JP2019511219A

JP2019511219A - 多能性幹細胞の分化方法

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Publication number: JP2019511219A
Application number: JP2018546672A
Authority: JP
Inventors: エリックルクレール; 酒井　康行; 康行酒井; 木村　圭一; 圭一木村; 宮島　篤; 篤宮島; 丈友木戸
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Foundation for the Promotion of Industrial Science
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Foundation for the Promotion of Industrial Science
Priority date: 2016-03-07
Filing date: 2016-03-07
Publication date: 2019-04-25
Also published as: US20190093082A1; EP3426768B1; EP3426768A1; WO2017153802A1

Abstract

【解決手段】多能性幹細胞を分化させる方法を提供することを目的とする。多能性幹細胞を分化させる方法であって、播種培地を備える容器に多能性幹細胞を播種するステップと；前記容器中の前記多能性幹細胞を分化させるステップと；前記多能性幹細胞が前駆段階に到達すると、前記多能性幹細胞を前記容器からバイオリアクターのチャンバ内へ移送するステップと；前記チャンバにおいて前記多能性幹細胞を成熟させるステップとを含み、前記チャンバの床は凹部又は凸部を含み、前記培地の流体が前記チャンバ内を流れ、酸素が前記チャンバへ供給される。
【選択図】図１

Description

本発明は、多能性幹細胞を分化させる方法に関するものである。

従来、肝臓病の起源に関与する細胞及び分子メカニズムを実証するため、新しい治療の開発のため、又は、物質の毒物学上のリスクアセスメントのために、肝臓細胞株、初代細胞及び／又は動物モデルが使用された。これらの異なるモデルを使用して得た結果は、いくつかの理由で批判することができる。最も一般に使用された細胞株は、癌によって生じたものか不死化されたものであり、主なシグナル経路の調節解除をもたらす遺伝子変異を備えている。動物モデルは、ハウジングの費用の理由のため及び倫理的理由のために、全く十分ということではない。より重要なことには、薬の約５０％の毒性を効果的に予測することができるので、動物は薬理毒物学上の研究のためによいモデルではない。もし、初代肝細胞が、現在、生体外での肝臓の代謝に関する研究のための基準モデルであるなら、それは多くの制限をも示している。ドナーの数は限られていて、得られた肝細胞の持続性／質は低い。さらに、遺伝的多型ドナーと関係する肝細胞バッチ変動性は、標準化された検査を複雑にする。特に最後のポイントは、肝細胞が、培地内で増殖せず、培地内で実質的に不可逆的に形質を失うことである。成熟して機能的な肝細胞の代替源の開発は、不可欠である。

多能性幹細胞から分化した肝細胞が、有望な源として出現した。多能性幹細胞は２つの主要な特性を有し、多能性幹細胞は、身体を構成するすべてのタイプの細胞に分化してもよく（多能性）、かつ、その場限りの条件において培地内で無限に増殖することができる（自己再生）。これらの細胞は、成熟して機能的な分化細胞の潜在的に無尽蔵の源を代表する（例えば、非特許文献１参照。）。

R.E. Schwartz, et al. Pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells. Biotechnology Advances 32(2014):504-513.

しかしながら、前述のアプローチは、まだ十分に満足なものではない。ＨＥＰ−ＬＣ（肝細胞に似た細胞（ＨｅｐａｔｏｃｙｔｅｓＬｉｋｅＣｅｌｌｓ））は、成熟が完全でないことを示す原始的な分化パターン（ＡＦＰ、ＳＯＸ１７）をまだ表している。これらの細胞の非成熟さを説明するために、異なる仮説を立てることができる：（ｉ）これらの細胞と他のコンポーネント肝細胞との間の相互作用の不在；（ii）使用されたシステム内の血行動態ストレスの欠如；(iii）臓器相互作用の欠如；（iv）細胞培地内の自己分泌及びパラ分泌要素の弱い濃度。

