CN116769699B - 一种肝干细胞来源的肝脏类器官培养和分化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝干细胞来源的肝脏类器官培养和分化方法，所述方法包括如下步骤：S1：肝干细胞培养S11：配制基础培养基；S12：对所述肝干细胞进行接种，加入所述基础培养基进行培养、传代，得到特定数量用于类器官构建的肝干细胞；S2：细胞成球培养；S3：肝脏类器官的增殖培养；S4：肝脏类器官的分化、成熟S41：更换所述固‑液混合物中的培养基为P型分化培养基，完成第一阶段分化；S42：再次将培养基更换为M型分化培养基，完成第二阶段分化，得到成熟的肝脏类器官。发明实现对类器官球体松散问题的进一步解决，且分化得到的肝脏类器官具有较高的成熟度，具有肝脏特定的细胞组成、结构和生理功能。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种肝干细胞来源的肝脏类器官培养和分化方法。
背景技术
肝脏是人体最重要的代谢器官，对于维持人体的生理稳态具有重要作用。各种原因导致的肝脏疾病已成为全球人类主要死亡原因之一，因此，迫切需要一种能够反映人体肝脏真实生理功能的肝脏疾病模型来进行实验和临床研究。
现有技术中常以人体肝脏驻留干细胞即成体干细胞（也包括肿瘤细胞）为来源构建肝脏类器官的培养方案，目前肝干细胞来源的肝脏类器官构建方法多采用悬滴法或U型底法，使得细胞形成三维球状结构，再结合不同种类生物化学因子进行增殖培养或分化，从而形成具有特定结构和功能的肝脏类器官。
但基于目前技术方法所构建的肝脏类器官的三维球状结构较松散，在后期增殖传代的过程中易散开，且成熟度不高，导致所分化形成的肝脏类器官内含有的细胞种类有限，因而不能很好地模拟和反映肝脏的功能，这些因素制约了成体干细胞来源的肝脏类器官的研究和应用。
现需要一种肝脏类器官培养和分化方法，不仅能够解决类器官球体松散问题，还可以获得一种高成熟度的肝脏类器官。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肝干细胞来源的肝脏类器官培养和分化方法，以解决现有技术中类器官球体松散、分化得到的肝脏类器官成熟度低的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明具体提供下述技术方案：
本发明提供了一种肝干细胞来源的肝脏类器官培养和分化方法，所述方法包括如下步骤：
S1：肝干细胞培养：
S11：配制基础培养基；
S12：对所述肝干细胞进行接种，加入所述基础培养基进行培养，隔天换液，80%汇合时进行传代，得到特定数量用于类器官构建的肝干细胞和培养液悬液；
S13：对所述细胞和培养液悬液进行第一次离心，弃去上清取细胞沉淀；
S2：细胞成球培养：
S21：向所述细胞沉淀中依次加入所述基质胶、基础培养基，吹打均匀，得到含有单细胞的基质胶-培养基混合液；
S22：将所述混合液按特定体积接种于培养板中置于37℃孵箱进行第一次孵育；
S23：向孵育完成的所述混合液中加入所述基础培养基，进行第二次孵育，得到固-液混合物；
其中，所述固-液混合物中含有含肝脏类器官的基质胶半球；
S3：肝脏类器官的增殖培养：
S31：对所述固-液混合物进行第二次离心处理，弃去上清，得到固溶物；
S32：向所述固溶物中加入等体积所述基质胶，混合均匀，重复步骤S22-S23，得到增殖后的所述固-液混合物；
S4：肝脏类器官的分化、成熟：
S41：更换所述固-液混合物中的培养基为P型分化培养基，完成第一阶段分化；
S42：再次将培养基更换为M型分化培养基，完成第二阶段分化，得到成熟的肝脏类器官。
作为本发明的一种优选方案，所述基础培养基由Williams’E培养基、10% FBS以及1%双抗组成。
作为本发明的一种优选方案，在步骤S12中，所述传代包括如下条件：0.25%胰酶消化所述肝干细胞3分钟。
作为本发明的一种优选方案，按照体积份数比，所述细胞液为10份、所述基础培养基为100份、所述基质胶为200份。
作为本发明的一种优选方案，所述第一次孵育的时间满足25 min；
所述第二次孵育满足以下条件：时间为7d，隔天或隔两天换液。
作为本发明的一种优选方案，所述第一次离心满足以下条件：170×g 离心3 min。
