合，大多数细胞也表达以下的一或多种、在其它实施方案中2或更多种、在其它实施方案中3或更多种、在其它实施方案中全部4种：CD74(HLA II类组织相容性抗原γ链；UniProtKB登录号No.P04233)，CD106(血管细胞粘附蛋白1[VCAM]；UniProtKB登录号No.P19320)，CD274(程序性细胞死亡1配体1；UniProtKB登录号No.Q9NZQ7)和HLA-DR。如本文所用，“在群水平上”对于标志物表达阳性是指每种所示标志物的表达高于该特定标志物的指定阈值水平。二选一或组合地，所述细胞群在群水平上对于以下的一或多个、在其它实施方案中2或更多个、在其它实施方案中3或更多个、在其它实施方案中4或更多个、在其它实施方案中全部5个为至少40％阳性：CD42a(血小板糖蛋白IX；UniProtKB登录号No.P14770)，CD45Ra(CD45[蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型，C]的同种型；UniProtKB登录号No.P08575)，CD77(乳糖神经酰胺4-α-半乳糖基转移酶；UniProtKB登录号No.Q9NPC4)，CD243(多药耐药蛋白1；UniProtKB登录号No.P08183)和CD275(ICOS配体；UniProtKB登录号No.O75144)。在进一步的实施方案中，细胞群的至少40％对于CD9(UniProtKB登录号No.P21926)的表达是阴性的。在某些实施方案中，细胞群衍生自胎盘组织。这个段落中提及的所有UniProtKB条目均在2015年1月22日存取。在某些实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一且如本文所述在“经典的”MSC分化为骨细胞的条件下不分化为骨细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一并且如本文所述在MSC分化为脂肪细胞的条件下不分化为脂肪细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一，并且在MSC分别分化为骨细胞或脂肪细胞的条件下不分化为骨细胞或脂肪细胞。
在另一个实施方案中，提供了细胞群，其中细胞群的大多数在群水平上对于CD10、CD29、CD38和HLA-DR的表达是阳性的。任选地，大多数细胞也表达CD90。二选一或组合地，大多数细胞也表达CD74、CD106、CD274和CD40的一或多种、在其它实施方案中表达2或更多种、在其它实施方案中表达3或更多种、在其它实施方案中表达全部4种。二选一或组合地，细胞群在群水平上对于CD42a、CD45Ra、CD77、CD243和CD275的一或多个、在其它实施例中2或更多个、在其它实施例中3或更多个、在其它实施例中4或更多个、在其它实施例中全部5个的表达是至少40％阳性的。在进一步的实施方案中，至少40％的细胞群对CD9表达是阴性的。在某些实施方案中，细胞群衍生自胎盘组织。在某些实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一并且如本文所述在“经典的”MSC分化为骨细胞的条件下不分化为骨细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)前述标志物组合之一并且如本文所述在MSC分化为脂肪细胞的条件下不分化为脂肪细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一，并且在MSC分别分化为骨细胞或脂肪细胞的条件下不分化为骨细胞或脂肪细胞。
在另一个实施方案中，提供了细胞群，其中细胞群的大多数在群水平上对于CD10、CD29、CD38和CD74表达是阳性的。任选地，大多数细胞也表达CD90。二选一或组合地，大多数细胞还表达HLA-DR、CD106、CD274和CD40的一或者多种、在其它实施方案中2或者更多种、在其它实施方案中3或者更多种、在其它实施方案中全部4种。二选一或组合地，细胞群在群水平上对于CD42a、CD45Ra、CD77、CD243和CD275的一或者多个、在其它实施方案中2或者更多个、在其它实施方案中3或者更多个、在其它实施方案中4或者更多个、在其它实施方案中全部5个是至少40％阳性的。在进一步的实施方案中，至少40％的细胞群对CD9表达是阴性的。在某些实施方案中，细胞群衍生自胎盘组织。在某些实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一并且如本文所述在“经典”MSC分化为骨细胞的条件下不分化为骨细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)前述标志物组合之一并且如本文所述在MSC分化为脂肪细胞的条件下不分化为脂肪细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一，并且在MSC分别分化为骨细胞或者脂肪细胞的条件下不分化为骨细胞或者脂肪细胞。
在另一个实施方案中，提供了细胞群，其中细胞群的大多数在群水平上对于CD10、CD29、HLA-DR和CD74表达是阳性的。任选地，大多数细胞也表达CD90。二选一或组合地，大多数细胞还表达CD38、CD106、CD274和CD40的一或者多种、在其它实施方案中2或者更多种、在其它实施方案中3或者更多种、在其它实施方案中全部4种。二选一或组合地，细胞群在群水平上对于CD42a、CD45Ra、CD77、CD243和CD275的一个或者多个、在其它实施方案中2或者更多个、在其它实施方案中3或者更多个、在其它实施方案中4或者更多个、在其它实施方案中全部5个是至少40％阳性的。在进一步的实施方案中，至少40％的细胞群对CD9表达是阴性的。在某些实施方案中，细胞群衍生自胎盘组织。在某些实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一并且如本文所述在“经典”MSC分化为骨细胞的条件下不分化为骨细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)前述标志物组合之一并且如本文所述在MSC分化为脂肪细胞的条件下不分化为脂肪细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一，并且在MSC分别分化为骨细胞或者脂肪细胞的条件下不分化为骨细胞或者脂肪细胞。
在另一个实施方案中，提供了细胞群，其中细胞群的大多数在群水平上对于CD10、CD29、HLA-DR、CD38和CD74表达是阳性的。任选地，大多数细胞也表达CD90。二选一或组合地，大多数细胞还表达CD106、CD274和CD40的一或者多种、在其它实施方案中2或者更多种、在其它实施方案中所有3种。二选一或组合地，细胞群在群水平上对于CD42a、CD45Ra、CD77、CD243和CD275的一或者多个、在其它实施方案中2或者更多个、在其它实施方案中3或者更多个、在其它实施方案中4或者更多个、在其它实施方案中全部5个是至少40％阳性的。在进一步的实施方案中，至少40％的细胞群对CD9表达是阴性的。在某些实施方案中，细胞群衍生自胎盘组织。在某些实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一并且如本文所述在“经典”MSC分化为骨细胞的条件下不分化为骨细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)前述标志物组合之一并且如本文所述在MSC分化为脂肪细胞的条件下不分化为脂肪细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一，并且在MSC分别分化为骨细胞或者脂肪细胞的条件下不分化为骨细胞或者脂肪细胞。
在其它实施方案中，提供了细胞群，其中至少30％、在其它实施方案中至少40％、在其它实施方案中至少50％、在其它实施方案中至少60％、在其它实施方案中至少70％、在其它实施方案中至少80％、在其它实施方案中至少90％的细胞在个体水平对于CD10、CD29、CD38和CD40表达是阳性的。在其它实施方案中，提供了对CD10、CD29、CD38和CD40的表达呈阳性的细胞。任选地，表达CD10、CD29、CD38和CD40的细胞也表达CD90。二选一或组合地，表达CD10、CD29、CD38和CD40的细胞也表达CD74、CD106、CD274和HLA-DR的一或者多种、在其它实施方案中2或者更多种、在其它实施方案中3或者更多种、在其它实施方案中全部4种。二选一或组合地，表达CD10、CD29、CD38和CD40的细胞也表达CD42a、CD45Ra、CD77、CD243和CD275的一或者多种、在其它实施方案中2或者更多种、在其它实施方案中3或者更多种、在其它实施方案中4或者更多种、在其它实施方案中表达全部5种。在进一步的实施方案中，表达CD10、CD29、CD38和CD40的细胞也不表达CD9。在某些实施方案中，细胞源自胎盘组织。在某些实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一并且如本文所述在“经典”MSC分化为骨细胞的条件下不分化为骨细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)前述标志物组合之一并且如本文所述在MSC分化为脂肪细胞的条件下不分化为脂肪细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一，并且在MSC分别分化为骨细胞或者脂肪细胞的条件下不分化为骨细胞或者脂肪细胞。