本発明は、多能性幹細胞を分化させる方法を提供することを目的とする。

したがって、本開示は、多能性幹細胞を分化させる方法であって：播種培地を備える容器に多能性幹細胞を播種するステップと；前記容器中の多能性幹細胞を分化させるステップと；前記多能性幹細胞が前駆段階に到達すると、前記多能性幹細胞を前記容器からバイオリアクターのチャンバ内へ移送するステップと；前記チャンバにおいて前記多能性幹細胞を成熟させるステップとを含み、前記チャンバの床は凹部又は凸部を含み、前記培地の流体が前記チャンバ内を流れ、酸素が前記チャンバへ供給される、方法を提供する。

他の方法においては、前記バイオリアクターは、灌流ループ中に載置され、該灌流ループ中でポンプに接続され、前記灌流ループは培地で満たされる。

更に他の方法においては、前記チャンバの底は、マイクロチャンバ及びマイクロチャンネルの配列を含んでいる。

更に他の方法においては、前記多能性幹細胞はヒト人工多能性幹細胞である。

更に他の方法においては、前記ヒト人工多能性幹細胞はＨＥＰ−ＬＣに分化させられる。

更に他の方法においては、前記前駆段階は、胚体内胚葉が形成される段階、特定の肝パターンが形成される段階、又は、未熟肝芽細胞が形成される段階である。

更に他の方法においては、前記ヒト人工多能性幹細胞は、未熟肝様細胞の全亜類型が一緒に接着した形態で、前記容器からバイオリアクターのチャンバ内へ移送される。

更に他の方法においては、前記ヒト人工多能性幹細胞は、未熟肝様細胞の全亜類型が一緒に接着した形態で、前記バイオリアクターのチャンバ内で成熟させられる。

本開示によれば、多能性幹細胞を、高い細胞密度で、高い成長率で、安定的に分化させることができる。

一般的な概念を示す模式図である。一般的な結果を示す図である。ｉＰＳ分化プロトコルを示す図である。バイオリアクターのデザインの模式図である。バイオリアクター内での組織形態を示す顕微鏡写真である。バイオリアクター染色を示す顕微鏡写真である。バイオリアクター内の細胞の３Ｄ再構築の画像である。バイオリアクター染色を示す他の顕微鏡写真である。機能分析の結果を示すグラフである。ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ１Ａ２分析の結果を示すグラフである。

実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。

図１は一般的な概念を示す模式図である。図２は一般的な結果を示す図である。図３はｉＰＳ分化プロトコルを示す図である。

本実施の形態においては、生化学的かつ機械的な刺激を使用する多能性幹細胞の分化の新しいプロセスを提案する。本実施の形態によって分化させることができる多能性幹細胞は、好ましくはプライム細胞である。プライム型幹細胞のカテゴリー内には、ヒトｉＰＳ細胞、ヒトＥＳ細胞及びヒトｍＥＳ細胞のような、多能性幹細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞及び胚性幹（ＥＳ）細胞、間葉系幹細胞の全てが含まれる。牛、猿、げっ歯動物の幹細胞のような他の動物源も適している。本発明者は、本実施の形態において、実験での便宜のために、ヒトｉＰＳ細胞だけを使用した。さらに、ここで使用されたようなヒト胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞のクローン培養（Rodin et al, Nation Communication 、２０１４年６月）のような人間の胚を破壊しない一般的な方法によって得られるが、単一の割球からのヒト幹細胞株の誘導（Klimanskaya et al., Nature、２００６年）やその他の方法は、人間の胚を破壊せずにヒト胚性幹細胞を得ることができる方法として当業者にとって周知である。好ましくは、本発明の方法では、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を使用する。より好ましくは、ｉＰＳＣはヒトｉＰＳＣである。

