KR20190127041A - 간 오가노이드 및 그의 제조 방법 - Google Patents

간 오가노이드 및 그의 제조 방법 Download PDF

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유재성
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문선주
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Abstract

본 발명은 신규 간 오가노이드 제조 방법 및 이에 따라 생성된 간 오가노이드, 및 이를 포함하는 간 모사체를 제공한다.
본 발명의 간 오가노이드 제조 방법에 따라 생성된 간 오가노이드, 및 이를 포함하는 간 모사체는 우수한 간세포 특이적 표현형을 나타내며, 정상간 특성 또는 지방간 특성을 잘 나타내는 간모사체로 활용될 수 있다.

Description

간 오가노이드 및 그의 제조 방법{liver organoid and method of preparing the same}
본 발명은 신규 간 오가노이드 및 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 삼차원 간 모사체에 관한 것이다.
신약 개발시 후보물질의 독성과 효능을 체외에서 평가할 수 있는 세포 배양 시스템의 중요성은 날로 증가하고 있다. 그러나 종래의 2D 세포주 배양법은 세포가 유래한 위치 고유의 성질과 조직 단위의 특성을 재현해내기 힘들다는 단점이 있다. 또한, 동물실험 모델은 인체와 유전적, 생물학적인 특성이 상이하기 때문에 약물 시험 반응의 신뢰성에 한계가 있다. 이에 대한 대안으로 암 환자 유래 이종 이식 모델이 활용되기도 하지만 대규모 약물 스크리닝에는 부적합하다는 단점이 있다.
문헌[Fatehullah et al., Nature cell biology 18.3 (2016): 246.]에 따르면 기존의 문제점을 보완할 새로운 약물 스크리닝 플랫폼으로서 오가노이드가 주목받고 있다. 오가노이드 기술은 환자 오가노이드 뱅킹, 다양한 질병 모델링, 유전체 교정 기술 융합을 통한 재생 치료, 환자 유전체 정보와 연계한 맞춤 치료 및 정밀 치료 등 다양한 잠재적 응용 가능성을 보여주고 있다.
사람 생체 내 조직 구성을 정확히 재현하는 오가노이드를 형성하는 과정은 단순한 기초 연구 도구에서부터 응용 연구의 플랫폼까지 다양하게 적용할 수 있게 확장되었다. 유전적 변화 없이 대량으로 오가노이드를 배양할 수 있다면, 오가노이드는 초고속 스크리닝을 위한 좋은 모델이 될 수 있으며, 환자 맞춤형 표적 치료에 이용될 수 있고, 재생의학 분야에 적용될 수 있는 완벽한 조직을 제공할 수 있다.
그러나 오가노이드 배양은 생존력, 크기 및 형태 측면에서 이질적인 세포가 한데 혼합되게 되므로, 배양 세포의 이질적 특성에 따라 약물 독성 및 효능 분석의 예측을 어렵게 만든다. 이러한 오가노이드의 제작의 한계를 극복하고 신약개발시 후보물질의 독성과 효능을 평가할 수 있는 인체모사 간 시스템 개발이 요구되고 있다.
본 발명자는 상기 종래기술의 문제점을 개선하고자 예의 노력한 결과, 후술할 고기능의 간 모사체를 제작할 수 있는 배양 용기, 배양 세포 및 그의 조합, 배양 조건 및 배양 시간을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신규 간 오가노이드 제조 방법 및 이에 따라 생성된 간 오가노이드, 및 이를 포함하는 삼차원 간 모사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신규 지방간 오가노이드 제조 방법 및 이에 따라 생성된 지방간 오가노이드, 및 이를 포함하는 삼차원 지방간 모사체를 제공하는 것이다.
본 발명은 (a) 생적합성 매트릭스를 포함하고 바닥이 오목부로 형성된 배양 용기에 배양 배지, 미분화 간세포, 혈관 내피 세포, 및 중간엽 줄기세포를 투여하는 단계; (b) 상기 배양 용기에 간세포 성숙인자를 투여하여 간세포 분화를 유도하는 단계; 및 (c) 상기 배양 용기에서 3차원 배양을 수행하여 세포 집합체 형성을 유도하는 단계를 포함하는 간 오가노이드 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 오가노이드 (organoid)란 자가 조직화가 가능한 3차원 세포 집합체를 의미한다. 오가노이드는 실제 조직의 해부 구조를 모방하는 소형의 단순화된 형태의 생체 외 3 차원 기관 (organ)으로, 다양한 약물 스크리닝 및 질환 모델로 사용될 수 있다.
본 발명에서, 간 오가노이드 제조 방법은 생적합성 매트릭스를 포함하고 바닥이 오목부로 형성된 배양 용기에 배양 배지, 미분화 간세포, 혈관 내피 세포, 및 중간엽 줄기세포를 투여하는 단계 (a)를 포함한다.