在其它实施方案中，提供了细胞群，其中至少30％、在其它实施方案中至少40％、在其它实施方案中至少50％、在其它实施方案中至少60％、在其它实施方案中至少70％、在其它实施方案中至少80％，在其它实施方案中至少90％的细胞在个体水平对于CD10、CD29、CD38和HLA-DR表达是阳性的。在其它实施方案中，提供了对CD10、CD29、CD38和HLA-DR表达呈阳性的细胞。任选地，表达CD10、CD29、CD38和HLA-DR的细胞也表达CD90。二选一或组合地，表达CD10、CD29、CD38和HLA-DR的细胞也表达CD74、CD106、CD274和CD40的一或者多种、在其它实施方案中2或者更多种、在其它实施方案中3或者更多种、在其它实施方案中所有4种。二选一或组合地，表达CD10、CD29、CD38和HLA-DR的细胞也表达CD42a、CD45Ra、CD77、CD243和CD275的一或者多种、在其它实施方案中2或者更多种、在其它实施方案中3或者更多种、在其它实施方案中4或者更多种、其它实施方案全部5种。在进一步的实施方案中，表达CD10、CD29、CD38和HLA-DR的细胞也不表达CD9。在某些实施方案中，细胞群衍生自胎盘组织。在某些实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一并且如本文所述在“经典”MSC分化为骨细胞的条件下不分化为骨细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)前述标志物组合之一并且如本文所述在MSC分化为脂肪细胞的条件下不分化为脂肪细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一，并且在MSC分别分化为骨细胞或者脂肪细胞的条件下不分化为骨细胞或者脂肪细胞。
在其它实施方案中，提供了细胞群，其中至少30％、在其它实施方案中至少40％、在其它实施方案中至少50％、在其它实施方案中至少60％、在其它实施方案中至少70％、在其它实施方案中至少80％、在其它实施方案中至少90％的细胞在个体水平上对于CD10、CD29、CD38和CD74表达是阳性的。在其它实施方案中，提供了对CD10、CD29、CD38和CD74表达呈阳性的细胞。任选地，表达CD10、CD29、CD38和CD74的细胞也表达CD90。二选一或组合地，表达CD10、CD29、CD38和CD74的细胞也表达HLA-DR、CD106、CD274和CD40的一或者多种、在其它实施方案中2或者更多种、在其它实施方案中3或者更多种、在其它实施方案中所有4种。二选一或组合地，表达CD10、CD29、CD38和CD74的细胞也表达CD42a、CD45Ra、CD77、CD243和CD275的一或者多种、在其它实施方案中2或者更多种、在其它实施方案中3或者更多种、在其它实施方案中4或者更多种、在其它实施方案中全部5种。在进一步的实施方案中，表达CD10、CD29、CD38和CD74的细胞也不表达CD9。在某些实施方案中，细胞群衍生自胎盘组织。在某些实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一并且如本文所述在“经典”MSC分化为骨细胞的条件下不分化为骨细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)前述标志物组合之一并且如本文所述在MSC分化为脂肪细胞的条件下不分化为脂肪细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一，并且在MSC分别分化为骨细胞或者脂肪细胞的条件下不分化为骨细胞或者脂肪细胞。
在其它实施方案中，提供了细胞群，其中至少30％、在其它实施方案中至少40％、在其它实施方案中至少50％、在其它实施方案中至少60％、在其它实施方案中至少70％、在其它实施方案中至少80％、在其它实施方案中至少90％的细胞在个体水平上对于CD10、CD29、HLA-DR和CD74表达是阳性的。在其它实施方案中，提供了对CD10、CD29、HLA-DR和CD74表达呈阳性的细胞。任选地，表达CD10、CD29、HLA-DR和CD74的细胞也表达CD90。二选一或组合地，表达CD10、CD29、HLA-DR和CD74的细胞也表达CD38、CD106、CD274和CD40的一或者多种、在其它实施方案中2或者更多种、在其它实施方案中3或者更多种、在其它实施方案中所有4种。二选一或组合地，表达CD10、CD29、HLA-DR和CD74的细胞也表达CD42a、CD45Ra、CD77、CD243和CD275的一或者多种、在其它实施方案中2或者更多种、在其它实施方案中3或者更多种、在其它实施方案中4或者更多种、在其它实施方案全部5种。在进一步的实施方案中，表达CD10、CD29、HLA-DR和CD74的细胞也不表达CD9。在某些实施方案中，细胞群衍生自胎盘组织。在某些实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一并且如本文所述在“经典”MSC分化为骨细胞的条件下不分化为骨细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)前述标志物组合之一并且如本文所述在MSC分化为脂肪细胞的条件下不分化为脂肪细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一，并且在MSC分别分化为骨细胞或者脂肪细胞的条件下不分化为骨细胞或者脂肪细胞。
在其它实施方案中，提供了细胞群，其中至少30％、在其它实施方案中至少40％、在其它实施方案中至少50％、在其它实施方案中至少60％、在其它实施方案中至少70％、在其它实施方案中至少80％、在其它实施方案中至少90％的细胞在个体水平上对于CD10、CD29、HLA-DR、CD38和CD74表达是阳性的。在其它实施方案中，提供了对CD10、CD29、HLA-DR、CD38和CD74的表达呈阳性的细胞。任选地，表达CD10、CD29、HLA-DR、CD38和CD74的细胞也表达CD90。二选一或组合地，表达CD10、CD29、HLA-DR、CD38和CD74的细胞也表达CD106、CD274和CD40的一或者多种、在其它实施方案中2或者更多种、在其它实施方案中全部3种。二选一或组合地，表达CD10、CD29、HLA-DR、CD38和CD74的细胞也表达CD42a、CD45Ra、CD77、CD243和CD275的一或者多种、在其它实施方案中2或者更多种、在其它实施方案中3或者更多种、在其它实施方案中4或者更多种、在其它实施方案中所有5种。在进一步的实施方案中，表达CD10、CD29、HLA-DR、CD38和CD74的细胞也不表达CD9。在某些实施方案中，细胞群衍生自胎盘组织。在某些实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一并且如本文所述在“经典”MSC分化为骨细胞的条件下不分化为骨细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)前述标志物组合之一并且如本文所述在MSC分化为脂肪细胞的条件下不分化为脂肪细胞。在其它实施方案中，细胞表达(和/或缺乏)上述标志物组合之一，并且在MSC分别分化为骨细胞或者脂肪细胞的条件下不分化为骨细胞或者脂肪细胞。
在各个实施方案中，提供了包含任何上述细胞群的培养物，或者在其它实施方案中提供了包含所述培养物的生物反应器。在一些实施方案中，所述生物反应器进一步包含合成的三维基质。在其它实施方案中，提供了包含任何上述细胞群的悬浮液。在某些实施方案中，所述悬浮液包含药学上可接受的赋形剂。在其它实施方案中，所述悬浮液是药物组合物。在其它实施方案中，所述悬浮液是冷冻的，在一些实施方案中进一步包含冷冻保护剂。在其它实施方案中，提供了包含任何上述细胞群的组合物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在进一步的实施方案中，所述赋形剂是冷冻保护剂，或者是载体蛋白。二选一或另外，所述组合物是冷冻的。在这方面，每个上述细胞群均代表一个单独的实施方案。
本发明还提供了由所述改性的ASC分泌的细胞外囊泡，例如外泌体。分离细胞外囊泡的方法是本领域熟知的，包括例如免疫磁性分离，例如Clayton A et al,2001、MathiasRA et al,2009及Crescitelli R et al,2013描述。
在一些实施方案中，从ASC已经在其中温育的生物反应器中收获囊泡。二选一或另外，将细胞冷冻保存，然后解冻，之后分离囊泡。在一些实施方案中，在解冻后，将细胞在2D培养物中培养，从中收获囊泡。在某些实施方案中，2D培养是在存在炎性细胞因子条件进行，所述炎性细胞因子在各个实施方案中可以是本文提及的任何细胞因子。
药物组合物
本发明另外提供了药物组合物，其包含所述改性的ASC或者细胞群。
在其它实施方案中提供了药物组合物，其包含所述外泌体。
本发明还提供了衍生自所述方法的条件培养基(CM)，并且在其它实施方案中提供了包含所述CM的药物组合物。本领域技术人员意识到在某些实施方案中，各种生物反应器可用于制备CM，包括但不限于活塞流生物反应器和固定床生物反应器(Kompier R etal.Use of a stationary bed reactor and serum-free medium for the productionof recombinant proteins in insect cells.Enzyme Microb Technol.1991.13(10):822-7.)。例如，CM是作为所述细胞扩增方法的副产物产生的。生物反应器中的CM可以从生物反应器中移出或以其它方式分离。在其它实施方案中，将所述改性的ASC从生物反应器中移出并在另一装置(其非限制性实例是组织培养装置)中温育，并收集来自细胞的CM。
在一些实施方案中，所述细胞、CM或外泌体可以作为药物组合物的一部分施用，所述药物组合物进一步包含一或多种药学上可接受的载体。在下文中，术语“药学上可接受的载体”是指载体或稀释剂。在一些实施方案中，载体或稀释剂不会对对象造成明显刺激，且不会消除施用的细胞的生物活性和性质。载体的实例包括但不限于丙二醇、盐水、乳剂及有机溶剂与水的混合物。在一些实施方案中，药物载体是盐水溶液。在其它实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在进一步的实施方案中，所述赋形剂是冷冻保护剂，或是载体蛋白。二选一或另外，所述组合物是冷冻的。
