CN103097517A - 用于提高多能干细胞分化成肝细胞的3维支架 - Google Patents

用于提高多能干细胞分化成肝细胞的3维支架 Download PDF

Info

Publication number
CN103097517A
CN103097517A CN2011800372371A CN201180037237A CN103097517A CN 103097517 A CN103097517 A CN 103097517A CN 2011800372371 A CN2011800372371 A CN 2011800372371A CN 201180037237 A CN201180037237 A CN 201180037237A CN 103097517 A CN103097517 A CN 103097517A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
liver
support
hps
aforementioned
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2011800372371A
Other languages
English (en)
Inventor
杨内·延森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takara Bio Europe AB
Original Assignee
Cellartis AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cellartis AB filed Critical Cellartis AB
Publication of CN103097517A publication Critical patent/CN103097517A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0671—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及合成或动物来源的3维（3D）生物支架作为基体用于提高hPS（人类多能干细胞）的生长和分化的应用；这些支架适合与现有的细胞培养实验室塑料器皿一起使用。更具体地说，本发明涉及用hPS细胞接种单独的或具有各种生物基质涂层的这些支架，以提高所述hPS细胞分化成肝细胞或肝细胞样细胞类型。本发明还涉及将部分分化的肝细胞祖细胞接种到支架上，以进一步分化成更成熟的肝细胞细胞类型。

Description

用于提高多能干细胞分化成肝细胞的3维支架
技术领域
本发明涉及合成或动物来源的3维（3D）生物支架作为基体用于提高hPS（人类多能干细胞）的生长和分化的应用；这些支架适合与现有的细胞培养实验室塑料器皿一起使用。更具体地说，本发明涉及用hPS细胞接种单独的或具有各种生物基质涂层的这些支架，以提高所述hPS细胞分化成肝细胞或肝细胞样细胞类型。本发明还涉及将部分分化的肝细胞祖细胞接种到支架上，以进一步分化成更成熟的肝细胞类型。
发明背景
哺乳动物细胞培养
多年来，哺乳动物细胞培养方法已被改善和标准化，并且允许细胞生长、扩增和分化所需要的条件已被充分确定。细胞可以在无菌塑料表面例如聚苯乙烯上常规培养，所述塑料表面往往与基质涂层一起使用，所述基质涂层被设计成更接近地重现细胞会正常生长的体内环境。在胚胎干细胞的情况下，往往需要饲养细胞层例如小鼠胚胎成纤维细胞层来为营养和支持所述细胞的增殖提供更好的基体。典型地，哺乳动物细胞被培养在通常含有添加剂例如胎牛血清的支持性培养基中，所述培养基除了向细胞提供各种激素和生长因子之外，还含有同样有助于复现细胞生长的理想微环境的许多细胞基质组分。
当前，哺乳动物细胞培养具有各种各样的下游应用，包括它们在基础研究中的应用、它们在药物和毒理学分析中的应用和它们在产生正确折叠的重组哺乳动物蛋白中的应用。最近，哺乳动物细胞培养已被进一步开发用于再生医学领域，由此获取组织例如皮肤真皮层并将其增殖一定的时间段，以便生成更大量的组织以供临床外科用，例如修复外伤性损伤之后的伤口或修复患病的内脏器官。可是，从原代来源获得的细胞在它们进一步增殖的能力方面往往非常有限，并需要复杂的生长培养基配方和生长条件来进行成功培养。由于免疫排斥的问题，它们在再生医学中的应用也有限。
最近，在旨在越过这些障碍的胚胎干细胞研究领域中有许多进展。这种多能干细胞不仅能够几乎无限地增殖，它们还具有分化成构成完全发育的生物体的每种细胞和组织类型的能力。因此，多能干细胞在开发新药的试验中可能是重要的工具，并且因为它们的供应实际上是无限的，因此它们提供了更廉价并且可变性较少的来源。
3D生物支架
多能干细胞分化中的主要挑战之一是控制分化，使得始终产生成熟、功能完全的细胞类型而不是部分分化、不成熟的前体细胞或各种细胞类型的高度异质性混合物。使多能干细胞分化的最简单方式是在2D塑料基体上，但不幸的是，这往往产生缺乏成熟细胞类型的特征性表型的分化细胞。这部分是由于不能复现干细胞在正常胚胎发生期间所经受的条件，正常胚胎发生过程与2D培养物的不同之处在于它当然是在3维中发生的。研究人员试图解决这个问题的一种方式是开发新的3D培养系统，所述新的3D培养系统旨在更忠实地复现细胞在胚胎发生期间所经受的一些条件并让它们以更天然的方式分化。特别是，这样的3D系统允许细胞在更大的程度上彼此相互作用，并允许开发比利用2D细胞培养观察到的任何物体更类似于功能性器官的复杂的多细胞聚集体。