상기 단계 (a)에서, 배양 용기는 생적합성 매트릭스를 포함한다. 생적합성 매트릭스는 생체 외 3차원 세포 배양에 적합한 당업계에 공지된 생체 적합성 소재일 수 있다. 상기 생적합성 매트릭스는 세포외 기질, 매트리겔 (Matrigel), 콜라겐, 아가로스, 메틸셀룰로스, 폴리우레탄, 및 히알루론산으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 생적합성 매트릭스는 매트리겔이다.
상기 단계 (a)에서, 배양 용기는 바닥이 오목부로 형성된다. 상기 배양 용기는 바닥이 오목한 형태를 가짐에 따라 투입된 세포가 중력에 의해 응집되는 효과가 있다. 상기 배양 용기는 바닥이 둥근 형태, 반구 형태, 또는 V-자 형태일 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 배양 용기는 코니칼 튜브 (cornical tube)이다. 본 발명에서, 바닥이 오목부로 형성된 배양 용기를 사용할 경우 바닥이 평평한 배양 용기를 사용한 방식에 비해 3차원 배양 세포의 세포 응집이 현저히 개선되어, 종래 기술보다 효율적으로 간 오가노이드를 제조할 수 있음을 확인하였다 (도 1의 A).
상기 단계 (a)에서, 미분화 간세포 (undifferentiated hepatocyte)는 간세포로 최종 분화될 수 있는 줄기세포, 전구세포, 또는 세포주 등을 의미한다. 상기 미분화 간세포는 일차 간 전구세포의 특성을 갖는 세포주일 수 있다 (배아줄기세포 또는 유도만능 줄기세포 유래 간 전구세포 등). 일 실시양태에서, 미분화 간세포는 미분화 HepaRG 세포주이다.
상기 단계 (a)에서, 혈관 내피 세포 (vascular endothelial cell)는 혈관 내강에 접하는 내막을 구성하는 한 층의 세포를 의미한다. 일 실시양태에서, 상기 혈관 내피 세포는 인간 탯줄 정맥 내피 세포 (human umbilical vein endothelial cells; HUVEC)이다.
상기 단계 (a)에서, 중간엽 줄기세포는 골수, 탯줄, 지방 조직, 말초 혈액 등에서 유래된 다분화능을 가진 기질 세포로서, 조골 세포, 연골 세포, 근육 세포, 지방 세포를 포함한 다양한 세포로 분화할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 제대혈에서 유래한 중간엽 줄기세포이다.
상기 단계 (a)에서 배양 배지는 미분화 간세포, 혈관 내피 세포, 및 중간엽 줄기세포의 배양에 적합한 것으로 당업계에 공지된 배양 배지일 수 있다. 예컨대, 상기 배양 배지는 William’s E 배지, Medium 199 배지, MEM 알파 배지, Advanced DMEM/F12, 또는 DMEM 배지일 수 있다. 상기 배양 배지는 인슐린-트란스페린-셀레늄 (ITS), 하이드로코르티손 헤미숙시네이트, basic fibroblast growth factor, 헤파린, FBS, 글루타메이트, HEPES, B27, N2, N-Acetylcystein, 니코틴아마이드, gastrin, EGF, HGF, Forskolin, A83-01, Oncostatin M, 덱사메타손, DAPT, BMP7, FGF19, 또는 이들의 혼합물로 보충될 수 있다. 오가노이드 제조 배지는 미분화 간세포 배양배지와 혈관 내피세포 배양배지를 4:1로 혼합하여 사용하였다.
본 발명에 따른 간 오가노이드 제조 방법은 상기 단계 (a)를 수행하기 전에 2차원 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 2차원 배양은 약 7일 내지 약 30일까지 수행할 수 있다. 일 실시양태에서 상기 2차원 배양은 약 12일 또는 약 20일 동안 수행할 수 있다. 상기 2차원 배양을 수행할 경우, 단계 (a)를 수행하기 약 10일 전에 배양액에 간세포 분화인자를 첨가할 수 있다. 일 실시양태에서, 단계 (a)를 수행하기 약 7일 전에 간세포 분화인자를 첨가할 수 있다.
상기 단계 (a)에서 미분화 간세포 및 혈관 내피 세포 수의 비율은 1:1 내지 20:1일 수 있다. 예컨대, 미분화 간세포 및 혈관 내피 세포 수의 비율은 5:1 내지 10:1일 수 있다. 일 실시양태에서, 미분화 간세포 및 혈관 내피 세포 수의 비율은 약 5:3.5, 약 7:2 또는 약 8:1이다.
상기 단계 (a)에서 미분화 간세포 및 중간엽 줄기세포의 세포 수 비율은 0.5:1 내지 15:1일 수 있다. 예컨대, 미분화 간세포 및 중간엽 줄기세포의 세포 수 비율은 4:1 내지 10:1일 수 있다. 일 실시양태에서, 미분화 간세포 및 중간엽 줄기세포의 세포 수 비율은 약 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 또는 9:1일 수 있다.
상기 단계 (a)에서 미분화 간세포, 혈관 내피 세포, 및 중간엽 줄기세포의 세포 수 비율은 예컨대 4~10 : 0.5~5 : 1의 비율일 수 있다. 일 실시양태에서 상기 단계 (a)에서 미분화 간세포, 혈관 내피 세포, 및 중간엽 줄기세포의 세포 수 비율은 5 : 3.5 : 1, 7 : 2 : 1, 또는 8 : 1 : 1이다.
