CN114891721A - 一种大鼠肝脏类器官模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大鼠肝脏类器官模型的建立方法,包括以下步骤:取大鼠肝脏组织,依次进行清洗、剪切、消化和过滤处理,处理完成后得到大鼠肝脏干细胞;对大鼠肝脏干细胞进行培养,培养完成后得到成品大鼠肝脏类器官模型。通过建立大鼠肝脏体外类器官的研究模型,可分化为与来源器官特异性的细胞类型,是一个生理高度相关系统,相对于细胞系模型功能单一、动物模型成本高,周期长的特点,更加具有应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,尤其涉及一种大鼠肝脏类器官模型建立方法。
背景技术
药物性肝毒性是新药研发中最重要的关键因素,目前检测药物代谢和肝毒性最主要还是通过永生化的肝细胞系和动物模型来检测,然而基于动物模型的肝脏毒理实验,成本高,实验周期长,无法进行快速高通量检测分析,永生化的肝细胞系则村子不准确性,无法有效还原体内环境。所以在肝毒性研究和临床前药物开发中,迫切需要能够开展高通量分析的体外模型来进行药物功效和毒性试验。
类器官是一种利用病人自己的细胞,在体外培养出来的微型器官,利用干细胞在体外3D条件下制备,能够模拟原生器官结构和功能。由于与对应的人类器官拥有高度相似的组织学特征,并能重现该器官的生理功能,类器官可作为多种疾病的体外模型,在干细胞与发育、再生医学、疾病研究、药物开发和肿瘤治疗等多个领域具有广泛的应用前景。相比传统的二维培养模型,类器官代表着一种能够概括整个生物体生理过程的创新技术,具有更接近生理细胞组成和行为、更稳定的基因组。
大鼠是常用药物安全性评价模型,如果能建立大鼠肝脏体外类器官研究模型,部分替代动物实验,能够极大提高基础研究和新药开发的效率。
发明内容
本部分的目的在于概述本申请的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例,在本部分以及本申请的说明书摘要和申请名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和申请名称的目的模糊,而这种简化或省略不能用于限制本申请的范围。
鉴于上述和/或现有技术中所存在的问题,提出了本申请。
因此,本申请所要解决的技术问题是:旨在建立大鼠肝脏体外类器官研究模型,部分替代动物实验,以提高基础研究和新药开发的效率。
为解决上述技术问题,本申请提供如下技术方案:一种大鼠肝脏类器官模型的建立方法,包括以下步骤:
取大鼠肝脏组织,依次进行清洗、剪切、消化和过滤处理,处理完成后得到大鼠肝脏干细胞;
对大鼠肝脏干细胞进行培养,培养完成后得到成品大鼠肝脏类器官模型。
作为本申请所述一种大鼠肝脏类器官模型的建立方法的一种优选方案,所述消化包括:
将剪切后的大鼠肝脏组织分散在灭菌处理过的PBS缓冲液中,并进行离心处理后收集肝脏组织沉淀;
取肝脏组织沉淀并向其中加入胶原酶、分散酶和DNaseI,在37℃下水浴消化1h,并以固定时间间隔涡旋若干次,然后加入PBS缓冲液终止消化,静置沉淀后得到第一上清液和第一细胞沉淀。
作为本申请所述一种大鼠肝脏类器官模型的建立方法的一种优选方案,所述消化还包括:
取第一细胞沉淀并向其中加入胶原酶、分散酶和DNaseI,在37℃下水浴消化1h,并以固定时间间隔涡旋若干次,然后加入PBS缓冲液终止消化,静置沉淀后得到第二上清液和第二细胞沉淀;
将第一上清液和第二上清液合并得到粗品大鼠肝脏干细胞。
作为本申请所述一种大鼠肝脏类器官模型的建立方法的一种优选方案,所述消化中:胶原酶的浓度均为2mg/ml。
作为本申请所述一种大鼠肝脏类器官模型的建立方法的一种优选方案,所述过滤包括:将粗品大鼠肝脏干细胞过滤得到滤液和滤渣,所述滤渣为成品大鼠肝脏干细胞。
作为本申请所述一种大鼠肝脏类器官模型的建立方法的一种优选方案,所述培养包括:原代培养和增殖培养。
作为本申请所述一种大鼠肝脏类器官模型的建立方法的一种优选方案,所述原代培养包括:将成品大鼠肝脏干细胞加入Matrigel胶混合均匀,待混合胶体凝固后加入原代提取培养基,于37℃、5%CO2浓度下培养5-10天,期间每间隔3-4天更换一次培养基。
