CN111411078A - 一种快速获得毛囊细胞源外泌体的方法 - Google Patents

一种快速获得毛囊细胞源外泌体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开的属于毛囊细胞外泌体获取技术领域，具体为一种快速获得毛囊细胞源外泌体的方法，该快速获得毛囊细胞源外泌体的方法的具体步骤如下：S1：2D毛囊细胞培养：首先采用2D培养的方式将毛囊细胞培养，直至毛囊细胞扩增至5x105个；S2：2D毛囊细胞转入旋转瓶；S3：旋转瓶旋转；S4：转入培养箱培养；S5：提取上清液，不同的细胞培养可以同时进行操作，大大节省了培养的时间；原材料的消耗较少，且对于原料的操作步骤较少，操作较为简单；耗时少，大大节省了临床试验及机制研究的时间、人力、物力和空间。

Description

一种快速获得毛囊细胞源外泌体的方法
技术领域
本发明涉及毛囊细胞外泌体获取技术领域，具体为一种快速获得毛囊细胞源外泌体的方法。
背景技术
作为皮肤重要的附属器之一毛囊，是富含间充质干细胞、黑色素细胞、角朊干细胞等的成体干细胞资源库，这些细胞来源的外泌体在护肤品行业，及皮肤再生生物医学领域有着独特的作用，因此如何短期内获得大量的，稳定的，高纯度的外泌体，对于后续体外机制研究，及体内验证试验的有效开展至关重要。
以往要想获得纯度较好外泌体，往往是采用2D培养方式，培养大量的细胞，进而利用超高速梯度离心法获得，但是这样不仅获得的外泌体量比较少，同时会因为2D培养过程中，需要反复换液，传代而浪费很多的人力和物理，且需要很大的空间来摆放这些培养瓶或培养皿，甚至会因为操作不当造成细胞污染，而全盘皆输。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速获得毛囊细胞源外泌体的方法，以解决上述背景技术中提出的2D培养方式获得的外泌体量比较少，同时会因为2D培养过程中，需要反复换液，传代而浪费很多的人力和物理，且需要很大的空间来摆放这些培养瓶或培养皿，甚至会因为操作不当造成细胞污染的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种快速获得毛囊细胞源外泌体的方法，该快速获得毛囊细胞源外泌体的方法的具体步骤如下：
S1：2D毛囊细胞培养：首先采用2D培养的方式将毛囊细胞培养，直至毛囊细胞扩增至5x105个；
S2：2D毛囊细胞转入旋转瓶：称取5x105个毛囊细胞所需量的微载体，对微载体高压灭菌，之后，将微载体装入旋转瓶中，根据步骤S1中，当毛囊细胞扩增至5x105个时，将毛囊细胞转入装有微载体的旋转瓶中培养；
S3：旋转瓶旋转：根据步骤S2，将装有毛囊细胞、微载体的旋转瓶放置在生物反应器中，设定生物反应器的转速为200-300r/min，生物反应器的转动时间为3-5min；
S4：转入培养箱培养：根据步骤S3中，在生物反应器中转动处理后的装有毛囊细胞、微载体的旋转瓶取出并置于培养箱中培养，且培养箱的环境温度设定为35摄氏度-39摄氏度，培养箱内CO2的含量为0.04％-0.06％；
S5：提取上清液：当培养箱内毛囊细胞培养至对数生长期时，更换无血清培养基，22-24h后即可收取上清，进行外泌体的提取。
优选的，所述旋转瓶为500ml容量的旋转瓶。
优选的，所述步骤S1中2D培养在T75培养瓶中进行。
优选的，所述步骤S2中高压灭菌的压强不小于103.4kPa，温度不低于121.3摄氏度，且高压灭菌的时间为15-30min。
优选的，所述毛囊细胞包括间充质干细胞、黑色素细胞、角朊干细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)不同的细胞培养可以同时进行操作，大大节省了培养的时间；
2)原材料的消耗较少，且对于原料的操作步骤较少，操作较为简单；
3)耗时少，大大节省了临床试验及机制研究的时间、人力、物力和空间。
附图说明