본 발명의 간 오가노이드 제조 방법은 배양 용기에 간세포 성숙인자를 투여하여 간세포 분화를 유도하는 단계 (b)를 포함한다.
상기 단계 (b)에서 간세포 성숙인자는 미분화 간세포를 분화 상태로 유도할 수 있는 당업계에 공지된 성분을 의미한다. 상기 간세포 성숙인자는 간세포 성장 인자 (hepatocyte growth factor; HGF) 또는 DMSO (dimethyl sulfoxide)일 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 간세포 성숙인자는 DMSO이다. 상기 DMSO는 약 0.1% 내지 5.0 %로 배양 배지에 첨가될 수 있으며, 구체적으로 약 1.0% 내지 약 2.0%로 배양 배지에 첨가될 수 있다.
상기 단계 (b)는 단계 (a)와 동시에 수행되거나, 또는 단계 (a) 이후, 예컨대 약 1일 내지 약 7일 후에 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, 단계 (b)는 단계 (a) 수행 약 1일 또는 2일 후에 수행된다.
본 발명의 간 오가노이드 제조 방법은 배양 용기에서 3차원 배양을 수행하여 세포 집합체를 형성하는 단계 (c)를 포함한다.
상기 단계 (c)에 따라, 3차원 배양은 5일 내지 20일 동안 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 3차원 배양은 약 7일, 10일, 또는 14일 동안 수행될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 간 오가노이드 제조 방법에 따라 생성된 간 오가노이드 및 이를 포함하는 정상간 모사체를 제공한다. 본 발명에 따른 간 오가노이드 제조 방법에 따라 생성된 간 오가노이드는 세포 집합체의 응집이 개선되고 (도 1의 A), 간세포, 혈관 내피 세포, 및 중간엽 줄기세포가 적절히 분포되어 있음을 확인하였다 (도 4). 또한, 상기 간 오가노이드는 기존의 2차원 배양법에 의해 제조된 간 세포에 비해 간 특이적 유전자 발현 수준이 현저히 상승하고 (도 2), 간 기능을 나타내는 알부민 생성 및 CYP3A4 활성 또한 현저히 상승하였다 (도 3). 따라서, 본 발명에 따른 간 오가노이드 제조 방법에 따라 생성된 정상간 오가노이드는 고기능성 간 모사체로 활용될 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 생적합성 매트릭스를 포함하고 바닥이 오목부로 형성된 배양 용기에 배양 배지, 미분화 간세포, 혈관 내피 세포, 및 중간엽 줄기세포를 투여하는 단계; (b) 상기 배양 용기에 간세포 성숙인자를 투여하여 간세포 분화를 유도하는 단계; (c) 상기 배양 용기에서 포도당 및 지방산을 투여하는 단계; 및 (d) 상기 배양 용기에서 3차원 배양을 수행하여 세포 집합체 형성을 유도하는 단계를 포함하는 지방간 오가노이드 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 지방간 오가노이드 제조 방법에서, 단계 (a), 및 단계 (b)는 위에서 설명한 바와 같다.
본 발명에 따른 지방간 오가노이드 제조 방법은 배양 용기에서 포도당 및 지방산을 투여하는 단계 (c)를 포함한다. 지방산으로는 올레이트, 팔미테이트 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 일 실시양태에서, 상기 지방산은 팔미테이트이다. 상기 단계 (c)에서, 포도당은 약 1 mM 내지 500 mM의 농도, 예컨대 약 10 mM 내지 100 mM의 농도로 배양 용기에 투여될 수 있고, 지방산은 약 10 μM 내지 약 10 mM의 농도로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 지방간 오가노이드 제조 방법에서, 상기 단계 (c)는 단계 (a)와 동시에, 또는 약 10일 후에 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 단계 (c)는 (a)를 수행한 후 약 7일 째에 수행될 수 있다.
본 발명의 지방간 오가노이드 제조 방법은 배양 용기에서 3차원 배양을 수행하여 세포 집합체를 형성하는 단계 (d)를 포함한다.
상기 단계 (d)에 따라, 3차원 배양은 단계 (a) 또는 단계 (b)를 수행한 후 5일 내지 20일 동안 수행될 수 있고, 단계 (c)를 수행한 후 약 3일 내지 약 14일 동안 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 단계 (d)는 단계 (c)를 수행한 후 약 5일 동안 수행된다.
본 발명은 또한, 상기 지방간 오가노이드 제조 방법에 따라 생성된 지방간 오가노이드 및 이를 포함하는 지방간 모사체를 제공한다. 본 발명에 따른 지방간 오가노이드 제조 방법에 따라 생성된 지방간 오가노이드는 포도당 생성 작용 및 지방 생성 작용에 관여하는 유전자 및 단백질의 발현이 현저히 상승하여 (도 10 및 도 11) 세포 내 중성지방 염색 및 트리글리세리드 양이 현저히 증가하였고 (도 12 및 도 13), 글루코스 흡수 능력이 억제되어 있음을 확인하였다 (도 14).