作为本申请所述一种大鼠肝脏类器官模型的建立方法的一种优选方案,所述原代提取培养基包括:AdvancedDMEM/F12培养基、不含Vit-A的B27,1-2X;N2,1-3X;EGF,25-50ng/ml;Gastrin,10-15nM;HGF,25-50ng/ml;N-acetylcysteine,1-2mM;R-spondin1,400-500ng/ml;FGF10,100-110ng/ml;FGF7,40-50ng/ml、Nicotinamide,10-20mM;Noggin,95-105ng/ml;Wnt3a,95-100ng/ml;Y-27632,10-20μM;Glutamax,1-2X;青霉素链霉素混合液,1-2X;HEPES,1-2mM。
作为本申请所述一种大鼠肝脏类器官模型的建立方法的一种优选方案,所述增殖培养包括:在经原代培养的细胞混合液中加入胰酶,于37℃消化3min,转移至预冷的AdvancedDMEM/F12中,离心收集细胞沉淀制成胶滴,待其凝固后加入增殖培养基,于37℃、5%CO2浓度下培养2-4天。
作为本申请所述一种大鼠肝脏类器官模型的建立方法的一种优选方案,所述增殖培养基包括:AdvancedDMEM/F12培养基、不含Vit-A的B27,1-2X;N2,1-3X;EGF,25-50ng/ml;Gastrin,10-15nM;HGF,25-50ng/ml;N-acetylcysteine,1-2mM;R-spondin1,400-500ng/ml;FGF10,100-110ng/ml;FGF7,40-50ng/ml、Nicotinamide,10-20mM;Noggin,95-105ng/ml;Wnt3a,95-100ng/ml;Y-27632,10-20μM;Glutamax,1-2X;青霉素链霉素混合液,1-2X;HEPES,1-2mM。
本申请的有益效果:通过建立大鼠肝脏体外类器官的研究模型,可分化为与来源器官特异性的细胞类型,是一个生理高度相关系统,相对于细胞系模型功能单一、动物模型成本高,周期长的特点,更加具有应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。其中:
图1为本申请实施例1培养所得的大鼠肝脏类器官光学显微镜图;
图2为本申请实施例1培养所得的大鼠肝脏类器官光学显微镜图;
图3为本申请实施例1培养所得的大鼠肝脏类器官光学显微镜图;
图4为本申请实施例1和对比例1-2类器官培养成活率数据对比图;
图5为本申请实施例1和对比例1-2类器官培养周期数据对比图;
图6为本申请实施例1和对比例3类器官培养成活率数据对比图。
具体实施方式
本发明实施例主要试剂来源:
本发明实施例采用的不含Vit-A的B27购自Gibco。
本发明实施例采用的N2购自Gibco。
本发明实施例采用的Gastrin购自Sigma。
本发明实施例采用的HGF购自Stemcell。
本发明实施例采用的N-acetylcysteine购自Sigma。
本发明实施例采用的R-spondin 1购自Peprotech。
本发明实施例采用的FGF10购自Peprotech。
本发明实施例采用的EGF购自Stemcell。
本发明实施例采用的Nicotinamide购自Sigma。
本发明实施例采用的Noggin购自Peprotech。
本发明实施例采用的Wnt3a购自Peprotech。
本发明实施例采用的Y-27632购自Targetmol。
本发明实施例采用的Glutamax购自Gbico。
本发明实施例采用的FGF7购自Peprotech。
本发明实施例采用的A-8301购自Targetmol。
本发明实施例采用的HEPES购自Gibco。
本发明实施例采用的青霉素-链霉素混合液购自大连美仑生物技术有限公司。
需要说明的是,实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合说明书附图对本申请的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请,但是本申请还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似推广,因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
其次,本申请结合示意图进行详细描述,在详述本申请实施例时,为便于说明,表示器件结构的剖面图会不依一般比例作局部放大,而且所述示意图只是示例,其在此不应限制本申请保护的范围。此外,在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间尺寸。