重要ポイントの１つは、容器として使用されるペトリ皿内でのｉＰＳの一般的な分化を、最終組織ターゲットｉＰＳ細胞の未熟段階で停止させることである。したがって、ｉＰＳ集団は、まだいくつかの亜類型の集団を備える不均一な状態である。それから、ｉＰＳ細胞はバイオリアクターへ移送され、分化プロトコルが継続される。ペトリ皿培養と比較すると、バイオリアクター環境は、分化プロトコル中のｉＰＳに更なる刺激を与える。生化学的刺激は、ｉＰＳ分化を選択された組織ターゲットに向かわせるように寄与する。同時に、バイオリアクター内の機械的刺激は、細胞集団の一部を第２の系統に向かわせるように寄与する。本発明者によって行われた実験によれば、高酸素化、成長因子勾配及びバイオリアクターに沿ったそれらの局所濃度（パラ分泌又は自己分泌、内分泌）は、選択的な分化を向上させ、それ故に全面的な組織成熟を向上させた（図１に示されるように）ことが観察された。図１は、（ｉ）せん断応力、（ii）酸素勾配、(iii）ｉＰＳ亜集団、（iv）成長因子、及び、（ｖ）３Ｄ培養組織のコントロールのような生体内生理を模倣するマイクロスケールのバイオリアクター（バイオチップ）内の肝臓成熟に基づいた実験の一般的な概念戦略を説明する。このプロトコルを使用する肝臓分化の場合、本発明者は、サブ分化系列のような肝内の、内皮の、及び、上皮の胆汁を識別した。バイオリアクター及び提案したプロトコルは、（図２に示されるように）生体内の模倣する微細環境として作用する。図２は、一般的な結果の例を図示する：（Ａ）肝類洞、（Ｂ）ヒトｉＰＳ肝臓共培養の模倣、（Ｃ）赤いアルブミン及び緑のスタビリン（ｓｔａｂｉｌｉｎ）陽性の細胞、（Ｄ）アルブミン生成、並びに、（Ｅ）バイオチップ（バイオリアクター）及びペトリ（ペトリ皿又は容器）内のＣＹＰ４５０活性。

多能性幹細胞は２つの主要な特性を有し、１つは、身体を構成するすべてのタイプの細胞に分化してもよいということ（多能性）であり、他の１つは、その場限りの条件において培地内で無限に増殖することができるということ（自己再生）である。これらの細胞は、このように、成熟して機能的な分化細胞の潜在的に無尽蔵の源であることを意味する。現在では、ヒト多能性細胞を肝細胞、ＨＥＰ−ＬＣ（肝細胞に似た細胞）に分化させ得る、と考えることができる。ＨＥＰ−ＬＣは、主要な肝臓表現型のマーカー、異物代謝を含む模擬の肝代謝を示す。これらの有望な結果にもかかわらず、前述の問題はまだ残っている。したがって、本発明者は、これらの問題を解決するために更なるアプローチを統合した。本実施の形態において提案されたプロトコルは、ペトリ皿内の予備分化、並びに、（図３に示されるような）バイオリアクター及び刺激のシーケンスを使用する成熟化に基づく。図３は、ペトリ皿分化のステップ３の後の、バイオリアクター（バイオチップ）内への未熟ｉＰＳの播種に基づく分化のプロトコルを示す。

本実施の形態によるヒト人工多能性幹細胞を分化させる方法は、肝細胞又はＨＥＰ−ＬＣに分化させることに限定されるべきものでなく、脾臓、膵臓、心臓及び腸のような他の臓器用の細胞に分化させることにも利用可能であろうことに、留意すべきである。しかし、便宜上、本実施の形態における説明の対象は、ヒト人工多能性幹細胞を肝細胞又はＨＥＰ−ＬＣに分化させることである。