본 발명에 따른 신규 간 오가노이드 제조 방법은 세포 집합체의 응집을 개선시켜, 간 오가노이드의 제작 성공률을 현저히 개선한다. 이에 따라 제조된 간 오가노이드는 우수한 간세포 특이적 표현형을 나타내며, 정상간 특성을 잘 나타내는 간모사체로 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 신규 지방간 오가노이드의 제조 방법은 우수한 지방간 모델 특이적 표현형을 나타내므로, 질환 특성을 잘 나타내는 지방간 모사체로 활용될 수 있다.
도 1은 3차원 간 스페로이드 제조 방법의 도식을 나타낸다.
도 2는 3차원 배양 방법에 따른 간세포 특이적 유전자 발현 수준 증가를 나타낸다.
도 3은 3차원 배양 방법에 따른 알부민 생성 및 CYP3A4 활성 증가를 나타낸다.
도 4는 3차원 배양 방법에 따라 제조된 간 스페로이드에서 간세포, 혈관 내피 세포, 및 중간엽 줄기세포의 분포를 나타낸다.
도 5는 3차원 배양 방법의 다양한 배양 조건의 도식을 나타낸다.
도 6은 3차원 배양 시기에 따른 간세포 특이적 유전자 발현 수준의 차이를 나타낸다.
도 7은 배양 세포의 비율에 따른 간세포 특이적 유전자 발현 수준의 차이를 나타낸다.
도 8은 분화 시기에 따른 간세포 특이적 유전자 발현 수준의 차이를 나타낸다.
도 9는 지방간 스페로이드의 제조방법의 도식을 나타낸다.
도 10은 지방간 스페로이드에서 포도당 생성 및 지방 생성 관련 유전자의 발현 수준 증가를 나타낸다.
도 11은 지방간 스페로이드에서 포도당 생성 및 지방 생성 관련 단백질의 발현 수준 증가를 나타낸다.
도 12는 지방간 스페로이드에서 중성지방 염색에 따라 지질 수치의 증가를 확인한 결과를 나타낸다.
도 13은 지방간 스페로이드에서 트리글리세리드의 수치 증가를 나타낸다.
도 14는 지방간 스페로이드에서 글루코스 흡수 저하를 나타낸다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 예시적으로 제공되었을 뿐, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에 한정되지 않는다.
< 실시예 1> 실험 재료 및 방법
본 발명에 공통적으로 사용된 실험 재료 및 방법을 하기에 설명한다.
1-1. 세포배양
미분화 HepaRG 세포 (HPR101, Biopredic International, Saint Gregoire, France)를 1X GlutaMAX (ThermoFisher Scientific), 10% (v/v) 우태아 혈청 (FBS, RMBIO, Missoula, MT, USA), 50 U/mL 페니실린 및 50 μg/mL 스트렙토마이신 (ThermoFisher), 1X 인슐린-트란스페린-셀레늄 (ITS, ThermoFisher Scientific), 및 5 × 10-5 하이드로코르티손 헤미숙시네이트 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas USA)로 보충된 William`s E 배지 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 배양하였다.
배지를 매 2 일마다 바꾸어주었고, 세포 증식을 위해 이전 계대로부터 14 일 후 1:4 비율로 계대 배양하였다. HUVEC을 0.2% 젤라틴 코팅된 플레이트 상에 20% FBS, 10 ng/ml의 basic fibroblast growth factor (bFGF), 및 5 unit/ml의 헤파린으로 보충된 Medium 199 (ThermoFisher Scientific)에서 배양하였다. hUCB MSC는 CEFO (Seoul, Korea)에서 구입하였고, 10% FBS, 1× MEM 비필수 아미노산 (NEAA, ThermoFisher Scientific), 1× GlutaMAX (ThermoFisher Scientific), 및 50 U/mL 페니실린 및 50 μg/mL 스트렙토마이신 (ThermoFisher)으로 보충된 MEM 알파 (Thermofisher Scientific)에서 유지하였다.
1-2. 정량적 RT- PCR
제조사의 설명서에 따라 Trizol 키트 (ThermoFisher Scientific)를 사용하여 샘플로부터 전체 RNA를 프렙하였다. 제조사의 설명서에 따라 TOPscript RT DryMIX (Enzynomics, Daejeon, Korea)를 사용하여 역전사 (RT)를 수행하였다. Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)를 사용하여 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)로 정량적 리얼-타임 PCR을 수행하였다.
PCR에 사용된 프라이머 서열은 표 1과 같다.