再其次,此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本申请至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例,也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
本实施例提供了一种大鼠肝脏类器官模型的建立方法,包括以下步骤:
(1)样本清洗:用无菌处理后的PBS缓冲液对大鼠肝脏组织进行数次清洗,剔除明显的脂肪组织。
(2)样本剪切:将清洗完成的组织剪切为大小约1mm3的小块。
(3)组织消化:①将剪切好的组织分散在灭菌好的PBS中,离心去上清后收集肝脏组织沉淀;
②然后将肝脏组织沉淀放入15ml离心管中并加入2mg/ml的胶原酶、1.0U/ml的分散酶与15U/ml的DNaseI,于37℃水浴消化1h,每隔10min涡旋一次,加入PBS终止消化,静置沉淀得到第一上清液和第一细胞沉淀;
③向第一细胞沉淀内加入2mg/ml的胶原酶、1.0U/ml的分散酶与15U/ml的DNaseI,于37℃水浴消化1h,每隔10min涡旋一次,加入PBS终止消化,静置沉淀得到第二上清液并与步骤②的第一上清液合并得到粗品大鼠肝脏干细胞。
(4)过滤:将粗品大鼠肝脏干细胞经100μm的滤网过滤,收集滤液;将收集的滤液经过40μm的滤网过滤,收集滤渣,用100μLAdvanced DMEM/F12培养基重悬滤渣。
(5)制胶:取200ul Matrigel胶(4℃融化),与细胞悬液充分混匀,滴到12孔板内,每滴约50ul,静置2min,倒扣在细胞培养箱内。
(6)原代培养:配制原代提取培养基,原代提取培养基包括:AdvancedDMEM/F12培养基、不含Vit-A的B27,1-2X;N2,1-3X;EGF,25-50ng/ml;Gastrin,10-15nM;HGF,25-50ng/ml;N-acetylcysteine,1-2mM;R-spondin1,400-500ng/ml;FGF10,100-110ng/ml;FGF7,40-50ng/ml、Nicotinamide,10-20mM;Noggin,95-105ng/ml;Wnt3a,95-100ng/ml;Y-27632,10-20μM;Glutamax,1-2X;青霉素链霉素混合液,1-2X;HEPES,1-2mM。待混合胶凝固后将其加入原代提取培养基内,于37℃、5%CO2浓度下培养5天,期间每间隔3天更换一次原代提取培养基。
(7)增殖培养:配制增殖培养基,增殖培养基包括:AdvancedDMEM/F12培养基、不含Vit-A的B27,1-2X;N2,1-3X;EGF,25-50ng/ml;Gastrin,10-15nM;HGF,25-50ng/ml;N-acetylcysteine,1-2mM;R-spondin1,400-500ng/ml;FGF10,100-110ng/ml;FGF7,40-50ng/ml、Nicotinamide,10-20mM;Noggin,95-105ng/ml;Wnt3a,95-100ng/ml;Y-27632,10-20μM;Glutamax,1-2X;青霉素链霉素混合液,1-2X;HEPES,1-2mM。将经过原代培养的细胞混合液中加入胰酶,于37℃消化3min,转移至预冷的AdvancedDMEM/F12中,离心收集细胞沉淀制成胶滴,待其凝固后加入增殖培养基,于37℃、5%CO2浓度下培养3天,培养完成后制得成品大鼠肝脏类器官模型。
对比例1
本对比例提供了一种大鼠肝脏类器官模型的建立方法,包括以下步骤:
(1)样本清洗:用无菌处理后的PBS缓冲液对大鼠肝脏组织进行数次清洗,剔除明显的脂肪组织。
(2)样本剪切:将清洗完成的组织剪切为大小约1mm3的小块。
(3)组织消化:①将剪切好的组织分散在灭菌好的PBS中,离心去上清后收集肝脏组织沉淀;
②然后将肝脏组织沉淀放入15ml离心管中并加入0.5mg/ml的胶原酶、1.0U/ml的分散酶与15U/ml的DNaseI,于37℃水浴消化1h,每隔10min涡旋一次,加入PBS终止消化,静置沉淀得到第一上清液和第一细胞沉淀;
③向第一细胞沉淀内加入2mg/ml的胶原酶、1.0U/ml的分散酶与15U/ml的DNaseI,于37℃水浴消化1h,每隔10min涡旋一次,加入PBS终止消化,静置沉淀得到第二上清液并与步骤②的第一上清液合并得到粗品大鼠肝脏干细胞。