次に、本実施の形態において使用されるバイオリアクター、すなわち、バイオチップの製作について説明する。

図４はバイオリアクターのデザインの模式図である。

バイオリアクター（バイオチップ）は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）中の複製を成型することによって製作された。型は、ＳＵ−８フォトレジストを使用して、二重のフォトリソグラフィ工程によって作られた。バイオリアクターは、長さ５ｃｍ及び幅１ｃｍの細胞培養チャンバを含んでいる。高さは３００μｍである。培養チャンバの底には、多層の細胞培養及びマイクロ流体の細胞培養を増進させるために、マイクロチャンバ及びマイクロチャンネルの配列が形成されている。図１の中間区画における左端の図、及び、図３の下の区画における左から２番目の図に示されるように、マイクロチャンバ及びマイクロチャンネルの床面の断面は、でこぼこ、すなわち、成長因子の流れの方向に関して凹凸が交互に接続された形状になっている。したがって、ｉＰＳ細胞を三次元（３Ｄ）において培養することができる。さらに、ｉＰＳ細胞の集団が速やかに増えるように、ＰＤＭＳの天井及びフロアパネルの両方を透過させることによって酸素を供給することができる。このマイクロアレイのデザインのこの基礎ユニットは、本発明者の１人であるエリック・ルクレールの以前の研究に基づく（非特許文献２参照。）。エリック・ルクレールは、（図４に示されるような）バイオリアクターのデザインを提案した。型は、ＲＴＢプログラムによるＬＡＡＳ設備によって製作された。ＰＤＭＳバイオリアクターは、ＬＩＭＭＳ／酒井教授の研究所で製作された。図４はバイオリアクターのデザインを示す：（Ａ）バイオリアクターを作成する微細構造層。最上層は培地（培養液）を散布するために使用される。底層は、マイクロスケールのマイクロチャンバ及びマイクロチャンネル内で細胞を培養するために使用される。最大の深さは３００μｍである。（Ｂ）バイオリアクター情報に沿って複製された周期的な微細構造を含む底層の詳細。

Audrey Legendre, et al. Investigation of the hepatotoxicity of flutamide. Toxicology in Vitro 28(2014):1075-1087.

次に、本実施の形態において使用される予備のｉＰＳ細胞分化プロトコルについて説明する。

本実施の形態において、ｉＰＳ分化のプロトコルは、ダンカン（Ｄｕｎｃａｎ）のグループの研究に基づく（非特許文献３参照。）。本実施の形態における実験に使用されたｉＰＳ細胞は、東京大学から入手された。ダンカンのグループのプロトコルは、宮島教授のグループ（木戸教授によって行われた研究）によって２４のくぼみプレート用に修正された。本発明者は、このプロトコルを６つのくぼみプレートに使用した。６つのくぼみペトリ皿を、１時間、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｒ））で被覆した。培養液で洗浄した後、ｉＰＳ細胞をペトリ皿内に播種した。播種培地は、反アポトーシス性薬品が補足されたｍＴｅＳＲ（Ｒ）だった。播種培地内で２４時間経過後、増殖ｍＴｅＳＲ（Ｒ）培地が使用された。ｉＰＳ細胞がコンフルエンスの９０％に達したとき、分化プロセスがスタートした。その目的のため、ｉＰＳ細胞は、胚体内胚葉を形成するために、Ｂ２７サプリメント及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡが補足されたＲＰＭＩ培地内に５日間曝された（ステップ１：図３の上端区画内の左端矢印を参照。）。それから、ｉＰＳ細胞は、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４に５日間曝されて、ＲＰＭＩ＋Ｂ２７培地内で特定の肝パターンを形成した（ステップ２：図３の上端区画内の左から２番目の矢印を参照。）。ステップ２の終わりで、細胞は、ＲＰＭＩ＋Ｂ２７培地内で２０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦに曝されて肝芽細胞前駆体に到達する（ステップ３：図３の上端区画内の左から３番目の矢印を参照。）。増殖中、培地は毎日取り替えられた。ステップ１、２及び３では、培地は２４時間及び７２時間の培養後に取り替えられた。増殖ステップ及びステップ１は、Ｏ₂２０％及びＣＯ₂５％のインキュベータ内で行われたのに対し、ステップ２及び３はＯ₂５％の下で行われた。

Karim Si-Tayeb, et al. Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-like Cells from Induced Pluripotent Stem Cells. Hepatology, 2010 January;51(1):297-305.