유전자 프라이머 서열 (정방향) 프라이머 서열 (역방향)
HNF-4a GGCCAAGTACATCCCAGCTTT
(서열번호 1)		 CAGCACCAGCTCGTCAAGG
(서열번호 2)
ALB TTTATGCCCCGGAACTCCTTT
(서열번호 3)		 AGTCTCTGTTTGGCAGACGAA
(서열번호 4)
TTR TGGGAGCCATTTGCCTCTG
(서열번호 5)		 AGCCGTGGTGGAATAGGAGTA
(서열번호 6)
RBP-4 GAGTTCTCCGTGGACGAGAC
(서열번호 7)		 TCCAGTGGTCATCATTTCCTTTC
(서열번호 8)
CK8 TCATAGACAAGGTACGGTTCC
(서열번호 9)		 GCCTAAGGTTGTTGATGTAGC
(서열번호 10)
CK18 GAGCTGCTCCATCTGTAGGG
(서열번호 11)		 CACAGTCTGCTGAGGTTGGA
(서열번호 12)
CYP34A CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
(서열번호 13)		 TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
(서열번호 14)
G6pase TGGTTGGGATTCTGGGCTGT
(서열번호 15)		 TCTACACCCAGTCCCTTGAG
(서열번호 16)
SREBP -1 TCAGCGAGGCGGCTTTGGAGCAG
(서열번호 17)		 CATGTCTTCGATGTCGGTCAG
(서열번호 18)
PGC -1a TGCCCTGGATTGTTGACATGA
(서열번호 19)		 TTTGTCAGGCTGGGGGTAGG
(서열번호 20)
FASN GTACACACCCAAGGCCAAGTA
(서열번호 21)		 GACGTGGACGGATACTTTCC
(서열번호 22)
β-actin GGACTTCGAGCAAGAGATGG
(서열번호 23)		 AGCACTGTGTTGGCGTACAG
(서열번호 24)
1-3. 웨스턴 블롯팅
간 스페로이드를 프로테아제 억제제 칵테일 (Merck Millipore, Frankfurter, Germany)을 함유한 RIPA 완충액 (Thermo Fisher Scientific)으로 얼음에서 20 분 동안 용해하고, 4 ℃에서 30 분 동안 20,000g로 원심분리하였다. 단백질 농도를 프래드포드 단백질 어세이 키트 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 총 단백질 (10 μg)을 Mini-PROTEAN TGX Gels (Bio-Rad)을 통해 분리하고, Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad)를 사용한 PVDF 멤브레인 (Bio-Rad)에 electrotransfer하였다. 그 다음, 멤브레인을 5% 스킴 밀크 (BD Biosciences)로 RT에서 2 시간 동안 블로킹하고, 특이적 일차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 멤브레인을 0.1% 트윈-20 (Sigma-Aldrich)을 함유하는 PBS로 세척한 다음, HRP-컨쥬게이션된 이차 항체 (Santa Cruz Biotechnology)로 프로브화하였다. SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific) 및 LAS-3000 (Fujifilm, Minato, Tokyo, JAPAN, www.fujifilm.com)로 밴드를 검출하였다. Image Gauge software (Fujifilm)를 사용하여 밴드를 분석하였다.
실험에 사용된 항체의 정보는 표 2와 같다.
항체 카탈로그 넘버 입수처 희석 비율
anti-Albumin A80-129A Bethyl Laboratories 1:200
anti-CD31 ab9498 Abcam 1:30
anti-CD29 NB100-92076 Novus Biologicals 1:100
anti-PGC-1a sc-13067 Santa Cruz Biotechnology 1:200
anti-PEPCK sc-271029 Santa Cruz Biotechnology 1:100
anti-FAS sc-48357 Santa Cruz Biotechnology 1:1,000
anti-DGAT2 sc-293211 Santa Cruz Biotechnology 1:200
anti-β-actin A1978 Sigma-Aldrich 1:500,000
anti-Rabbit-HRP sc-2004 Santa Cruz Biotechnology 1:1,000
anti-Mouse-HRP sc-2005 Santa Cruz Biotechnology 1:1,000
anti-Goat-Alexa488 A11055 Life Technology 1:200
anti-Rabbit-Alexa594 A21442 Life Technology 1:200
1-4. 면역조직화학
4% 파라포름알데히드 (PFA)로 간 스페로이드를 고정하였다. 고정된 간 스페로이드를 30% 수크로스 용액에 담근 다음 OCT compound (Sakura Finetek USA Inc, Torrance, CA, USA)에 임베딩하였다. 동결 절편화된 조직을 0.1% 트리톤 X-100으로 투과화시킨 후 4% 소 혈청 알부민 (Sigma)로 RT에서 2 시간 동안 블로킹하였다. 4 ℃에서 블로킹 완충액으로 희석된 일차 항체로 샘플을 염색하고, 포스페이트-완충된 식염수 (PBS)에서 0.05% 트윈-20 (Sigma)로 세척한 다음, 알렉사 플루오르-컨쥬게이션된 이차 항체 (Thermo Fisher Scientific)와 함께 RT에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 나일 레드 염색을 사용하여 지질 액적 (lipid droplet) 축적을 검출하였다. 형광 이미지를 올림푸스 현미경으로 촬영하였다.
1-5. 통계적 분석
데이터는 3개 이상의 독립된 생물학적 복제물 (replicate)의 각 대표치이다. 그래프는 CYP3A4 및 CYP4A 활성, 알부민 생산, PCT 분석, 글루코스 흡수, 및 트리글리세리드 농도에 대한 triplicate 샘플의 평균 ± SE를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트를 사용하여 그룹 간 비교를 평가하였고, P < 0.05의 수치는 통계적 유의성이 있는 것으로 고려되었다.
