JP6990462B2

JP6990462B2 - 器官芽

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Publication number: JP6990462B2
Application number: JP2020112338A
Authority: JP
Inventors: 英樹谷口; 貴則武部
Original assignee: Yokohama City University
Current assignee: Yokohama City University
Priority date: 2011-09-27
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2022-02-03
Anticipated expiration: 2032-09-27
Also published as: EP2762558A1; US20170159024A1; EP2762558A4; JP2017127319A; JP2020171295A; CN103857787B; CN103857787A; JP6456425B2; US20140289877A1; JP6124348B2; JPWO2013047639A1; JP6731678B2; WO2013047639A1; JP2019041773A; US11326150B2

Description

本発明は、臓器細胞、未分化間葉系細胞及び血管内皮細胞から作製された器官芽に関する。

近年、様々な機能細胞へ分化する能力を有するiPS細胞などの多能性幹細胞を利用して、創薬スクリーニングや再生医療に有益なヒト機能細胞を分化誘導により創出する方法が注目されている。これまでに、多能性幹細胞の培養系に様々な誘導因子などを添加する事で、各種機能細胞を分化誘導する多くの試みが行われている（M.Schuldiner, et al. PNAS, 97(21), 11307-11312 (2000), K.Si-Taiyeb, et al. Hepatology, 51 (1): 297- 305(2010)）。しかし、従来の三次元的な組織構造の再構築を伴わない分化誘導法においては、機能細胞の終末分化への誘導が困難であることや、分化誘導の効率が低く再現性にも乏しいという大きな問題点がある。

一方、重篤な臓器不全に対して、臨床現場においては臓器移植や人工臓器による置換治療が行われている。しかし、臓器移植については拒絶反応や絶対的なドナー不足が存在し、人工臓器については機能の一部のみを短期間代替できるにすぎないなど（特開平９－５６８１４号公報、特開２００４－１６６７１７号公報）、根本的な未解決課題が残されている。ヒト組織の人為的創出については、終末分化した細胞を用いて担体（足場材料）への細胞播種を行う方法などが考案されているものの、肝臓など複雑な高次機能を有する臓器については確立された手法は存在しないのが現状である（非特許文献１）。すなわち、成体組織で見られる複数の細胞系譜からなる秩序だった立体構造を有するヒト組織・臓器の再構築法の確立は、未だに達成されていないのが現状である。

特開平９－５６８１４号公報特開２００４－１６６７１７号公報

Uygun, B. E., et al. Nat Med, 16(7), 814-820 (2010)

従来、多能性幹細胞を用いた分化誘導法は、液性因子の添加や遺伝子導入など様々な分化因子の組み合わせにより、細胞分化の誘導を試みるものである。しかし、これらの従来法では、終末分化した機能細胞を誘導できていないばかりか、その前駆集団である組織幹細胞への初期分化誘導すら充分には達成されていない。

一方、組織や臓器を構成している細胞は機能細胞だけではなく、血管系細胞や間充織細胞など複数の細胞種が存在しており、さらに、それらが秩序だった空間的配置をとることにより、協調的な相互作用が生じることにより組織構造が成り立っている。しかし、現状では、ヒト組織・臓器の再構築技術としては足場材料などの担体を用いる方法しか存在せず、播種された機能細胞の生着率が極めて低く、長期培養が困難であり、再構築された組織・臓器の機能が著しく未熟であるという問題があった。

本発明は、以上の問題を解決し、成熟機能を有する組織及び臓器を再構築する手段を提供することを目的とする。

これらの諸問題を解決する為には、器官発生プロセスの精緻な再現化により、細胞分化と形態形成を同時に誘導することが必須であると考えられる。すなわち、複数の細胞を用いて、異なった細胞系譜が適切に時空間的に配置された３次元的な組織構造体を再構成するための新規技術を開発することが極めて重要である。本発明では、器官発生で生じる複数の細胞による細胞間相互作用の再現化というアプローチにより、３次元的な組織・臓器の再構築技術を開発することを試みた。

生理的な器官発生過程において、臓器細胞が血管内皮細胞および未分化な間葉系細胞と密な細胞間相互作用を持つことで、自律的な組織構造の構築と細胞分化を伴う器官形成が進行する。

本発明では、この様な器官発生の早期プロセスを人為的に再現することで、複数の細胞系譜による相互作用を介した初期分化誘導を行い、初期分化を遂げた臓器細胞の組織形成能力を誘導し、試験管内で組織・臓器の元となる器官芽（organ bud）を人為的に作製しようとするものである。さらに、培養系で誘導された器官芽を生体内へ移植することで血流を開始させ、終末分化した機能細胞と血管系とから成る組織・臓器の作製を行うものである。

具体的には、iPS細胞などの多能性幹細胞より得た至適分化段階の臓器細胞を、血管内皮細胞および間葉系細胞と共培養を行う。これら３つの異なった細胞成分を最適な混合比率で培養を行うとよく、細胞外マトリクス成分に支持された特殊な環境下で、特定の栄養因子・液性因子を含む分化誘導培地のもと短期間培養を行うことで、微小血管構造を有する立体的な器官芽を試験管内で誘導することが可能となる。さらに、培養系で誘導された器官芽を生体内へ移植することにより、血管化を促し血流を開始させることにより、成体組織と同等な高度に秩序だった組織構造を有する組織・臓器を作製することが可能となる。血管内皮細胞と間葉系細胞のいずれか一方又は両方は、血管内皮細胞から分泌される因子、間葉系細胞から分泌される因子、血管内皮細胞と間葉系細胞の両方が存在することによって分泌される因子などの物質で代替することも可能と考える。

このような複数の細胞の細胞間相互作用に注目し、組織・臓器の３次元的な再構築を試みる手法は過去には存在せず、新規性の極めて高い方法であると考えられる。

本発明の要旨は以下の通りである。
（１）血管内皮細胞、間葉系細胞、血管内皮細胞から分泌される因子、間葉系細胞から分泌される因子、血管内皮細胞と間葉系細胞の両方が存在することによって分泌される因子からなる群より選択される少なくとも１つの細胞及び/又は因子とともに、臓器細胞を培養することを含む、器官芽の作製方法。
（２）臓器細胞が分化した細胞である（１）記載の器官芽の作製方法。
（３）臓器細胞が未分化な細胞である（１）記載の器官芽の作製方法。
（４）臓器細胞が、内胚葉性器官の細胞若しくは内胚葉性器官の細胞に分化可能な細胞、中胚葉性器官の細胞若しくは中胚葉性器官の細胞に分化可能な細胞、又は外胚葉性器官の細胞若しくは外胚葉性器官の細胞に分化可能な細胞である（１）～（３）のいずれかに記載の器官芽の作製方法。
（５）臓器細胞が、内胚葉性器官の細胞若しくは内胚葉性器官の細胞に分化可能な細胞である（４）記載の器官芽の作製方法。
（６）内胚葉性器官が、肝臓又は膵臓である（５）記載の器官芽の作製方法。
（７）臓器細胞が、人工多能性幹細胞由来の細胞である（１）～（６）のいずれかに記載の器官芽の作製方法。
（８）人工多能性幹細胞がヒト由来である（７）記載の器官芽の作製方法。
（９）血管内皮細胞、間葉系細胞、血管内皮細胞から分泌される因子、間葉系細胞から分泌される因子、血管内皮細胞と間葉系細胞の両方が存在することによって分泌される因子からなる群より選択される少なくとも１つの細胞及び/又は因子とともに、臓器細胞を血管内皮細胞培養用培地中で培養する（１）～（８）のいずれかに記載の器官芽の作製方法。
（１０）血管内皮細胞、間葉系細胞、血管内皮細胞から分泌される因子、間葉系細胞から分泌される因子、血管内皮細胞と間葉系細胞の両方が存在することによって分泌される因子からなる群より選択される少なくとも１つの細胞及び/又は因子とともに、臓器細胞をゲル上に播種して培養する（１）～（９）のいずれかに記載の器官芽の作製方法。
（１１）血管内皮細胞が分化した細胞である（１）～（１０）のいずれかに記載の器官芽の作製方法。
（１２）血管内皮細胞が未分化な細胞である（１）～（１０）のいずれかに記載の器官芽の作製方法。
（１３）間葉系細胞が分化した細胞である（１）～（１２）のいずれかに記載の器官芽の作製方法。
（１４）間葉系細胞が未分化な細胞である（１）～（１２）のいずれかに記載の器官芽の作製方法。
（１５）（１）～（１４）のいずれかに記載の方法によって作製された器官芽を非ヒト動物に移植し、組織又は臓器に分化させることを含む、組織又は臓器の作製方法。
（１６）（１）～（１４）のいずれかに記載の方法によって作製された器官芽をヒト又は非ヒト動物に移植することを含む、器官芽の移植方法。
（１７）器官芽の移植部位が、頭蓋内、腸間膜、肝臓、脾臓、腎臓、腎被膜下、門脈上からなる群より選択される（１６）記載の器官芽の移植方法。
（１８）（１）～（１４）のいずれかに記載の方法によって作製された器官芽をヒト又は非ヒト動物に移植し、組織又は臓器に分化させることを含む、組織又は臓器の再生又は機能回復方法。
（１９）（１）～（１４）のいずれかに記載の方法によって作製された器官芽を非ヒト動物に移植し、組織又は臓器に分化させることを含む、非ヒトキメラ動物の作製方法。
（２０）（１）～（１４）のいずれかに記載の方法によって作製された器官芽、（１５）記載の方法によって作製された組織及び臓器、並びに（１９）記載の方法によって作製された非ヒトキメラ動物からなる群より選択される少なくとも一つを用いて、薬剤を評価する方法。

従来、多能性幹細胞から分化誘導により得られた機能細胞は、生体組織を構成している機能細胞と比較して未成熟な分化段階に止まっていた。これは、従来の分化誘導法においては機能細胞の終末分化が誘導されていないことが原因である。本発明により、立体的な組織再構築に基づくヒト機能細胞の終末分化の誘導法の確立が期待されることから（例えば、血管構造に対する細胞極性の再構成など）、ヒト機能細胞の創出技術として価値が高い。

また、従来の多能性幹細胞の分化誘導法においては、組織幹細胞を得ることが全く出来ていない。本発明により、iPS細胞から組織幹細胞を創出することが達成されれば、本発明者らが過去に開発したヒト肝幹細胞操作技術(国際公開番号：WO/2009/139419)と連動することで、ヒト肝細胞の大量創出に有用な細胞操作技術となることが期待される。

さらに、本発明では、器官発生で生じている複数の細胞間相互作用を人為的に再現することにより、血管系を有する立体的なヒト組織構造体を再構築することが可能である。したがって、これまでの技術では全く達成されていなかった、血管系が適切に配置された血流を有するヒト組織・臓器を作製するための基盤技術となることが期待される。

本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2011‐210157の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

