JP6025715B2 - 多能性幹細胞の肝細胞への分化を向上する三次元スキャホールド - Google Patents
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Description
哺乳類細胞培養の方法は、長年にわたって改良され標準化されてきており、細胞の生育、増殖および分化を可能にするのに必要な条件が確立されている。通常、細胞はポリスチレンなどの無菌のプラスチック表面上で、多く場合、細胞が正常に生育すると思われる生体内環境を、より厳密に再現するように作られたマトリックスコーティングとともに培養することができる。胚性幹細胞の場合、マウス胎仔線維芽細胞などのフィーダー細胞の層が、細胞の増殖を助長、補助する、より良好な基質を提供するのに必要とされることが多い。典型的には、哺乳類細胞は、通常ウシ胎児血清などの添加物を含有する支持培地中で培養されることになる。その培地は、さまざまなホルモンおよび成長因子を細胞に与えることにくわえて、この場合もやはり細胞生育のための理想的な微環境を再現するのに役立つ多くの細胞マトリックス成分を含有する。
多能性幹細胞を分化させるにあたって直面する主な課題の1つは、部分的に分化した、未成熟な前駆細胞(precursor cells)、またはさまざまな細胞型の高度に不均一な混合物よりむしろ、成熟した、完全に機能的な細胞型を常に一貫して作り出すように分化を制御することである。多能性幹細胞を分化させる最も単純な方法は、2Dプラスチック基質上であるが、残念ながらこの方法は、成熟した細胞型の特徴的な表現型を欠いている分化細胞を作り出すことが多い。これは、一部には、当然三次元で起こるという点で2D培養と異なるプロセスである正常な胚発生時に幹細胞が経る状態を再現できないからである。研究者がこのことに対処するよう試みてきた方法の1つは、胚発生の間に細胞が経る状態の幾つかをより忠実に再現し、細胞がより自然な形で分化できることを意図する新規の3D培養系を開発することである。特に、そのような3D系により、細胞がより大きい度合いで相互に作用することができ、2D細胞培養の使用で見られるいずれと比べても、機能する臓器により類似する複雑な多細胞の凝集体を開発することができる。
肝不全および末期の肝疾患は、全世界における膨大な数の死亡の原因であり、医療制度に大きな負担となっている。肝移植は、依然として最も有効な治療である。しかし、この治療の有効性は限定的で、感染症または拒絶反応などの多くの合併症につながる。また、肝移植は、入手可能ドナー臓器の不足に悩まされており、治療を受けた患者は、非常に多くの場合、生涯続く免疫抑制治療に委ねられることになる。臓器の必要性を減らすことによって、細胞に基づいた治療は、社会と、これらの重い疾患を患う個人の両方にとって非常に重要であると思われる。
本明細書において使用する場合、「ヒト多能性幹細胞」(hPS)は、任意の供給源に由来しうる、適切な条件下で3つの胚層(内胚葉、中胚葉、および外胚葉)のすべての誘導体である種々の細胞型のヒト後代産物を生成できる細胞を指す。hPS細胞は、8〜12週齢のSCIDマウスで奇形腫を形成する能力、および/または組織培養で全3胚層の同定可能な細胞を形成する能力を有しうる。ヒト多能性幹細胞には、ヒト胚性幹(hES)細胞(例えば、Thomson, J.A. et al (1998), Heins, N. et.al. (2004)を参照されたい)および人工多能性幹細胞(例えば、Yu, J. et al, (2007); Takahashi,K. et al (2007)を参照されたい)を含むさまざまな型の胚細胞が含まれる。本明細書において記載されるさまざまな方法および他の実施形態は、多岐にわたる供給源からのhPS細胞を必要とし利用しうる。例えば、使用に好適なhPS細胞は、発生中の胚から得られうる。くわえてまたはあるいは、好適なhPS細胞は、確立された細胞系および/またはヒト人工多能性幹細胞(hiPS)細胞から得られうる。
BIO (2’Z,3’E)‐6‐ブロモインジルビン‐3’‐オキシム(GSK3阻害剤IX);
BIO‐アセトキシム (2’Z,3’E)‐6‐ブロモインジルビン‐3’‐アセトキシム(GSK3阻害剤X);
(5‐メチル‐[H‐ピラゾール‐3‐イル}(2‐フェニルキナゾリン‐4‐イル)アミン(GSK3阻害剤XIII);
ピリドカルバゾール‐シクロペナジエニル(cyclopenadienyl)ルテニウム複合体(GSK3阻害剤XV);
TDZD‐8 4‐ベンジル‐2‐メチル‐1,2,4‐チアジアゾリジン‐3,5‐ジオン(GSK3ベータ阻害剤I);
2‐チオ(3‐ヨードベンジル)‐5‐(I‐ピリジル)‐[1,3,4]‐オキサジアゾール(GSK3ベータ阻害剤II);
OTDZT 2,4‐ジベンジル‐5‐オキソチアジアゾリジン‐3‐チオン(GSK3ベータ阻害剤III);
アルファ‐4‐ジブロモアセトフェノン(GSK3ベータ阻害剤VII);
AR‐AO14418 N‐(4‐メトキシベンジル)‐N’‐(5‐ニトロ‐1,3‐チアゾール‐2‐イル)尿素(GSK‐3ベータ阻害剤VIII);
3‐(1‐(3‐ヒドロキシプロピル}1H‐ピロロ[2,3‐b]ピリジン‐3‐イル]‐4‐ピラジン‐2‐イル‐ピロール‐2,5‐ジオン(GSK3ベータ阻害剤XI);
TWSI19 ピロロピリミジン化合物(GSK3ベータ阻害剤XII);
L803 H‐KEAPPAPPQSpP‐NH2またはそのミリストイル化された形態(GSK3ベータ阻害剤XIII);および