次に、本実施の形態において使用されたバイオリアクター内でのｉＰＳ培養について説明する。

バイオリアクターを利用の前にオートクレーブによって殺菌した。その内表面を、１時間、マトリゲル（Ｒ）の溶液で被覆した。培地で洗浄した後、ｉＰＳ細胞をバイオリアクター内に載置した（ステップ４：図３の下端区画内の図をすべて参照。）。バイオリアクター内でｉＰＳの肝臓の成熟を行うために、分化のステップ３の終わりで、ｉＰＳ細胞をペトリ皿から分離した。バイオリアクター内の播種密度を、バイオリアクター内での少ない細胞数及びその後の脱分化を回避するために、ペトリ皿内の２倍にした。細胞接着を、酸素２０％のインキュベータ内でかつステップ３の培地内で（ＨＧＦを使用して）行ったが、そこに抗アポトーシス性の基板を加えた。一旦、ｉＰＳ細胞が接着すると、バイオリアクターを灌流ループ中に載置した。灌流ループは泡トラップであって、そこでは、バイオリアクターとポンプとを直列的に接続した。ループ管はＰＴＦＥで作られた。ループを３ｍＬのステップ４の培地で満たした。ステップ４の培地は、プロバイダーの成長因子が補足されたＬｏｎｚａ培地であり、２０ｎｇ／ｍＬのＯＳＭが更に補足されたものであった。流量は、ダイナミックな培養を行うために、１０〜２５μＬ／ｍｉｎ（好ましくは、２０μＬ／ｍｉｎ）で始められた。１．５ｍＬの培地が灌流中に毎日取り替えられた。実験を、ＣＯ₂５％及びＯ₂２０％のインキュベータ内で１週間行った。

未熟な肝細胞に似た細胞をペトリ皿内で成熟させる従来の方法によると、それらを亜類型のそれぞれのグループに分離し、各グループの細胞を成熟段階にまで別々に成熟させ、成熟した肝細胞に似た細胞を得るために成熟段階の細胞のグループを集めることは、普通のことであった。これに対し、本実施の形態によれば、バイオリアクター内において、未熟肝様細胞の複数の亜類型を、未熟肝様細胞の全亜類型が一緒に接着した形態で、成熟した肝様細胞にまで成熟させることができた。肝様細胞は、肝細胞に似た細胞、内皮に似た細胞、胆汁に似た細胞等を含む。これは、細胞がバイオリアクターのマイクロチャンバ及びマイクロチャンネル内で三次元で培養され得るので、細胞の密度が局所的に高くて単位当たりの表面積が大きいということに起因するかもしれないし、また、培地が流れの形態でスムーズに内部に提供されるとともに酸素がＰＤＭＳのパネルを通して十分に供給されるので、細胞の集団が急速に成長するということに起因するかもしれない。バイオリアクターチャンバ内の高い細胞密度（数マイクロリットル中に数百万の細胞）は、自己分泌及びパラ分泌因子を含む、成長因子を局所的に集中させることに寄与する。不均一なマイクロスケール環境（マイクロチャンネル及びマイクロチャンバ）は、細胞が適応し得る（内皮細胞壁に沿った延長や局部せん断応力による再編成のような）種々の局所的な微小環境を提供する。

次に、本実施の形態における実験の結果を説明する。本実施の形態において使用されるプロトコルが、従来のペトリ皿方法と比較すると、肝細胞の成熟を増進させることに寄与するとともに、より機能的な肝組織を作ることに寄与することを示す。最初に、組織の不均一性を説明する。

図５はバイオリアクター内での組織形態を示す顕微鏡写真である。図６はバイオリアクター染色を示す顕微鏡写真である。図７はバイオリアクター内の細胞の３Ｄ再構築の画像である。図８はバイオリアクター染色を示す他の顕微鏡写真である。