ヒトiPS細胞由来の肝臓内胚葉細胞の自立的組織化を示す図。左下図は、ヒト肝臓内胚葉細胞を示す。左上図は、肝臓内胚葉細胞、血管内皮細胞及び未分化間葉系細胞の三者の共培養によって形成された三次元構造体（肝芽）を示す（培養開始４日後）。右上図は、前記三次元構造体の蛍光顕微鏡写真である。血管内皮細胞(HUVEC)はEGFPで標識され、未分化間葉系細胞(hMSC)はKOで標識されている。iPS細胞は標識されていない。器官芽を構成する細胞等のマーカータンパク質の発現量を示す図。図中の「Hep.End. HUVEC MSC」は器官芽を構成する細胞を表し、「undiff iPS」及び「iPS」はiPS細胞を表し、「Def End」はアクチビンによって誘導された内胚葉系細胞を表し、「Hep End」はBMP4及びFGF2によって誘導された肝臓内胚葉細胞を表す。「IH-like」はK.Si-Taiyeb, et al. Hepatology, 51 (1): 297- 305(2010)に記載されているimmature hepatocyte-like cellsを表し、「MH-like」はK.Si-Taiyeb, et al. Hepatology, 51 (1): 297- 305(2010)に記載されているmature hepatocyte-like cellsを表す。器官芽を構成する細胞等のマーカータンパク質の発現量を示す図。図中の「Hep.End. HUVEC MSC」は器官芽を構成する細胞を表し、「iPS」はiPS細胞を表し、「Def End」はアクチビンによって誘導された内胚葉系細胞を表し、「Hep End」はBMP4及びFGF2によって誘導された肝臓内胚葉細胞を表す。「IH-like」はK.Si-Taiyeb, et al. Hepatology, 51 (1): 297- 305(2010)に記載されているimmature hepatocyte-like cellsを表し、「MH-like」はK.Si-Taiyeb, et al. Hepatology, 51 (1): 297- 305(2010)に記載されているmature hepatocyte-like cellsを表す。免疫不全マウス生体内へ移植した肝芽の状態を示す図。iPS細胞はGFPで標識され、未分化内皮細胞はKOで標識されている。移植２週後の肝芽を組織学的に解析した図。膵β細胞の自立的組織化を示す図。左図は、共培養した膵β細胞を示し、右図は、単独培養した膵β細胞を示す。膵β細胞の集塊及び血管様管腔構造を示す図。移植した細胞塊への血液還流を示す図。膵β細胞のスフェロイド形成過程を示す図。血管内皮細胞(HUVEC)はGFPで標識され、膵β細胞 (MIN6)はKOで標識されている。膵β細胞集団内への血管形成を示す図。血管内皮細胞(HUVEC)はGFPで標識され、膵β細胞 (MIN6)はKOで標識されている。膵β細胞集団内部への血液還流を示す図。標識したdextranによって血流を可視化している。膵β細胞集団を組織学的に解析した図。 hiPSCsを用いたヒト肝芽（hiPSC-LBs）の作成。（a）本手法の略図。（b）肝内胚葉分化（hiPSC-Hep）は、9日目にHNF4A及びAFPを抗体染色することで評価した（結果は平均値±標準偏差として表記、n=3）。（c）hiPSC-HepsをHUVECs及びhMSCsと共培養した際のhiPSC-LBsの3次元的な自己組織化。hiPSC-LBs内で内皮発芽が認められた。緑色、EGFP標識したHUVEC；赤色、KOFP（Kusabira Orange Fluorescent Protein）標識したhMSC。バーの長さは100 μm。（d）hMSCsを含まない培養系ではhiPSC-LBsの形成が認められなかった。バーの長さは1 mm。（e）共焦点顕微鏡を用いたタイムラプス観察により、Cell Tracker Red CMTMR（Molecular Probes）を用いてラベルされたhiPSC-Hepsの自律的な組織化が確認された。画像は、最大強度の共焦点Z方向の画像を投影したもの。（f）トランスウェル培地にて96時間、hiPSC-Heps単独もしくはHUVEC及びhMSCsと共培養した際の HNF4A、FOXA2、AFP、RBP4、TTR及びALBの発現を定量RT-PCR（qPCR）により解析した（結果は平均値±標準偏差として表記、n=3）。（g、h）肝分化マーカー遺伝子の発現解析の結果、BMP阻害剤Noggin（500ng/ml）及びFGF阻害剤SU-5402（50μM）の添加により、HUVEC及びhMSCsと共培養したhiPSC-Hepsの効率的な肝成熟を妨げることが示された（g）。他方、BMP4（20ng/ml）及びFGF2（20ng/ml）を添加することで、hiPSC-Heps単独で培養を行ったにも関わらず、肝分化マーカーの発現亢進が確認された（h）（結果は平均値±標準偏差として表記、n=3）。 hiPSC-LBsのin vitroでの特性解析。（a）サイトケラチン8及び18（CK8.18）、AFP、PECAM-1（CD31）、Flk-1、Desmin、PCNA及び5′-bromo-2′-deoxyuridine（BrdU）の抗体染色。バーの長さは100 μm。（b、c、d、e）各細胞形質の比率は以下の通りである：肝芽細胞、AFP陽性/CK8.18陽性；増殖細胞、(PCNA陽性もしくはBrdU陽性)/CK8.18陽性；内皮細胞、(CD31陽性もしくはFlk1陽性)/DAPI陽性；間葉細胞、Desmin陽性/DAPI陽性。hiPSC-LBs内の各細胞種の比率は、E10.5マウスLBs（mLBs）のそれとほぼ類似している。b、c、dでは結果を平均値±標準偏差として、eでは平均値±平均値の標準誤差として表記、n=3。（f）マウスとヒトの肝臓発生の際、段階的に発現が上昇する83種の肝臓特異的遺伝子について、マイクロアレイデータより取得したヒートマップを示す。In vitroでの肝芽形成の後、これら肝臓に特徴的な遺伝子群の発現が顕著に上昇した。hiPSC-Def；hiPSC由来の胚体内胚葉細胞、hiPSC-Hep；hiPSC由来の肝内胚葉細胞、hiPSC-IH；hiPSC由来の未成熟肝細胞様細胞、hiPSC-MH； hiPSC由来の成熟肝細胞様細胞、hFLT；胎児（妊娠後期、22-40週）肝臓組織、 hALT；ヒト成体（30歳）肝臓組織。 In vivoでの機能的な血管網を有するヒト肝臓組織の作成。（a）NOD/SCIDマウスの頭蓋窓内へhiPSC-LBsを移植した。移植を行ったhiPSC-LBsを肉眼で観察した結果、移植から約48時間後には、ヒト血管への血液流入が認められた。ドット領域は移植されたhiPSC-LBsを示す。バーの長さは1 mm。（b）経時的な共焦点顕微鏡によるライブ観察の結果、hiPSC-LBs中の血管内皮細胞による血管網の形成が認められた。（c）デキストランの静脈内投与により、移植3日目には、機能的なヒト血管網を通じてhiPSC-LBsが完全に灌流していることを確認した。パネルはヒトとマウス血管の連結を示す。点線は移植片の末端を示す。バーの長さは500μm。（d）HUVECs（緑色、GFP）と宿主血管（青色、Alexa647標識したマウス特異的なCD31、静脈投与）の連結を直接可視化した。バーの長さは250μm。（e、f）形成した肝臓組織内のhMSCsもしくはhiPSC由来細胞の局在を移植15日目に観察した。バーの長さは100（e）及び250（f）μm。（g）In vivoのhiPSC-LB移植片内部のヒト血管網の定量解析（結果は平均値±平均値の標準誤差として表記、n=3）。（h）機能的な血管の長さをhiPSC-LBとHUVEC hMSC移植片（Tx）間で比較した（結果は平均値±平均値の標準誤差として表記、n=5、*：P<0.01）。（i）FITC-デキストランを注入した後の生体内共焦点観察。hiPSC-LB由来の組織の血管新生は、正常な成体マウス肝臓のそれとほぼ同程度である（結果は平均値±平均値の標準誤差として表記、n=5、*：P<0.01）。 hiPSC由来の肝臓組織のin vivoでの機能解析。（a）移植60日後の組織切片をHE染色した結果、類洞様の内皮細胞を含む肝細胞索の形成が認められた一方、HUVEC hMSC移植片（Tx）内では認められなかった。点線は脳上にある移植片の境界を示す。バーの長さは200μm（上部）及び100μm（下部）。（b）hiPSC-LB及びhFLC-LB由来の組織内での肝臓マーカーの発現を示す免疫染色。バーの長さは100μm（左、中央）及び25μm（右）。（c、d）経時的なマウス血清中のヒトALB及びAAT量（結果は平均値±平均値の標準誤差として表記、cはn=6、dはn=3）。 AAT産生は、hiPSC-LBの移植片数と比例関係に有った。2個のLBを頭蓋に、3もしくは6個のLBを腸間膜にそれぞれ移植を行った。（e）CE-TOFMSにより測定されたhiPSC-LB移植片の代謝特徴を示すVennダイアグラム（図31）。hiPSC-LB移植片で見出された代謝物のうち、78%が成体肝臓のそれと一致した。右パネルはhiPSC-LB移植片及び健常なヒト成体肝臓の両方で検出され、元のhiPSCsでは検出されなかった主要な代謝物を示す。（f）マススペクトロメトリーによりマウス尿で検出されたヒト特異的なケトプロフェン代謝物（結果は平均値±平均値の標準誤差として表記、n=3、*：P<0.05）。（g）デブリソキンを経口投与したマウスでの血清代謝物4-OHDBの形成を薬物動態解析により検討。（h）血清4-OHDB代謝物の形成を頭蓋内移植（CW）もしくは腸間膜移植したマウス間で比較した（結果は平均値±平均値の標準誤差として表記、n=3、*：P<0.05）。（i）hiPSC-LB移植後のTK-NOGマウスのKaplan-Meier生存曲線。Wilcoxon統計解析により、模擬処置を受けたコントロール群とhiPSC-LB移植群の曲線に有為な差がある事が示された（P=0.0120）。 hiPSCの肝内胚葉への初期分化誘導。(a)hiPSCからの胚体内胚葉への分化および肝内胚葉への分化を、6日目および9日目にFOXA2、SOX17、HNF4A およびAFPに対してそれぞれ免疫染色することによりモニターした。(b)誘導6日目にFOXA2およびSOX17に対して免疫染色することにより胚体内胚葉への分化効率を評価した(結果は平均値±標準偏差で表す; n=3)。 In vitroにおけるhiPSC由来肝芽形成条件の最適化。(a)種々の細胞タイプとの共培養による肝芽(LB)の形成。バーの長さは1mm。(b)肝内胚葉細胞を、種々のマトリックスタンパク質上で、HUVECs およびhMSCsと共培養した。細胞をマトリゲル（LAM COL ENT）上に播き、hiPSC由来LB（hiPSC-LB）の形成を観察した。LAM :ラミニン； ENT：エンタクチン； COL：コラーゲンIV。(c)LB形成に及ぼすマトリックスタンパク質濃度の効果。(d)hiPSC-LBのqPCR遺伝子発現分析。内皮および間葉系細胞と共培養することにより、初期肝分化マーカー遺伝子であるALB, RBP4, TTR および G6PCの有意な発現上昇が示された(結果は平均値±標準偏差で表す; n=3)。ストローマ細胞との共培養物由来液性因子の同定。(a)未分化hiPS細胞と比較して、内皮および間葉細胞との共培養物においてアップレギュレーションされた5000種の遺伝子のジーンオントロジー(GO)分析。バーは、生物学的プロセスについてGO:0008083（増殖因子活性）内の特定GOカテゴリーの有意性(P値)を表わす。ストローマ細胞特異的遺伝子の中で、FGFシグナル経路（赤色）およびBMPシグナル経路(青色)が強調されている。(b, c)内皮および間葉細胞がFGF2およびBMP4を高発現していることを示す、(b)FGFsおよび(c)BMPsのqPCR分析。代表的肝マーカー遺伝子のマイクロアレイ分析による発現プロファイリング。hiPSC-LBの遺伝子発現は、ヒト胎児(妊娠22-40週）および成体肝組織（30歳）の遺伝子発現と比較して、適切な段階にあった。TAT:チロシンアミノトランスフェラーゼ；G6PC: グルコース-6-ホスファターゼ；TDO²: トリプトファン-2,3-ジオキシゲナーゼ；GLUT2: グルコーストランスポーター２；GYS2: グリコーゲンシンターゼ２；APOL6:アポリポプロテインL；KNG1:キニノーゲン１；CFB:補体Ｂ因子；CFI: 補体Ｉ因子；PCK1: ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；LDHD: 乳酸脱水素酵素D；CP:セルロプラスミン；ACTB:アクチンベータ。マウス肝芽由来細胞からのマウス肝組織の作製。(a)EGFP標識E13.5mFLC移植片の経時的生体内蛍光イメージ。移植30日後にテトラメチルローダミンデキストランを尾静脈より注入し、血管が機能的であることを明らかにした。(b)作製されたマウス肝組織のHE染色。肝細胞クラスターは、類洞内皮細胞を含んでいた(右、矢印)。クラスター内部に、胆管状の構造物が形成されており、サイトケラチン免疫染色により確認された（右、下部）。作製されたマウス肝組織、E13.5胎児肝組織および成体肝組織の組織学的比較。(a)500 ng/ml のHGFおよび 200 ng/ml のEGFの添加は、肝組織の再構成を増強した。(b)作製されたマウス肝組織は、E13.5胎児肝組織と比較して成体肝組織に類似する組織学的特徴を有していた。バーの長さ：200μm。 hFLC-LBsのin vivo移植。In vitroで作成したhFLC-LBsをNOD/SCIDマウスの頭蓋窓下へ移植した。(a)血管新生の進行を示す経時的肉眼イメージ。機能的な血流が3日目に始まり、そして時間が経つにつれ、血管はより複雑化するとともに安定化した。(b)hFLC-LBs 由来組織の3日目における生体内共焦点イメージ。緑色：EGFPを発現するhFLCs; 赤色：KOFPを発現するHUVECs。バーの長さは100μm。 hFLC由来肝組織内における機能的血管網のin vivo形成。テキサスレッドデキストランの注入（3日目）によって示された開存性脈管構造。宿主血管に連結したヒト血管網の形成は、hiPSC-Hepの上首尾な生着に不可欠である。(a)HUVECs (緑色、GFP)および宿主血管（青色、Alexa647結合マウス特異的CD31;静注）間の連結の直接可視化。灌流した血管を、蛍光抱合デキストラン(赤色）の静注によって10日目に可視化した。バーの長さは250μmおよび25μm。(b)外植されたhiPSC-LB移植片の種特異的CD31免疫染色は、hiPSC由来肝組織におけるヒトおよびマウス血管の間の直接連結を示す。バーの長さは100μm。(c)内皮細胞を含まないhiPSC/hMSC移植片の複数時点における肉眼イメージ。同定可能な血管は全く見えない。(d) hiPSC/hMSC移植片のHE染色は、30日後に線維性組織の形成を示した。この結果は、hiPSC由来肝細胞の生着の失敗を示すものであり、内皮細胞の必要性が示唆された。バーの長さは100μm。作製されたヒト肝臓およびin vivoにおける正常なマウス肝臓の脈管構造の生体内イメージング。(a)移植30日後にFITC結合デキストランの注入により可視化した、HUVEC hMSC のみ(上段)またはhiPSC-LB移植片（下段）の血管構造。(b) FITCデキストランによる血流を可視化した正常なマウス肝臓のライブイメージング。バーの長さは200μm。肝組織内部のヒト血管網および肝細胞形態の生体内評価。(a)FITCデキストラン注入により可視化した機能性ヒト血管。イメージ投影(左側パネル)は、次にMetaMorph Angiogenesis Moduleソフトウエアを用いてプロセシングした。右側パネルは、各イメージのセグメンテーション画像を示す。(b)血管直径の定量（平均値±標準偏差；n=3）。(c)hiFLC-LB移植片内部の肝細胞形態の生体内イメージ、および細胞真円度（形状因子）の推定（結果は、平均値±標準誤差で表す；n=3；各サンプルにつき100個以上の細胞を計測した；*：P<0.05；N.S.:有意でない）。 hiPSC-LB移植片のin vivoにおける経時変化。(a)hiPSC-LB移植片の長時間HE染色。正常なマウス肝臓発生において観察されるように¹、丸い形状のhiPSC由来肝芽細胞が大規模に増殖し、増大した細胞質を有する未成熟肝細胞に分化した。バーの長さは50μm。(b)in vivoにおけるhiPSC-LB移植片内の増殖性細胞数の2週間後、1、2および4ヶ月後におけるKi67免疫染色による定量。 hiPSC-LBまたはhFLC-LB移植片のホールマウント免疫染色。(a)作製された肝組織内の基底膜タンパク質の再構成を示すコラーゲンIV免疫染色。バーの長さは100μm および50μm。(b)正常なマウス肝組織と同様に、成熟肝細胞および間葉細胞から成る移植片由来ヒト肝組織。バーの長さは50μm。 hFLC-LB由来ヒト肝組織の免疫染色および透過型電子顕微鏡分析。(a)hFLC-LB移植片由来の肝組織は、肝細胞特異的抗原(HSA)を発現するが、AFPを発現しない（左側パネル）。ヒトCD31およびα平滑筋アクチン(SMA)に対する免疫染色は、肝組織内部における主要血管の形成を示す（右側パネル）。バーの長さは100μm 。(b, c, d, e) hFLC-LB由来肝組織の電子顕微鏡画像。タイトジャンクション (b, c)、毛細胆管、豊富なミトコンドリア、ならびにグリコーゲンおよび脂質の蓄積(d, e)を有する肝細胞が示されている。 hiPSC-LB移植片の遺伝子発現プロファイル。移植60日後における多数の肝成熟マーカー遺伝子の(a)マイクロアレイプロファイルおよび(b) qPCR検証の結果により、hiPSC-LBは移植による成熟肝細胞へと成熟することが明らかとなった。 60日hiPSC-LB移植片（青色）、ヒト成体肝臓（赤色）および未分化hiPSCs（緑色）の代謝経路マップ。経路マップ中で同定された代謝物を、異なる色で着色した四角で示した。N.D.:検出されず。治療用途に向けての腸間膜移植モデルの確立。(a)in vitroで増殖させたhiPSC またはFLC由来LBを、フィブリン糊で覆った腸間膜に移植した。(b)移植60日後のhiPSC由来肝組織の肉眼観察。点々で囲った領域は移植片を示す。(c)hiPSC-LB移植30日後に、2/3PHによってヒトアルブミンの産生が増大した。(n=3)(d)DT注入Alb-TRECK/SCIDマウスの、hFLC-LB移植された(n=8)または偽手術された(n=7)グループにおけるKaplan-Meier生存曲線。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の器官芽の作製方法は、臓器細胞を、血管内皮細胞、間葉系細胞、血管内皮細胞から分泌される因子、間葉系細胞から分泌される因子、血管内皮細胞と間葉系細胞の両方が存在することによって分泌される因子からなる群より選択される少なくとも１つの細胞及び/又は因子とともに、臓器細胞を培養することを特徴とするものである。