在其它实施方案中，本发明提供的组合物包含ASC或CM组合赋形剂如药学上可接受的赋形剂。在进一步的实施方案中，所述赋形剂是渗透保护剂或冷冻保护剂，其是保护细胞免受冷冻和冰形成的破坏作用的制剂，在一些实施方案中可以是渗透化合物，其非限制性实例是二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、甲酰胺、丙二醇、聚乙二醇、乙酰胺、丙二醇和侧金盏花醇；或者在其它实施方案中可以是非渗透性化合物，其非限制性实例是乳糖、棉子糖、蔗糖、海藻糖和d甘露醇。在其它实施方案中，存在渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂。在其它实施方案中，所述赋形剂是载体蛋白，其非限制性实例是白蛋白。在其它实施方案中，存在渗透保护剂和载体蛋白；在某些实施方案中，渗透保护剂和载体蛋白可以是相同的化合物。二选一或另外，所述组合物是冷冻的。所述细胞可以是本文提及的ASC的任何实施方案，其每一个都被认为是单独的实施方案。
由于非自体细胞在某些情况下在给对象施用时可诱导免疫反应，因此可以根据本发明提供的方法使用一些方式降低非自体细胞排斥的可能性。在一些实施方案中，这些方法包括在移植前抑制受体免疫系统或将非自体细胞包封在免疫分离的半透膜中。在一些实施例中，无论ASC自身是否植入宿主中，都可以进行此操作。例如，在各个实施方案中，大多数细胞在植入后可以不存活超过3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天，或超过14天。
可用于本发明提供的方法和组合物中的免疫抑制剂的实例包括但不限于氨甲蝶呤、环磷酰胺、环孢菌素、环孢菌素A、氯喹、羟氯喹、柳氮磺胺吡啶(sulphasalazopyrine)、金盐、D-青霉胺、来氟米特、硫唑嘌呤、阿那白滞素、英夫利昔单抗(REMICADE)、依那西普、TNF-α阻断剂、拮抗一或多种炎性细胞因子的生物学剂，以及非甾体抗炎药(NSAID)。NSAID的实例包括但不限于乙酰水杨酸、水杨酸胆碱镁、二氟尼柳、水杨酸镁、水杨酰水杨酸、水杨酸钠、双氯芬酸、乙哚乙酸、非诺洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸(meclofenamate)、萘普生、萘普酮、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美汀、对乙酰氨基酚、布洛芬、Cox-2抑制剂和曲马多。
在各个实施方案中，可以以全身方式施用所述药物组合物(如上文详述)。或者，可以局部施用所述药物组合物，例如通过将药物组合物直接注射到患者受影响的组织区域中。在其它实施方案中，细胞通过静脉内(IV)、血管内、皮下(SC)或腹膜内(IP)途径施用，其每一种被认为是单独的实施方案。在其它实施方案中，所述药物组合物在淋巴管内施用，例如如并入本文作参考的名称为Eleuterio Lombardo and Dirk Buscher的美国专利No.8,679,834所述。
在其它实施方案中，对于注射，可以将所述细胞以水性溶液配制，例如在生理上相容的缓冲液如Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理盐水缓冲液，任选地组合含有冷冻保存剂的介质。
对于在所述方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量最初可以从体外和细胞培养测定中估算。通常，在动物模型中配制剂量以达到所需的浓度或滴度。这些信息可用于更准确地确定人体中的有效剂量。
本发明所述活性成分的毒性和治疗效力可以通过体外标准药学程序、细胞培养或者实验动物确定。
从这些体外和细胞培养测定及动物研究中获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。所述剂量可根据使用的剂型和施用途径而变化。在一些实施方案中，精确的配制、施用途径和剂量可以由各个医师根据患者的状况加以选择。
根据待治疗病症的严重程度和反应性，施用可以是单次施用，或者在其它实施方案中可以是多次施用，治疗过程持续数天至数周，或者在其它实施方案中直至达到疾病状态缓解。
在某些实施方案中，在施用后，大多数细胞、在其它实施方案中超过60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或者超过99％的细胞在施用后1个月内在对象体内不再能检测到。
也可以制备包括在相容的药学载体中配制的所述制备物的组合物，置于合适容器中，并且标记治疗指征。
如果需要，所述组合物可以包装在附有施用说明书的容器中。所述容器也可以提供有管理药物生产、使用或销售的政府机构规定的表格形式的与容器相关的商品描述(notice)，该商品描述反映了所述组合物形式或者人用或者兽用的许可。例如，这种商品描述可以是美国食品和药物管理局批准的处方药标签或合格产品插页。
在一些实施方案中，所述ASC适当地配制成药物组合物，其可适当地包装为制品。这种制品包括包装材料，其包含描述用于如本文所述治疗免疫介导的或者循环的病症的应用的标签。在其它实施方案中，药剂包含在包装材料内，其中所述药剂有效治疗免疫介导的或者循环的病症。在一些实施方案中，所述药物组合物是冷冻的。
在一些实施方案中，单独使用的所述ASC的典型剂量范围可以是每次施用大约1千万至大约5亿个细胞。例如，在一些实施方案中，所述剂量可以是1千万、2千万、3千万、4千万、5千万、6千万、7千万、8千万、9千万、1亿、1.25亿、1.5亿、1.75亿、2亿、2.25亿、2.5亿、2.75亿、3亿、3.25亿、3.5亿、3.75亿、4亿、4.25亿、4.5亿、4.75亿或者5亿个细胞或者这些数字之间的任何数量。进一步应理解，可以使用的粘附基质细胞的范围包括大约1千万至大约5亿个细胞、大约1千万至大约4亿个细胞，大约1千5百万至大约3亿个细胞。因此，本方面揭示了治疗方法，所述方法包括给对象施用治疗或者预防有效量的ASC，其中给对象施用的剂量是1千万、2千万、3千万、4千万、5千万、6千万、7千万、8千万、9千万、1亿、1.25亿、1.5亿、1.75亿、2亿、2.25亿、2.5亿、2.75亿、3亿、3.25亿、3.5亿、3.75亿、4亿、4.25亿、4.5亿、4.75亿或者5亿个细胞，或者在其它实施方案中施用1千5百万至3亿个细胞。在各个实施方案中，ASC、包含ASC的组合物和/或使用ASC生产的药物可以注射1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、1-10、1-15、1-20、2-10、2-15、2-20、3-20、4-20、5-20、5-25、5-30、5-40或5-50次或更多次施用。
在各个实施方案中，本发明提供了在有需要的对象中治疗、改善、抑制或者预防免疫介导的疾病的方法，包括给对象施用包含所述改性的ASC的药物组合物的步骤。本发明还提供了用于治疗、改善、抑制或者预防免疫介导的疾病的组合物，其包含所述改性的ASC。另外本发明提供了所述改性的ASC在制备用于治疗、改善、抑制或者预防免疫介导的疾病的药物中的应用。在某些实施方案中，免疫介导的疾病是自身免疫疾病，而在其它实施方案中免疫介导的疾病不是自身免疫疾病。在其它实施方案中，免疫介导的疾病的特征在于慢性炎症。
在一些实施方案中，免疫介导的疾病选自类风湿性关节炎、类风湿性脉管炎、多发性硬化症(MS)、移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、重症肌无力(MG)、格林-巴利综合征(GBS)、桥本氏甲状腺炎(HT)、格雷夫斯病、1型糖尿病(T1DM)、炎症性肠病(包括例如溃疡性结肠炎和克罗恩病)、哮喘、慢性炎症(包括例如胰腺炎和非传染性肝炎)、银屑病、过敏症、系统性红斑狼疮(SLE)、特发性肺纤维化(IPF)、斑秃(包括例如斑秃，全秃(alopecia areata totalis)及普秃(alopecia areata universalis))、原发性硬化性胆管炎(PSC)和结节病。在各个实施方案中，所述疾病可以是主要由B细胞介导的疾病(例如SLE)，主要由T细胞介导的疾病，或者显著涉及B细胞和T细胞的疾病。
在某些实施方案中，免疫介导的疾病是视神经脊髓炎(NMO)。NMO可被描述为CNS的慢性炎性脱髓鞘疾病，其通常与血清抗水通道蛋白4(AQP4)抗体相关。症状可包括急性失明和下肢轻瘫或者四肢轻瘫，通常伴有感觉和括约肌损伤。NMO的动物模型在本领域中是熟知的，例如在实施例20中描述。
二选一或另外，对视神经炎(ON)进行治疗。ON可以被描述为视神经的炎症，如果不治疗通常导致永久性视力丧失。ON的动物模型在本领域中是熟知的，例如在实施例20中描述。
在某些实施方案中，免疫介导的疾病是硬皮病，在各个实施方案中可以是局限性硬皮病或者系统性硬化症(SSc)。在更特别的实施方案中，SSc可以是有限的皮肤SSc、弥散性皮肤SSc或者有限的SSc。硬皮病的特征在于胶原蛋白和其它细胞外基质蛋白的广泛沉积。本领域技术人员意识到硬皮病的血清学标志物包括升高的红细胞沉降率(ESR)；类风湿因子(RF)，其在30-40％的病例中是阳性的；抗核抗体(ANA)，存在于35-96％的病例中，抗SCL-70(30-70％的病例，特别是在弥漫性疾病中)，抗着丝粒抗体(20-40％的病例，特别是在限制性疾病(limited disease)中)，以及抗拓扑异构酶I抗体。硬皮病的动物模型是本领域熟知的，例如在实施例21中描述。
其它炎症和自身免疫疾病的动物模型也是本领域熟知的，例如炎症领域中IPF的博来霉素暴露(Wang Z等人及其中引用的参考文献)和斑秃的C3H/HeJ近交小鼠(Silva KA等人和参考文献)；自身免疫领域中的胶原诱导的类风湿性关节炎(Talaat RM等人及其中引用的参考文献)和超氧化物歧化酶A诱导结节病(Swaisgood CM等人及其中引用的参考文献)。
在其它实施方案中，提供了在有需要的对象中治疗、改善、抑制或者预防免疫介导的疾病的方法，包括给对象施用包含所述CM的药物组合物的步骤。本发明还提供了用于治疗、改善、抑制或者预防免疫介导的疾病的包含所述CM的组合物。本发明另外提供了所述CM在制备用于治疗、改善、抑制或者预防免疫介导的疾病的药物中的应用。在某些实施方案中，所述免疫介导的疾病是自身免疫疾病，在其它实施方案中所述免疫介导的疾病不是自身免疫疾病。在其它实施方案中所述免疫介导的疾病的特征在于慢性炎症。
在其它实施方案中，提供了在有需要的对象中治疗、改善、抑制或者预防免疫介导的疾病的方法，包括给对象施用包含所述外泌体的药物组合物的步骤。本发明还提供了治疗、改善、抑制或者预防免疫介导的疾病的包含所述外泌体的组合物。本发明另外提供了所述外泌体在制备用于治疗、改善、抑制或者预防免疫介导的疾病的药物中的应用。在某些实施方案中，所述免疫介导的疾病是自身免疫疾病，在其它实施方案中所述免疫介导的疾病不是自身免疫疾病。在其它实施方案中，所述免疫介导的疾病的特征在于慢性炎症。