灌流の開始から９６時間が過ぎたとき、本発明者は、バイオリアクターのマイクロチャンバ及びマイクロチャンネルの中心部内において立方形肝細胞に似た形状の表現型を明瞭に観察することができた。マイクロチャンネルの側面に、長く延びた細胞が観察された。９６時間の培養後に、モルフォ・タイプ線維芽細網細胞に囲まれた肝細胞に似た細胞が、バイオリアクターのマイクロチャンネル内の全体に、大きく観察された。７日間の灌流後に、バイオリアクター内で創造された組織は、高密度の３Ｄのような組織を形成した（図５参照。）。図５はバイオリアクター内の組織形態を示し、（Ａ）及び（Ｂ）は接着後のものを示し、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）は９６時間の培養後のものを示し、（Ｇ）は１４４時間の培養後のものを示している。

組織の免疫染色は、肝細胞に似た細胞がアルブミン免疫染色に対して陽性であることを示した（図６参照。）。図６はバイオリアクター染色を示し、（Ａ）、（Ｅ）及び（Ｉ）は細胞核のものを図示し、（Ｂ）及び（Ｆ）はスタビリン陽性の細胞のものを示し、（Ｃ）及び（Ｇ）はアルブミン陽性の細胞のものを示し、（Ｄ）及び（Ｈ）は細胞核、スタビリン及びアルブミンの合体画像を示し、（Ｊ）はファロイジン陽性の細胞のものを示し、（Ｋ）はアルファ−フェトプロテイン陽性の細胞のものを示し、（Ｌ）はファロイジン及びアルファ−フェトプロテインの合体画像を示している。スタビリン陽性の細胞は、それらのエリアにおいて、アルブミン陽性の細胞を囲んで包埋するように見えた。さらに、微細構造及び組織の上部に位置する細胞は、アルブミン陽性ではなくスタビリン陽性であった（図６及び７参照。）。図７は、バイオリアクター内における赤いアルブミン及び緑のスタビリン陽性の細胞の共焦点像からの３Ｄ再構築を示している。

コリルリシルフルオレスセイン（ＣＬＦ）が、胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ）によって、毛細胆管内に分泌された。ＣＬＦ染色は一般にバイオリアクター培地内で多数の陽性細胞を示すが、ＣＬＦ蓄積を備えた濃厚な胆汁のようなダクトネットワークが、微細構造の壁を塞ぐ細胞凝集塊内で観察された（図８参照。）。図８は、ＭＤＲ１、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＬＦ及びＢＳＥＰ陽性の細胞を示すバイオリアクター内での染色を示している。そこでは、ＤＡＰＩは細胞核を示し、ＡＦＰは弱く表現される。ＣＬＦネットワークに似た蓄積は、ペトリ皿内でわずかに観察された。さらに、ＢＳＥＰの免疫染色は、バイオリアクター組織が、主にマイクロチャンネル側で、この輸送体に対して陽性であることを明らかにした。ＢＳＥＰ及びＣＬＦ蓄積の重ね合わせは、ＢＳＥＰ及びＣＬＦが広く共存していることを確認した。

いくつかのバイオリアクター及び実験からの１セットの画像を使用し、画像処理に基づいて、本発明者は、細胞集団全体に対するアルブミン陽性の細胞の比率を確立した。バイオリアクター内では、６０±８％までのアルブミン陽性の細胞が発見されたのに対し、ペトリ皿内では、２９±１％だけのアルブミン陽性の細胞が発見された。さらに、ＦＡＣＳ実験に基づいて、本発明者は、バイオリアクター内培養では、３６±６％の細胞がアルブミン陽性であるのに対し、ペトリ皿内培養ではより大きな分散が観察される（２３±２３％）ことを証明した。

次に、組織機能性を説明する。

図９は機能分析の結果を示すグラフである。図１０はＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ１Ａ２分析の結果を示すグラフである。