2‐クロロ4‐(4,5‐ジブロモ‐チオフェン‐2‐イル}エタノン(GSK3ベータ阻害剤VI);およびアミノピリミジンCHIR99021。くわえて、多数のwinglessタンパク質またはWntタンパク質が、GSK阻害剤、特に本発明に記載のGSK阻害剤と同様に機能する。したがって、それらはGSK阻害剤という用語に包含される。本発明において使用されうる例示的なWntタンパク質としては、Wntタンパク質のなかでも特に、Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt10、Wnt14、Wntl4b、Wnt15、およびWnt16の1つ以上が挙げられる。Wnt3aの使用が好ましい。
i)hPSまたは肝細胞前駆細胞(precursor cells)を二次元の表面に播種して分化を開始する工程、
ii)さらなる分化および成熟化のために、工程i)の初期分化した細胞を三次元の(3D)スキャホールドに移す工程を含む方法に関する。
ヒト多能性幹細胞由来の肝細胞の出発材料
hPS細胞(上記で定義された)すべてを、本発明の出発材料として使用することができる。下の例では、肝細胞様細胞を、mEF細胞上で培養した未分化ヒト胚性幹細胞(hESC)からインビトロで生成した(Heins, N. et al. 2004, Stem Cells)。この実験に使用する細胞系は、限定されないがhES細胞系SA002、SA121、SA181、SA461(Cellartis AB、Goteborg、スウェーデン、http://www.cellartis.com)であり、Heins,Nらによる2004年の記載のように増殖させることができる。これらの細胞系は、NIH幹細胞レジストリー(the NIH stem cell registry)、英国幹細胞バンク(the UK Stem Cell bank)および欧州hESCレジストリー(the European hESC registry)に載っており、依頼に応じて入手可能である。hESCから得られるhPSと並んで、hiPS(人工多能性幹細胞)から得られるhPSを本発明の実施例のための肝細胞の誘導に使用している。この場合、「hiPS‐HEP」とは、アルブミン、CYP3A4、UGT2B7、OATP‐2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19およびCYP2D6などの成熟した肝臓のマーカーを発現している人工多能性幹細胞に由来する細胞型を意味することを意図する(「定義」も参照されたい)。ゼノフリーiPS細胞またはSA611(Cellartis AB、Goteborg、スウェーデン、http://www.cellartis.com)などのゼノフリー由来hES細胞系を使用することにより、随意に発明全体をゼノフリー状態下で使用してゼノフリー細胞生成物を作製することが可能になりうる。
3Dスキャホールドを使用したヒト多能性幹細胞からの肝細胞の誘導
以下に詳しく述べるように、肝細胞をプロトコールa〜eに従ってhES細胞およびヒトhiPS細胞の両方から生成した。分化の開始前に、培養物をPBSで2回洗浄した。異なる培地(表1)を、0日目からそれ以降、プロトコール概説に従って新たに調製して加えた。培地を、初期分化(ID)段階の間は毎日または1日おきに交換し、それ以降は1日おきまたは2日おきに交換した。各実験に対して1つ細胞系のみを使用したが、細胞の共培養が可能な3Dスキャホールド上に第一の細胞系を播種する場合、随意に第二(またはより多くの)細胞系を追加することもできた。
試験に使用したスキャホールドおよびマトリックスコーティング
Artelon(Artimplant);細孔径<150pm、48ウェルプレート用にフォーマット
Artelon(Artimplant)(Vastra Frolunda、スウェーデン)の厚意により提供(国際公開第0035507号、またBlumenthal, B. et al. (2010)を参照されたい。)
Alvatex;48ウェル用サイズ、Stefan Przyborski Relnnervate(Durham、英国)の厚意により提供(国際公開第07125288号、国際公開第10038013号を参照されたい。)
AlgiMatrix;Invritogen/ギブコ(Gibco)、カタログ番号12684、ロット番号731950、96ウェル(実験088+089)(国際公開第08112904号、またShapiro, L & Cohen, S. (1997)を参照されたい。)
UltraWeb;コーニング(Corning)、カタログ番号3873xx、ロット番号09207043、96ウェル(実験088+089)(国際公開第09032117号、国際公開第10060066号、またPiryaei, A. et al.(2010)を参照されたい。)
Aggrewell;Stem Cell Technologies、カタログ番号27865、およそ300マイクロウェル(国際公開第20081067711号を参照されたい)。
HAC/Porocell;(HacBiomed);(Cell Transplant. 1997 Sep−Oct;6(5):463−8 幹細胞用三次元培養系としての高度に多孔質のポリマーマトックス(Highly polymer matrices as a three−dimensional culture system for hepatocytes.) Kaufmann PM, Heimrath S, Kim BS, Mooney DJ.)