本発明において「器官芽」とは、成熟することで器官に分化することができる構造体であって、臓器細胞、血管内皮細胞、及び未分化間葉系細胞若しくはそれから分化した細胞の三種類の細胞を含む構造体をいう。ある構造体が器官芽であるかどうかは、例えば、その構造体を生体へ移植し、目的の器官に分化できるかどうかを調べること（目的の器官へ分化していれば器官芽であると判断できる。）、及び／又はその構造体が上述した三種類の細胞をすべて含んでいるかどうかを調べること（三種類の細胞をすべて含んでいれば器官芽であると判断できる。）により確認できる。器官芽は、例えば、腎臓、心臓、肺臓、脾臓、食道、胃、甲状腺、副甲状腺、胸腺、生殖腺、脳、脊髄などの器官に分化する器官芽などであってもよいが、肝臓に分化する器官芽（肝芽）、膵臓に分化する器官芽（膵芽）、腸管に分化する器官芽など内胚葉性器官に分化する器官芽が好ましい。ある構造体が内胚葉性器官に分化する器官芽であるかどうかは、マーカーとなるタンパク質の発現を調べることにより確認できる（後述するマーカータンパク質のいずれか一つあるいは複数が発現していれば器官芽であると判断できる。）。例えば、肝芽では、HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、 ALBなどがマーカーになり、膵芽では、PDX1、SOX17、SOX9などがマーカーになり、腸管に分化する器官芽では、CDX2、SOX9などがマーカーになる。当業者間で使用されている用語のうち、liver bud、liver diverticula、liver organoid、pancreatic (dorsal or ventral) buds、pancreatic diverticula、pancreatic organoid、intestinal bud、intestinal diverticula、intestinal organoid（K. Matsumoto, et al. Science.19;294(5542):559-63.(2001)）などは本発明における器官芽に含まれる。

本発明において「臓器細胞」とは、臓器を構成する機能細胞、又は機能細胞へと分化する未分化細胞をいう。「未分化な臓器細胞」としては、例えば、腎臓、心臓、肺臓、脾臓、食道、胃、甲状腺、副甲状腺、胸腺、生殖腺、脳、脊髄などの器官に分化可能な細胞などであってもよく、脳、脊髄、副腎髄質、表皮、毛髪・爪・皮膚腺、感覚器、末梢神経、水晶体などの外胚葉性器官に分化可能な細胞、腎臓、尿管、心臓、血液、生殖腺、副腎皮質、筋肉、骨格、真皮、結合組織、中皮などの中胚葉性器官に分化可能な細胞、肝臓、膵臓、腸管、肺、甲状腺、副甲状腺、尿路などの内胚葉性器官に分化可能な細胞などを挙げることができる。ある細胞が外胚葉性器官、中胚葉性器官又は内胚葉性器官に分化可能な細胞であるかどうかは、マーカーとなるタンパク質の発現を調べることにより確認できる（マーカータンパク質のいずれか一つあるいは複数が発現していれば内胚葉性器官に分化可能な細胞であると判断できる。）。例えば、肝臓に分化可能な細胞では、HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、 ALBなどがマーカーになり、膵臓に分化可能な細胞では、PDX1、SOX17、SOX9などがマーカーになり、腸管に分化可能な細胞では、CDX2、SOX9などがマーカーになり、腎臓に分化可能な細胞では、SIX2、SALL1、心臓に分化可能な細胞では、NKX2-5 MYH6、ACTN2、MYL7、HPPA、血液に分化可能な細胞では、C-KIT、SCA1、TER119、HOXB4、脳や脊髄に分化可能な細胞では、HNK1、AP2、NESTINなどがマーカーになる。当業者間で使用されている用語のうち、hepatoblast、hepatic progenitor cells、pancreatoblast、hepatic precursor cells、pancreatoblast、 pancreatic progenitors、pancreatic progenitor cells、pancreatic precursor cells、endocrine precursors、intestinal progenitor cells、intestinal precursor cells、intermediate mesoderm、metanephric mesenchymal precursor cells、multipotent nephron progenitor、renal progenitor cell、cardiac mesoderm、cardiovascular progenitor cells、cardiac progenitor cells、（JR. Spence, et al. Nature.;470(7332):105-9.(2011)、Self, et al. EMBO J.; 25(21): 5214-5228.(2006)、J. Zhang, et al. Circulation Research.; 104: e30-e41(2009)、G. Lee, et al. Nature Biotechnology 25, 1468 - 1475 (2007)）などは本発明における未分化な臓器細胞に含まれる。未分化な臓器細胞は、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性幹細胞（ES細胞）などの多能性幹細胞から公知の方法に従って作製することができる。例えば、肝臓に分化可能な臓器細胞は、K.Si-Taiyeb, et al. Hepatology, 51 (1): 297- 305(2010)、T. Touboul, et al. Hepatology. 51(5):1754-65.(2010)に従って作製することができ、膵臓に分化可能な臓器細胞は、D. Zhang, et al. Cell Res.;19(4):429-38.(2009)に従って作製することができ、腸管に分化可能な臓器細胞は、J. Cai, et al. J Mol Cell Biol.;2(1):50-60(2010)、R. Spence, et al. Nature.;470(7332):105-9.(2011)に従って作製することができ、心臓に分化可能な臓器細胞は、J. Zhang, et al. Circulation Research.; 104: e30-e41(2009) に従って作製することができ、脳や脊髄に分化可能な細胞では、G. Lee, et al. Nature Biotechnology 25, 1468 - 1475 (2007) に従って作製することができる。「分化した臓器細胞」としては、膵臓の内分泌細胞、膵臓の膵管上皮細胞、肝臓の肝細胞、腸管の上皮細胞、腎臓の尿細管上皮細胞、腎臓の糸球体上皮細胞、心臓の心筋細胞、血液のリンパ球や顆粒球、赤血球、脳の神経細胞やグリア細胞、脊髄の神経細胞やシュワン細胞などを例示できる。臓器細胞は、主としてヒト由来のものを用いるが、ヒト以外の動物、例えば、マウス、ラット、イヌ、ブタ、サルなどの動物由来の臓器細胞を用いてもよい。