3D系统依赖于生物活性支架的存在，细胞可以接种并可以粘着在所述支架上。这样的支架必须有助于引导细胞以所需的3D构造生长和增殖，并且也可能需要提供帮助细胞形成所需结构的某些分子信号。生物支架的另一个重要要求是它们是可放大的，以便组织生长和细胞分化可以在更大、更经济的规模上进行。支架可以由各种材料构成，正确的支架选择在引导接种到其上的任何细胞的生长、增殖和分化中可能是关键的。例如，支架通常由安排成多孔海绵形式的聚合材料构成。于是，接种到这种支架中的细胞可以通过支架内部相互连接的管道和通道网络在所述支架的孔结构内部粘着和生长，当选择适合的支架时，孔径是重要的考虑因素。生体活性剂例如细胞外基质（ECM）组分，在沉积到支架表面上时，也可以用来增强支架功能，以容许更好的细胞粘着。最终的结果是为细胞提供一种体外环境，使细胞可以在其中更切实可行地并且以更接近地类似于它们正常的体内家园的方式进行相互作用。
在几种培养系统中，添加细胞外基质诱导细胞极性和组织的组织化。例如，当用第二层胶原蛋白进一步覆盖培养在平的胶原蛋白层上的单层原代肝细胞时，即所谓的夹心培养，与常规2D培养物的肝细胞相比，所述细胞显示出形态和功能改善（Dunn,J.等，1991）。所述覆盖层导致细胞保持肌动蛋白丝与体内状态相似，与此相反，在2D对照培养中看到异常的应激纤维形成（Berthiaume,F.等，1996）。生理更相关的细胞骨架组织化和随后的细胞极性与形状可能引起肝功能性提高，但是后来认为，夹心培养的有益效应主要起因于改善的细胞-细胞接触而不是细胞与细胞外基质的接触（Hamilton,G.等，2001）。胶原蛋白支架也已被用于将胚胎干细胞分化成肝细胞。Baharvand和同事发现，与传统2D中分化的细胞相比，肝细胞样细胞在胶原蛋白支架内部的分化改善了形态特征、基因表达模式和代谢活性（Baharvand,H.等，2006）。
藻酸盐提供了多孔非粘着性3D支架，支持肝细胞聚集形成强烈的细胞-细胞相互作用，导致肝功能改善（Dvir-Ginzberg,M.等，2003）。藻酸盐基质中的环境还支持新生大鼠肝细胞的分化（Dvir-Ginzberg,M.等，2008）和HepG2成熟（Elkayam,T.等，2006）为更成熟的功能性表型。另外，当将C3A肝细胞系作为球状体在藻酸盐中进行培养时，因为许多不同CYP的酶活性比在2D单层培养中增加，因此，C3A肝细胞系显示出药物代谢提高（Elkayam,T.等，2006）。最近，市场上已推出几种用于提供3D支架以支持细胞培养的新产品，包括已被发现改善肝细胞培养条件的3D交织纳米纤维支架（Wang,S.等，2008）。另外，多孔聚苯乙烯支架提供了空间，能够让细胞生长和分化并形成具有复杂的3D细胞-细胞相互作用的层（Bokhari,M.等，2007a；Bokhari,M等，2007b）。在这些支架中，HepG2响应于生化试剂的方式远比在2D中培养的细胞更加类似于体内组织的活性（Bokhari,M.等，2007a）。另外，小鼠ES细胞在灌流的聚氨酯泡沫中已作为球状体成功地向肝细胞分化，目的在于通过组合生长因子处理和多细胞球状体形成来发展大量分化培养法（mass differentiation culture method）（Matsumoto,K.等，2008）。
肝细胞培养
肝功能衰竭和终末期肝脏疾病在全世界造成为数巨大的死亡并且是医疗保健系统的主要负担。肝脏移植仍然是最成功的治疗。可是，这种方法的功效有限并且与许多并发症例如感染或排斥关联。肝脏移植还具有可利用的供体器官短缺的缺点，并且被治疗的患者往往需要终身免疫抑制治疗。通过减少对器官的需要，基于细胞的治疗对于社会和患有这些严重疾病的个体都将是极为重要的。
此外，肝脏是人体中代谢和解毒的中心，因此为了鉴定用于体外试验的功能性细胞类型的可靠来源，已经进行了大量的尝试。不幸的是，目前可利用的任何细胞类型都不能真实反映肝脏的复杂性和功能。
从hPS细胞生成肝细胞样细胞的方法往往包括胚状体的形成和/或基于添加细胞毒性化合物进行早期选择，所述肝细胞样细胞可以进一步分化成成熟肝细胞（Rambhatla,L.等，2003）。这些选择步骤，特别是胚状体的形成，往往导致大量细胞损失并进而导致效率低下。该方法是复杂的，大多数具有非常长的世代时间并包括几个耗时的步骤。因此，需要迅速和简单的方法用于形成源自于未分化的hBS细胞的肝细胞样细胞。以前用于获得肝细胞样细胞的尝试，例如如US20030003573中所公布的，产生了与起始材料有关的低收率。此外，原代人类肝细胞的可利用性非常有限，并且还知道，所述细胞在用于体外应用时迅速失去它们的正常表型和功能性质。一种经常使用的原代细胞替代物是转而包含非常低水平（或完全缺乏）的代谢酶并且其他重要蛋白质的分布与体内天然肝细胞显著不同的肝细胞系。因此，虽然已知肝脏代谢是物种特异性的并因此在预测所测试的物种以外的其他物种的肝脏代谢和毒性中产生困难，但许多试验仍然使用动物材料来进行。
在药物开发中，肝脏不良反应仍然是最突出的副作用。因此早期预测发生人类肝脏毒性的倾向性在选择化合物进入临床试验时具有至高的重要性。提高这方面的能力的尝试必须解决可利用性问题和模型建立这两者，这为与引起人类肝脏不良损伤相符的复杂生物过程提供更好的覆盖度。
因此，迫切需要一种模型系统，所述模型系统模拟人类肝细胞，而且能够在新药或化学品的开发中预测候选分子的效应。就可利用性和生理相关性这两方面而言，hPS细胞可以担任功能性人类肝细胞的理想的可再生来源。
发明内容
本发明的发明人已经制定了许多稳妥的方案，这些方案允许将hPS细胞、肝细胞前体细胞或肝细胞祖细胞接种到3D生物支架上，以可再现地和可放大地产生具有成熟的形态和功能的肝细胞。
本发明包括用于提高人类多能干细胞（hPS）分化成肝细胞祖细胞或肝细胞细胞类型的方法，其中所述hPS细胞初始被培养在2维培养表面上，然后转移到一组定义的3D生物支架之一上用于进一步分化和成熟。hPS细胞初始也可以在2维表面上部分分化成肝细胞祖细胞类型。随后，将肝细胞祖细胞或hPS细胞接种到裸露的3维支架或已经涂覆有基质化合物的支架上，并进一步培养。
作为本发明的重要方面，本发明人已经发现，通过将hPS细胞在2D环境中初始生长并任选初始分化，然后将所述细胞转移到3D环境中，显著增加了肝细胞相关基因的表达和肝细胞相关酶的产生。
定义