图1为本发明的获取方法流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种快速获得毛囊细胞源外泌体的方法，该快速获得毛囊细胞源外泌体的方法的具体步骤如下：
S1：2D毛囊细胞培养：首先采用2D培养的方式将毛囊细胞培养，直至毛囊细胞扩增至5x105个；
S2：2D毛囊细胞转入旋转瓶：称取5x105个毛囊细胞所需量的微载体，对微载体高压灭菌，之后，将微载体装入旋转瓶中，根据步骤S1中，当毛囊细胞扩增至5x105个时，将毛囊细胞转入装有微载体的旋转瓶中培养；
S3：旋转瓶旋转：根据步骤S2，将装有毛囊细胞、微载体的旋转瓶放置在生物反应器中，设定生物反应器的转速为200-300r/min，生物反应器的转动时间为3-5min；
S4：转入培养箱培养：根据步骤S3中，在生物反应器中转动处理后的装有毛囊细胞、微载体的旋转瓶取出并置于培养箱中培养，且培养箱的环境温度设定为35摄氏度-29摄氏度，培养箱内CO2的含量为0.04％-0.06％；
S5：提取上清液：当培养箱内毛囊细胞培养至对数生长期时，更换无血清培养基，22-24h后即可收取上清，进行外泌体的提取。
进一步地，旋转瓶为500ml容量的旋转瓶。
进一步地，步骤S1中2D培养在T75培养瓶中进行。
进一步地，步骤S2中高压灭菌的压强不小于103.4kPa，温度不低于121.3摄氏度，且高压灭菌的时间为15-30min。
进一步地，毛囊细胞包括间充质干细胞、黑色素细胞、角朊干细胞。
实施例一：
该快速获得毛囊细胞源外泌体的方法的具体步骤如下：
S1：2D毛囊细胞培养：首先采用2D培养的方式将毛囊细胞培养，2D培养在T75培养瓶中进行，毛囊细胞包括间充质干细胞、黑色素细胞、角朊干细胞，可以同时进行多种细胞的培养，直至毛囊细胞扩增至5x105个；
S2：2D毛囊细胞转入旋转瓶：称取5x105个毛囊细胞所需量的微载体，对微载体高压灭菌，高压灭菌的压强不小于103.4kPa，温度不低于121.3摄氏度，且高压灭菌的时间为15-30min，之后，将微载体装入旋转瓶中，根据步骤S1中，当毛囊细胞扩增至5x105个时，将毛囊细胞转入装有微载体500ml容量的旋转瓶中培养；
S3：旋转瓶旋转：根据步骤S2，将装有毛囊细胞、微载体的旋转瓶放置在生物反应器中，设定生物反应器的转速为200r/min，生物反应器的转动时间为3min；
S4：转入培养箱培养：根据步骤S3中，在生物反应器中转动处理后的装有毛囊细胞、微载体的旋转瓶取出并置于培养箱中培养，且培养箱的环境温度设定为35摄氏度，培养箱内CO2的含量为0.04％％；
S5：提取上清液：当培养箱内毛囊细胞培养至对数生长期时，更换无血清培养基，22h后即可收取上清，进行外泌体的提取。
实施例二：
该快速获得毛囊细胞源外泌体的方法的具体步骤如下：
S1：2D毛囊细胞培养：首先采用2D培养的方式将毛囊细胞培养，2D培养在T75培养瓶中进行，毛囊细胞包括间充质干细胞、黑色素细胞、角朊干细胞，可以同时进行多种细胞的培养，直至毛囊细胞扩增至5x105个；
S2：2D毛囊细胞转入旋转瓶：称取5x105个毛囊细胞所需量的微载体，对微载体高压灭菌，高压灭菌的压强不小于103.4kPa，温度不低于121.3摄氏度，且高压灭菌的时间为15-30min，之后，将微载体装入旋转瓶中，根据步骤S1中，当毛囊细胞扩增至5x105个时，将毛囊细胞转入装有微载体500ml容量的旋转瓶中培养；
S3：旋转瓶旋转：根据步骤S2，将装有毛囊细胞、微载体的旋转瓶放置在生物反应器中，设定生物反应器的转速为250r/min，生物反应器的转动时间为4min；
S4：转入培养箱培养：根据步骤S3中，在生物反应器中转动处理后的装有毛囊细胞、微载体的旋转瓶取出并置于培养箱中培养，且培养箱的环境温度设定为37摄氏度，培养箱内CO2的含量为0.05％；
S5：提取上清液：当培养箱内毛囊细胞培养至对数生长期时，更换无血清培养基，23h后即可收取上清，进行外泌体的提取。