本発明において「血管内皮細胞」とは、血管内皮を構成する細胞、又はそのような細胞に分化することのできる細胞をいう。ある細胞が血管内皮細胞であるかどうかは、マーカータンパク質、例えば、TIE2、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、CD41が発現しているかどうかを調べることにより確認できる（前記マーカータンパク質のいずれか一つあるいは複数が発現していれば血管内皮細胞であると判断できる。）。本発明において用いる血管内皮細胞は、分化したものであっても、未分化なものであってもよい。血管内皮細胞が、分化した細胞であるかどうかは、CD31、CD144により、確認することができる。当業者間で使用されている用語のうち、endothelial cells、umbilical vein endothelial cells、endothelial progenitor cells、endothelial precursor cells、vasculogenic progenitors、hemangioblast（HJ. joo, et al. Blood. 25;118(8):2094-104.(2011)）などは本発明における血管内皮細胞に含まれる。血管内皮細胞は、主としてヒト由来のものを用いるが、ヒト以外の動物、例えば、マウス、ラット、イヌ、ブタ、サルなどの動物由来の血管内皮細胞を用いてもよい。

本発明において「間葉系細胞」とは、主として中胚葉に由来する結合織に存在し、組織で機能する細胞の支持構造を形成する結合織細胞であるが、間葉系細胞への分化運命が決定しているが、まだ間葉系細胞へ分化していない細胞も含む概念である。本発明において用いる間葉系細胞は、分化したものであっても、未分化なものであってもよい。ある細胞が未分化間葉系細胞であるかどうかは、マーカータンパク質、例えば、Stro-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD133、CD271、Nestinが発現しているかどうかを調べることにより確認できる（前記マーカータンパク質のいずれか一つあるいは複数が発現していれば未分化間葉系細胞であると判断できる。）。また、前項のマーカーのいずれも発現していない間葉系細胞は分化間葉系細胞と判断できる。当業者間で使用されている用語のうち、mesenchymal stem cells、mesenchymal progenitor cells、mesenchymal cells（R. Peters, et al. PLoS One. 30;5(12):e15689.(2010)）などは本発明における間葉系細胞に含まれる。間葉系細胞は、主としてヒト由来のものを用いるが、ヒト以外の動物、例えば、マウス、ラット、イヌ、ブタ、サルなどの動物由来の未分化間葉系細胞を用いてもよい。

共培養における三種類の細胞の培養比は器官芽が形成できる範囲内であれば特に限定されないが、好適な細胞の数比は、臓器細胞：血管内皮細胞：未分化間葉系細胞＝１０：１０～５：２～１である。

また、血管内皮細胞と間葉系細胞のいずれか一方又は両方は、血管内皮細胞から分泌される因子、間葉系細胞から分泌される因子、血管内皮細胞と間葉系細胞の両方が存在することによって分泌される因子などの物質で代替することもできる。

血管内皮細胞から分泌される因子、間葉系細胞から分泌される因子、及び血管内皮細胞と間葉系細胞の両方が存在することによって分泌される因子などの物質の例としては、FGF2、FGF5、BMF4、BMP6、CTGFなどを例示することができるが、これらに限定されることはない。

これらの物質の添加量としては、FGF2については、細胞1x10^6個当たり、10～100ng/mlが適当であり、20ng/ml程度が好ましく、BMF4については、細胞1x10^6個当たり、10～100ng/mlが適当であり、20ng/ml程度が好ましい。

培養の際に使用する培地は、器官芽が形成されるものであればどのようなものでもよいが、血管内皮細胞培養用の培地、臓器細胞培養用の培地、前記２つの培地を混合したものなどを使用することが好ましい。血管内皮細胞培養用の培地はどのようなものを使用してもよいが、hEGF（組換えヒト上皮細胞成長因子）、VEGF（血管内皮細胞成長因子）、ヒドロコルチゾン、bFGF、アスコルビン酸、IGF1、FBS、Antibiotics(例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシンBなど)、Heparin、L-Glutamine、Phenolred、BBEの少なくとも１種を含むものを使用するのが好ましい。血管内皮細胞培養用の培地としては、EGM-2 BulletKit（Lonza社製）、EGM BulletKit（Lonza社製）、VascuLife EnGS Comp Kit（LCT社製）、Human Endothelial-SFM Basal Growth Medium（Invitrogen社製）、ヒト微小血管内皮細胞増殖培地（TOYOBO社製）などを用いることができる。臓器細胞培養用の培地はどのようなものを使用してもよいが、臓器細胞が肝細胞である場合、ascorbic acid、BSA- FAF、insulin、hydrocortisone、GA-1000の少なくとも１種を含むものを使用するのが好ましい。肝細胞培養用の培地としては、HCM BulletKit（Lonza社製）よりhEGF（組換えヒト上皮細胞成長因子）を除いたもの、RPMI1640（Sigma-Aldrich社製）に1% B27 Supplements (GIBCO社製) と 10ng/mL hHGF (Sigma-Aldrich社製)などを用いることができる。ヒト肝芽の形成に関しては、GM BulletKit（Lonza社製）とHCM BulletKit（Lonza社製）よりhEGF（組換えヒト上皮細胞成長因子）を除いたものを１：１で混ぜたものに、Dexamethasone、Oncostatin M、HGFを添加すると、肝芽の成熟に効果があることが判明している。

臓器細胞は、ゲル上に播種して培養を行うことが好ましい。この際、使用するゲルは特に限定されないが、BD Matrigel（BD pharmingen社製）などを使用することができる。

培養時の温度は特に限定されないが、３０～４０℃とするのが好ましく、３７℃とするのが更に好ましい。

培養期間は特に限定されないが、３～１０日とするのが好ましく、６日とするのが更に好ましい。

以上のようにして作製した器官芽を非ヒト動物に移植し、その非ヒト動物内で成熟させることにより、組織又は臓器を作製することができる。使用する非ヒト動物としては、マウス、ウサギ、ブタ、イヌ、サルなどを挙げることができる。また、使用する非ヒト動物は、免疫拒絶反応を回避するために、免疫不全動物であることが好ましい。

従って、本発明は、上記の方法によって作製された器官芽をヒト又は非ヒト動物に移植することを含む、器官芽の移植方法も提供する。器官芽の移植部位は、移植可能であればどの部位であってもよいが、頭蓋内、腸間膜、肝臓、脾臓、腎臓、腎被膜下、門脈上などを例示することができる。頭蓋内に移植する場合には、in vitroで作製した1～3個程度の5mm大の器官芽を移植するとよく、腸間膜に移植する場合には、in vitroで作製した１～6個程度の5mm大の器官芽を移植するとよく、門脈上に移植する場合には、in vitroで作製した１～20個程度の5mm大の器官芽を移植するとよい。腎皮膜に移植する場合には、in vitroで作製した1～5個程度の5mm大の器官芽を移植するとよく、肝臓・脾臓・腎臓・に移植する場合には、in vitroで作製した100～200個程度の100μm大の器官芽を移植するとよい。

以上のようにして作製した組織及び臓器は、創薬スクリーニングや再生医療などに使用することができる。

従って、本発明は、上記の方法によって作製された器官芽をヒト又は非ヒト動物に移植し、組織又は臓器に分化させることを含む、組織又は臓器の再生又は機能回復方法を提供する。非ヒト動物としては、マウス、ウサギ、ブタ、イヌ、サルなどを挙げることができる。

また、本発明は、上記の方法によって作製された器官芽を非ヒト動物に移植し、組織又は臓器に分化させることを含む、非ヒトキメラ動物の作製方法も提供する。器官芽を移植した非ヒト動物（例えば、マウス）は、器官芽の作製に用いた臓器細胞の由来生物種（例えば、ヒト）の生理機能を模倣しうる。後述の実施例では、ヒト由来のiPS細胞から作製した器官芽を移植したマウスがヒトの肝機能を模倣することが確認されたので、このマウスを用いてヒトの薬物代謝プロファイルを予測することができると考えられる。

さらに、本発明は、上記の方法によって作製された器官芽、組織及び臓器、及び非ヒトキメラ動物からなる群より選択される少なくとも一つを用いて、薬剤を評価する方法も提供する。薬剤の評価としては、例えば、薬の候補化合物の薬物代謝プロファイルの予測、薬効評価、毒性評価、薬物相互作用評価などを挙げることができる。

また、本発明の方法により作製した組織及び臓器から組織幹細胞を創出することも可能であり、本発明はヒト組織細胞や臓器細胞の大量創出の細胞操作技術への応用が可能である。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
〔実施例１〕未分化な臓器細胞を用いた臓器の作製

〔実験方法〕
（１）ヒト肝臓内胚葉細胞の作製
ヒトiPS細胞（ヒト皮膚由来TkDA3 hiPSCクローン（Koji Eto氏及び Hiromitsu Nakauchi氏より譲渡））を無血清培地にアクチビンを添加して培養することで、CXCR4及びE-cadherin両陽性の内胚葉系細胞を誘導した。得られた内胚葉系細胞をBMP４、FGF２を添加して２日間培養することで、CXCR4陰性 HNF4α陽性の肝臓内胚葉集団を得た。CXCR4及びHNF4αの発現は、Hepatology, 51(1), 297-305,2010の記載に従い、免疫染色及び遺伝子発現解析により確認した。
（２）ヒト肝芽の作製
得られた肝臓内胚葉細胞を、血管内皮細胞（ヒト臍帯血由来静脈内皮細胞）（Lonza、Basel、Switzerland）及び未分化間葉系細胞（ヒト間葉系幹細胞）（Lonza、Basel、Switzerland）を各々１０：５-１０：２の割合で混合し、共培養を行った。血管内皮細胞および未分化間葉系細胞は、各々蛍光標識を行ったものを用いた。共培養に際しては、原液ないし２倍希釈のマトリゲル（BD pharmingen）の固相化を行った培養皿の上へ細胞懸濁液を播種した。培養液は、内皮細胞培地キット-2：EGM-2 BulletKit（製品コード CC-3162：Lonza）を用いた。