<실시예 2> 다세포성 3차원 간 오가노이드의 생성
in vitro에서 간 스페로이드를 생성하기 위해, 15 ml 코니칼 튜브에 매트리겔을 HUVEC 배지와 1:1로 희석하여 고형화시킨 후, HepaRG (1.6 × 106 세포/스페로이드), HUVEC (2 × 105 세포/스페로이드), 및 UCB MSC (2 × 105 세포/스페로이드)를 HepaRG : HUVEC 배양 배지 (4:1, v:v)에 혼합하여 올려주었다. 1 일 후, 적응을 위해 배지를 1% 디메틸 설폭시드 (DMSO)를 함유하는 신선한 배지로 교체하고, 전체 배양 기간 동안 1.7% DMSO를 함유하는 신선한 배지로 후속 교체하였다. 배지를 매 2 일 마다 바꾸어주었다 (도 1의 B).
그 결과, 세포 응집이 잘 이루어진 세포 집합체가 형성됨을 확인하였다. 종래 방식에 따라 24-well에서 3 차원 배양을 수행할 경우에는 배양 세포가 뭉쳐지지 않고 흩어지는 경우가 많이 발생하여 세포 집합체 제작에 어려움이 있었으나 (도 1의 가운데 사진, 제작 실패율 30%), 본 발명에 따라 기존 24-well을 코니칼 튜브로 대체할 경우 제작 실패율이 1-2 %로 감소하였다 (도 1의 B).
<실시예 3> 생성된 간 오가노이드의 표현형 확인
상기 실시예 2에서 생성된 간 오가노이드에서 간 표현형을 확인하였다. HepaRG 세포 단독 또는 HUVEC 및 MSC와 함께 2D 또는 3D 배양한 후, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 간 유전자 특이적 mRNA 발현 수준을 측정하였다.
그 결과, 본 발명에 따라 HepaRG, HUVEC 및 MSC를 3D 공배양한 간 오가노이드에서 간세포 특이적 유전자인 Hnf-4a, Alb, Ttr, Rbp-4, Ck8, Ck18의 mRNA 발현 수준이 HepaRG 세포 단독 또는 HUVEC 및 MSC와 함께 2D 배양한 그룹에 비해 현저히 상승하였음을 확인하였다 (도 2).
또한, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 알부민 생산 및 CYP3A4 활성을 측정하였다. 구체적으로, 알부민 생산량을 측정하기 위해 각 그룹 (2D 공배양 및 간 스페로이드)에서 100 μL 배양 배지를 수집하고, 제조사의 프로토콜에 따라 효소 연결 면역흡착 어세이 키트 (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA)를 사용하여 정량화하였다. CellTiter Glo 3D cell viability 어세이 키트 (Promega)를 사용하여 총 알부민 농도를 각 샘플의 총 아데노신 트리포스페이트 (ATP) 함량으로 정규화하였다.
CYP3A4 활성 측정을 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 CYP3A4에 대한 Luciferin-IPA에 의한 P450-Glo 어세이 키트 (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 CYP3A4 활성을 분석하였다. 루미노미터 (Victor X Light; Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였고, 제조사의 설명서에 따라 CellTiter Glo 3D cell viability 어세이 키트를 사용하여 결과를 ATP 농도로 정규화하였다.
그 결과, 본 발명에 따라 3D 공배양한 간 오가노이드의 알부민 생산 수준 및 CYP3A4 활성 모두 2D 배양된 간세포에 비해 현저히 상승하였음을 확인하였다 (도 3).
한편, 본 발명에 따라 3D 공배양한 간 오가노이드에서 실시예 1에 기재된 방법에 따라 면역조직형광 염색법으로 3D 배양 12 일째에 동결 절편 내 HepaRG (ALB), HUVEC (CD31), MSC (CD29) 및 세포핵 (DAPI)을 염색하였다 (blue).
그 결과, 본 발명에 따라 제조된 간 오가노이드 내에서 HepaRG (ALB), HUVEC (CD31), 및 MSC (CD29)가 조직 내에 골고루 분포되었음을 확인하였다 (도 4).
(HepaRG 단독 그룹과 비교하여 **p < 0.01 및 ***p < 0.001로 표시하였고, 2D 공배양 그룹과 비교하여 †p <0.05 및 ††p <0.01로 표시하였다. 스케일바는 50 μm를 나타낸다.)
<실시예 4> 다세포성 3차원 간 오가노이드의 생성을 위한 최적 배양 조건의 확인
4.1. Protocol A 및 B
Protocol A: 미분화 HepaRG 세포를 종래 2D 배양액에서 12 일 동안 증식시킨 다음, DMSO 함유 배지 하에서 분화를 개시하였다. 먼저 적응을 위해 1% DMSO로 1 일 동안 배양한 후, 1.7% DMSO로 추가 14 일 동안 후속 배양하였다. 상기 후속 배양 기간 중, 1.7% DMSO 배양 7일 째 (D20)에 지지 세포와 함께 7일 동안 3D 공배양을 수행하였다.