Artelon(Artimplant)およびAlvatexスキャホールドを、70%EtOHに浸し、EtOHを取り除き、スキャホールドをDPBSで2回洗浄した。
ゼラチン:製造用ゼラチン(gelatin from production)を、スキャホールドおよび/または2D培養皿にを加え、室温で少なくとも30分間インキュベーションし、次にそのゼラチンを使用直前に取り除いた。
hES細胞培養の継代および維持
培養細胞から培地を取り除き、培養物をDPBS−/−(37℃、0.5mL/cm2)で2回洗浄した。TrypLE Selectを加え(室温、0.1mL/cm2)、37℃にて(未分化細胞またはアクチビンA処理後の細胞については4〜5分間、前記細胞(progenitor)段階にある細胞については10〜45分間)インキュベーションした。次に、p1000で細胞を流して細胞を剥がした。VitroHESを加え(37℃、0.1mL/cm2)、細胞懸濁液を遠心分離チューブに移し、330×gで5分間室温にて遠心分離した。細胞ペレットを、培養培地で懸濁して細胞を数え、適切な播種懸濁液に希釈した。幾つかの実験(実験113、114、116、118、119、120)では、播種する日に10mMのRock阻害剤を培養培地に加えた。
3Dスキャホールドで培養したhESC由来肝細胞の遺伝子発現分析
図の説明に示したように、mEF層上でDEF培養系またはSA002培養から培養した細胞系SA002、SA121、SA181、SA46からhESC−HEPを生成した。
CYPアッセイ
16、18、20、21および25日目に、基質であるフェナセチン、ジクロフェナクおよびミダゾラムを、それぞれ最終濃度、26pM、9pMおよび3pMで、0.1%ペニシリン・ストレプトマイシン、2mM L‐グルタミンおよび25mM Hepesを補充したフェノールレッドを含まないWilliams培地E中でインキュベーションすることによって、hESC由来肝細胞培養をシトクロムP4501A、2Cおよび3A活性について分析した。ウェル表面1cm2当たり100μLの容積(例えば48ウェルでは75μL)の希釈した基質を加えた。基質とともに、hESC由来肝細胞培養を一晩インキュベーションした。16時間後、培地を回収し、それに続いて10000gで4℃にて20分間遠心分離した。シトクロムp450酵素CyplA2、1A1(フェナセチン)Cyp2C9、2C8(ジクロフェナク)およびCyp3A4、3A5(ミダゾラム)によって生物学的に変換された(biotransformed)代謝産物であるパラセタモール、4‐OH‐ジクロフェナクおよび1‐OHミダゾラムの存在について、液体クロマトグラフィー‐質量分析(LC‐MS)LCMSにより試料を分析した。
Reinnervateスキャホールドで培養した細胞におけるCyp2C9活性の向上およびCYP2C9活性の誘導の向上
実施例1および2、実験083の条件、次いで以下のスキームに従って、細胞系SA461(Cellartis AB)を培養して分化させた。
Alvatex(Relnnervate)スキャホールドでは、1cm2当たり100uLを播種するために、細胞を(260/7.5×0.1=34.6)3.46mLに懸濁した。
細胞を、1mM フェノバルビタール、10μM デキサメタゾンおよび5μM β‐ナフトフラボンで誘導した。
これらの溶液を得るために、100μLの64mM デキサメタゾン溶液を、540μLのDMSOに希釈し、10mM デキサメタゾン溶液を得た。
11.4mgのβ‐ナフトフラボンを8.446mLのDMSOに溶かし、5mM溶液を得た。
1M フェノバルビタールを、PBSで1:1で希釈した。
35mL M6(Dex含まず)に、35μLの10mM dex、35μLの5mM β‐ナフトフラボンおよび70μLの0.5M フェノバルビタール。
酵素活性をベースライン酵素活性と比較できるように、対照培地(非誘導培地)はDMSOを含有しなかった。
各ウェルに、誘導または対照培地のいずれか(2D培養では400μL/ウェル、Relnnevateスキャホールドでは2000μL/ウェル)を加え、プレートを24時間インキュベーションした。
誘導の24時間後、全ウェルをDPBS+/+で2回洗浄し、活性アッセイ培地を加えた:2D対照では200uL/ウェルおよびRelnnervateスキャホールドでは1000uL/ウェル。活性アッセイ培地:0.1%PEST、2mM L‐グルタミン、25mm HEPESならびに26uM フェナセチン、3uM ミダゾラムおよび9uM ジクロフェナク含有WEからなるフェノールレッドを含まない無タンパク質培地。
スキャホールドに播種したときに、細胞が胚体内胚葉または肝臓前駆体(precursors)に分化していることの検証