本发明还提供了在有需要的对象中治疗或者在其它实施方案中抑制移植排斥的方法，包括给对象施用包含所述改性的ASC的药物组合物的步骤。本发明还提供了治疗或者在其它实施方案中抑制有需要的对象的移植排斥的包含所述改性的ASC的组合物。本发明另外提供了所述改性的ASC在制备用于治疗或者抑制移植排斥的药物中的应用。
在其它实施方案中，提供了在有需要的对象中治疗或者在其它实施方案中抑制移植排斥的方法，包括给对象施用包含所述外泌体的药物组合物的步骤。本发明还提供了治疗或者抑制移植排斥的包含所述外泌体的组合物。本发明另外提供了所述外泌体在制备用于治疗或者抑制移植排斥的药物中的应用。
在其它实施方案中，提供了治疗或者在其它实施方案中抑制有需要的对象的移植排斥的方法，包括给对象施用包含所述CM的药物组合物的步骤。本发明还提供了治疗或者抑制移植排斥的包含所述CM的组合物。本发明另外提供了所述CM在制备用于治疗或者抑制移植排斥的药物中的应用。
本文还提供了治疗有需要的对象的局部缺血的方法，包括给对象施用包含所述改性的ASC的药物组合物的步骤。本发明还提供了治疗有需要的对象的局部缺血的包含所述改性的ASC的组合物。本发明另外提供了所述改性的ASC在制备用于治疗局部缺血的药物中的应用。
根据本分明公开，本领域技术人员意识到所述改性的ASC可用于治疗局部缺血，在更特别的实施方案中用于治疗外周缺血、严重肢体缺血(CLI)、下肢缺血、缺血性血管疾病、肾脏血管疾病、缺血性心脏病、心肌缺血、冠状动脉疾病(CAD)、动脉粥样硬化性心血管疾病、左主冠状动脉疾病、动脉闭塞性疾病、外周缺血、周围血管疾病、动脉硬化、缺血性脑病、中风、脑缺血、血管疾病、Buerger's病、缺血性肾病和/或胎盘缺血(ischemic placenta)。
在其它实施方案中，提供了治疗有需要的对象的局部缺血的方法，包括给对象施用包含所述外泌体的药物组合物的步骤。本发明还提供了用于治疗局部缺血的包含所述外泌体的组合物。本发明另外提供了所述外泌体在制备用于治疗局部缺血的药物中的应用。
在其它实施方案中，提供了治疗有需要的对象的局部缺血的方法，包括给对象施用包含所述CM的药物组合物的步骤。本发明还提供了用于治疗局部缺血的包含所述CM的组合物。本发明另外提供了所述CM在制备用于治疗局部缺血的药物中的应用。
本发明还提供了在有需要的对象中治疗心肌梗塞(MI)的方法，包括给对象施用包含所述改性的ASC的药物组合物的步骤。本发明还提供了用于治疗有需要的对象的MI的包含所述改性的ASC的组合物。本发明另外提供了所述改性的ASC在制备用于治疗MI的药物中的应用。在某些实施方案中，所述MI是急性MI。
本发明还提供了在有需要的对象中诱导或者在其它实施方案中增强血管生成的方法，包括给对象施用包含所述改性的ASC的药物组合物的步骤。本发明还提供了在有需要的对象中诱导或者增强血管生成的包含所述改性的ASC的组合物。本发明另外提供了所述改性的ASC在制备用于诱导或者增强血管生成的药物中的应用。
在其它实施方案中，提供了在有需要的对象中刺激血管发生的方法，包括给对象施用包含所述外泌体的药物组合物的步骤。本发明还提供了刺激血管生成的包含所述外泌体的组合物。本发明另外提供了所述外泌体在制备用于刺激血管生成的药物中的应用。
本发明还提供了在有需要的对象中增强造血干细胞(HSC)再建群的方法，包括给对象施用包含所述改性的ASC的药物组合物的步骤。本发明还提供了在有需要的对象中增强HSC植入的包含所述改性的ASC的组合物。本发明另外提供了所述改性的ASC在制备用于增强HSC植入的药物中的应用。根据本发明公开，本领域技术人员意识到所述改性的ASC可用于增强HSC植入，在更特别的实施方案中，HSC植入可以在辐射诱导的骨髓消融、化疗或者意外辐射暴露之后使用。
本发明还提供了在有需要的对象中增强外源性HSC植入的方法，包括给对象施用包含所述改性的ASC的药物组合物的步骤。本发明还提供了增强有需要的对象中的外源HSC植入的包含所述改性的ASC的组合物。本发明另外提供了所述改性的ASC在制备用于增强外源HSC植入的药物中的应用。根据本发明公开，本领域技术人员意识到所述改性的ASC可用于增强外源HSC植入，例如减少植入时间和/或成功植入所需的细胞数量。本领域技术人员意识到，例如用脐带血移植获得的相对少量的细胞可能限制该方法的有效性。在更特别的实施方案中，所述治疗可以在辐射诱导的骨髓消融、化疗或者意外辐射暴露之后进行。
在某些实施方案中，ASC能够支持受体的内源性造血系统的再建群而无需进一步共移植HSC，或者在其它实施方案中能增强外源性HSC植入。在各个实施例中，这种增强在宿主中可以有或无ASC自身移植的条件下实现。例如，在各个实施方案中，所述细胞可以支持红细胞、白细胞和/或血小板的再建群，而其自身不会存活超过3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或者超过14天。
其它实施方案中，提供了在有需要的对象中增强外源性HSC植入的方法，或者在其它实施方案中支持内源性造血系统的再建群的方法，包括给对象施用包含所述外泌体的药物组合物的步骤。本发明还提供了包含所述外泌体的增强外源HSC植入的组合物或者在其它实施方案中支持内源性造血系统再建群的组合物。本发明另外提供了所述外泌体在制备增强外源性HSC植入或者在其它实施方案中支持内源性造血系统的再建群的药物中的应用。
本发明还提供了在有需要的对象中抑制纤维化的方法，包括给对象施用包含所述改性的ASC的药物组合物的步骤。本发明还提供了在有需要的对象中抑制纤维化的包含所述改性的ASC的组合物。本发明另外提供了所述改性的ASC在制备用于抑制纤维化的药物中的应用。在某些实施方案中，所述纤维化是身体组织的过度生长、硬化或者瘢痕形成。二选一或另外，所述纤维化可由细胞外基质成分例如胶原的过量沉积引起。在一些实施方案中，所述纤维化是肺纤维化，其非限制性实例是特发性肺纤维化。在其它实施方案中，所述纤维化继发于间质性肺炎、囊性纤维化、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、炎性肺病、肺部感染、放射性肺炎、胶原疾病相关的间质性肺炎及药物诱发的间质性肺炎(IIP)，其具体实例包括非特异性间质性肺炎(NSIP)、隐源性机化性肺炎(COP/BOOP)、急性间质性肺炎(AIP)、脱屑性间质性肺炎(DIP)、呼吸性细支气管炎相关的间质性肺炎(RB-ILD)和淋巴细胞间质性肺炎(LIP)。
清楚的是，所述ASC的每个实施方案可以与关于治疗方法或药物组合物的每个实施方案自由组合。
此外，所述外泌体的每个实施方案可以与关于治疗方法或者药物组合物的每个实施方案自由组合。
在其它实施方案中，所述CM用于任何所述治疗方法中。CM的每个实施方案可以与关于治疗方法或者药物组合物的每个实施方案自由组合。
对象和施用途径
在某些实施方案中，通过所述方法和组合物治疗的对象是人。在其它实施方案中，所述对象可以是动物。在某些实施方案中，可以给所述对象施用另外的治疗剂或者细胞。
在某些实施方案中，所述ASC或者组合物通过肌肉内、皮下或者全身施用。在这方面，“肌肉内”施用是指施用至对象的肌肉组织内；“皮下”施用是指在皮肤下施用；“静脉内”施用是指施用至对象的静脉内。
本发明还揭示了试剂盒和制品，其涉及用于实施本发明的方法的试剂。所述试剂盒和制品可包括本文讨论的或者在实施揭示的方法中被理解为需要或者有益的任何试剂或试剂组合，包括粘附基质细胞。另一方面，所述试剂盒和制品可包含例如治疗免疫介导的或者循环障碍或者本文提及的其它治疗指征的标签、说明书和包装材料，。
通过对如下非限制性实施例的检验，本领域普通技术人员将显而易见本发明的其它目的、优点和新特点。另外，如上文描述的和如下文权利要求部分中要求的本发明的各个实施方案和方面中的每一个在以下实施例中得以实验性支持。
实施例
现在参考以下实施例，其与以上描述一起以非限制性方式说明某些实施方案。
实施例1：粘附基质细胞的产生和培养
概述:最终细胞产物的生产过程包括2个阶段：
阶段1，中间细胞原种(ICS)生产，包括如下步骤：
1.从胎盘中提取ASC，
2.细胞进行二维生长直至12次群体倍增，
3.细胞浓缩、配制、填充及低温贮存。
阶段2，解冻ICS并进一步培养，包括如下步骤：
1.解冻的ICS进行二维生长直至8次另外的倍增，
2.在生物反应器中细胞进行三维生长，直至10次另外倍增，从生物反应器中收获细胞，
3.后续处理：细胞浓缩、洗涤、配制、填充和低温贮存。
所述程序包括定期检测生长培养基的无菌性和污染。
ICS的生产
步骤1-1：粘附基质细胞(ASC)的提取
胎盘来自35岁以下供体，她们预先经筛选并确定为乙型肝炎、丙型肝炎、HIV-1和HIV-2、HTLV-1和HTLV-2以及梅毒阴性。将供体胎盘保持无菌并冷却直至开始提取程序。
在分娩4小时内，将胎盘放置为面对母体侧朝上，将其切块(大小约1cm3)，用含有庆大霉素的等渗缓冲液彻底洗涤。
·将洗过的块与胶原酶和DNAse在等渗缓冲液中温育1-3小时
·加入补加了庆大霉素的培养基(DMEM，10％过滤的FBS和L-谷氨酰胺)，并将消化的组织粗略过滤通过无菌不锈钢筛并离心。
·将细胞悬浮于培养基中，接种于培养瓶中，并在补充了5％CO2的湿润条件下在组织培养仪中在37℃温育。
·2-3天后，用磷酸缓冲盐水(PBS)将细胞洗涤细，更换培养基。
·在第一次传代之前将细胞再温育4-5天。
步骤1-2：最初的2D培养
·传代1：使用胰蛋白酶分离细胞，离心并以3.5±0.5×103个细胞/cm2培养密度接种于在组织培养瓶中没有庆大霉素的培养基中。
·后续传代：当培养物达到60-90％铺满时，如上所述传代细胞。
步骤1-3：细胞浓缩、洗涤、配制、填充和低温贮存
最后一次传代后，将所得细胞悬浮液离心并重悬于培养基中，终浓度为20-40×106个细胞/毫升(mL)。用2D冷冻溶液(20％DMSO，80％FBS)将所述细胞悬浮液以1:1稀释，并将细胞在10％DMSO、45％FBS和45％DMEM中冷冻保存。在控制速率的冷冻机中降温(以1℃/分钟降至-80℃，随后以5℃/分钟降至-120℃)，将细胞贮存在液氮冷冻仪中以产生ICS。
细胞产物的生产
步骤2-1:额外的二维(2D)细胞培养
将ICS解冻，用培养基稀释，并培养直至10次额外的倍增，当达到60-90％铺满时传代，然后收获以接种在生物反应器中。