实施例三：
该快速获得毛囊细胞源外泌体的方法的具体步骤如下：
S1：2D毛囊细胞培养：首先采用2D培养的方式将毛囊细胞培养，2D培养在T75培养瓶中进行，毛囊细胞包括间充质干细胞、黑色素细胞、角朊干细胞，可以同时进行多种细胞的培养，直至毛囊细胞扩增至5x105个；
S2：2D毛囊细胞转入旋转瓶：称取5x105个毛囊细胞所需量的微载体，对微载体高压灭菌，高压灭菌的压强不小于103.4kPa，温度不低于121.3摄氏度，且高压灭菌的时间为15-30min，之后，将微载体装入旋转瓶中，根据步骤S1中，当毛囊细胞扩增至5x105个时，将毛囊细胞转入装有微载体500ml容量的旋转瓶中培养；
S3：旋转瓶旋转：根据步骤S2，将装有毛囊细胞、微载体的旋转瓶放置在生物反应器中，设定生物反应器的转速为300r/min，生物反应器的转动时间为5min；
S4：转入培养箱培养：根据步骤S3中，在生物反应器中转动处理后的装有毛囊细胞、微载体的旋转瓶取出并置于培养箱中培养，且培养箱的环境温度设定为39摄氏度，培养箱内CO2的含量为0.06％；
S5：提取上清液：当培养箱内毛囊细胞培养至对数生长期时，更换无血清培养基，24h后即可收取上清，进行外泌体的提取。
若想获得500mL细胞上清分离外泌体：
原有的2D培养方式，大约需要至少100个10cm培养皿，1.5L培养基，170mL血清，反复传代3次，一整个培养箱，历时15天，中途还要每次操作至少3个小时进行处理细胞，而这只是培养一种细胞的消耗，且保证不污染一次就能成功的计算；
本方案的旋转瓶—微载体—生物反应器培养方式，选择4个500mL旋转瓶，毛囊中的四种细胞可以同时操作，仅需1g微载体，56mL血清，0.5L培养基，一次细胞消化，一次换液，培养箱中的一层，5-7天即可获得四种细胞的各500mL的上清。大大节省了临床试验及机制研究的时间，人力，物力，和空间。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明；因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种快速获得毛囊细胞源外泌体的方法，其特征在于：该快速获得毛囊细胞源外泌体的方法的具体步骤如下：
S1：2D毛囊细胞培养：首先采用2D培养的方式将毛囊细胞培养，直至毛囊细胞扩增至5x105个；
S2：2D毛囊细胞转入旋转瓶：称取5x105个毛囊细胞所需量的微载体，对微载体高压灭菌，之后，将微载体装入旋转瓶中，根据步骤S1中，当毛囊细胞扩增至5x105个时，将毛囊细胞转入装有微载体的旋转瓶中培养；
S3：旋转瓶旋转：根据步骤S2，将装有毛囊细胞、微载体的旋转瓶放置在生物反应器中，设定生物反应器的转速为200-300r/min，生物反应器的转动时间为3-5min；
S4：转入培养箱培养：根据步骤S3中，在生物反应器中转动处理后的装有毛囊细胞、微载体的旋转瓶取出并置于培养箱中培养，且培养箱的环境温度设定为35摄氏度-39摄氏度，培养箱内CO2的含量为0.04％-0.06％；
S5：提取上清液：当培养箱内毛囊细胞培养至对数生长期时，更换无血清培养基，22-24h后即可收取上清，进行外泌体的提取。
2.根据权利要求1所述的一种快速获得毛囊细胞源外泌体的方法，其特征在于：所述旋转瓶为500ml容量的旋转瓶。
3.根据权利要求1所述的一种快速获得毛囊细胞源外泌体的方法，其特征在于：所述步骤S1中2D培养在T75培养瓶中进行。
4.根据权利要求1所述的一种快速获得毛囊细胞源外泌体的方法，其特征在于：所述步骤S2中高压灭菌的压强不小于103.4kPa，温度不低于121.3摄氏度，且高压灭菌的时间为15-30min。
5.根据权利要求1所述的一种快速获得毛囊细胞源外泌体的方法，其特征在于：所述毛囊细胞包括间充质干细胞、黑色素细胞、角朊干细胞。
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