肝細胞への分化に使用したプロトコールを、「内胚葉誘導」工程後の胚体内胚葉細胞、プロトコールa)に従って培養した細胞の形成について分析した(図11)。分化プロトコール中の7日目に、細胞をRNA用に採取し、リアルタイムPCRで分析し、実験の開始(0日目)からの未分化細胞と比較した。分化プロトコールにより、胚体内胚葉マーカー(FOXA2、SOX17、HHEX、CXCR4、CER1)を発現する細胞が生成されることが示された。さらに、未分化細胞のマーカー(NanogおよびOCT4)が、未分化出発材料に比べて下方制御されていることが確かめられた。くわえて、胚体外内胚葉マーカー(Sox7およびCDX2)は内胚葉誘導の間に増加しないので、細胞がこれらの遺伝子を発現していることを確認した。同様の方法を採用して、スキャホールド「肝前駆体(precursors)」として播種された細胞が実際にこの表現型を保有することを検証した(図12)。
Claims (13)
- ヒト多能性幹(hPS)細胞を、肝細胞様細胞または成熟肝細胞に分化するインビトロの方法であって:
i)hPS細胞を胚体内胚葉(DE)細胞(definitive endoderm)へ二次元の表面で播種および分化する工程、
ii)工程i)の前記DE細胞を、三次元(3D)スキャホールドに移すとともに、該三次元(3D)スキャホールド上に播種された前記DE細胞を肝細胞様細胞または成熟肝細胞へさらに分化する工程を含み、
前記3Dスキャホールドが以下:
i)多孔性アルギン酸塩スポンジ
ii)生物分解性ポリ(ウレタン尿素)(PUUR)ポリマー
iii)エマルジョンテンプレート型ポリスチレン
iv)合成ナノ繊維性複合材
v)ポリ(L‐乳酸)(PLLA)から作られた多孔性スポンジ
の1つから選択されるインビトロの方法。 - 前記細胞が二次元と比べ、より高い密度で三次元に播種される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が二次元と比べ、3倍、5倍または10倍高い密度で三次元に播種される、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞が、細胞生存因子の存在下で播種される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞生存因子は、一つのROCK Rhoキナーゼの阻害剤である請求項4に記載の方法。
- 工程i)またはii)の少なくとも1つが、フィーダーフリー(feeder‐free)条件下で行われる、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 工程i)またはii)の少なくとも1つが、ゼノフリー(xeno‐free)条件下で行われる、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記hPS細胞が、ヒト胚性幹(hES)細胞である、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記hPS細胞が、人工多能性幹(iPS)細胞である、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記3Dスキャホールドがコーティングされていない、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記3Dスキャホールドが、1つ以上の細胞外マトリックス成分で予めコーティングされる、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記1つ以上の細胞外マトリックス成分が、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ポリリシン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸、ヒアルロナンヒドロゲル、絹フィブロイン、キトサンまたは前述のいずれかの複合材を含むリストから選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記DE細胞が、前記3Dスキャホールドで、肝星細胞、肝免疫(クッパー(Kuppfer))細胞、肝内皮細胞、胆管上皮細胞または線維芽細胞から選ばれる少なくとも1つの他の細胞型と共培養される、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
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