步骤2-2:在生物反应器中三维(3D)细胞生长
用所述细胞悬浮液接种1或2个生物反应器。每个生物反应器包含由聚酯和聚丙烯制成的载体(New Brunswick Scientific)和培养基。将170×106个细胞接种于每个2.8升生物反应器中。
将生物反应器中的培养基保持在以下条件：温度：37±1℃，溶解氧(DO)：70±10％，pH 7.4±0.2。如通过控制系统所确定的提供过滤的气体(空气，CO2，N2和O2)以维持目标DO和pH值。
接种后，通过在24小时以逐步增加至150-200RPM的速度搅拌培养基。在接种后若干小时开始灌注并每天调整以保持葡萄糖浓度恒定在大约550mg/L。
在生长期结束时(大约第6天)进行细胞收获。用预热的无菌PBS洗涤生物反应器1分钟，分离细胞。发现90％的细胞是母体来源的细胞。
步骤2-3:后续处理：细胞浓缩，洗涤，配制，填充和低温贮存
在一些实验中，将细胞悬浮液进行浓缩和洗涤，使用悬浮液(5％w/v人血清白蛋白[HSA]于等渗溶液中)作为洗涤缓冲液，用2×的3D-冷冻溶液(20％DMSO v/v和5％HSA w/v于等渗溶液中)以1:1稀释至浓度为10-20×106个细胞/ml。逐渐降低培养小瓶的温度，并将培养小瓶贮存在气相液氮冷冻仪中。
实施例2:骨细胞和脂肪细胞分化测定
方法
骨髓(BM)粘附细胞：BM粘附细胞得自经历心脏直视手术或BM活组织检查的血液学健康供体的抽吸的胸骨骨髓。将骨髓抽吸物在HBSS中稀释3倍并进行Ficoll-Hypaque(Robbins Scientific Corp.Sunnyvale，CA)密度梯度离心。之后，收集骨髓单个核细胞(<1.077gm/cm3)，在HBSS中洗涤3次，并重悬于生长培养基[DMEM(Biological Industries，Beit HaEmek，Israel)，补加10％FCS(GIBCO BRL)，10-4M巯基乙醇(Merck，White HouseStation，NJ)，Pen-Strep-Nystatin混合物(100U/ml:100μg/ml:1.25un/ml；Beit HaEmek)，2mM L-谷氨酰胺(Beit HaEmek)]中。将来自各个供体的细胞分别在组织培养瓶(Corning，Acton，MA)中在37℃(5％CO2)温育，每周更换培养基。每3-4天使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Beit HaEmek)传代细胞。传代2-40代后，当达到60-80％铺满时，收集细胞用于分析。
表1：骨生成培养基成分
<u>成分</u> <u>原液浓度</u> <u>量</u> <u>终浓度</u>
DMEM低葡萄糖(Invitrogen,Gibco) 8.7ml 87％
血清(加热失活) 1ml 10％
地塞米松 1mM 1μl 0.1μM
抗坏血酸-2-磷酸盐溶液 0.1M 20μl 0.2mM
甘油-2-磷酸盐溶液 1M 100μL 10mM
L-谷氨酰胺 X 100 100μl X 1
Pen&Strep X 100 100μl X 1
骨生成诱导
将衍生自胎盘的细胞或衍生自BM的细胞铺板(200,000个细胞/孔)于孔中1ml生长培养基中，所述培养基包含DMEM(Invitrogen，Gibco)、10％FCS(Invitrogen，Gibco)、2mML-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)、45μg/ml庆大霉素-IKA(Teva Medical)和0.25μg/ml两性霉素(Invitrogen，Gibco)，所述孔用含有12μg/ml玻连蛋白和12μg/ml胶原蛋白的包被混合物包被，其由Millipore间充质干细胞骨生成试剂盒提供。在加入骨生成分化培养基之前，使细胞生长至100％铺满(通常过夜培养)。
在分化第1天，抽吸出生长培养基并用1ml骨生成诱导培养基替换，每2-3天将其用新鲜培养基替换，共14-17天。固定骨细胞并用茜素红溶液染色。
在其它实验中，使用改性的骨生成诱导培养基，其具有表2中列出的成分，包括维生素D，培养26天。
表2：改性的骨生成培养基成分
脂肪生成的诱导
根据Chemicon脂肪生成试剂盒(cat no.scr020,Millipore,MA,USA)提供的指导进行脂肪生成。
脂肪生成城诱导培养基
在每次更换培养基时新鲜制备脂肪生成诱导培养基和维持培养基，使用下表3和表4中列举的成分。
表3：脂肪生成诱导培养基成分
表4：脂肪生成维持培养基成分
<u>成分</u> <u>原液浓度</u> <u>量</u> <u>终浓度</u>
DMEM低葡萄糖 4.4ml 90％
血清(加热失活) 0.5ml 10％
胰岛素 10mg/ml 5μL 10μg/ml
Pen&Strep X 100 50μl X 1
细胞生长
将衍生自胎盘或BM的细胞铺板(200,000个细胞/孔)于1ml生长培养基中，所述培养基包含DMEM(Invitrogen，Gibco)、10％FCS(Invitrogen，Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)，45μg/ml庆大霉素-IKA(Teva Medical)和0.25μg/ml Fungizone(Invitrogen，Gibco)，在开始脂肪生成分化之前使其生长至100％铺满(通常过夜培养)。
在分化第1天，抽吸出生长培养基并用1ml脂肪生成诱导培养基更换，根据表5的时间表，每2-3天用新鲜的诱导或维持培养基更换，总共25天。
表5：脂肪生成分化时间表
天数 培养基
1 脂肪生成诱导培养基
3 脂肪生成诱导培养基
5 脂肪生成诱导培养基
7 脂肪生成维持培养基
9 脂肪生成诱导培养基
11 脂肪生成诱导培养基
13 脂肪生成诱导培养基
15 脂肪生成维持培养基
17 脂肪生成诱导培养基
19 脂肪生成诱导培养基
21 脂肪生成诱导培养基
在第25天，固定脂肪细胞并用油红溶液染色。
改性的脂肪生成诱导培养基
改性的脂肪生成诱导培养基含有表6列举的成分，共使用26天。
表6：修改的脂肪生成诱导培养基成分
成分 原液浓度 量 终浓度
DMEM低葡萄糖 4.4ml 90％
血清(加热失活) 0.5ml 10％
地塞米松(Sigma) 1mM 5μl 1μM
IBMX(Sigma) 0.5M 5μl 0.5mM
胰岛素(Sigma) 10mg/ml 5μL 10μg/ml
吲哚美辛(Sigma) 10mM 200μl 200μM
庆大霉素(Biological Industries) 10μl
结果
骨细胞诱导.如通过阳性茜素红染色中表明，在骨生成诱导培养基中培养衍生自BM的粘附细胞导致超过50％的BM细胞分化。相反，没有衍生自胎盘的细胞表现出骨生成分化的迹象。
接下来，使用包含维生素D和更高浓度地塞米松的改性的骨生成培养基。超过50％的BM细胞经历分化为骨细胞，而没有衍生自胎盘的细胞表现出骨生成分化的迹象。
脂肪细胞诱导.如通过阳性油红染色及通过典型的形态变化(例如细胞质中油滴的积累)表明，脂肪细胞诱导培养基中衍生自胎盘或BM的粘附细胞的脂肪细胞分化导致超过50％的衍生自BM的细胞分化。相反，没有衍生自胎盘的细胞分化为脂肪细胞。
接下来，使用含有更高浓度吲哚美辛的改性的培养基。超过50％的衍生自BM的细胞经历分化为脂肪细胞。相反，没有衍生自胎盘的细胞表现出脂肪细胞的典型形态学改变。
实施例3：在粘附基质细胞上的标志物表达
方法(实施例3-5)
通过用单克隆抗体(MAb)染色细胞进行膜标记物的FACS分析。将400,000-600,000个细胞悬浮于5ml试管中的1ml流式细胞缓冲液中，在室温(RT)避光与如下每个MAb温育15分钟：PE-缀合的抗人CD29 MAb(Becton Dickinson[BD])，PE-缀合的抗人CD73 MAb(BD)，PE-缀合的抗人CD105 MAb(BD)，PE-缀合的抗人CD90 MAb(BD)，PE-缀合的抗人CD45 MAb(BD))，PE缀合的抗人CD19 MAb(BD)，PE缀合的抗人CD14 MAb(BD)，PE缀合的抗人HLA-DRMAb(BD)，PE缀合的抗人CD34 MAb(BD)，PE-缀合的抗人CD31 MAb(BD)，PE缀合的抗人CD200MAb(BD)，PE缀合的同种型IgG2β(BD)，PE缀合的同种型IgG1α(BD)；及抗CD106，抗CD54，抗CD56，抗CD49d，抗-glyA和抗CD39，都是PE-缀合的且来自BD；-缀合的抗SSEA4(eBioscience)和IgG3κ同种型对照(Biolegend)。
将细胞用流式细胞缓冲液洗涤两次，重悬浮于400微升(mcl)流式细胞缓冲液中，通过流式细胞术分析。
人/人混合的淋巴细胞反应(MLR)
用等量照射的(3000Rad)衍生自PB的MNC(来自供体B)刺激2×105外周血(PB)衍生的MNC(来自供体A)。向培养物中加入增加量的基质细胞。将每组一式三份接种在96孔板中。将细胞在含有20％FBS的RPMI 1640培养基中培养。在为期5天培养的最后18小时期间，用1微居里(mcCi)3H-胸苷脉冲平板。通过玻璃纤维滤器收获细胞，用闪烁计数器定量胸苷摄取。
人/大鼠PBMC增殖测定
将ASC接种在96孔板中并温育24小时。将外周血单个核细胞(PBMC)用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记(CFSE是一种荧光细胞染料，扩散进细胞并标记正在增殖的细胞)，用PHA活化，及与ASC共培养5天。最大增殖(100％)被任意设定为在不存在ASC条件下在PHA刺激后PBMC细胞的增殖。流式细胞术用于确定PBMC的百分比。结果可以T细胞增殖的抑制百分比(％ITCP)或者％ITCP的相对百分比表示，后者通过将测试样品的％ITCP除以参考批次的％ITCP计算。
对于CFSE染色，在培养之前将PB-MNC细胞进行CFSE(Molecular Probes)染色以进行增殖测量。5天后收集细胞，通过流式细胞术检测CFSE染色的强度。
ELISA
将MNC(分离自外周血)在存在基质细胞条件下在湿润5％CO2在37℃下，用5微克(mcg)/ml ConA(Sigma)、0.5mcg/ml LPS(SIGMA)或者10mcg/ml PHA(SIGMA)刺激。收集上清液，使用ELISA试剂盒针对IFN-γ(DIACLONE)、TNF-α(DIACLONE)和IL-10(DIACLONE)进行细胞因子分析。