在本文中使用时，“人类多能干细胞”（hPS）是指可以源自于任何来源并且在适合的条件下能够产生源自于全部3个胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的不同细胞类型的人类子代细胞的细胞。hPS细胞可以具有在8-12周龄SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力和/或在组织培养中形成可识别的所有三个胚层的细胞的能力。人类多能干细胞的定义中包括各种类型的胚胎细胞，包括人类胚胎干（hES）细胞（参见，例如，Thomson,J.A.等（1998）,Heins,N.等（2004）），以及诱导的多能干细胞（参见，例如Yu,J.等，（2007）；Takahashi,K.等（2007））。本文中描述的各种方法和其他实施方式可能需要或利用来自各种来源的hPS细胞。例如，适合使用的hPS细胞可以从发育中的胚胎获得。另外或可选地，合适的hPS细胞可以从建立的细胞系和/或人类诱导的多能干（hiPS）细胞获得。
在本文中使用时，“hiPS细胞”（也称为“iPS”）是指人类诱导的多能干细胞。
在本文中使用时，“定型内胚层（DE）”和定型内胚层细胞（DE细胞）是指表现出例如但不限于定型内胚层细胞典型的蛋白质或基因表达和/形态的细胞，或者包含大量与定型内胚层细胞类似的细胞的组合物。
在本文中使用时，“肝前体细胞”或“肝祖细胞”是指表现出例如但不限于定型内胚层细胞典型的蛋白质或基因表达和/或形态的标志物的细胞，或者包含大量与肝前体细胞或肝祖细胞的细胞类似的细胞的细胞组合物。
在本文中使用时，“肝细胞”或“肝细胞样细胞（HCLC）”用来表示表达至少一些成熟的肝脏标志物例如白蛋白、CYP3A4、UGT2B7、OATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6的细胞类型。
在本文中使用时，“hESC-HEP”用来表示源自于人类胚胎干细胞并表达成熟的肝脏标志物例如白蛋白、CYP3A4、UGT2B7、OATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6的细胞类型。
在本文中使用时，“hiPS-HEP”用来表示源自于诱导的多能干细胞并表达成熟的肝脏标志物例如白蛋白、CYP3A4、UGT2B7、OATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6的细胞类型。
在本文中使用时，“无异源（Xeno-free）”是指细胞系或细胞材料从来没有直接或间接暴露于非人类动物来源的材料，例如细胞、组织和/或体液或其衍生物。
在本文中使用时，“Wnt信号转导”是指Wnt信号转导中所包括的途径，如例如Nejak-Bowen和Monga（2008）中所综述的。
在本文中使用时，HDAC抑制剂是指组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
在本文中使用时，“GSK抑制剂”是指抑制GSK（尤其是GSK3，包括GSK3α或GSK3β）的化合物。用于本发明的优选GSK抑制剂的实例包括下列的一种或多种：
BIO(2'Z,3'E)-6-溴靛红-3'-肟（GSK3抑制剂IX）；
BIO-丙酮肟(2'Z,3'E)-6-溴靛红-3'-丙酮肟（GSK3抑制剂X）；
(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-(2-苯基喹唑啉-4-基)胺（GSK3-抑制剂XIII）；
吡啶咔唑-环戊二烯钌复合物（GSK3抑制剂XV）；
TDZD-8 4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑啉-3,5-二酮（GSK3β抑制剂I）；
2-硫代(3-碘苄基)-5-(1-吡啶基)-[1,3,4]-噁二唑（GSK3β抑制剂II）；
OTDZT2,4-二苄基-5-氧代噻二唑啉-3-硫酮（GSK3β抑制剂III）；
α-4-二溴苯乙酮（GSK3β抑制剂VII）；
AR-AO 14418 N-(4-甲氧基苄基)-N'-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲（GSK-3β抑制剂VIII）；
3-(1-(3-羟丙基)-IH-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2,5-二酮（GSK-3β抑制剂XI）；
TWSI 19吡咯并嘧啶化合物（GSK3β抑制剂XII）；
L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2或其肉豆蔻酰化形式（GSK3β抑制剂XIII）；和
2-氯-1-(4,5-二溴-噻吩-2-基)-乙酮（GSK3β抑制剂VI）；和
氨基嘧啶CHIR99021。另外，许多无翅型蛋白或Wnt蛋白的功能与GSK抑制剂、特别是本发明的GSK抑制剂相似。因此，它们被归入术语GSK抑制剂下。可以用于本发明的示例性Wnt蛋白包括Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt10、Wnt14、Wnt14b、Wnt15和Wnt16中的一种或多种，以及其他Wnt蛋白。优选使用Wnt3a。
此外，小分子可用于指导Wnt信号转导。同样，对诱导Wnt信号转导的GSK33阻断剂或抑制剂可以用于调节Wnt信号转导以实现指导分化和成熟。可以在起动之后较晚的阶段或在诱导发生之前诱导Wnt信号转导途径。
在本文中使用时，“CYP”用来表示细胞色素P，更具体地是表示细胞色素P450，细胞色素P450是肝脏的主要I相代谢酶，由许多不同的同工酶组成，例如CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2A6/2A7/2A13、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP7A1。