Protocol B: 미분화 HepaRG 세포를 종래 2D 배양액에서 12일 동안 증식시킨 다음, 배양 12 일째 (D12)에 HepaRG 세포를 HUVEC 및 MSC와 함께 3D 공동 배양하였다 (Protocol A에 비해 3차원 공배양 시작 날짜를 20일에서 12일로 앞당김). 배양 13일 째 (D13)에 1% DMSO로 1 일 동안 배양한 후, 1.7% DMSO로 추가 14 일 동안 후속 배양하였다.
Protocl A 및 Protocol B의 배양 방법으로 제조된 간 오가노이드에 대해 실시예 1에 기재된 방법에 따라 간 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하였다.
그 결과, Protocl B에 따라 제조된 간 오가노이드에서 간세포 특이적 유전자인 Hnf-4a, Alb, Ttr, Rbp-4, Ck8, Ck18의 mRNA 발현 수준은 Protocol A를 사용한 경우보다 현저히 상승하였음을 확인하였다 (도 6).
4.2. Protocol B1, B2, B3
간 유전자의 mRNA 발현 수준을 다양한 세포 수 비율의 조건에서 비교하였다 (Protocol B1, B2, B3). 각 프로토콜별 세포수 비율은 아래와 같았다.
HepaRG
세포수 		HUVEC
세포수 		MSC
세포수 		HepaRG:HUVEC:MSC
세포수 비율
Protocol B1 1.0 × 106 7 × 105 2 × 105 5 : 3.5 : 1
Protocol B2 1.4 × 106 4 × 105 2 × 105 7 : 2 : 1
Protocol B3 1.6 × 106 2 × 105 2 × 105 8 : 1 : 1
Protocol B1, B2 및 B3의 세포수 비율에 따라 제조된 간 오가노이드에 대해 실시예 1에 기재된 방법에 따라 간 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하였다. 그 결과, Protocol B3에서 더 높은 간 유전자 발현 수준을 확인하였다 (도 7).
4.3. Protocol B3_D14 및 D3_D10
Protocol B3_D10는 Protocol B3의 3D 배양 기간을 14일 (Protocol B3_D14)에서 10일로 단축시킨 것이다. Protocol B3_D14 및 D3_D10의 배양 기간에 따라 제조된 간 오가노이드에 대해 실시예 1에 기재된 방법에 따라 간 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하였다. 그 결과, 양 그룹 사이에서 간세포 마커의 발현 수준은 큰 차이가 없음을 확인하였다 (도 8). (*p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001)
상기 결과는, 본 발명에 따른 간 오가노이드의 제조를 위한 최적의 배양 조건, 배양 세포 수의 비율 및 배양 기간을 확인하였음을 보여준다.
<실시예 5> 다세포성 3차원 지방간 오가노이드의 생성
질환 모델 간모사체 제작을 위해, 고농도의 글루코스 및 지방산을 처리하는 단계를 추가하여 지방증 (steatosis) 표현형을 나타내는 3차원 지방간 오가노이드를 생성하였다.
구체적으로, 실시예 2에 따른 간 스페로이드 형성 후 7 일 째에 간 스페로이드에 50 mM 글루코스 (ThermoFisher Scientific) 및 125 μM 팔미테이트 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA)를 5 일 동안 처리하였다 (도 9).
그 다음, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 포도당 생성에 관여하는 G6Pase, PGC-1α의 mRNA의 수치와 지방 생성에 관여하는 SREBP, FASN의 mRNA 수치를 측정한 결과, 상기 유전자의 발현 수치가 모두 현저히 증가하는 것을 확인하였다 (도 10). 또한, 포도당 생성에 관여하는 PGC-1α 및 PEPCK 단백질의 발현 수준을 실시예 1에 기재된 방법에 따라 웨스턴 블롯팅으로 측정한 결과, 지방 생성에 관여하는 FAS 및 DGAT2 단백질의 발현 수준 모두 현저히 증가하는 것을 확인하였다 (도 11). 따라서, 상기 결과는 본 발명에서 지방증 표현형을 나타내는 우수한 지방간 모사체를 제조하였음을 보여준다.
한편, 세포내 지질을 나일 레드 (Nile red)로 염색한 다음, 형광 세기로 정량화하였다 (스케일바는 50 μm를 나타냄). 그 결과, 글루코스 및 팔미테이트를 처리한 지방간 오가노이드에서 세포 내 지방 수치가 증가를 의미하는 상대 형광 세기가 현저히 증가하였음을 확인하였다 (도 12).
또한, 제조사의 프로토콜에 따라 Triglyceride Assay Kit-Quantification (Abcam)를 사용하여 트리글리세리드 농도를 측정하였다. 트리글리세리드 농도는 대조군 또는 글루코스/팔미테이트 처리된 3D 샘플에서 흡광도로 정량화하였다. 그 결과, 글루코스 및 팔미테이트를 처리한 지방간 오가노이드에서 트리글리세리드의 수치가 현저히 증가하였음을 확인하였다 (도 13).