短期間（３-１０日）培養を行い、ヒト三次元構造体（肝芽）を作製した。また、形成過程、及び形成された構造体の共焦点顕微鏡による観察を行い、細胞の形態、局在などの動態／静態解析を実施した。更に、形成されたヒト三次元構造体の遺伝子発現解析を行った。
（３）ヒト肝組織の作製
形成されたヒト三次元構造体を、免疫不全マウス（NOD/SCIDマウス（Sankyo Lab. Co., Tsukuba, Japan））生体内へ移植した。肉眼および共焦点顕微鏡によるライブ観察を実施し、ヒト細胞の生着・増殖を確認するとともに、移植後の血管成熟化過程を解析した。移植早期のサンプル（２週間）を回収し、その組織学的解析を行った。

〔実験結果〕
（１）ヒト細胞のみから自律的に組織化が進行し、肉眼的に観察可能な立体的な構造体が形成された（図１）。
（２）培養４日目には、血管様の管腔構造が確認された（図１右上図の拡大像）。
（３）形成された三次元構造体は、未分化細胞のマーカーであるNANOGやCXCR4などの発現を減弱した（図２）。
（４）従来技術により終末分化誘導を行った細胞と比較して、肝細胞の分化マーカーであるアルブミン(ALB)の発現を100倍以上増強し（図２）、その他の分化マーカー（FOXA2、TAT、PCK2）の発現も数十倍程度の発現増強を示した（図３）。
（５）移植により、ヒト血管がマウス血管と接続し、早期（移植２日目）から血液灌流が開始した（図４）。
（６）ヒトiPS細胞由来肝臓細胞の増殖が確認された（図５）。
（７）移植早期（２週）のサンプルの組織学的解析により、アルブミン陽性の索状構造の形成が確認された。また、類洞様構造の形成も確認された（図５）。
（８）共培養の際、細胞懸濁液をマトリゲル固相化培養皿上へ播種するのではなく、細胞懸濁液をマトリゲル中に包埋した場合、非コートの培養皿へ播種した場合、あるいは培養皿をtype 1 collagenでコートした培養皿へ播種した場合、には立体構造は形成されなかった。
（９）共培養の際、培養液として内皮細胞培地ではなく、Hepatocyte Medium (XenoTech)、あるいはBMP4及びFGF2を添加した肝細胞誘導培地（Hepatology, 51(1), 297-305,2010）を用いた場合には、肝芽に特徴的な遺伝子発現の増強(Alb、TTRなど)は認められなかった。

〔実施例２〕分化した臓器細胞を用いた臓器の作製
〔実験方法〕
膵β細胞株（MIN6）を、血管内皮細胞（ヒト臍帯血由来静脈内皮細胞）及び未分化間葉系細胞（ヒト間葉系幹細胞）を各々５：５-１０：２の割合で混合し、共培養を行った。膵β細胞株(KO)および血管内皮細胞(EGFP)は、各々蛍光標識を行ったものを用いた。共培養に際しては、原液ないし２倍希釈のマトリゲル（BD pharmingen）の固相化を行った培養皿の上へ細胞懸濁液を播種した。尚、マトリゲル内部へ包埋した場合、あるいは、非コート、type 1 collagenコートの培養皿では、立体構造は形成されなかった。培養液は、内皮細胞培地キット-2：EGM-2 BulletKit（製品コード CC-3162：Lonza）を用いた。

短期間（３-１０日）培養を行い、三次元構造体を作製した。形成過程、及び形成された構造体の共焦点顕微鏡による観察を行い、細胞の形態、局在などの動態／静態解析を実施した。

形成された三次元構造体を、免疫不全マウス（NOD/SCIDマウス（Sankyo Lab. Co., Tsukuba, Japan））生体内へ移植した。肉眼および共焦点顕微鏡によるライブ観察を実施し、細胞の生着・増殖を確認するとともに、移植後の成熟化過程を解析した。移植サンプル（4週間）を回収し、その組織学的解析を行った。

〔実験結果〕
（１）細胞のみから自律的に組織化が進行し、翌日には肉眼的に観察可能な立体的な構造体が形成された(図６)。
（２）培養２日目には、膵β細胞株が集塊を形成し、その周囲を取り囲むようにヒト血管様の管腔構造が確認された(図７)。
（３）移植により、ヒト血管がマウス血管と接続し、移植早期から血液灌流が開始した（図８）。
（４）膵β細胞株は集塊を形成するように増殖し、膵島様の構造体を形成した（図９）。
（５）形成された膵島様構造体の中にヒト細胞からなる血管構造の形成が確認された（図１０）。
（６）血流の可視化により、膵島様構造体の内部では、充分に血液灌流が再開していることが確認された（図１１）。
（７）移植サンプルの組織学的解析により、インスリン陽性の島状構造の形成が確認された。形成された構造体は、内部に複雑な血管構造を有しており、正常マウス膵島と類似の構造を有していた（図１２）。

〔実施例３〕人工多能性幹細胞由来の器官芽移植による機能的な血管化ヒト肝臓の創出
末期臓器不全を治療するためのドナー臓器は著しく不足しており、患者由来の人工多能性幹細胞（hiPSCs）^1, ²を用いて臓器を作成する必要性が一段と高まっている。多くの論文にて機能的な細胞分化が報告されているものの^3-7、肝臓といった3次元の血管網を有する臓器の作成に成功した例はない。我々は、in vitroで調製したhiPSC由来の肝芽（hiPSC-LBs）の移植により、血管構造を有する機能的なヒト肝臓組織の作成に成功した。内皮細胞と間葉細胞⁸を加え、器官形成を促したところ、iPS細胞由来肝内胚葉細胞は3次元的なhiPSC-LBsへと自己組織化した。免疫染色及び遺伝子発現解析の結果、in vitroで成長したhiPSC-LBsとin vivoの肝芽間で類似性が認められた。hiPSC-LBs移植片内のヒト血管網は、48時間以内に宿主血管と連結し、血液灌流が開始した。機能的な血管構造が形成されることにより、hiPSC-LBsは成体肝臓と類似する組織へと成熟することが明らかとなった。さらに、高い代謝能を有するhiPSC由来の移植組織は、レシピエントの肝臓の置換^9, ¹⁰を要することなく、ヒト型のタンパク質産生やヒト特異的な薬物代謝といった肝臓特異的な機能を発揮した。さらに、hiPSC-LBsを腸間膜へ移植したところ、薬物で誘導した致死的肝不全モデルの生存率を向上させた。我々の知る限り、本報告は多能性幹細胞から機能的なヒト臓器を作成した最初の例である。本手法を臨床に応用するには更なる検討が必要であるものの、我々が実験で実証した器官芽移植は、再生医療において可能性のある新たなアプローチを提供するものである。

1981年に胚幹細胞が発見されて以来、多能性幹細胞から肝臓のような複雑な構造をもつ臓器を作成することが数々試みられてきたが、成功した例は無い。これは器官形成過程に生じる細胞や組織間での複雑な相互作用をin vitroで再現するのは困難であると考えられてきたからである^2, ¹¹。我々は、器官形成における最初のプロセス、つまり、器官芽発生時の細胞間相互作用に注目し、本課題に取り組んだ。

肝臓形成初期時では、シート状の前腸内胚葉層より細胞が放出し、三次元的な肝芽（LB）¹²を形成する。このような形態学的な大きな変化は、血液灌流に先立って起こる内胚葉細胞、間葉系及び内皮系前駆細胞間での精密に編成されたシグナルに依存する⁸。これらの知見に基づき、我々は、肝内胚葉細胞を内皮系及び間葉系細胞と共に培養することで、3次元的（3D）なLB形成をin vitroで再現しうると仮定した（図13a）。本仮説を実証するため、まず最初に、段階的な誘導因子の添加によりヒトiPSCsを肝内胚葉細胞（hiPSC-Hep）へと分化誘導した。その結果、当該細胞の約80%において細胞運命決定に関わる肝性マーカーHNF4Aの発現が認められた（図17及び13b）。

次に、初期肝臓形成を再現する目的で、hiPSC-Hep細胞をストローマ細胞群と共培養した。内皮及び間葉細胞については、未分化性を有するヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）及びヒト間葉幹細胞（hMSCs）を特記しない限り用いた。特筆すべき事に、2D培養の条件で培養したにも関わらず、特定のマトリックスタンパク質上で生育したhiPSC-Hep細胞は、内在性の組織化能力により肉眼で確認できる程の大きさの3D細胞クラスターを培養後24時間以内に形成した（図 13 c、 d、e）。hiPSC-Hep由来の肝芽（hiPSC-LBs）と推定されるクラスターは、適度な力学的強度を有し、のちの移植操作等に耐えうるものであった。hiPSC-LBs内での精密な内皮細胞の発芽を伴う血管網の発達を、蛍光タンパク質で標識された細胞を用いて可視化した（図 13 c）。また、同一のドナーから得られた臍帯由来のMSCs及びHUVECsを用いることで、hiPSC-LBの形成は均一に保たれた（図18a、右）。qPCR解析の結果、hiPSC-LBs内の細胞は、肝臓の初期分化マーカーであるアルファフェトプロテイン（AFP）、レチノール結合プロテイン（RBP4）、トランスチレチン（TTR）及びアルブミン（ALB）⁵を高いレベルで転写していた（図18d）。興味深いことに、ストローマ細胞依存的なhiPSC-Hep細胞の肝成熟は、トランスウェルを用いた共培養系でも一定程度維持された（図13f）。肝成熟を誘導する介在因子を調べる目的で、マイクロアレイ及びqPCR解析を行った。ストローマ細胞特異的な遺伝子群のうち、BMP4及びFGF2が内皮及び間葉細胞との共培養系において顕著に上昇していた（図19）。BMP-及びFGF-特異的なシグナリングの阻害剤であるNoggin及びSU-5402は、ストローマ細胞との共培養による分化促進効果を阻害した。一方で、BMP4及びFGF2をhiPSC-Hep培地に添加すると、同様の肝分化誘導効果が観察された（図13g、h）。これら結果は、動物実験¹³でも認められたように、直接的な細胞間の相互作用に加えて、BMP及びFGF経路の活性化を介して、ストローマ細胞による液性因子によるパラクリンサポートが肝臓初期成熟を一部支持している事を示唆している。

hiPSC-LBは、妊娠後期及び生後マウスにあるような発達した肝臓とは異なり、E10.5マウスのLBs（mLBs）と良く類似していた（図14a）。hiPSC-LB及びE10.5 mLBsは、間葉系及び内皮系前駆細胞と同様に、AFP^14, ¹⁵を発現し、二分化能を有する増殖性肝芽細胞によって構築されている。hiPSC-LB及びE10.5 mLBsでは90%以上の推定肝細胞がAFPを発現していたが、E15.5及びE17.5 mLBsでは認められなかった（図14b）。hiPSC-LB内の肝細胞は、E10.5 mLBsと同程度の増殖能を有した（図14c）。さらに、hiPSC-LBはE10.5 mLBsと同様の割合の間葉系及び内皮系前駆細胞より構成されていた（図14d、e）。遺伝子発現の特徴を調べるため、肝臓発生時に連続的に発現上昇する83種の遺伝子を選択し、その発現をマイクロアレイRNAプロファイリングにより検討した。先行研究により、E10.5 mLBsは妊娠3-4週（3-4GW）のヒト胎児肝臓と対応することが示されたいるが^16, ¹⁷、これと合致するように、妊娠22-40GWの胎児及び成体に由来するより発達した肝臓組織と比較して、hiPSC-LB における83種の遺伝子発現パターンは適切な分化ステージにあることが認められた（図14f及び図20）。