结果
细胞标志物在分离的细胞上的表达：用单克隆抗体检测分离细胞表达的表面抗原。所述细胞表达CD73、CD29和CD105，并且不表达标志物CD34、CD45、CD19、CD14和HLA-DR。更特别地，所有阳性标记物由超过90％的细胞表达，所有阴性标记物由少于3％的细胞表达。
此外，细胞不表达内皮标志物，如两种内皮标志物CD31和KDR的阴性染色所示。然而，成纤维细胞典型标记物D7-fib的表达是明显的。
实施例4:ASC的免疫原性和免疫调节性质
测量ASC上共刺激分子的表达。FACS分析表明细胞膜上不存在CD80、CD86和CD40(图2A-C)。此外，通过HLA A/B/C染色检测到细胞表达低水平的HLA I类分子(图2D)。
为了进一步研究细胞的免疫原性和免疫调节性质，进行了人/大鼠混合淋巴细胞反应(MLR)测试。在不存在或存在(人)ASC的条件下用LPS(脂多糖)刺激大鼠PBMC，并测量PBMC分泌IL-10。ASC增加IL-10分泌(图3)。
使用2个不同供体进行的MLR，在促有丝分裂刺激如同种异体细胞(图4A)和伴刀豆球蛋白A(Con A)(图4B)以及植物血凝素(PHA；相对于单独PHA通常至少25％的抑制)以及抗CD3和抗CD28的非特异性刺激之后，通过胸腺嘧啶核苷掺入测量也表明ASC逃脱同种异体识别，且降低淋巴细胞增殖。淋巴细胞增殖的减少与ASC的数量呈剂量依赖性。
接下来，使用方法(其阻止细胞与细胞的接触，但能使细胞因子在两个区室之间扩散)通过PHA刺激PBMC。在这个测定中也保持增殖的抑制，表明细胞与细胞的接触对于抑制不是必需的。
实施例5:ASC改变PBMC的细胞因子分泌
进行另外的共培养研究以检测ASC对淋巴细胞分泌细胞因子的影响。用ASC培养PB衍生的单个核细胞(PBMC)略微降低IFN-γ分泌及显著降低PBMC的TNF-α分泌，即使仅存在少量ASC时也如此(图5A-B)。在LPS刺激条件下，ASC以剂量依赖性方式增加PBMC分泌IL-10，同时降低其TNF-α分泌(图5C)。
实施例6:粘附基质细胞刺激ECP
方案-内皮细胞增殖(ECP)测定:
如实施例1中所述制备ASC，如PCT国际申请公开No.WO2012/140519所述通过振动收获，及低温贮存。将1×106个解冻的ASC接种在组织培养板中的2ml DMEM培养基中。24小时(hr)后，将培养基更换为EBM-2培养基(Lonza Group Ltd，Basel，Switzerland)，将细胞在低氧条件下(1％O2)再培养24小时，之后收集条件培养基(CM)。平行地，接种750个人脐带内皮细胞(HUVEC)，温育24小时，然后在37℃的常氧条件下与CM一起温育4天。除去CM后，使用荧光测定法测定HUVEC细胞的增殖。
结果
使用细胞因子(人)抗体阵列C系列4000(RayBio)检测在含氧量正常(5％O2)或低氧条件下培养的ASC的蛋白质分泌情况。在低氧条件下一些促血管生成因子的分泌是正调节的，如图6所示。
在另外的实验中，将各批ASC与HUVEC细胞共温育以测试它们对ECP的影响。观察到ECP的刺激，通常在不存在ASC的情况下观察到至少135％的ECP。
实施例7:在3D培养期间用促炎性细胞因子处理ASC
方法
一般实验方案.ASC得自胎盘，在2D条件下培养，然后在3D条件下培养，然后收获，均如实施例1中所述进行，不同之处是：3D培养结束之前36-40小时(通常在第5天或第6天)，将给料袋培养基用DMEM更换，加入或不加入10纳克/毫升(ng/ml)肿瘤坏死因子α(TNF-α)、10ng/ml干扰素-γ(IFN-γ)和/或10％FBS(见表7)，并将生物反应器以分批模式(或者在选择的实验中以灌注模式)温育另外一天。使用人细胞因子阵列试剂盒测量生物反应器培养基中分泌的细胞因子的水平。
表7：所测试的温育条件
名称 细胞因子 FBS
1 无 无
2 无 有
3 TNF 无
4 TNF 有
5 TNF+IFN 无
6 TNF+IFN 有
在条件培养基中测量细胞因子:在生物反应器温育后，将细胞低温贮存。将解冻的细胞在组织培养板1ml中低氧温育24小时，如在先前实施例中关于ECP测定所述，在CM中测量分泌的细胞因子的水平。
分泌的蛋白质的定量检测:使用人IL-6免疫测定ELISA试剂盒(R&DSystems)定量测量IL-6。使用人VEGF免疫测定试剂盒(R&D Systems)定量测量VEGF。
结果
在测试各种条件的一系列并行实验中，如前述实施例中所述在生物反应器中温育ASC。在生物反应器中温育的最后一天，在存在或不存在FBS的条件下，将培养基更换为含有或没有所加入的TNF-α和/或IFN-γ的培养基。在组织培养板中温育后，在生物反应器培养基和(在解冻的细胞中)CM中通过ELISA测量VEGF和IL-6分泌。无论是否存在IFN-γ，包含TNF-α显著增加VEGF的分泌(表8)。
表8：在各种条件下ASC分泌VEGF情况(微微克/ml[pg/ml])
*在这个表和整个文件中，RPD是指ELISA中一式两份样品之间的差异百分比。
**指示的数是标准偏差。
在相同实验中，包含TNF-α显著增加IL-6分泌，其通过IFN-γ进一步增加。
通过基于荧光的细胞因子阵列测定法测量均在不存在血清的条件下进行的实验1-2的生物反应器培养基中的一组因子的表达(见表8-9)，表明几种因子的表达增加，包括GRO、IL-6、IL-8、MCP-1、MCP-2、MCP-3、RANTES和IP-10(实验1-2分别示于图7A-B)。在另一个实验中，将单独TNF-α处理与不含细胞因子的培养基(也没有血清)进行比较，结果示出GRO、IL-8、MCP-1、RANTES表达增加，以及IL-6、MCP-3、血管生成素、胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)、骨桥蛋白和骨保护素较低程度增加(图7C-D)。
在几个实验中通过定量ELISA验证生物反应器培养基中MCP-1和GM-CSF的表达增加，所有实验均在不存在血清的条件下进行。结果示出，对于MCP-1诱导，TNF-α+IFN-γ处理优于单独TNF-α处理(图8A)，而单独TNF-α处理对于GM-CSF诱导似乎略优(图8B)。相对于对照培养基(不含细胞因子)，来自TNF-α+IFN-γ试验的细胞因子浓度和倍数变化在下表9中示出。
表9：生物反应器培养基中MCP-1和GM-CSF浓度
通过前述细胞因子阵列在几个实验中利用TNF-α+IFN-γ或者单独TNF-α(均不存在血清)检测一些其它因子的诱导。许多蛋白质是一致正调节，部分示于下表10中。
表10：在与TNF-α+/-IFN-γ温育基础上选择的蛋白质富集倍数(相对于未细胞因子处理的细胞)。仅示出高于2倍的倍数变化
实施例8:在3D培养期间血清对ASC的促炎性细胞因子处理的影响
这个实验检验了生物反应器中FBS对TNF-α+IFN-γ(图9A)或者单独TNF-α(图9B)诱导前述一组因子的影响。在存在或者不存在FBS条件下诱导了一组相似的主要蛋白质。在单独TNF-α处理的情况下，IL-6的诱导在FBS存在下比其不存在时强得多，TNF-a+IFN-g处理比TNF-a+FBS处理提供甚至更强的诱导作用。图9C-E示出由未刺激的细胞或者用单独的TNF-a或TNF-a+IFN-g刺激的细胞的各种因子的分泌的蛋白质浓度，以pg/ml为单位。
实施例9:用促炎性细胞因子预处理的ASC的免疫调节作用
方法—PBMC IL-10分泌测定
在第1天，将于150微升(mcL)体积中的150,000个未处理的ASC、预处理的ASC或者对照培养基(无细胞)接种在48孔板的孔中，温育过夜。第2天，将于100mcL体积中的50,000个人PBMC接种于含有ASC或者对照培养基的孔中。第3天，向细胞中加入在50mcL培养基中的1.5微克(mcg)LPS，并将细胞在37℃下温育5小时。从孔中收集无细胞上清液，使用ELISA Human IL-10试剂盒进行ELISA。
结果
这个实验检验了预处理的ASC对来自PBMC的LPS诱导的IL10分泌的影响。由预处理的ASC激发的IL-10分泌高于未处理的ASC。
实施例10:对预处理的ASC的另外的定量RANTES ELISA测定
如实施例7所述，将ASC与单独的10ng/ml TNF-α或者组合10ng/ml IFN-γ温育。将细胞低温贮存，然后解冻，将5×105个细胞接种于补加10％FBS的DMEM中，在标准条件下温育。24小时后，将培养基用1ml无血清培养基更换，将细胞在常氧条件下再培养24小时。除去培养基并使用Quantikine ELISA Human CCL5/RANTES试剂盒(R&D Systems)通过ELISA测定RANTES分泌。与其它组相比，TNF-α+IFN-γ处理的细胞具有明显正调节的RANTES分泌(表11)。在相似的实验中，平行检测TNF-α+IFN-γ处理、单独TNF-α处理、单独IFN-γ处理或者不处理组。在TNF-α+IFN-γ处理的细胞中平均RANTES表达是任何其它组的高于10倍(图10)。
表11：培养基中RANTES浓度(pg/ml)
*校正曲线之外
实施例11:处理的ASC的整体基因表达阵列
对如实施例7所述用炎性细胞因子处理的ASC进行整体基因表达阵列。相对于未处理的细胞，在用TNF-α+IFNγ处理或者单独TNF-α处理的细胞中有610和130个基因是差异表达的(至少1.5倍变化)，包括在2个样品之间共有的100个基因。
实施例12:用TNF-α、IFN-γ或者TNF-α+IFN-γ处理的ASC的qRT-PCR基因表达测定
进行qRT-PCR测定以测量如实施例7所述未用细胞因子处理或者用TNF-α和/或IFN-γ处理的胎盘细胞中所选蛋白质的表达。在细胞因子处理的细胞中，IDO1(图11A)、IL18BP(图11B)、MCP1/CCL2(图11C)、IL1β(图11D)、HLA-DR(图11E)、CD106(VCAM)(图11F)和MMP3(图11G)是正调节的，而IGFBP5(图11H)和RGS4(图11I)是负调节的。在许多情况下，这2种细胞因子的组合极大地增强了效果。
当针对RANTES进行另外的定量ELISA时也观测到RANTES分泌的增强。结果示于表12。
表12：另外的RANTES ELISA结果
实施例13:用炎性细胞因子处理的ASC的免疫表型