作为本发明的一种优选方案，所述第二次离心满足以下条件：170×g离心5min。
作为本发明的一种优选方案，所述P型分化培养基由HCM培养基、20 ng/mL BMP2、20 ng/mL FGF4以及1% DMSO组成。
作为本发明的一种优选方案，所述M型分化培养基由HCM培养基、1 ng/mLSB41542、20 ng/mL HGF、20 ng/mL OSM、100 nM地塞米松以及1% DMSO组成。
作为本发明的一种优选方案，所述第一阶段分化满足以下条件：分化培养7d；所述第二阶段分化满足以下条件：分化培养7d-14d。
本发明与现有技术相比较具有如下有益效果：
本发明基于基质胶包埋技术的肝脏类器官构建方法，将肝干细胞包埋于基质胶中构建肝脏类器官，在特定培养时间使用含独特组成及配比的肝脏类器官增殖培养基或分化培养基对肝脏类器官进行培养及分化，得到的一种肝脏类器官，生长状态良好；使用本发明发展的肝脏类器官构建的操作技术、培养基配方及培养时间等条件培养的类器官，进一步解决类器官球体松散问题，且分化得到的肝脏类器官具有较高的成熟度，具有肝脏特定的细胞组成、结构和生理功能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明提供实施例1中免疫荧光检测HepaRG干性及细胞形态检测图（其中SOX9及LGR5为肝干细胞标志物）；
图2为本发明提供实施例1中HepaRG来源肝脏类器官的增殖和分化形态的光镜检测图。
图3为本发明提供实施例1中免疫荧光检测标志物蛋白表达的示意图（CK19-为胆管细胞标志物；ALB-为肝细胞标志物）
图4为本发明提供实施例1中免疫印迹方法检测标志物蛋白表达的定量检测图表（SOX9-为肝干细胞标志物；AFP、CK19、ALB、CK18、HNF4α-为肝细胞标志物）。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
以下涉及的肝脏类器官构建方法、培养基配方及培养时间对肝脏干细胞来源（含肝组织来源）肝脏类器官的构建具有普适性。
现以人肝干细胞系HepaRG为例进行说明：
1、肝干细胞培养
11）配制基础培养基：基础培养基组成及比例：Williams’E培养基 + 10% FBS +1%双抗；
12）将HepaRG细胞接种在T25瓶中，加入5mL基础培养基进行培养，隔天换液；80%汇合时传代，一传四瓶；
13）传代使用0.25%胰酶消化3分钟后终止，170×g离心3 min。
2、HepaRG成球培养
21）HepaRG细胞消化后，吹打为单细胞，吸取吹打为含有单细胞的细胞液10 μL到一个新的1.5 mL EP管中，加入100 μL基础培养基，再加入200 μL基质胶（如Matrigel）混匀，得到混合液；
22）用移液枪吸取混合液30 μL点入24孔板孔中央，倒扣24孔板，置于37℃孵箱孵育25 min；
23）在24孔板的每个孔中加入750 μL基础培养基，放回孵箱，隔天或隔两天换液，共培养7天，此时增殖阶段肝脏类器官（HepaRG growth organoid, HGO）体积增大，得到固-液混合物，固-液混合物中含有含肝脏类器官的基质胶半球。
3、肝脏类器官的增殖培养及传代
31）将24孔板中所有液体及含肝脏类器官的基质胶半球吸入到15mL离心管中；吸取约750 μL基础培养基，清洗24孔板孔后得到清洗液，清洗液与所有液体及含肝脏类器官的基质胶半球一并加入离心管，170×g离心5min后，弃去上清，得到固溶物；
32）将固溶物按照1传4的比例加入等体积基质胶，混匀后操作重复第22）-23）条，替换22）-23）条中的混合液。
4、HGO分化为成熟的肝脏类器官（HepaRG differentiation organoid, HDO）
41）配制P型分化培养基以及M型分化培养基；
P型培养基组成及比例：HCM培养基 + 20 ng/mL BMP2 + 20 ng/mL FGF4 + 1%DMSO；
M型分化培养基组成及比例：HCM培养基 + 1 ng/mL SB41542 + 20 ng/mL HGF +20 ng/mL OSM + 100 nM 地塞米松 + 1% DMSO；
42）HGO培养7天后进行传代（操作同第步骤2），并更换培养基为P型分化培养基；