グルコース消費及び乳酸塩生成のレベルを評価して、培養中の呼吸及び解糖系状態についての情報を得た（図９参照。）。図９はバイオリアクター及びペトリ皿内の機能的基礎分析を示している。（Ａ）は乳酸塩グルコース比率を示し、（Ｂ）はアルブミン生成を示し、（Ｃ）はアルファ−フェトプロテインを示し、（Ｄ）はアルブミン／アルファ−フェトプロテイン比率を示している。細胞接着及び２４時間の灌流後、バイオリアクター内で、本発明者は、嫌気性呼吸を示す、高い乳酸塩／グルコース比率を伴う激しいグルクース消費を発見した。４８時間の灌流後、乳酸塩／グルコース比率は０．８に近い１未満の値を維持したが、これは、組織全体における健全な好気性呼吸を示している。嫌気性プロフィールは、アルブミン生成が高い場合、ペトリ皿培養において、１．６と１．８との間の範囲の値の比率を有することが観察された。

バイオリアクター及びペトリ皿内での成熟のレベルに関して細胞の機能性を評価するために、本発明者は、アルブミン及びアルファ−フェトプロテインの生成を測定した。測定値を各培養における肝細胞の数によって正規化すると、バイオリアクター生成が、ペトリ皿よりバイオリアクター内でのバイオリアクター生成が高いことが分かった。同時に、ＡＦＰ／ＡＬＢ比の動力学はバイオリアクターのための時間とともに減少し、バイオリアクター内での肝細胞の連続的な成熟を示した（図９参照。）。

バイオリアクター内のｉＰＳ肝細胞に似た細胞の成熟のレベル及び組織の機能的な性能を確認するために、本発明者は、ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ１Ａ２分析を行った（図１０参照。）。図１０（Ａ）は、専用基板からのルシフェリンの生成によって測定されたＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ１Ａ２の活性を示し、図１０（Ｂ）は、バイオリアクター内のリファンピシンによる誘導に続くＣＹＰ３Ａ４による典型的なルシフェリン生成を示している。その目的のために、本発明者は、バイオリアクター及びペトリ皿内の特定の基板からのルシフェリン生成を調査した。すべてのペトリ皿培養において、本発明者はルシフェリン生成を検出しなかった。反対に、ルシフェリンはバイオリアクター内で培養されたｉＰＳ細胞から生成された。さらに、２５μｍのリファンピシンの処理は細胞を誘発するために寄与した。実際、未処理の細胞と比較すると、処理された細胞は、ルシフェリンの生成を２倍にした。ペトリ皿培養は誘導可能ではなかった。

次に、本実施の形態が提供する効果を説明する。

本実施の形態の特徴の１つは、ｉＰＳ細胞を、マイクロスケールのバイオ人工臓器として、バイオリアクター及びバイオリアクター技術と結び付けて分化することができることである。多くのグループが、肝細胞のメンテナンス及び開発により適した環境を供給するために、組織工学（ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）プロセスを開発している。この環境は、生体内で見つかった特性をできる限り精密に再生しなければならない。そのような生体外システムの１つを、マイクロスケールの生体内模擬装置をデザインするマイクロ技術分野での最近の進化を用いて、作製することができる。これらのシステムのマイクロトポグラフィーによってもたらされる細胞再編にダイナミックなマイクロ流体培養条件を加えたものが、生体外での３Ｄ多細胞を複製する主要な特徴であるように見える。可能性のある方法の例として、本発明者は、バイオリアクター内での肝臓ｉＰＳ分化の予備的結果を示した。マルチ細胞分化及び初期の肝細胞成熟が、バイオリアクター内で達成された。さらに、機能的なＣＹＰ４５０活性と結び付けられたバイオリアクター内の肝臓に似たスパンが、ペトリ皿と比較したときに、観察された。バイオリアクターの見地は重要であるが、本実施の形態は、不均一で未熟なｉＰＳ細胞の亜集団を得るために従来のペトリ皿前分化を使用する、ｉＰＳの前処理を含んでいる。

本実施の形態は、内分泌成長因子による化学的刺激、細胞培養エリアに沿った成長因子の勾配、せん断応力による機械的刺激、細胞のサポートとして使用された透過性材料による酸素調整、及び、表面上での高い細胞密度と細胞培養エリアの大容量とを可能にする微細構造のサポートによる３Ｄ細胞再編成を含む多重の刺激を使用するｉＰＳ分化プロトコルのような複数の新規な特徴を含んでいる。これらの特徴はすべて、マイクロ流体バイオリアクターを使用するプロトコルに含まれ得るものである。