마지막으로, 제조사의 프로토콜에 따라 Glucose Uptake Cell-Based Assay Kit (Cayman)를 사용하여 글루코스 흡수를 분석하였다. 글루코스 흡수 (uptake)는 형광 세기로 정량화하였다. 그 결과, 글루코스 및 팔미테이트를 처리한 지방간 오가노이드에서 글루코스 흡수가 감소되었음을 확인하였다 (도 14).
상기 결과는, 본 발명에 따라 생성된 지방간 오가노이드에서 포도당 생성작용 (gluconeogenesis) 및 지방생성 (lipogenesis) 작용이 활성화되고, 중성 지질 및 지방산 축적이 증가하여 글루코스 흡수능이 저하된 지방증 표현형을 나타내므로, 지방간 질환 모델 특성을 나타내는 지방간 모사체로 활용될 수 있음을 보여준다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구범위와 그의 등가물에 의하여 정의될 것이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> liver organoid and method of preparing the same <130> P18-030-KRI <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(F)_HNF-4a <400> 1 ggccaagtac atcccagctt t 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(R)_HNF-4a <400> 2 cagcaccagc tcgtcaagg 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(F)_ALB <400> 3 tttatgcccc ggaactcctt t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(R)_ALB <400> 4 agtctctgtt tggcagacga a 21 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(F)_TTR <400> 5 tgggagccat ttgcctctg 19 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(R)_TTR <400> 6 agccgtggtg gaataggagt a 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(F)_RBP-4 <400> 7 gagttctccg tggacgagac 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(R)_RBP-4 <400> 8 tccagtggtc atcatttcct ttc 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(F)_CK8 <400> 9 tcatagacaa ggtacggttc c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(R)_CK8 <400> 10 gcctaaggtt gttgatgtag c 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(F)_CK18 <400> 11 gagctgctcc atctgtaggg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(R)_CK18 <400> 12 cacagtctgc tgaggttgga 20 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(F)_CYP34A <400> 13 cttcatccaa tggactgcat aaat 24 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(R)_CYP34A <400> 14 tcccaagtat aacactctac acagacaa 28 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(F)_G6pase <400> 15 tggttgggat tctgggctgt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(R)_G6pase <400> 16 tctacaccca gtcccttgag 20 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(F)_SREBP-1 <400> 17 tcagcgaggc ggctttggag cag 23 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(R)_SREBP-1 <400> 18 catgtcttcg atgtcggtca g 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(F)_PGC-1a <400> 19 tgccctggat tgttgacatg a 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(R)_PGC-1a <400> 20 tttgtcaggc tgggggtagg 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(F)_FASN <400> 21 gtacacaccc aaggccaagt a 21 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(R)_FASN <400> 22 gacgtggacg gatactttcc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(F)_beta-actin <400> 23 ggacttcgag caagagatgg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(R)_beta-actin <400> 24 agcactgtgt tggcgtacag 20

Claims (10)

  1. (a) 생적합성 매트릭스를 포함하고 바닥이 오목부로 형성된 배양 용기에 배양 배지, 미분화 간세포, 혈관 내피 세포, 및 중간엽 줄기세포를 투여하는 단계;
    (b) 상기 배양 용기에 간세포 성숙인자를 투여하여 간세포 분화를 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 배양 용기에서 3차원 배양을 수행하여 세포 집합체 형성을 유도하는 단계
    를 포함하는 간 오가노이드 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 배양 용기의 바닥이 V-자 형상인 간 오가노이드 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 생적합성 매트릭스는 세포외 기질 또는 매트리겔(Matrigel)인 간 오가노이드 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 간세포 성숙인자는 DMSO (dimethyl sulfoxide)인 간 오가노이드 제조 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 배양은 5 일 내지 20 일 동안 수행되는 것인 간 오가노이드 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 미분화 간세포 및 혈관 내피 세포 수의 비율이 5:1 내지 1:1인 간 오가노이드 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 미분화 간세포 및 중간엽 줄기세포의 세포 수 비율이 4:1 내지 10:1인 간 오가노이드 제조 방법.
  8. (a) 생적합성 매트릭스를 포함하고 바닥이 오목부로 형성된 배양 용기에 배양 배지, 미분화 간세포, 혈관 내피 세포, 및 중간엽 줄기세포를 투여하는 단계;
    (b) 상기 배양 용기에 간세포 성숙인자를 투여하여 간세포 분화를 유도하는 단계;
    (c) 상기 배양 용기에 포도당 및 지방산을 투여하는 단계; 및
    (d) 상기 배양 용기에서 3차원 배양을 수행하여 세포 집합체 형성을 유도하는 단계
    를 포함하는 지방간 오가노이드 제조 방법.
  9. 제 1 항에 따라 제조된 간 오가노이드를 포함하는 삼차원 정상간 모사체.
  10. 제 8 항에 따라 제조된 지방간 오가노이드를 포함하는 삼차원 지방간 모사체.
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