通过几个实验检验如实施例7所述已经用促炎性细胞因子预处理的ASC的免疫表型。一致地，所述细胞对于CD29、CD90和CD54是超过90％阳性；对于CD73和CD105是超过85％阳性；对于CD49超过65％阳性。此外，所述细胞对于CD14、CD19、CD31、CD34和CD39是小于1％阳性；所述细胞对于CD200是小于3阳性％；对于GlyA小于6％阳性；对于SSEA4小于20％阳性。
在不同组的实验中，对比未处理细胞与用单独TNF-α或者TNF-α+IFN-γ处理的细胞之间的一组标志物的表达。发现处理的细胞与未处理细胞在如下标志物表达中的差异：CD9，CD26，CD38，CD40，CD42a，CD45RA，CD49f，CD56，CD66acde，CD74，CD77，CD79b，CD106，CD107a，CD107b，CD120a，CD162，CD243，CD274，CD275，CD282，CD326和HLA-DR。阴性对照和其它代表性图(CD9、CD38、CD42a、CD74、CD77、CD79b、CD106、CD107a、CD243、CD275和HLA-DR)在图12A-L中示出。
实施例14:改变的细胞因子处理条件改良细胞活力
用与实施例7中所述相似的方式用炎性细胞因子刺激ASC，除了两个例外：1.细胞因子暴露24小时；2.细胞因子加入生物反应器培养基中，在24小时温育开始时使用浓缩的原种溶液，从而迅速使细胞因子浓度达到目标浓度。在接下来的24小时，将含有目标浓度的细胞因子的新鲜培养基灌注到生物反应器中。在接种生物反应器后5天开始24小时温育，相应于指数生长期。到细胞因子处理的结束，细胞生长已达到倍增速度开始减慢的程度。将ASC冷冻。将解冻的细胞接种在组织培养皿上，通过测量和比较接种后第3和4天收获的平板中的细胞密度测量群倍增时间(PDT)。
24小时刺激的细胞呈现出PDT显著降低(图13)。表13示出每个样品的条件。
表13：图13中描述的样品的条件
运行 TNF/IFN浓度 暴露小时 PDT
277BR021PT180313 10/10 40 49.7
296BR020PD300913 10/10 40 74.2
299BR01P270114R3 10/10 40 67.2
309BR07PD111113S6 10/10 40 55.5
316BR07PT180313 10/10 40 126.5
317BR021PD111113S7 10/10 40 83
335BR08P070414 10/10 40 95.2
358BR07PD111113 10/10 24 19
358BR08PD111113 1/1 24 19.3
360BR020P070414 5/5 24 24.7
360BR021P070414 10/10 24 19.4
实施例15:对ASC进行细胞因子处理24小时保持通过细胞因子处理诱导的基因正调节
接下来，进行头对头实验以补充前一实施例的数据。将来自步骤2-1终点的细胞(这相应于生物反应器接种前的最后一步，参见实施例1)接种在组织培养皿中。72-96小时后，相应于指数生长期，将细胞因子加入培养皿中。然后将细胞冷冻、解冻，并再次接种在培养瓶中用于上述生长测定。再次，暴露于细胞因子24小时的细胞表现出良好的生命力，通过其复制而证明(图14A)，同时保持CCL2、IL1B和IL6的正调节(图14B-C)。暴露于各种浓度的细胞因子的细胞在解冻后的存活率保持超过70％(图14D)。
实施例16:在给料袋和生物反应器中观测的细胞因子浓度之间的差异
在这个实验中，如实施例14中所述运行生物反应器。虽然装有培养基(含细胞因子)的给料袋保持在4℃，但是生物反应器中的TNF-α浓度降低至原始值的17％-47％(图15)。
实施例17:预处理的ASC在治疗IBD中的应用
在炎性肠病(IBD)如克罗恩病或者溃疡性结肠炎动物模型中检测用TNF-a和IFN-g预刺激的ASC，例如通过向(Muc2-/-)小鼠或者其它动物的饮用水中加入葡聚糖硫酸钠(DSS；例如0.5％、1％、2％或3％)建模，例如Heazlewood et al 2008及其中引用的参考文献所述；或者通过在大鼠或其它动物中经直肠滴注二硝基苯磺酸(DNBS)建模，例如Hareletal 2011及其中引用的参考文献所述。在其它实验中，给患有IBD的人对象施用所述细胞。
实施例18:预处理的ASC在治疗DTH中的应用
在后天免疫系统介导的炎性疾病如迟发型超敏反应(DTH)的动物模型中检测用TNF-a和IFN-g预刺激的ASC。例如，可以通过例如通过应用如十二烷基硫酸钠、苯扎氯铵或者巴豆油等化学品诱导过敏性接触性皮炎(ACD)，随后应用相同化学品并评估炎性结果如湿疹皮肤反应，由此检测DTH。这可以例如Martin SF 2013及其中引用的参考文献中所述进行。在其它实验中，将另一种炎性物质导入对象的软组织中模拟另一种炎性病症。在其它实验中，给患有炎性疾病的人对象施用所述细胞。
实施例19:预处理的ASC在治疗CP/CPPS中的应用
在先天免疫系统介导的炎性疾病如非细菌性慢性前列腺炎(CP/CPPS)的动物模型中检测用TNF-a和IFN-g预刺激的ASC。例如，可以通过将角叉菜胶注射进前列腺中诱导CP/CPPS，例如Chen CS et al 2013及其中引用的参考文献所述。在其它实验中，在实验对象中模拟另一种先天免疫系统介导的炎性病症。在其它实验中，给具有先天免疫系统介导的炎性病症的人对象施用所述细胞。
实施例20:预处理的ASC在治疗NMO中的应用
在视神经脊髓炎(NMO)的动物模型中检测用TNF-a和IFN-g预刺激的ASC。例如，NMO可以通过将NMO诱导抗体例如具有或者不具有补体的抗水通道蛋白4(AQP4)抗体导入大鼠脑中诱导NMO。这可以例如使用全身转移(例如在诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)后进行，例如通过施用髓鞘少突细胞糖蛋白和佐剂的制备物诱导)或者颅内注射完成，如Saadoun S et al 2010、Saini H et al 2013、Wrzos et al 2014、Tradtrantip et al2013及Tradtrantip et al 2014及其中的参考文献所述。给大鼠施用ASC，例如与NMO诱导抗体同时在脑内施用，或者在其它实施方案中通过颅内、肌内、血管内或者静脉内施用。在一些实验中，NMO的进展和严重程度通过少突细胞、少突胶质细胞前体细胞和/或星形胶质细胞的损失或者损害而确定，或者通过CNS组织的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、AQP4、神经丝(NF)或者髓鞘的损失而确定，或者存在CD45阳性淋巴细胞，离子化钙结合适体分子-1(Iba1)或者激活的补体(可通过C9neo免疫染色检测)，或者通过测量人和大鼠炎性细胞因子如IL-2或者IL-6的血浆水平而确定；例如上述参考文献中所述。
在一些实验中，诱导视神经炎(ON)，例如通过在视交叉附近通过球后输注、玻璃体内注射或者颅内注射导入NMO抗体而诱导，例如Asavapanumas N et al 2014所述；或者通过使用髓鞘少突细胞糖蛋白特异性(MOG特异性)TCR转基因动物，例如如Bettelli E1et al2006所述。在一些实验中，ON的严重性通过检测视神经中的脑膜和/或实质炎性病变来确定，例如上述参考文献中所述。
在其它实施方案中，给NMO和/或ON人对象施用所述细胞。
实施例21:预处理的ASC在治疗硬皮病中的应用
在硬皮病的动物模型中检测用TNF-a和IFN-g预刺激的ASC。例如，在小鼠中硬皮病可以通过重复(在4周内大约24次剂量)皮下注射博来霉素(BLM)如在盐水溶液中100mcgBLM/剂而诱导。这可以例如Yamamoto T et al 1999,Yamamoto T et al 2005,Avouac Jet al,2013及其中引用的参考文献所述完成。例如通过在第14天和21天(或者在其它实验中在第1天和7天)通过肌肉注射施用动物载体或者预刺激的ASC，其中第1天指第一次BLM注射。在一些实验中，硬皮病的进展和严重程度是通过评估皮肤纤维化以及任选确定全身性纤维化的大体病理学检查而确定，例如在上述参考文献中所述。肤纤维化可以通过测量皮肤厚度和/或胶原染色以确定皮肤中的胶原密度而确定，或者通过染色测量皮肤中的TGB-βRNA水平。
在其它实施方案中，给人硬皮病患者施用所述细胞。
实施例22:预处理的ASC在治疗肢体缺血中的应用
在肢体缺血的动物模型中检测用TNF-a和IFN-g预刺激的ASC，例如通过小鼠或者另一动物的动脉和/或静脉结扎，例如Masaki et al 2002及其中引用的参考文献描述的方案；或者通过对糖尿病小鼠或者其它动物切除动脉，例如Huang et al 2012和其中引用的参考文献中所述。在其它实验中，给患有肢体缺血的人对象施用所述细胞。
实施例23:预处理的ASC的骨髓迁移研究
方法
BM细胞制备和低温贮存.从ICR小鼠(Harlan)收集新鲜小鼠肝素化BM细胞置于PBS+10％FBS+12.5单位/ml肝素中，离心，并在PBS中洗涤。将细胞重悬于10ml新鲜趋化性缓冲液(含有0.5％白蛋白的RPMI)中，以10×106个细胞/ml的浓度冷冻。
CM制备.将冷冻的ASC在完全DMEM培养基(Gibco)中解冻并稀释至最终细胞浓度为0.5×106个细胞/4ml DMEM培养基。将0.5×106个细胞/孔一式两份接种在6孔板中，在37℃、5％CO2、21％O2条件下温育24小时。将细胞用PBS洗涤，并在1ml趋化性缓冲液/孔中温育24小时。合并来自一式两份孔的CM并通过离心澄清，保留上清液。
BM接种.将BM细胞解冻并在趋化性缓冲液中稀释至10×106细胞/ml的浓度。将100mcl悬浮液(1×106个细胞)一式两份接种到24孔Transwell板的上层。将0.5ml CM或者仅趋化性缓冲液(阴性对照)一式两份加入到Transwell板的下层，将平板在5％CO2、95％空气及在37℃下温育24小时。
细胞收获.从每个孔中取出上层。混合每个孔的下层，组合一式两份下层孔的培养基。将趋化性缓冲液或者CM(具有迁移的BM细胞)移至试管中。洗涤孔，并将洗液与试管中的培养基合并。将细胞离心，弃去培养基，使用NF细胞增殖分析试剂盒计数细胞。
结果
在骨髓迁移试验中检测几批用细胞因子(在血清存在下)预处理的ASC。尽管所有细胞均示出相对于阴性对照(仅缓冲液)增加的迁移，但TNF处理的细胞表现出对迁移刺激的增强，TNF+IFN处理的细胞表现出更强的增强效果(表14)。
表14.骨髓迁移增强倍数.