血行動態の促進は、LB成熟に必須である¹⁸。hiPSC-LBsが完全な機能を有する肝臓組織を再構築するか検討するため、長期にわたって繰り返しイメージング¹⁹を行うことのできる頭蓋観察窓への移植を行った。まず、マウス肝芽由来の細胞（mLB）を移植実験に用いることにより、本モデルがLBの成熟過程を再現できることを確認した（補足考察、図21及び22）。さらに、LB（hFLC-LBs）形成能を同様に有する胎児肝細胞をコントロールとして培養の際に用いた（図18a）。移植されたヒト細胞のin vivoでの経過を観察するため、in vivoにおけるhiPSC-LBs由来の組織を様々な時点で繰り返しイメージングした。特筆すべき事に、in vitro由来のhiPSC-LBsは、移植後48時間以内に宿主の血管構造と速やかに連結した（図15a、b及び図23）。フルオレセイン・デキストラン接合体及びまたはAlexa 647標識したマウス特異的CD31抗体を注入した結果、移植したhiPSC-LBs内のヒト血管は、移植片の末端で宿主血管と連結することが明らかとなった。この結果は、摘出組織片をホールマウントした免疫染色によっても確認された（図15c、d及び図24、25a、b）。さらに、内皮細胞を含まずに移植を行ったhiPSC-Hepsは血管形成が生じず、生着が出来なかった事から、機能的な血管形成がhiPSC-LBの移植及び増大に必要不可欠である事が示された（図15f及び図25）。hMSC由来の血管周囲細胞によって安定化されたヒト血管は少なくとも180日間残存した（図15e及びg）。興味深い事に、hiPSC-LB 移植片の血管網は、類似の形態を持つ成体肝臓と同程度の密度であった。一方、 HUVECs及びhMSCsのみで構築された移植片内の血管構造は、hiPSC-LB 移植片と比較して、血管径は同程度（約12 μm）であったものの、密度はより低かった（図15h、i及び図26、27）。また、生体内イメージングにより、肝細胞の形態に基づいて分化状態を推定しうることが見出された（図27c及び補足考察）。近年、遺伝子改変動物を対象とした詳細な研究の結果から、内皮細胞は、栄養素や酸素を輸送する経路を形成しているのみならず、パラクリントロフォゲン産生により肝臓の器官形成および再生^8, ^20, ²¹を促進する血管微小環境を確立しているものと推測されている。このような移植モデルを用いることにより、ヒト組織を対象としても、器官形成時の成熟及び分化過程を評価しうるユニークな生体内モニタリングシステムが確立されたといえる。さらなる研究により、生理的な肝形成をより精密に再現するヒトストローマ細胞株の知られざる器官発生時の役割が明らかになる事が期待される。

LB移植片は60日後に組織学的に解析を行った。hFLC-LBと同様に、hiPSC-LB移植片も成体肝臓に特徴的な肝細胞索様の構造を有しており（図16a及び図28a）、本構造はタイトジャンクションプロテイン・ゾナオクルーデンス1（ZO-1）、ALB、サイトケラチン8及び18（CK8.18）（図16b）を発現する細胞、及び、通常は洞様血管²²の全長に沿って見出されるコラーゲンIVを含む基底膜（図29a）により構成されていた。さらに、成熟肝細胞マーカーであるアシアログリコプロテインレセプター1（ASGR1）が発現し、未成熟肝細胞マーカーAFPの発現していないことが示された（図29b、14a）。移植4ヶ月後には、肝組織を形成する殆どの細胞において、通常の肝臓内の肝細胞と同様に増殖が停止したことが、増殖マーカーであるKi-67の発現によって確認された（図28b）。よく発達した卵形のミトコンドリア、タイトジャンクションの形成、グリコーゲンおよび脂肪の細胞質内蓄積、毛細胆管といった成熟肝細胞に特徴的な超微細構造を移植片由来の細胞は有していた（図30b、c、d、e）。

hiPSC-LB移植を行ったマウスの血清を解析した結果、ヒトタンパク質であるヒト型ALB及びA1アンチトリプシン（AAT）の生産及び分泌が確認された（図16e）。移植60日後に外植したhiPSC-LBsをqPCR解析した結果、in vitro由来のhiPSC-LBsと比較して有為な肝成熟が認められた（図31）。糖質、アミノ酸及びヌクレオチド代謝といった低分子量代謝物のプロファイルを調べるため、hiPSC-LB移植片をメタボローム解析したところ、タウロコール酸といった肝臓特異的な物質を含む222の代謝物が検出された（図16f）。これら代謝性の高いプロファイルは、元のhiPSCsよりもヒト成体肝臓のプロファイルと近似していた（図32）。さらに、肝臓の重要な機能の一つである薬物代謝活性を調べるため、ヒトとマウスで異なる様式により代謝されることが知られているケトプロフェン²³もしくはデブリソキン^24, ²⁵をマウスに投与した。薬物投与の後、ヒトに特異的な代謝物の形成がhiPSC-LBを移植したマウスの尿及び血清サンプルより認められた（図16f、g、h及び補足考察）。これより、本マウスを用いてヒトのin vivoでの生理機能を模倣することで、ヒトの薬物代謝プロファイルを予測しうる事が示された。特に、従来法では重度に損傷を受けた肝臓を持つマウス^26、27を宿主とし、高品質な成体肝細胞を移植する必要があったことから、今後ヒトiPS細胞を用いてヒト型の薬物応答を精密に検証しうる点で意義が深い。

将来的な臨床への応用を目的とし、頭蓋よりも現実的な標的部位であり、侵襲性が極めて低い腸間膜移植モデルについて検討した。hiPSC-LBをフィブリン糊でシールした腸間膜へ移植した結果、1ヶ月目にはヒト血管が宿主血管と連結し、移植LBの生着が肉眼により確認された（図33a、b）。腸間膜へ移植を行ったhiPSC-LBは、頭蓋移植の場合と比較して、タンパク質産生および薬物代謝の点でより高い機能を有しており、先の研究²⁸でも示されたように門脈循環の重要性が裏付けられた。さらに、模擬処置マウスと比較して、hiPSC-LBの移植により、ガンシクロビルで肝不全を引き起こしたTK-NOGマウス²⁹の生存率が向上した（図16i及び補足考察）。以上のことから、in vitro hiPSCs由来のLBを移植することで、我々は血管網を有する機能的なヒト肝臓組織を誘導することに成功したと言える。

自己の多能性幹細胞を用いた再生医療は、極めて大きな期待を集めている。しかし、幹細胞を用いたアプローチとして現在主要な課題である細胞移植を用いた臨床試験は、現在までに満足のいく結果が得られていない^30、31。3次元の血管新生した器官をin vivoで作成する新たな手法として、器官芽の移植が有効である事が本研究により証明された。これら結果は、器官不全の治療として、in vitroで成長させた器官芽の移植が大きな治療的有効性を持つ事を強調するものである。

方法要約
hiPSCsの肝初期分化誘導は先述の方法⁵に従い行った。HUVECsとhMSCs（Lonza、Basel、Switzerland）は、内皮増殖培地（EGM）（Lonza）もしくはMSC増殖培地（Lonza）を用いて、加湿インキュベーター内で37度、5%のCO₂存在下で維持された。ヒトLBをin vitroで作成する際は、EGMと肝細胞用培地（HCM）（Cambrex、 Baltimore、MD）（デキサメタゾン（0.1 μM、Sigma-Aldrich、St Louis、MO）、オンコスタチンM（10 ng/ml、R&D System、Minneapolis、MN）、HGF（20 ng/ml、PromoKine）及び SingleQuots（Lonza）を含む）に1x10⁶のhiPSC由来肝細胞、0.8-1x10⁶のHUVECs、及び2x10⁵のhMSCsを懸濁し、マトリゲル（BD Biosciences、Bedford、MA、USA）上に塗布した。培養4-6日後、生成したhiPSC-LBsを剥がし、採取した後、免疫不全マウスの頭蓋窓¹⁹に移植した。

方法
細胞培養及び分化 TkDA3 hiPSCクローンは、Koji Eto氏及び Hiromitsu Nakauchi氏より分譲頂いた。未分化hiPSC細胞については、マウス胚線維芽細胞をフィーダー細胞として用い、その上で生育させた。内胚葉性分化の際は、hiPSCsをマトリゲルでコートしたディッシュ上に撒いた後、1%のB27（インスリン不含）と（100ng/ml）を含むRPMI1640培地へと移し、5-6日間培養した。hiPSC由来の内胚葉細胞をhbFGF（10ng/ml）、hBMP4（20ng/ml）及び1% B27を含むPRMI1640でさらに3-4日間処理することで肝臓への特定化を行った。ヒト組換体アクチビンA/ EDFは、Yuzuru Eto氏（Ajinomoto Co. Inc.）より分譲頂いた。hFLCs（CS-ABI-3716；Applied Cell Biology Research Institute）は、コラーゲンIVでコーティングされた6-wellプレート（BD Biosciences）上に撒かれた後、当研究室の標準培地［10% FBS（Lot.7219F; ICN Biochemical、USA）、50 mmol/l HEPES（Wako Pure Chemical Industries、Japan）、2 mmol/L L-glutamine（Life Technologies Corporation、USA）、50 mmol/L 2-mercaptoethanol（Sigma）、1× penicillin/streptomycin（Life Technologies）、10 mmol/L nicotinamide（Sigma）、1 × 10^-4 M Dexamethasone（Sigma）及び1 μg/ml insulin（Wako）を含むF-12（Sigma Aldrich、Japan）とDMEMの1:1混液］を用いて維持された。ヒト組換体HGF（50 ng/ml）及び EGF（20 ng/ml）（Sigma）を培養前に添加した。HUVECs及びhMSCs（Lonza）は上皮増殖培地もしくはMSC増殖培地（Lonza）を用いて、加湿インキュベーター内で37度、5%のCO₂存在下で維持された。

レトロウイルスによる形質導入ライブイメージングのため、EGFPまたはkusabira orange (KOFP)を発現するレトロウイルスに文献に記載されているように¹⁹ 細胞を感染させた。すなわち、レトロウイスルベクターpGCDNsam IRES-EGFP または KOFP を293gp および 293gpg パッケージング細胞（Masafumi Onodera氏に提供いただいた）中にトランスフェクションし、テトラサイクリン誘導性の系を用いてウイルス粒子産生を誘導した。レトロウイルスに感染した細胞の培養上清を0.45-μm フィルター (Whatman, GE Healthcare, Japan)に通し、直ちに感染に用いた。KOFPは、515 nmに小さい肩を有する主要吸収極大波長を548 nmに示し、そして561 nmにピークを有する明るいオレンジ色蛍光を発した³²。

移植 In vitroで生成したLBを剥がし、採取した後、重度免疫不全のNOD/SCIDマウス（Sankyo Lab. Co., Tsukuba, Japan）に施した頭蓋窓内に移植した。移植された細胞のin vivoでの経過は、蛍光顕微鏡（model BZ-9000; Keyence、Osaka、Japan）もしくはLeica TCS SP5共焦点顕微鏡（Leica Microsystems、 Germany）を用いた生体内イメージングにより観察された。生存曲線については、TK-NOGマウス（体重<20-30 g ）（提供元Central Institute for Experimental Animals、Kanagawa、Japan）²⁹を用いて解析した。1ダースのhiPSC-LBsを腸間膜に移植後、7及び10日目に、ヒト及びマウス組織には無毒なガンシクロビル（GCV、 50mg/kg、腹腔内注入）をマウスに投与することで、遺伝子導入された肝臓の実質細胞を組織特異的に消去した。動物実験利用に関する当研究施設ガイドラインに沿って、マウスは交配及び維持された。