(4)过滤:将粗品大鼠肝脏干细胞经100μm的滤网过滤,收集滤液;将收集的滤液经过40μm的滤网过滤,收集滤渣,用100μLAdvanced DMEM/F12培养基重悬滤渣。
(5)制胶:取200ul Matrigel胶(4℃融化),与细胞悬液充分混匀,滴到12孔板内,每滴约50ul,静置2min,倒扣在细胞培养箱内。
(6)原代培养:配制原代提取培养基,原代提取培养基包括:AdvancedDMEM/F12培养基、不含Vit-A的B27,1-2X;N2,1-3X;EGF,25-50ng/ml;Gastrin,10-15nM;HGF,25-50ng/ml;N-acetylcysteine,1-2mM;R-spondin1,400-500ng/ml;FGF10,100-110ng/ml;FGF7,40-50ng/ml、Nicotinamide,10-20mM;Noggin,95-105ng/ml;Wnt3a,95-100ng/ml;Y-27632,10-20μM;Glutamax,1-2X;青霉素链霉素混合液,1-2X;HEPES,1-2mM。待混合胶凝固后将其加入原代提取培养基内,于37℃、5%CO2浓度下培养5天,期间每间隔3天更换一次原代提取培养基。
(7)增殖培养:配制增殖培养基,增殖培养基包括:AdvancedDMEM/F12培养基、不含Vit-A的B27,1-2X;N2,1-3X;EGF,25-50ng/ml;Gastrin,10-15nM;HGF,25-50ng/ml;N-acetylcysteine,1-2mM;R-spondin1,400-500ng/ml;FGF10,100-110ng/ml;FGF7,40-50ng/ml、Nicotinamide,10-20mM;Noggin,95-105ng/ml;Wnt3a,95-100ng/ml;Y-27632,10-20μM;Glutamax,1-2X;青霉素链霉素混合液,1-2X;HEPES,1-2mM。将经过原代培养的细胞混合液中加入胰酶,于37℃消化3min,转移至预冷的AdvancedDMEM/F12中,离心收集细胞沉淀制成胶滴,待其凝固后加入增殖培养基,于37℃、5%CO2浓度下培养3天,培养完成后制得成品大鼠肝脏类器官模型。
对比例2
本对比例提供了一种大鼠肝脏类器官模型的建立方法,包括以下步骤:
(1)样本清洗:用无菌处理后的PBS缓冲液对大鼠肝脏组织进行数次清洗,剔除明显的脂肪组织。
(2)样本剪切:将清洗完成的组织剪切为大小约1mm3的小块。
(3)组织消化:①将剪切好的组织分散在灭菌好的PBS中,离心去上清后收集肝脏组织沉淀;
②然后将肝脏组织沉淀放入15ml离心管中并加入5mg/ml的胶原酶、1.0U/ml的分散酶与15U/ml的DNaseI,于37℃水浴消化1h,每隔10min涡旋一次,加入PBS终止消化,静置沉淀得到第一上清液和第一细胞沉淀;
③向第一细胞沉淀内加入5mg/ml的胶原酶、1.0U/ml的分散酶与15U/ml的DNaseI,于37℃水浴消化1h,每隔10min涡旋一次,加入PBS终止消化,静置沉淀得到第二上清液并与步骤②的第一上清液合并得到粗品大鼠肝脏干细胞。
(4)过滤:将粗品大鼠肝脏干细胞经100μm的滤网过滤,收集滤液;将收集的滤液经过40μm的滤网过滤,收集滤渣,用100μLAdvanced DMEM/F12培养基重悬滤渣。
(5)制胶:取200ul Matrigel胶(4℃融化),与细胞悬液充分混匀,滴到12孔板内,每滴约50ul,静置2min,倒扣在细胞培养箱内。
(6)原代培养:配制原代提取培养基,原代提取培养基包括:AdvancedDMEM/F12培养基、不含Vit-A的B27,1-2X;N2,1-3X;EGF,25-50ng/ml;Gastrin,10-15nM;HGF,25-50ng/ml;N-acetylcysteine,1-2mM;R-spondin1,400-500ng/ml;FGF10,100-110ng/ml;FGF7,40-50ng/ml、Nicotinamide,10-20mM;Noggin,95-105ng/ml;Wnt3a,95-100ng/ml;Y-27632,10-20μM;Glutamax,1-2X;青霉素链霉素混合液,1-2X;HEPES,1-2mM。待混合胶凝固后将其加入原代提取培养基内,于37℃、5%CO2浓度下培养5天,期间每间隔3天更换一次原代提取培养基。