43）分化7天后，再次将培养基更换为M型分化培养基，继续培养7天-14天；
44）进行取样检测。
表征与总结：
1、对实施例中步骤1中使用的肝干细胞（即HepaRG）进行表型检测，结果表明实施例1的培养条件下HepaRG能很好维持形态和表型（图1），即采用适量的基础培养基能够有效维持肝干细胞的形态和表型。
2、在本实施例中，对HepaRG成球培养后，本实施例第3步骤增殖培养、本实施例第4步骤分化后的肝脏类器官的形态及表型，分别在HGOs阶段第7天、HDOs阶段第7天、HDOs阶段第14天、HDOs阶段第21天的形态进行检测（图2），结果显示本专利使用的培养基及培养条件有利于肝脏类器官的生长和分化。
3、在本实施例第2步骤HepaRG成球培养后、第3步骤增殖培养、第4步骤分化后的肝脏类器官的形态及表型，分别在HGOs阶段、HDOs-7天、HDOs-14天、HDOs-21天在蛋白水平进行定位（图3）及定量（图4）检测，结果表明本实施例使用的培养基及培养条件有利于肝脏类器官的成熟。
通过本实施例的肝干细胞来源的肝脏类器官培养和分化方法，可以进一步解决类器官球体松散问题，且分化得到的肝脏类器官具有较高的成熟度，具有肝脏特定的细胞组成、结构和生理功能。
以上实施例仅为本申请的示例性实施例，不用于限制本申请，本申请的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本申请的实质和保护范围内，对本申请做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本申请的保护范围内。
Claims (2)
1.一种肝干细胞来源的肝脏类器官培养和分化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1：肝干细胞培养：
S11：配制基础培养基；
S12：对所述肝干细胞进行接种，加入所述基础培养基进行培养，隔天换液，80%汇合时进行传代，得到特定数量用于类器官构建的肝干细胞和培养液悬液；
S13：对所述细胞和培养液悬液进行第一次离心，弃去上清取细胞沉淀；
所述肝干细胞为人肝干细胞系HepaRG；
S2：细胞成球培养：
S21：向所述细胞沉淀中依次加入所述基质胶、基础培养基，吹打均匀，得到含有单细胞的基质胶-培养基混合液；
S22：将所述混合液按特定体积接种于培养板中置于37℃孵箱进行第一次孵育；
S23：向孵育完成的所述混合液中加入所述基础培养基，进行第二次孵育，得到固-液混合物；
其中，所述固-液混合物中含有含肝脏类器官的基质胶半球；
所述基础培养基由Williams’E培养基、10% FBS以及1%双抗组成；
按照体积份数比，所述细胞液为10份、所述基础培养基为100份、所述基质胶为200份；
所述第一次孵育的时间满足25 min；
所述第二次孵育满足以下条件：时间为7d，隔天或隔两天换液；
S3：肝脏类器官的增殖培养：
S31：对所述固-液混合物进行第二次离心处理，弃去上清，得到固溶物；
S32：向所述固溶物中加入等体积所述基质胶，混合均匀，重复步骤S22-S23，得到增殖后的所述固-液混合物；
S4：肝脏类器官的分化、成熟：
S41：更换所述固-液混合物中的培养基为P型分化培养基，完成第一阶段分化；
S42：再次将培养基更换为M型分化培养基，完成第二阶段分化，得到成熟的肝脏类器官；
所述第一次离心满足以下条件：170×g 离心3 min；
所述第二次离心满足以下条件：170×g离心5min；
所述P型分化培养基由HCM培养基、20 ng/mL BMP2、20 ng/mL FGF4以及1% DMSO组成；
所述M型分化培养基由HCM培养基、1 ng/mL SB41542、20 ng/mL HGF、20 ng/mL OSM、100 nM地塞米松以及1% DMSO组成；
所述第一阶段分化满足以下条件：分化培养7d；所述第二阶段分化满足以下条件：分化培养7d-14d。
2.根据权利要求1所述的一种肝干细胞来源的肝脏类器官培养和分化方法，其特征在于，
在步骤S12中，所述传代包括如下条件：0.25%胰酶消化所述肝干细胞3分钟。
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