生着血管による灌流の数量化 1%テトラメチルローダミン結合デキストラン(MW 2,000,000)、フルオレセインイソチオシアナート結合デキストラン (MW 2,000,000) およびテキサスレッド結合デキストラン (70,000 MW, 中性)の尾静脈注入により、血管腔を同定した(すべて Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。移植された血管およびデキストランについて共焦点イメージを多数得た。MetaMorph Angiogenesis Moduleソフトウエア (Molecular Devices, Union City, CA, USA)を用いて、イメージの投影をプロセシングした。次に、全細管長、フィールドあたり細管％および管直径をExcelスプレッドシートに自動的に記録した。

遺伝子発現分析 qPCR分析を以前に記述されているように³³実施した。ヒト胎児肝臓(Lot No.: A601605) およびヒト成体肝臓 (Lot No.: B308121)の全RNAは Biochain Institute (Hayward, CA, USA)から得た。

遺伝子発現マイクロアレイおよびデータ分析
全RNAは、RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)を用いて、hiPSC由来細胞／組織(hiPSC, hiPSC-Def, hiPSC-Hep, hiPSC-IH, hiPSC-MH, hiPSC-LB, hiPSC-LB-Tx) から調製した。ヒト胎児肝臓(Lot No.: A601605) およびヒト成体肝臓 (Lot No.: B308121)の全RNAは Biochain Institute (Hayward, CA, USA)から得た。cRNAを増幅し、Low Input Quick Amp Labeling Kit (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)を用いて標識し、44Kの60量体オリゴマイクロアレイ(Human Gene Expression 4x44K v2 Microarray Kit; Agilent Technologies)に製造者の指示に従ってハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたマイクロアレイスライドを、Agilent High-Resolution Microarray Scannerを用いてスキャンした。Feature Extraction Software バージョン 10.7.3.1 (Agilent Technologies)を用いて、相対ハイブリダイゼーション強度およびバックグラウンドハイブリダイゼーション値を計算した。Agilent Technologiesが推奨する手順に従ってGeneSpring 11.5.1 Software中のフラグ基準を用いて、生のシグナル強度および各プローブのフラグをハイブリダイゼーション強度およびスポット情報から計算した。さらに、サンプルの生シグナル強度をlog2変換し、変位値アルゴリズムによって正規化した。我々は全てのサンプルに、「妥協した」(compromised)フラグを除きプローブを選択し、検出された遺伝子として34,183個のプローブを得た。さらに、我々は遺伝子レベルにおける26,153個の発現データに焦点をあてる。GeneSpringによってヒートマップが作製された。正規化された強度値をロードし、各プローブの中央値からの距離によりスケーリング調整した。我々はユークリッド測定基準を用いる序列的クラスタリング法によってサンプルおよび遺伝子を分類した。種々の段階のhiPSCs中における遺伝子発現パターンの相違を評価するため、我々は選択した83種の遺伝子の発現変化を分析した。これらの遺伝子は、種々の異なる発生段階にあるマウス肝細胞および2つの異なる段階にあるヒト肝組織のマイクロアレイ分析による我々の以前の研究において同定された。すべての遺伝子から83種の遺伝子を肝臓特性遺伝子として選択した。なぜなら、それらの遺伝子はヒトおよびマウス両者の肝臓発生に際し継続的に増加したからである。

ELISA 血液サンプルを室温で遠心管内で凝固させ（約5分間）、管の側面から離し、4℃（溶けかかった氷）に20分間保った。凝固した血液を10-15分間400 g, 4℃で遠心し、赤血球または凝固した物質を排除するよう注意しながら、血清画分を除去した。マウス血清サンプル中のヒトALBおよびAATを、Human Albumin ELISA Quantitation Kit (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA) および human alpha 1-antitrypsin ELISA Quantitation Kit (GenWay Biotech, Inc., San Diego, CA, USA)を製造者の指示に従って用いて測定した。

ホールマウント免疫染色 PBSに溶解した4%パラホルムアルデヒド(PFA)を用いて心穿刺｛しんせんし｝によりマウスを灌流した。頭蓋窓を形成するカバーグラスを除去し、移植片（厚さ約300μm）を摘出し、PBSに溶解した4% PFA中に氷上で1.5時間置いた。免疫染色のため、固定コラーゲンゲルをPBSで3回洗浄し（各10分間）、3% BSA/0.1% Triton X-100を用いて1時間ブロックし、一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。次に、PBS/0.1% Triton X-100を用いた10分間洗浄を3回実施した。二次抗体と共にサンプルを4℃で一晩インキュベートし、次にPBS/0.1% Triton X-100を用いた10分間洗浄を3回実施した。DAPIを用いて組織サンプルを対比染色し、封入剤(Vector Laboratories, USA)中のガラススライド上にマウントし、カバースリップを載せた。以下の一次抗体を使用した：マウス抗ヒトZO1、マウス抗ヒトCD31、およびラット抗マウスCD31（BD Biosciences）、ウサギ抗マウスコラーゲンIV（Millipore, USA）およびデスミン(Dako Corporation, Carpinteria, CA)。免疫染色は、Leica TCS SP5共焦点顕微鏡を用いて分析した。

組織プロセシングおよび免疫染色組織を4% PFA中で4℃で一晩固定し、プロセシングし、そしてパラフィン中に包埋した。ヘマトキシリン／エオシン(HE)を用いる免疫染色または標準的組織学的染色のため、横断切片（4μm）をMAS被覆スライド(Matsunami, Osaka, Japan)上に載せた。免疫染色の前に、クエン酸バッファー(pH 6.0)を用いたオートクレーブ抗原回収を実施した。用いた一次抗体は、抗ヒト：CD31；平滑筋アクチン；AFP；CK8.18（すべてDako Corporation）およびALB (BD Biosciences)。組織切片を二次抗体Alexa Fluor (Life Technologies)と共に室温で1時間インキュベートし、次にDAPI (Sigma)核染色を行った。LSM510レーザー走査顕微鏡(Carl Zeiss Co., Germany)を用いてイメージを得た。

統計学的分析データは、3または6回の独立した実験から得た平均値±標準偏差として表わす。3または4群間の比較を、順位による(by ranks)クラスカル・ワリス検定を用いて分析し、そしてマン・ホイットニーのU検定をボンフェローニ補正と共に用いて事後比較を行った。<0.05である両側P値を有意と考えた。

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補足方法
HUVEC MSC単離。我々は、横浜市立大学の倫理委員会によって定められ、承認されたガイドラインに従って臍帯サンプルを入手した(承認番号：13120510008)。HUVECsおよびMSCsは、文献に記述されているように²、臍帯から同時に単離した。

mFLC単離。C57BL/6-Tg CAG::EGFP (SLC, 日本)より単離したE13.5 mFLCsを、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM; 10%ウシ胎児血清(FBS)を含む）(JRH Bioscience, USA)中でピペッティングすることにより機械的に分離した。低速遠心分離(690 rpm/4℃で 1分間)を数回実施することにより、肝細胞を非実質細胞から分離した。分離した細胞を70μm 細胞ストレイナー (Falcon, USA)に2回通し、単細胞を得た。

生着した肝細胞形態の定量。IN Cell Investigatorソフトウエア (GE Healthcare, Fairfield, CT, USA)を用いて生体内共焦点イメージをプロセシングし、「形状因子」（周辺の長さを面積と関連させる、真円度の標準的推定）を用いて肝細胞分化の状態を分類した。この測定値は、１を完全な円として、0から１まで変動する。

メタボロームプロファイルの獲得。移植60日後にhiPSC-LB移植片(n=3)を回収し、分析した。Agilent 6210 時間飛行型質量分析計, Agilent 1100 均一濃度 HPLC ポンプ, Agilent G1603A CE-MS アダプターキットおよび Agilent G1607A CE-ESI-MS スプレーヤーキットを備えたAgilent CE キャピラリー電気泳動システム (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)を用いて、CE-TOFMSを実施した。このシステムは、CE用Agilent G2201AA ChemStation ソフトウエアバージョン B.03.01 (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)によって制御した。カチオン性代謝物は、電解質としてCation Buffer Solution (Human Metabolome Technologies)を用いる融合シリカキャピラリー（内径50μm x 全長80 cm）を用いて分析した。50 mbarの圧力で10秒間サンプルを注入した(約10 nl)。印加電圧を27 kVに設定した。陽性イオンモードでエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)を実施し、キャピラリー電圧を4,000 Vに設定した。m/z 50から1,000まで質量分析計をスキャンした。他の条件は、カチオン分析³におけるものと同様であった。

アニオン性代謝物は、電解質としてAnion Buffer Solution (Human Metabolome Technologies)を用いる融合シリカキャピラリー（内径50μm x 全長80 cm）を用いて分析した。50 mbarの圧力で25秒間サンプルを注入した(約25 nl)。印加電圧を30 kVに設定した。陰性イオンモードでESI-MSを実施し、キャピラリー電圧を3,500 Vに設定した。m/z 50から1,000まで質量分析計をスキャンした。他の条件は、アニオン分析⁴におけるものと同様であった。

CE-TOFMSによって得た生データを、自動積分ソフトウエアであるMasterHands⁵によってプロセシングした。m/z、移動時間(MT)および面積を含むピーク情報を得た。ピーク面積は、下記の等式にしたがって、相対ピーク面積に変換した。各ピークは、CEにおける類似の移動時間およびTOFMSによって決定されるm/z値にしたがって並べた。

相対ピーク面積＝代謝物ピーク面積／（内部標準ピーク面積ｘサンプル量）

代謝経路マップは、公有のソフトウエアであるVANTED: Visualisation and Analysis of Networks containing Experimental Data⁶を用いて提供された。

薬物代謝活性。頭蓋窓内にhiPSC-LBを移植したNOD/SCIDマウス(n=3)にケトプロフェン(15 mg/kg)を静脈内投与した。対照として、偽手術したNOD/SCIDマウスを用いた。尿（0-2時間）を0.5 M 酢酸バッファー (pH 5.0)中に集めた。尿サンプルに1 N KOHを添加し、80℃で3時間インキュベーションし、その後、等容量の1 N HCLを用いて中和した。1%酢酸を含むアセトニトリルを添加し、遠心にかけた（15000 rpm, 4℃, 5分）。上清を液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC/MS/MS)にかけた。液体クロマトグラフィー実験には、Intersil ODS-3カラム（ジーエルサイエンス株式会社、東京、日本）を備えたLC-20Aシリーズ（島津、京都、日本）を用いた。クロマトグラフィーによる分離は、Intersil ODS-3カラム（5 μm, 4.6 x 150 mm I.D.; ジーエルサイエンス株式会社、東京、日本）を用いて達成した。カラム温度は40℃に維持した。0.1%酢酸（溶媒A）および0.1%酢酸含有アセトニトリル(溶媒B)からなる移動相を、以下の勾配スケジュールに従って、流速0.5 mL/分で注入した：25-80%溶媒Bの直線勾配（0-15分）、80%溶媒B(15-25分)、80-25%溶媒Bの直線勾配（25-26分）、および25%溶媒B（26-35分）。液体クロマトグラフィーは、4000 Q Trapシステム(AB SCIEX, Foster City, CA)に連結し、陰性エレクトロスプレーイオン化モードで操作した。turboガスは600℃に維持した。親および／または断片イオンは第一の四極子でろ過し、そして衝突ガスとして窒素を用いて衝突セル内で解離した。イオンスプレー電圧は-4500Vで、ケトプロフェンおよび1-ヒドロキシケトプロフェンの分析された m/z移行(Q1/Q3)は、それぞれ253.1/209.3 および 269.1/209.3であった。