(7)增殖培养:配制增殖培养基,增殖培养基包括:AdvancedDMEM/F12培养基、不含Vit-A的B27,1-2X;N2,1-3X;EGF,25-50ng/ml;Gastrin,10-15nM;HGF,25-50ng/ml;N-acetylcysteine,1-2mM;R-spondin1,400-500ng/ml;FGF10,100-110ng/ml;FGF7,40-50ng/ml、Nicotinamide,10-20mM;Noggin,95-105ng/ml;Wnt3a,95-100ng/ml;Y-27632,10-20μM;Glutamax,1-2X;青霉素链霉素混合液,1-2X;HEPES,1-2mM。将经过原代培养的细胞混合液中加入胰酶,于37℃消化3min,转移至预冷的AdvancedDMEM/F12中,离心收集细胞沉淀制成胶滴,待其凝固后加入增殖培养基,于37℃、5%CO2浓度下培养3天,培养完成后制得成品大鼠肝脏类器官模型。
对比例3
本对比例提供了一种大鼠肝脏类器官模型的建立方法,包括以下步骤:
(1)样本清洗:用无菌处理后的PBS缓冲液对大鼠肝脏组织进行数次清洗,剔除明显的脂肪组织。
(2)样本剪切:将清洗完成的组织剪切为大小约1mm3的小块。
(3)组织消化:①将剪切好的组织分散在灭菌好的PBS中,离心去上清后收集肝脏组织沉淀;
②然后将肝脏组织沉淀放入15ml离心管中并加入2mg/ml的胶原酶与15U/ml的DNaseI,于37℃水浴消化1h,每隔10min涡旋一次,加入PBS终止消化,静置沉淀得到第一上清液和第一细胞沉淀;
③向第一细胞沉淀内加入2mg/ml的胶原酶与15U/ml的DNaseI,于37℃水浴消化1h,每隔10min涡旋一次,加入PBS终止消化,静置沉淀得到第二上清液并与步骤②的第一上清液合并得到粗品大鼠肝脏干细胞。
(4)过滤:将粗品大鼠肝脏干细胞经100μm的滤网过滤,收集滤液;将收集的滤液经过40μm的滤网过滤,收集滤渣,用100μLAdvanced DMEM/F12培养基重悬滤渣。
(5)制胶:取200ul Matrigel胶(4℃融化),与细胞悬液充分混匀,滴到12孔板内,每滴约50ul,静置2min,倒扣在细胞培养箱内。
(6)原代培养:配制原代提取培养基,原代提取培养基包括:AdvancedDMEM/F12培养基、不含Vit-A的B27,1-2X;N2,1-3X;EGF,25-50ng/ml;Gastrin,10-15nM;HGF,25-50ng/ml;N-acetylcysteine,1-2mM;R-spondin1,400-500ng/ml;FGF10,100-110ng/ml;FGF7,40-50ng/ml、Nicotinamide,10-20mM;Noggin,95-105ng/ml;Wnt3a,95-100ng/ml;Y-27632,10-20μM;Glutamax,1-2X;青霉素链霉素混合液,1-2X;HEPES,1-2mM。待混合胶凝固后将其加入原代提取培养基内,于37℃、5%CO2浓度下培养5天,期间每间隔3天更换一次原代提取培养基。
(7)增殖培养:配制增殖培养基,增殖培养基包括:AdvancedDMEM/F12培养基、不含Vit-A的B27,1-2X;N2,1-3X;EGF,25-50ng/ml;Gastrin,10-15nM;HGF,25-50ng/ml;N-acetylcysteine,1-2mM;R-spondin1,400-500ng/ml;FGF10,100-110ng/ml;FGF7,40-50ng/ml、Nicotinamide,10-20mM;Noggin,95-105ng/ml;Wnt3a,95-100ng/ml;Y-27632,10-20μM;Glutamax,1-2X;青霉素链霉素混合液,1-2X;HEPES,1-2mM。将经过原代培养的细胞混合液中加入胰酶,于37℃消化3min,转移至预冷的AdvancedDMEM/F12中,离心收集细胞沉淀制成胶滴,待其凝固后加入增殖培养基,于37℃、5%CO2浓度下培养3天,培养完成后制得成品大鼠肝脏类器官模型。
结论分析
(1)参照图1-3,图1-3中可以明显看出空泡状的大鼠肝脏类器官,证明本发明提供的方法可以建立完整的大鼠肝脏类器官模型。且附图中的环形区域由大鼠肝脏干细胞群构成,可以证明本发明提供的类器官模型是具有高度相关性的生理系统,相较于单一细胞模型具有明显的优势。
(2)参照图4-5,和表1:
表1实施例1及对比例1-2类器官培养成活例数及周期
可以得出以下结论:
a.当胶原酶的浓度由0.5mg/ml上升至5mg/ml的过程中,类器官的成活率整体呈现了先上升后下降的趋势;
b.当胶原酶的浓度由0.5mg/ml上升至5mg/ml的过程中,类器官的培养周期呈现了先降低后上升的趋势。
故综合考虑类器官的成活率和培养周期,胶原酶的浓度优选在2mg/ml。当胶原酶在2mg/ml时,类器官的成活率可以达到80%,且培养周期可以控制在14-20天,具有极高的类器官培养效率。
(3)参照图6,对比例3中去除了分散酶的添加,在常规使用中,分散酶一般起到均匀分化的作用。而在本申请中,分散酶和胶原酶可以起到一定的复配效果,当消化过程中额外添加了分散酶后,会对类器官的成活率具有小幅度的提升。
综上所述,本发明提供的大鼠肝脏类器官模型的建立方法,具有以下的有益效果:
本发明中大鼠肝脏类器官模型建立方法与常规方法相比,一方面大大缩短了培养周期:从取材到模型的获得,时间周期约为14~20天,而常规的培养方法耗时30天,明显提高了模型应用的局限性。另一方面,本发明方法明显提高了大鼠肝脏类器官培养的成功率并加快原代培养中类器官的生长速度。
本发明利用大鼠成体干细胞建立的肝脏类器官模型包括一个自我更新干细胞群,可分化为与来源器官特异性的细胞类型,是一个生理高度相关系统,相对于细胞系模型功能单一、动物模型成本高,周期长的特点,更加具有应用价值。
应说明的是,以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本申请进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本申请的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本申请技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本申请的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种大鼠肝脏类器官模型的建立方法,其特征在于:包括以下步骤:
取大鼠肝脏组织,依次进行清洗、剪切、消化和过滤处理,处理完成后得到大鼠肝脏干细胞;
对大鼠肝脏干细胞进行培养,培养完成后得到成品大鼠肝脏类器官模型。
2.根据权利要求1所述的大鼠肝脏类器官模型的建立方法,其特征在于:所述消化包括:
将剪切后的大鼠肝脏组织分散在灭菌处理过的PBS缓冲液中,并进行离心处理后收集肝脏组织沉淀;
取肝脏组织沉淀并向其中加入胶原酶、分散酶和DNaseI,在37℃下水浴消化1h,并以固定时间间隔涡旋若干次,然后加入PBS缓冲液终止消化,静置沉淀后得到第一上清液和第一细胞沉淀。
3.根据权利要求2所述的大鼠肝脏类器官模型的建立方法,其特征在于:所述消化还包括:
取第一细胞沉淀并向其中加入胶原酶、分散酶和DNaseI,在37℃下水浴消化1h,并以固定时间间隔涡旋若干次,然后加入PBS缓冲液终止消化,静置沉淀后得到第二上清液和第二细胞沉淀;
将第一上清液和第二上清液合并得到粗品大鼠肝脏干细胞。
4.根据权利要求2或3所述的大鼠肝脏类器官模型的建立方法,其特征在于:所述消化中:胶原酶的浓度均设置为2mg/ml。
5.根据权利要求4所述的大鼠肝脏类器官模型的建立方法,其特征在于:所述过滤包括:将粗品大鼠肝脏干细胞过滤得到滤液和滤渣,所述滤渣为成品大鼠肝脏干细胞。
6.根据权利要求5所述的大鼠肝脏类器官模型的建立方法,其特征在于:所述培养包括:原代培养和增殖培养。
7.根据权利要求6所述的大鼠肝脏类器官模型的建立方法,其特征在于:所述原代培养包括:将成品大鼠肝脏干细胞加入Matrigel胶混合均匀,待混合胶体凝固后加入原代提取培养基,于37℃、5%CO2浓度下培养5-10天,期间每间隔3-4天更换一次培养基。
8.根据权利要求7所述的大鼠肝脏类器官模型的建立方法,其特征在于:所述原代提取培养基包括:AdvancedDMEM/F12培养基、不含Vit-A的B27,1-2X;N2,1-3X;EGF,25-50ng/ml;Gastrin,10-15nM;HGF,25-50ng/ml;N-acetylcysteine,1-2mM;R-spondin1,400-500ng/ml;FGF10,100-110ng/ml;FGF7,40-50ng/ml、Nicotinamide,10-20mM;Noggin,95-105ng/ml;Wnt3a,95-100ng/ml;Y-27632,10-20μM;Glutamax,1-2X;青霉素链霉素混合液,1-2X;HEPES,1-2mM。