在本文中使用时，术语“GST”用来表示谷胱甘肽转移酶，其亚型的实例是GST A1-1、GST M1-1和GST P1-1。
在本文中使用时，术语“UGT”用来表示尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶，它是催化葡萄糖醛酸化活性的一组肝脏酶。
在本文中使用时，术语“细胞色素P450还原酶”（亦称CPR）用来表示其生理功能是通过电子转移来还原细胞色素P450酶并因此是细胞色素P450酶介导的反应所需要的蛋白质。
术语“功能性药物代谢酶”用来表示属于I相和II相酶的功能性酶，所述I相和II相酶执行异源生物物质和药物的化学修饰，即所谓的药物或异源生物物质代谢。
在本文中使用时，术语“功能活性”是指有效的可测定的肝细胞功能，例如药物转运蛋白的可测定的药物转运以及细胞色素P450（CYP）的可测定的酶代谢，它们通常是在原代人类肝细胞中被检测到的。
在本文中使用时，术语“胚外内胚层（ExE）”用来表示分化的内胚层细胞，它们与定型内胚层相反，在人类发育中将构成胚胎外部的区室，例如卵黄囊。
在本文中使用时，术语“AAT”用来表示肝脏标志物α-抗胰蛋白酶。
在本文中使用时，术语“醇脱氢酶1”用来表示一种脱氢酶类型，其促进醇与醛或酮之间的相互转化，其中将NAD+还原为NADH。醇脱氢酶1起到分解原本可能有毒的醇的作用。
在本文中使用时，术语“AFP”用来表示肝脏标志物α-甲胎蛋白。在本文中使用时，术语“BSEP”用来表示胆汁转运蛋白胆盐输出泵。
在本文中使用时，术语“CK”用来表示肝脏标志物细胞角蛋白（可互换使用），它有不同的亚型，例如细胞角蛋白18（CK18/KRT18）、细胞角蛋白19（CK19/KRT19）、细胞角蛋白8（CK8）和细胞角蛋白7（CK7）。
在本文中使用时，术语“FGF”是指成纤维细胞生长因子，优选为人和/或重组来源的，属于它的亚型是例如“bFGF”（是指碱性成纤维细胞生长因子，有时也称为FGF2）和FGF4。“aFGF”是指酸性成纤维细胞生长因子（有时也称为FGF1）。
在本文中使用时，术语“BMP”是指骨形态发生蛋白，优选为人和/或重组来源的，属于它的亚型是例如BMP4和BMP2。
在本文中使用时，术语“HGF”是指肝细胞生长因子，优选为人和/或重组来源的。
在本文中使用时，“HNF3β”或“HNF3b”可互换使用，用来表示肝细胞核因子3，它是调节内胚层来源的组织例如肝脏、胰岛和脂肪细胞中基因表达的转录因子。HNF3β有时也可以称为HNF3b或Fox2A，后一名称起源于该转录因子是叉头框（Forkhead box）转录因子家族的成员。
在本文中使用时，术语“OCT-1”用来表示有机阳离子转运蛋白1。OCT-1是主要的肝转运蛋白，它介导许多有机阳离子从血液摄取到肝脏中，化合物可以在肝脏中被代谢或分泌到胆汁中。
在本文中使用时，术语“MDR”用来表示多药耐药性转运蛋白。MDR1和3是ATP结合盒（ABC）转运蛋白家族的成员，二者都是药物外排转运蛋白。MDR1在调节药物、肽和异源生物物质运输到身体中以及在保护身体对抗异源生物物质损伤和药物毒性方面是重要的，而MDR3是磷脂分泌到胆汁中所必不可少的。
在本文中使用时，术语“激活素”用来表示一个TGF-β家族成员，它表现出范围广泛的生物活性，包括调节细胞增殖和分化，例如“激活素A”或“激活素B”。激活素属于常见的TGF-β配体超家族。
在本文中使用时，术语“ROCK抑制剂”用来表示ROCK Rho激酶的小分子抑制剂，例如Y-27632或法舒地尔。
在本文中使用时，术语“无异源”用来表示完全避开了直接或间接暴露于非人类动物组分。
在本文中使用时，术语“肝细胞毒性”是指细胞反应例如坏死性毒性、凋亡、线粒体毒性、磷脂沉积、脂肪变性和胆汁酸转运。
发明的具体描述
本发明的一个方面涉及用于将人类多能干细胞（hPS）或肝细胞前体细胞分化成成熟肝细胞或肝细胞样细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
i）在2维表面上接种hPS或肝细胞前体细胞以起始分化
ii）将步骤i）的初始分化的细胞转移到3维（3D）支架上用于进一步分化和成熟。
然而，所述细胞在3D支架上的接种密度可以高于在2D培养物上的接种密度，例如高三倍或高五倍或高十倍。此外，可以添加Rho激酶（rock）抑制剂和/或可以在无饲养细胞或无异源的条件下执行所述方法。
本发明的方法中所使用的细胞可以是无异源的细胞，例如无异源的hPS细胞系或来源于无异源的hPS细胞系的细胞，或者所述细胞可以是人类胚胎干（hES）细胞或诱导的多能干（iPS）细胞。本发明的肝细胞前体细胞可以是定型内胚层（DE）细胞或不是定型内胚层细胞，并且可以具有胚胎内胚层或肝内胚层的特征。
可以在2至25天、例如4至15天之后执行从步骤i）到ii）的过渡，即将步骤i）中获得的细胞转移到3D支架上（步骤ii）。
3维支架可以选自下列类型之一：i）多孔藻酸盐海绵，ii）可生物降解的聚氨酯脲（PUUR）聚合物，iii）乳液模板型聚苯乙烯，iv）合成纳米纤维复合物，v）具有至少一个非直立侧壁的微孔装置，vi）由聚L-乳酸[PLLA]制造的多孔海绵，或者所述3维支架可以是另一种合适的类型。
多孔藻酸盐海绵可以具有50-200μΜ的孔径，而乳液模板型聚苯乙烯支架的孔径在0.1-1000μΜ、例如15-45μΜ范围内。
此外，本发明涉及如上所述的方法，其中3D支架是未涂覆的。在另一个方面，用例如一种或多种细胞外基质组分预先涂覆3D支架。这样的细胞外基质组分的实例包括：明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白、聚赖氨酸、玻连蛋白、透明质酸、透明质酸水凝胶、丝纤蛋白、壳聚糖、或任何前述项的复合物。
本发明的3D支架可以被包含在合适的培养容器内，所述培养容器例如多孔板，包括但不限于6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板、1536孔板，或其他合适的细胞培养容器。