既存の技術及びプロトコルは、十分に定義されたシーケンスにおいて培地中に特定の成長因子を加えることによって、又は、遺伝子組み替えによって、ｉＰＳ分化を促進している。本実施の形態のアプローチは、追加的なタイプの刺激を提供して、幹細胞分化に含まれる他の細胞経路を誘発する。

従来のプロトコルは肝臓の肝細胞を成熟に導かなかった。同様に、膵臓のような他の組織に適用された場合、生成された細胞は、ヒト成熟組織と比較して弱く機能的だった。

次に、本実施の形態の利用について説明する。

肝臓のｉＰＳパターンの原始性の現状は、肝臓のｉＰＳの治療ソリューションを臨床試験に入れることが１つの欠点である。薬物検査用の機能的肝細胞の限定された有用性も、製薬会社に肝細胞だけに毎年１０億ドルを費やさせるための主な障害として、報告される。ヒト多能性幹細胞からの機能的な肝細胞の供給を作り出す将来の能力が、この状況を変更することができる。現在、本実施の形態において使用されるバイオリアクターの規模が小さすぎるので、肝臓移植用の機能細胞の大規模生成について考えることができない。主な応用は、現在のところ、薬物スクリーニングアッセイであり、それにより、薬物アッセイにおけるヒト初代細胞の部分的な代用である。

生体内の生理を模擬するバイオリアクター内で培養する前の部分的に分化したｉＰＳ細胞を使用するプロトコルの概念は、膵臓、腸、腎臓のような多数の他の標的臓器に応用することができる。他の応用は、より広く、再生医療及びオーダーメード医療に関係し得る。実際、患者のｉＰＳ細胞の収集に基づいて、特定の細胞療法又は患者に関連する疾病が、より適切に調査されるかもしれない。最終的に、大規模生成までプロトコルを拡大することができれば、組織及び臓器移植のための十分な細胞を生成することは可能であろう。

本明細書での開示は、上記実施の形態に限定されるものでなく、様々に修正及び変更されてもよい。したがって、修正及び変更はこの明細書に添付された特許請求の範囲の保護の範囲から除外されない。

本発明は、多能性幹細胞を分化させる方法に適用可能である。

Claims

多能性幹細胞を分化させる方法であって：
播種培地を備える容器に多能性幹細胞を播種するステップと；
前記容器中の前記多能性幹細胞を分化させるステップと；
前記多能性幹細胞が前駆段階に到達すると、前記多能性幹細胞を前記容器からバイオリアクターのチャンバ内へ移送するステップと；
前記チャンバにおいて前記多能性幹細胞を成熟させるステップとを含み、
前記チャンバの床は凹部又は凸部を含み、前記培地の流体が前記チャンバ内を流れ、酸素が前記チャンバへ供給される、方法。
前記バイオリアクターは、灌流ループ中に載置され、該灌流ループ中でポンプに接続され、前記灌流ループは培地で満たされる、請求項１に記載の方法。
前記チャンバの底は、マイクロチャンバ及びマイクロチャンネルの配列を含んでいる、請求項２に記載の方法。
前記多能性幹細胞はヒト人工多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
前記ヒト人工多能性幹細胞はＨＥＰ−ＬＣに分化させられる、請求項４に記載の方法。
前記前駆段階は、胚体内胚葉が形成される段階、特定の肝パターンが形成される段階、又は、未熟肝芽細胞が形成される段階である、請求項５に記載の方法。
前記ヒト人工多能性幹細胞は、未熟肝様細胞の全亜類型が一緒に接着した形態で、前記容器からバイオリアクターのチャンバ内へ移送される、請求項４に記載の方法。
前記ヒト人工多能性幹細胞は、未熟肝様細胞の全亜類型が一緒に接着した形態で、前記バイオリアクターのチャンバ内で成熟させられる、請求項７に記載の方法。