实施例24:预处理的ASC帮助HSC植入
在HSC植入的动物模型中检测用TNF-a和IFN-g预刺激的ASC，例如测量人细胞植入的鼠模型。这种模型的非限制性实例由Wiekmeijer AS等及其中的参考文献中描述。
实施例25:ASC在治疗肺纤维化中的应用
在肺纤维化的培养模型中检测ASC。施用C57BL/6小鼠单次鼻内施用硫酸博来霉素(BLM)(0.1μl BLM/50μl/小鼠)，随后4小时后通过气管内施用5×105ASC。之后在第7/14和21天通过跑台性能和氧饱和度评估小鼠的体重及其肺功能。在第21天处死小鼠，检查肺组织学和胶原蛋白含量。
应当理解，为了清楚起见，在单独的实施方案中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方案描述的本发明的各种特征也可以单独提供或者以任何合适的变形形式提供。
尽管已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但显然许多替代、修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，本发明涵盖符合本发明权利要求和说明书的精神和宽范围内的替代、修改和变化。本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请以及GenBank登录号均以其全部内容并入本文作参考，参考度如同每个单独的出版物、专利或者专利申请或者GenBank登录号特别和单独指出并入本文作参考一样。另外，本申请中任何参考文献的引用或者标识不应被解释为承认这样的参考文献可用作本发明的现有技术。
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Claims (47)

1.一种产生改性的粘附基质细胞(ASC)的方法，所述方法包括在含有细胞因子的生长培养基中以三维(3D)培养温育来自胎盘或者脂肪组织的ASC的步骤，其中所述含有细胞因子的生长培养基添加了一或多种促炎性细胞因子，从而产生改性的ASC。
2.权利要求1的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在第一生长培养基中的3D培养中温育来自胎盘或者脂肪组织的所述ASC，其中没有向所述第一生长培养基添加促炎性细胞因子；和(b)随后进行在所述含有细胞因子的生长培养基中温育所述ASC的步骤。
3.权利要求1或2的方法，进一步包括通过从所述3D培养移出所述ASC以收获所述ASC的后续步骤。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述3D培养在生物反应器中进行。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述3D培养包含合成的粘附材料。
6.权利要求5的方法，其中所述合成的粘附材料选自聚酯、聚丙烯、聚烯烃、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒、聚-L-乳酸及惰性金属纤维。
7.权利要求2的方法，其中所述3D培养在生物反应器中进行，且步骤(a)的至少部分是以灌注模式进行。
8.权利要求2的方法，其中所述3D培养在生物反应器中进行，且步骤(b)的至少部分是以灌注模式进行。
9.权利要求2的方法，其中所述3D培养在生物反应器中进行，且步骤(a)进行至少3天。
10.权利要求2的方法，其中所述3D培养在生物反应器中进行，且步骤(b)进行6-48小时。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中在2D粘附细胞培养中温育了所述ASC。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中在所述含有细胞因子的生长培养基中温育所述ASC的步骤在指数期开始。
13.权利要求4-12任一项的方法，其中在所述含有细胞因子的生长培养基中温育所述ASC的步骤包括：(i)向所述生物反应器中的培养基添加一次所述一或者多种促炎性细胞因子，从而产生所述含有细胞因子的生长培养基；和(ii)将含有细胞因子的所述第二生长培养基与包含额外量的所述含有细胞因子的生长培养基的外部容器的可操作地。
14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述一或者多种促炎性细胞因子包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)。
15.权利要求14的方法，其中所述一或者多种促炎性细胞因子还包括干扰素-γ(IFN-γ)。
16.权利要求1-13任一项的方法，其中所述一或者多种促炎性细胞因子包括干扰素-γ(IFN-γ)。
17.权利要求14-16任一项的方法，其中所述一或者多种促炎性细胞因子的每一种以1-4纳克/毫升的浓度存在。
18.权利要求14-16任一项的方法，其中所述一或者多种促炎性细胞因子的每一种以4-8纳克/毫升的浓度存在。
19.权利要求14-16任一项的方法，其中所述一或者多种促炎性细胞因子的每一种以8-12纳克/毫升的浓度存在。
20.权利要求14-19任一项的方法，其中在所述含有细胞因子的生长培养基中温育所述ASC的步骤在生物反应器中进行16-28小时的时间，且在所述含有细胞因子的生长培养基中温育所述ASC的所述步骤是当培养物处于指数期时开始。
21.权利要求15和17-20任一项的方法，其中所述TNF-α和所述IFN-γ的浓度均在1-12纳克/毫升之间；且所述浓度的比例在1:5至5:1之间。
22.权利要求21的方法，其中所述浓度的所述比例在1:2至2:1之间。
23.权利要求14-22任一项所述的方法，其中：
-在所述含有细胞因子的生长培养基中温育所述ASC的步骤在生物反应器中进行；及
-在所述含有细胞因子的生长培养基中温育所述ASC的步骤包括：(i)向所述生物反应器中的培养基加入一次所述一或者多种促炎性细胞因子，从而产生所述含有细胞因子的生长培养基；和(ii)将所述含有细胞因子的生长培养基与包含额外量的所述含有细胞因子的生长培养基的外部容器可操作地连接。
24.权利要求1-23任一项的方法，其中所述ASC源自胎盘组织。
25.权利要求1-23任一项的方法，其中所述ASC源自脂肪组织。
26.通过权利要求1-25任一项的方法产生的改性的ASC。
27.细胞群，其中所述群的大多数在群水平上表达CD10、CD29、CD38和CD40的每一个。
28.细胞群，其中所述群的大多数在群水平上表达CD10、CD29、CD38和HLA-DR中的每一个。
29.细胞群，其中所述群的大多数在群水平上表达CD10、CD29、CD38和CD74中的每一个。
30.细胞群，其中所述群的大多数在群水平上表达CD10、CD29、HLA-DR和CD74中的每一个。
31.权利要求30的细胞群，其中所述群的大多数还在群水平上表达CD38。
32.权利要求27-31任一项的细胞群，其中所述细胞的大多数还在群水平上表达CD90。
33.权利要求27-31任一项的细胞群，其中所述细胞群对于选自以下的至少一种标志物是至少40％阳性的：CD42a、CD45Ra、CD77、CD243和CD275。
34.权利要求27-33任一项的细胞群，其中所述细胞的大多数不表达CD9。
35.药物组合物，其包含权利要求26的改性的ASC或者权利要求27-34任一项的细胞群。
36.来自权利要求1-2或者4-25任一项的方法的条件培养基。
37.药物组合物，其包含权利要求36的条件培养基。
38.一种治疗或者抑制有需要的对象的免疫介导的疾病的方法，包括给所述对象施用包含权利要求26的改性的ASC或者权利要求27-34任一项的细胞群的药物组合物的步骤，从而治疗有此需要的对象的自身免疫疾病。
39.权利要求38的方法，其中所述免疫介导的疾病选自视神经脊髓炎(NMO)、硬皮病、类风湿性关节炎、多发性硬化症(MS)、移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征、重症肌无力(MG)、格林-巴利综合征(GBS)、桥本氏甲状腺炎(HT)、格雷夫氏病、1型糖尿病(T1DM)、炎症性肠病、哮喘、慢性炎症、银屑病、过敏和狼疮。
40.一种治疗或者抑制有需要的对象的移植排斥的方法，包括给所述对象施用包含权利要求26的改性的ASC或者权利要求27-34任一项的细胞群的药物组合物的步骤，从而治疗或者抑制移植排斥。
41.一种药物组合物，其包含权利要求26的改性的ASC或者权利要求27-34任一项的细胞群，用于治疗或者抑制免疫介导的疾病。
42.权利要求41的药物组合物，其中所述免疫介导的疾病选自类风湿性关节炎、多发性硬化症(MS)、移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、系统性红斑狼疮(SLE)、系统性硬化症、干燥综合征、重症肌无力(MG)、格林-巴利综合征(GBS)、桥本氏甲状腺炎(HT)、格雷夫氏病、1型糖尿病(T1DM)、炎症性肠病、哮喘、慢性炎症、银屑病、过敏和狼疮。
43.药物组合物，其包含权利要求26的改性的ASC或者权利要求27-34中任一项的细胞群，用于治疗或者抑制移植排斥。
44.权利要求37和41-43任一项的药物组合物，进一步包含药学可接受的赋形剂。
45.权利要求37和41-43任一项的药物组合物，其中所述药物组合物是冷冻的。
46.一种生物反应器，其包含权利要求26的改性的ASC或者权利要求27-34任一项的细胞群。
47.权利要求46的生物反应器，其中所述生物反应器进一步包括合成的三维基质。
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