因此，本文详述的发明包括用于提高hPS细胞向更具肝脏表型的细胞或最终具有部分或完全成熟的肝脏表型的细胞分化的方法，这种方法要求细胞初始被培养在2维培养表面上，然后转移到六种可能的3维支架之一上。肝脏表型的这种改善与任何具体的细胞培养基的组成无关（对于所采用的细胞培养方案的详情，参见图9）。
根据基因表达和代谢研究，本发明的发明人发现，与更传统的2D基体相比，3D支架为hPS来源的肝细胞或肝细胞祖细胞的成熟和进一步分化提供了更好的环境（图1-6）。此外，本发明人发现，当将细胞培养在2D表面上、然后将所述细胞接种到3D环境中时，有进一步的效果。
这可以通过比较几种肝脏标志物基因例如Cyp2C9、白蛋白、Cyp3A4和UGT2B7的表达看出，所述标志物基因在3D支架上培养的细胞中的表达均比在2D表面上培养的细胞中的表达高，而与细胞系、基质涂层、培养天数或所选的支架无关。特别是，当被培养在3D中时，许多肝转运蛋白（BSEP、FABP1、MRP2、NTCP、OATP2、OCT1）的表达水平高得多，表明肝细胞更成熟和更具功能。在一系列不同的支架类型上，包括拓扑形态支架（topographical scaffolds）例如Ultraweb（图3）和Aggrewell（图5）、多孔海绵类型例如AlgiMatrix（图2）和聚L-赖氨酸（图6），以及在基于合成聚合物的支架例如Artelon（图1）和Alvatex（图4）上，都可以看到这种结果。
可以预先用基质组分涂覆3D支架，以更好地类似于肝细胞正常遇到的体内微环境。特别是，基质组分明胶和基质胶已经显示出在与支架一起使用时提高一些肝脏标志物的表达水平。几种标志物（TAT，CYP2C9，OATP2）在基质胶涂覆的Artelon（Artimplant）上的表达高于未涂覆的（图1C和E；图1A和D）。许多标志物（TAT和UGT2B7）在基质胶涂覆的Alvatex上的表达显著高于未涂覆的（图4F和G，在第18天时分析），并且对于几种其他标志物（例如TAT，UGT2B7）也是如此，它们在明胶涂覆的Alvatex上的表达程度高于未涂覆的（图4E和G）。根据希望看到哪种标志物高度表达，可以任选应用本发明的这种具体实施方式。因为特定的标志物组的表达将暗含肝谱系的某些表型或阶段，因此，本发明这方面的运用可以允许程度更精细地控制所生成的肝细胞的功能性。这方面的扩展是可以向接种到3D支架上的hPS细胞或hPS来源的肝祖细胞添加一种或多种不同的细胞类型，使得在3D支架上共同培养细胞系。
值得注意的是，可以将细胞以不同的相对密度接种在3D支架上。相对密度可以是标准的x1密度（即，与接种在2D对照表面上的细胞密度相同）或高三倍的初始密度（表示为x3）或高10倍的密度或其间的任何密度。图1H和I显示，当使用未涂覆的Artelon（Artimplant）时，标志物OATP2、OCT1和TAT的表达在以较低的x1初始密度接种的细胞中更高。某些标志物（例如CYP7A1）在未涂覆的Alvatex上以x3接种的细胞中的表达也比以x1接种的细胞中的表达低（图4N和O），但其他标志物（例如OCT1）在未涂覆的Alvatex上以x3接种的细胞中具有更高的表达（图4I和K）。因此，这种具体实施方式的运用也取决于使用者需要的肝细胞的期望表型。
为了容许控制分化，细胞被接种到3D支架上时的分化阶段是相关的，即被接种到3D支架中之前培养较长时间则表型更成熟。hPS细胞可以在几个不同的分化阶段，例如作为未分化的细胞（第0天）、或用激活素A进行定型内胚层诱导处理之后（第4-7天）、或作为肝前体细胞（第9、11、13、14和15天），被接种到所述支架中用于在3D支架中成熟。在接种到支架上之前，可以对这样的前体细胞进行表征，以确定它们是处于胚胎内胚层谱系（图11）还是更晚期的肝细胞前体（图12），依据的是这两个阶段特征性的所定义的标志物基因的表达。在被培养在Artelon（Artimplant）上的细胞中容易观察到差别，其中例如在14天时接种的细胞中OCT1的表达水平几乎是在第11天时接种的细胞的两倍（图1F和H）。与此相反，在14天时接种到Artelon（Artimplant）上的细胞中，OATP2的水平比在第11天时接种的细胞低（图1J和M）。在被培养在Alvatex上的细胞中也可以看出这种趋势，其中14日龄接种的细胞同样具有比11天细胞低的OATP2表达水平，这可能表明OATP2是更不成熟的肝细胞表型的标志物（图4I和J）。以类似的方式能够看出，在更年轻时（第11天）接种的细胞中OCT1的水平也比更成熟（第14天）的细胞中的高（图4N和P）。因此，细胞培养和分化时间的长度是本发明在控制所产生的细胞的最终表型方面的重要因素，并可以相应地进行改变。如图9和下面表中所概括的，可以调整培养的持续时间和培养基组成，以优化通过本文中公开的方法获得的细胞的成熟度和发育阶段。相关的方面涉及细胞在接种到支架上之前所接受的分化方案，如实施例2中所详述的，特别是细胞是否暴露于含有Rho激酶ROCK抑制剂的培养基，这种抑制剂被用来在2D和3D两阶段中传代和接种之后提高存活率和再粘着。
已经观察到，与生长在常规的2D表面上的肝细胞相比，接种到3D支架上的肝细胞中的功能和代谢活性改善。根据实施例6，在3D支架中成熟的hESC来源的肝细胞，当暴露于药物非那西汀（APAP）、咪达唑仑或双氯芬酸时，显示出比2D对照培养更高的CYP活性诱导（图7和8、10），其中Alvatex支架显示出比Ultraweb更高的诱导。对培养在Alvatex（Reinnervate）上的细胞的进一步研究显示，在起始分化之后23和29天时，如由CYP2C9活性所测定的，那些细胞均比培养在2D表面上的细胞具有高得多的代谢活性。CYP2C9活性在培养在3D表面上的细胞中已经是高的，但是当用双氯芬酸处理细胞时还观察到升高（图8）。这再次显示在3D支架上分化的肝细胞在与2D培养物细胞相比时，具有优异的肝细胞代谢功能。这些结果得到以下实验结果的支持：当对药物咪达唑仑的细胞代谢分解产物进行分析时，发现与2D对照相比，关键的肝脏标志物CYP3A在培养在基质胶涂覆的Alvatex（Reinnervate）上的细胞中的水平也较高，在培养在Ultraweb上的细胞中的水平略高（图8）。因此，本发明已经显示了在培养在3D支架上的细胞中肝代谢活性提高的几个实施例。