頭蓋窓内(n=3)および腸間膜内(n=3)にhiPSC-LBを移植したNOD/SCIDマウスにデブリソキン(2 mg/kg)を経口投与した。対照として、偽手術したNOD/SCIDマウスを用いた。投与の0.5、1，2および8時間後に血液サンプルを集め、ヘパリンナトリウムを添加した。遠心により血液から血漿を分離した。内部標準（ニフルミン酸 1 μm）およびメタノール溶液（100 μL）を5 μLの血漿に添加し、遠心にかけた（15000 rpm, 4℃, 5分）。上清をLC/MS/MSにかけた。LC実験には、Aquity UPLC BEH C18 カラム (Waters, Milford, MA, USA)を備えたAcquity UltraPerformance LC システム(Waters, Milford, MA, USA)を用いた。クロマトグラフィーによる分離は、Acquity UPLC BEH C18 (1.7 μm, 2.1 x 50 mm I.D.; Waters, Milford, MA, USA)を用いて達成した。カラム温度は40℃に維持した。10 mM酢酸アンモニウム（溶媒A）およびアセトニトリル(溶媒B)からなる移動相を、％以下の勾配スケジュールに従って、流速0.8 mL/分で注入した：0%溶媒B（0-0.2分）、0-30%溶媒Bの直線勾配（0.2-0.3分）、30-60%溶媒Bの直線勾配（0.3-0.85分）、60%溶媒B（0.85-1.15分）、60-100%溶媒Bの直線勾配(1.15-1.16分)、および100%溶媒B（1.16-1.5分）。液体クロマトグラフィーは、API4000システム(AB SCIEX, Foster City, CA)に連結し、陽性エレクトロスプレーイオン化モードで操作した。turboガスは450℃に維持した。親および／または断片イオンは第一の四極子でろ過し、そして衝突ガスとして窒素を用いて衝突セル内で解離した。イオンスプレー電圧は5000Vで、4-ヒドロキシデブリソキンおよび内部標準の分析された m/z移行(Q1/Q3)は、それぞれ192.6/132.1 および 283.2/245.4であった。

肝損傷モデル。我々の移植戦略の治療的可能性を評価するため、Alb-TRECK/SCIDマウスを用いて肝損傷研究を行った。Alb-TRECK/SCIDマウスは、Hiromichi Yonekawa および Kunie Matsuoka（東京都臨床医学総合研究所）より提供いただいた。このトランスジェニック系統はALBエンハンサー／プロモーターからHBEGFを発現し、そして少量のジフテリア毒素(DT)を投与すると劇症肝炎を発症する⁷。フィブリン糊で覆った腸間膜中にhFLCs-LBsを移植した。LB移植後、2日目に尾静脈より1.5 μg/kg DTを注入し、重篤な肝損傷を引き起こした。移植を受けたマウスと受けていないマウスの間で生存を比較した。

補足考察
機能性肝臓組織創出における頭蓋窓モデルの可能性
頭蓋窓調製のための詳しい手順は、以前に記述されている⁸。我々は、EGFPを発現しているE13.5マウス胎児肝細胞(mFLCs)の移植片を用いて、肝細胞の成熟を研究する上での頭蓋窓の可能性を評価した。コラーゲン／フィブロネクチンゲルに包埋したmFLCsの一片を切り出し、頭蓋窓の中心部に置いた。次に、組織適合性のシアノアクリレート糊を用いて8mmのカバーグラスを骨に接着させ、この窓をシールした。生体内蛍光顕微鏡イメージングは、移植されたmFLCsがうまく生着したこと、および機能性血管網が移植片内で形成されたことを示した（図21a）。移植された組織は、肝細胞索、類洞および胆管に類似した組織に広範に分化した。これらの組織は成体肝臓に特徴的なものであり、ドナーE13.5 LBsに特徴的なものではない（図21b）。mFLCsによる肝組織再構成は、HGFおよびEGF（これらは肝幹細胞／前駆細胞の増殖を刺激することが知られている）の添加により増強された（図22）^9,10。したがって、この移植アプローチは、LB細胞の成熟および分化を評価するために有益な生体内モニタリング系となることが示唆された。

ヒト肝細胞成熟の生体内評価
正常肝発生過程において、肝細胞の形態は円形から敷石上の細胞へと変化する¹¹。この変化は、サイトケラチン免疫染色によって容易に可視化することができる（図16a、左）。IN Cell Investigatorソフトウエアを用いて、我々はマウス肝細胞の真円度（形状因子）がE13.5における0.833 ± 0.18 から生後8週における 0.568 ± 0.16 まで低下することを見出した。同様に、単細胞形態の生体内イメージングは、移植されたEGFP標識hFLCsの真円度が0日目の0.93 ± 0.07 から30日後には 0.512 ± 0.13 に変化することを明らかにした（図27c、右）。これらの考察と一致して、酵素結合免疫測定法（ELISA）は移植30日後からのヒトアルブミン産生の出現を示した（図16cおよびd）。したがって、細胞形態の生体内モニタリングは、in vivoにおける肝細胞分化の状態を予測するための１つの指標となりうる。

ヒト特異的薬物代謝の検出
我々は、ケトプロフェン(KTP)を用いて、ヒト特異的薬物代謝機能を評価した。KTPはマウス中でシトクロームP450によって第一に代謝され、1-ヒドロキシケトプロフェン(OH-KTP)を形成する¹²。他方、ヒトにおいては、KTPは主としてUDP-グルコロノシルトランスフェラーゼ(UGT)によって代謝され、ケトプロフェングルクロニド(KTP-G)を形成する¹³。

肝臓ヒト化マウスは、ヒト特異的薬物代謝を研究する上で有用なツールである。肝臓ヒト化マウスにおけるヒト特異的薬物代謝機能は、高品質の成体肝細胞および酷く損傷した肝臓を有する免疫不全マウスを用いて、以前に報告されている。KTPの投与後、UGTがKTPグルクロニド化を容易にすること¹⁴、および加水分解によりKTPがKTP-Gに代謝されること、が観察された。KTP/OH-KTPピーク面積比を計算し、加水分解サンプルと非加水分解サンプルの間でこの面積比を比較した。KTP/OH-KTPピーク面積比の倍増は、サンプル中におけるKTP-Gの形成を示唆する。移植されたhiPSC-LBsを有するNOD/SCIDマウスおよび対照マウスにおける尿中の倍増は、それぞれ11.8±5.2 および 2.3±0.7であり、hiPSC-LBsを移植したNOD/SCIDマウスにおいてKTPグルクロニド化（ヒト特異的薬物代謝機能）が観察されることを示唆している。

ヒトCYP2D6に対する一般的な表現型検査剤として働くデブリソキンは、ヒトの中で4-ヒドロキシデブリソキン(4-OHDB)に代謝されるが、マウスでは無視できる。重要なことに、ヒトCYP2D6は公知薬物の25%の代謝に関与しており、そして多型が多数存在することにより、顕著な個体差に寄与している。デブリソキンの経口投与後、腸間膜または頭蓋に移植を受けた群における4-OHDBの血漿濃度は、偽手術群におけるそれよりも高く、これはヒト特異的薬物代謝物の産生を反映している。

臨床応用に向けたhFLC- またはhiPSC-LBの腸間膜移植モデルの確立
頭蓋窓モデルは高度に侵襲性であるため、器官芽移植にとって非常に効率的な方法とは言えない。したがって、臨床応用を想定する際には、より低侵襲的な移植法の開発が必要である。さらに、移植可能な容量が肝不全を逆転させるには不十分である。よって、我々は侵襲性が最少で、臨床的適切性を有する、腸間膜移植モデルの可能性を検討しようと試みた。なぜなら、肝機能の改善にとって門脈血流が重要であると考えられたからである。我々の期待と一致して、最近なされた報告が、恐らく腸間膜血流からの宿主血管補充によって、腹腔部位はヒト成体肝細胞の生着および肝機能の維持を支持しうることを示した¹⁵。In vitroで増殖させたhFLC-LBsまたはhiPSC-LBsを腸間膜上に移植した（図33a）。

2/3部分肝切除による刺激
hiPSC-LB移植片における肝細胞成熟は、HGF等の再生因子によって促進しうるかどうかを決定するため、腸間膜移植後7日目に2/3部分肝切除（PH）を実施した。2/3 PH実施後、30日目にヒトアルブミンの産生が偽手術群の82.1 ng/mlから2/3 PH群では121 ng/mlに上昇した（図33c）。これらの結果は、恐らくhiPSC-LB移植片内における広範な肝細胞増殖および成熟のゆえに、hiPSC-Hepsは2/3 PH後の再生刺激に応答しうることを示唆した。

hFLC-LB腸間膜移植を用いた肝不全の逆転
我々の移植法を用いた治療可能性を評価するため、in vitroで増殖させたhFLC-LBsをフィブリン糊でシールした腸間膜上に移植した。肝損傷モデルとして、肝細胞特異的アルブミンプロモーターの制御下でヒトHB-EGF前駆体を発現するトランスジェニック免疫不全マウスを用いた。毒素受容体媒介細胞ノックアウト／重症複合免疫不全(TRECK/SCID)マウスと呼ばれるこれらのマウスは、少量のジフテリア毒素(DT)を投与すると劇症肝炎を発症する⁷。DT剤は、移植後2日目に1.5 μg/kgの用量で尾静脈より注入した。生存曲線は、移植を受けなかったTRECK/SCIDマウスの全部が10日以内に死亡したことを明らかにした。対照的に、hFLC-LBを移植されたTRECK/SCIDマウスの28%は40日以上にわたって生存し、我々の概念実証の治療上の可能性を示した（図32d）。しかし、この移植モデルはある程度までうまくいくが、救助率は高くない。なぜなら、DTはヒト細胞に対しても毒性だからである。そこで、我々は免疫不全肝損傷モデルとしてTK-NOGマウスを採用した。なぜなら、GCV（ヒト組織に対して非毒性である）の投与が、適切なタイミングでトランスジェニック肝実質細胞の組織特異的除去を誘導するからである。このモデルを用いて、我々は、機能性ヒト血管網の形成を介して移植片がうまく生着することが予測される移植後7日目および10日目に、宿主肝細胞を除去した。

SUPPLEMENTARY REFERENCES
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9 Suzuki, A., Iwama, A., Miyashita, H., Nakauchi, H. & Taniguchi, H. Role for growth factors and extracellular matrix in controlling differentiation of prospectively isolated hepatic stem cells. Development 130, 2513-2524, (2003).
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本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

本発明の方法によって作製される組織及び臓器は、創薬スクリーニングなどに用いることができるので、本発明は、製薬産業などに利用可能である。

Claims

血管内皮細胞と未分化間葉系細胞とが相互作用して自律的に組織化することにより形成された三次元構造体からなる移植片であって、前記三次元構造体は、血管内皮細胞と未分化間葉系細胞以外の細胞を含まず、生体に移植すると血管構造を形成することができる前記移植片。
血管内皮細胞が分化した細胞である請求項１記載の移植片。
分化した細胞が臍帯血由来静脈内皮細胞である請求項２記載の移植片。
血管内皮細胞が未分化な細胞である請求項１記載の移植片。
未分化間葉系細胞が間葉系幹細胞である請求項１～４のいずれかに記載の移植片。
血管内皮細胞及び未分化間葉系細胞がヒト由来である請求項１～５のいずれかに記載の移植片。
未分化間葉系細胞とともに血管内皮細胞を培養することを含む、請求項１～６のいずれかに記載の移植片の製造方法。