9.根据权利要求6-8任一所述的大鼠肝脏类器官模型的建立方法,其特征在于:所述增殖培养包括:在经原代培养的细胞混合液中加入胰酶,于37℃消化3min,转移至预冷的AdvancedDMEM/F12中,离心收集细胞沉淀制成胶滴,待其凝固后加入增殖培养基,于37℃、5%CO2浓度下培养2-4天。
10.根据权利要求9所述的大鼠肝脏类器官模型的建立方法,其特征在于:所述增殖培养基包括:AdvancedDMEM/F12培养基、不含Vit-A的B27,1-2X;N2,1-3X;EGF,25-50ng/ml;Gastrin,10-15nM;HGF,25-50ng/ml;N-acetylcysteine,1-2mM;R-spondin1,400-500ng/ml;FGF10,100-110ng/ml;FGF7,40-50ng/ml、Nicotinamide,10-20mM;Noggin,95-105ng/ml;Wnt3a,95-100ng/ml;Y-27632,10-20μM;Glutamax,1-2X;青霉素链霉素混合液,1-2X;HEPES,1-2mM。
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---|---|---|---|---|
CN116769699A (zh) * | 2023-07-13 | 2023-09-19 | 中国科学院力学研究所 | 一种肝干细胞来源的肝脏类器官培养和分化方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111454878A (zh) * | 2020-03-13 | 2020-07-28 | 张高华奥生命科学(上海)有限公司 | 类器官病毒感染模型的构建方法和应用 |
CN111961642A (zh) * | 2020-08-10 | 2020-11-20 | 创芯国际生物科技(广州)有限公司 | 一种小鼠肝脏类器官模型及其建立方法和应用 |
CN111979183A (zh) * | 2020-08-10 | 2020-11-24 | 创芯国际生物科技(广州)有限公司 | 一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法 |
CN112920989A (zh) * | 2021-02-09 | 2021-06-08 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种肝脏类器官模型及其建立方法、用途以及治疗肝细胞铁死亡的药物组合物 |
-
2022
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111454878A (zh) * | 2020-03-13 | 2020-07-28 | 张高华奥生命科学(上海)有限公司 | 类器官病毒感染模型的构建方法和应用 |
CN111961642A (zh) * | 2020-08-10 | 2020-11-20 | 创芯国际生物科技(广州)有限公司 | 一种小鼠肝脏类器官模型及其建立方法和应用 |
CN111979183A (zh) * | 2020-08-10 | 2020-11-24 | 创芯国际生物科技(广州)有限公司 | 一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法 |
CN112920989A (zh) * | 2021-02-09 | 2021-06-08 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种肝脏类器官模型及其建立方法、用途以及治疗肝细胞铁死亡的药物组合物 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116769699A (zh) * | 2023-07-13 | 2023-09-19 | 中国科学院力学研究所 | 一种肝干细胞来源的肝脏类器官培养和分化方法 |
CN116769699B (zh) * | 2023-07-13 | 2024-05-03 | 中国科学院力学研究所 | 一种肝干细胞来源的肝脏类器官培养和分化方法 |
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