因此，正如以上的讨论，本发明的一方面涉及一种方法，其中如由一种或多种CYP标志物例如CYP2C9或CYP3A的表达增加和/或选自CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7、CYP7A1、MRP2、白蛋白、UGT2B7、AAT、TAT的肝细胞相关遗传标志物的水平升高所显示的，肝细胞或肝细胞祖细胞表现出代谢活性升高。
此外，本发明的一方面涉及一种方法，其中肝细胞或肝细胞祖细胞表现出一种或多种肝相关转运蛋白例如BSEP、FABP1、MRP2、NTCP、OATP2、OCT1的表达增加。
正如以上的讨论，本发明方法刺激了肝细胞或肝细胞祖细胞与非肝细胞相比的比例大于5%，例如10%、例如20%、例如30%、例如40%、例如50%、例如60%、例如70%、例如80%、例如90%、例如100%。
前述权利要求任一项的方法，其中将肝细胞或肝细胞祖细胞与至少一种其他细胞类型共同培养在3D支架上，所述其他细胞类型选自但不限于：星形肝细胞、肝免疫（Kuppfer）细胞、肝内皮细胞、胆管上皮细胞或成纤维细胞。
因此并且正如以上的讨论，本发明的一方面涉及可通过本文中描述的方法获得的hPS来源的肝细胞或肝细胞祖细胞或者包含hPS来源的肝细胞或肝细胞祖细胞的组合物。本发明的其他方面涉及通过本文中的方法获得的hPS来源的肝细胞或肝细胞祖细胞或者包含hPS来源的肝细胞或肝细胞祖细胞的组合物在治疗、再生医学、药物筛选、毒性测试或药物递送中的应用。
所述组合物还可以包含3D支架，例如但不限于多孔藻酸盐海绵、可生物降解的聚氨酯脲（PUUR）聚合物、乳液模板型聚苯乙烯或合成纳米纤维复合物。
实施例
实施例1.
来源于人类多能干细胞的肝细胞的起始材料
所有hPS细胞（如上所定义）均可被用作本发明的起始材料。对于下面的实施例而言，肝细胞样细胞在体外来源于被培养在mEF细胞上的未分化人类胚胎干细胞（hESC）（Heins,N.等2004,Stem Cells）。用于这个实验的细胞系可以是、但不限于hES细胞系SA002、SA121、SA181、SA461（Cellartis AB，
Figure BDA00002789320500171
瑞典，http://www.cellartis.com），并且它们可以如Heins,N等2004所描述的进行增殖。在NIH干细胞登记处、UK干细胞库和欧洲hESC登记处中列出了这些细胞系，并且可通过请求来获得这些细胞系。与从hESC获得的hPS一起，从hiPS（诱导的多能干细胞）获得的hPS已被用于在本发明实施例中获得肝细胞。在这种情况下，“hiPS-HEP”用来表示源自于诱导的多能干细胞并表达成熟的肝脏标志物例如白蛋白、CYP3A4、UGT2B7、OATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6的细胞类型（也参见“定义”）。无异源的iPS细胞或无异源来源的hES细胞系例如SA611（Cellartis AB，
Figure BDA00002789320500172
瑞典，http://www.cellartis.com）的应用可以任选让整个发明在无异源的条件下用于产生无异源的细胞产物。
实施例2.
利用3D支架从人类多能干细胞获得肝细胞
按照下面详述的方案a-e，从hES细胞和人类hiPS细胞二者获得肝细胞。在开始分化之前，用PBS洗涤培养物两次。新鲜制备不同的培养基（表1），并从0天以后根据方案概述添加所述培养基。在初始分化（ID）步骤期间，每天或每两天更换培养基，以后每两天或每三天更换培养基。每个实验只使用一种细胞系，但是任选在将初始细胞系接种到3D支架上时可以添加第二种（或更多种）细胞系，让所述细胞共同培养。
除了在实验114和116中，2D培养物被接种在明胶涂覆的培养容器上之外，2D培养物均被接种在基质胶涂覆的培养容器上。2D培养物以150.000-200.000细胞/cm2进行接种。
下表显示了关于不同实验、哪种细胞系被用作起始材料、如图9中概括的不同形式的分化方案、分化方案中细胞被接种到3D支架中时的时间、对细胞进行分析时的分化时间、和在接种到支架中时是否向培养基添加了10mM ROCK抑制剂的概述（对于所采用的方案的示意性细节，也参见图9）：
Figure BDA00002789320500181
Figure BDA00002789320500191
实施例3.支架
研究中所使用的支架和基质涂层
Artelon（Artimplant）；<150μm孔径，48孔板样式，由Artelon（Artimplant）（
Figure BDA00002789320500192
瑞典）友情提供[参见WO0035507；以及Blumenthal，B.等（2010）]
Alvatex；48孔大小，由Stefan Przyborski Relnnervate（Durham，UK）友情提供（参见WO07125288，WO10038013）
AlgiMatrix；Invritogen/Gibco，目录号12684，批号731950，96孔（exp088+089）[参见WO08112904；以及Shapiro，L和Cohen，S.（1997）]
UltraWeb；Corning，目录号3873xx，批号09207043，96孔（exp088+089）[参见WO09032117；WO10060066，以及Piryaei,A.等（2010）]
Aggrewell；Stem Cell Technologies，目录号27865，大约300个微孔[参见WO2008106771]
HAC/Porocell；（HacBiomed）；[Cell Transplant.1997Sep-Oct;6(5):463-8.
高度多孔的聚合物基质作为肝细胞的三维培养系统。KaufmannPM，Heimrath S，Kim BS，Mooney DJ.]
使用之前3D支架和2D培养皿的制备：
将Artelon（Artimplant）和Alvatex支架浸泡在70%EtOH中，去除EtOH并将支架用DPBS洗涤两次。
基质胶：将来自BD、批号为0934的生长因子减少的基质胶在DPBS中稀释到0.016mg/ml，并添加到支架和2D培养皿中，在室温下温育至少1h RT，然后在去除基质胶后立即使用。
明胶：将制造的明胶添加到支架和/或2D培养皿中，在室温下温育至少30min，然后在去除明胶后立即使用。
实施例4.
hES细胞培养物的传代和维持
从细胞培养物去除培养基，将所述培养物在DPBS-/-中洗涤2次（37°C，0.5ml/cm2）。添加TrypLE Select（RT，0.1ml/cm2）并在37°C下温育（对于未分化的细胞或激活素A处理之后的细胞为4-5min，对于祖细胞阶段的细胞为10-45分钟）。然后通过用p1000冲洗细胞使细胞不再贴壁。添加VitroHES（37°C，0.1ml/cm2）并将细胞悬液转移到离心管中，在室温下以330xg离心5min。将细胞沉淀重悬在培养基中，对细胞进行计数并稀释为适合的接种悬液。在一些实验中，在接种当天向培养基添加10mM Rock抑制剂（exp113、114、116、118、119、120）。
实施例5.
培养在3D支架上的hESC来源的肝细胞的基因表达分析
如附图说明所指出的，hESC-HEP源自于培养自DEF培养系统的细胞系SA002、SA121、SA181、SA46或在mEF层上的SA002培养物。
在第18、22、24、25和30天，利用来自Qiagene的RNA分离试剂盒从hES-HEP培养物收集和分离总RNA。利用Taqman探针，对下列肝脏标志物基因进行定量逆转录酶PCR，即QrtPCR：I相药物代谢酶；CYP（细胞色素P450）1A2、2C9、3A4、7A1，II相药物代谢酶GSTA1（谷胱甘肽-S-转移酶A1），UGT2B7（UDP葡萄糖醛酸转移酶2B7），III相转运蛋白；MRP2（多药耐药蛋白2，也称为ABCC2），BSEP（胆盐输出泵），NTCP（溶质载体，钠/胆汁酸共转运蛋白），OCT1（溶质载体，有机阳离子转运蛋白），OATP2（溶质载体，有机阴离子转运蛋白），FABP1（参与脂肪酸摄取、转运和代谢的脂肪酸结合蛋白），以及普通的肝脏标志物；AAT（α-1抗胰蛋白酶），ADH1A（醇脱氢酶1A），ALB（白蛋白）和TAT（酪氨酸氨基转移酶）。除非另有指明，否则将所有数据都针对管家基因CREBBP进行归一化。除非另有指明，否则数据被表示为2D对照的倍数改变。
数据被提供在图1-4中，并显示出当被培养在3D中时，与2D相比，hESC-HEP中的肝基因以更高的水平表达。3D培养中其他肝脏标志物的表达水平提高支持这一研究结果，即3D培养在hESC的肝分化中是重要的。
实施例6.
CYP分析
在第16、18、20、21和25天，通过在补充有0.1%青霉素-链霉素、2mM L-谷氨酰胺和25mM Hepes的无酚红Williams培养基E中与终浓度分别为26μΜ、9μΜ和3μΜ的底物非那西汀、双氯芬酸和咪达唑仑温育，分析hESC来源的肝细胞培养物的细胞色素P450 1A、2C和3A活性。向每cm2孔表面添加100μl体积的稀释的底物（例如75μl/48孔）。将hESC来源的肝细胞培养物与底物温育过夜。在16h后，收集培养基，随后在4°C以10 000g离心20min。通过液相色谱-质谱（LC-MS）LCMS分析样品中被细胞色素p450酶Cyp1A2、1A1（非那西汀）、Cyp2C9、2C8（双氯芬酸）和Cyp3A4、3A5（咪达唑仑）生物转化的代谢物对乙酰氨基酚、4-OH-双氯芬酸和1-OH咪达唑仑的存在。
实施例7.
在培养在Relnnervate支架中的细胞中Cyp2C9活性提高并且Cyp2C9活性的诱导增加
按照实施例1和2、实验083中的条件，然后根据下面的方案，来培养和分化细胞系SA461（Cellartis AB）：
Figure BDA00002789320500221
上面所应用的生长培养基的组成：
Figure BDA00002789320500231
分化进行到直至第15天，在第15天将支架切成小圈装进24孔板中。将Alvatex（Relnnervate）支架用70%EtOH洗涤，去除EtOH并将孔用PBS+/+洗涤两次。基质胶：将批号为6741的GFR基质胶在DPBS中稀释到0.016mg/ml，并添加到支架中，每孔和每支架500μl。将支架在室温下与基质胶温育~1小时。去除基质胶后立即使用。
目的是以1.5:1的分种率（split ratio）接种在2D孔中。在Alvatex（Relnnervate）中，接种多达5倍的细胞，分种率为7.5:1。以9.6cm2的27个孔开始，即260cm2。为了在Alvatex（Relnnervate）支架中接种100μl/cm2，将细胞悬浮在（260/7.5×0.1=34.6）3.46ml中。
将细胞的27个孔在DBPS+/+中洗涤1次，并且向每孔添加2mlTryple Select，在37°C下温育23min。添加旋转沉降培养基，并冲洗细胞使它们不再贴壁。收集细胞并以400xg旋转5min。重悬在3.46ml接种培养基中。每个Alvatex（Relnnervate）支架接种200μl该悬液。将600μl悬液稀释5倍，每个2D孔接种200μl稀释后的悬液。然后向所有孔添加培养基，直至每孔为共800μl。
对细胞进行计数：27.9x106个细胞/ml（87%存活率），共3.46ml，共计96x106个细胞。
Figure BDA00002789320500241
诱导：
用1mM苯巴比妥、10μΜ地塞米松和5μΜβ-萘黄酮诱导细胞。
为了获得这些溶液，用540μl DMSO稀释100μl64mM地塞米松溶液以获得10mM地塞米松溶液
将11.4mgβ-萘黄酮溶解在8.446ml DMSO中以获得5mM溶液用PBS1:1稀释1M苯巴比妥
向35ml M6（无地塞米松）添加35μl 10mM地塞米松、35μl 5mMβ-萘黄酮和70μl 0.5M苯巴比妥。
对照培养基（未诱导培养基）不包含任何DMSO，以便能够将酶活性与基线酶活性进行比较。
向每个孔添加诱导或对照培养基（400μl/孔2D培养物，Relnnevate支架中2000μl/孔），并将板温育24h。
活性分析：
在诱导24小时后，将所有孔在DPBS+/+中洗涤2次并添加活性分析培养基，2D对照中为200μl/孔，Relnnervate支架中为1000μl/孔。活性检测培养基：没有酚红的无蛋白培养基，由具有0.1%PEST、2mM L-谷氨酰胺、25mM HEPES和26μM非那西汀、3μM咪达唑仑和9μM双氯芬酸的WE组成。
在37°C下温育16小时之后，将培养基转移到eppendorf管中并在4°C和10000g下旋转沉降20min。通过HPLC分析上清液中双氯芬酸的代谢物OH-双氯芬酸的存在。
实施例8.
验证细胞在接种到支架中时已经分化成胚胎内胚层或肝前体细胞
分析向肝细胞分化所使用的方案中在“内胚层诱导”步骤之后胚胎内胚层细胞的形成，其中按照方案a）来培养细胞（图11）。在分化方案中的第7天，收获细胞用于提取RNA，并通过实时PCR进行分析，并与实验开始时（第0天）的未分化细胞进行比较。据显示，分化方案产生的细胞表达胚胎内胚层标志物（FOXA2，SOX17，HHEX，CXCR4，CER1）。此外，还证实了，与未分化的起始材料相比，未分化细胞的标志物（Nanog和OCT4）下调。另外，检查了细胞对胚外内胚层标志物（Sox7和CDX2）的表达，因为这些基因在内胚层诱导期间不增加。采用类似的方法检验到作为“肝前体细胞”接种到支架上的细胞的确具有这种表型（图12）。
附图说明
图1.
培养在Artelon(Artimplant）上的hESC来源的肝细胞
培养在2D培养物或3D Artelon（Artimplant）支架上的hESC来源的肝细胞的肝脏标志物的相对表达水平。Artelon（Artimplant）是未涂覆的或涂覆有基质（基质胶或明胶），并且细胞以x1密度或x3密度接种。该图显示了三种独立的细胞系（SA461，SA002，SA181），其中按照所示实验编号，将细胞在支架上培养0、5、11、12、14或15天方案a）和c）。
图2a.
在AlgiMatrix上的hESC来源的肝细胞
培养在2D或3D AlgiMatrix支架上的hESC来源的肝细胞的肝脏标志物的相对表达。该图显示了两种独立的细胞系（SA002和SA121），其中将细胞在支架上分别培养14或13天，方案d）。
图2b.
在AlgiMatrix上的iPS来源的肝细胞
培养在2D或3D AlgiMatrix支架上的iPS来源的肝细胞的肝脏标志物的相对表达。在接种到支架上之前将细胞分化7天，并在培养32天之后进行分析；方案h（Exp169a）或f（Exp169b）。
图3.
在UltraWeb上的hESC来源的肝细胞
培养在2D或3D Ultraweb支架上的hESC来源的肝细胞的肝脏标志物的相对表达。Ultraweb是未涂覆的或涂覆有基质（基质胶或明胶）。该图显示了四种独立的细胞系（SA002，SA461，SA121和SA181），其中将细胞在支架上培养4、5、7或14天，方案a）、b）、c）、d）。
图4a.
在Alvatex.(Reinnervate）上的hESC来源的肝细胞
培养在2D培养物或3D Alvatex（Reinnervate）支架上的hESC来源的肝细胞的肝脏标志物的相对表达水平。Alvatex是未涂覆的或涂覆有基质（基质胶或明胶），并且细胞以x1密度或x3密度接种。该图显示了四种独立的细胞系（SA461，SA002，SA181和SA121），其中按照所示实验编号，将细胞在支架上培养0、4、9、11、13或14天，方案a）、c）、d）。
图4b.
在Alvatex.(Reinnervate）上的iPS来源的肝细胞
培养在2D培养物或3D Alvatex（Reinnervate）支架上的iPS来源的肝细胞的肝脏标志物的相对表达水平。Alvatex是未涂覆的或涂覆有基质（基质胶或纤连蛋白），并且将细胞在2D培养物7天之后以细胞从2D培养物收获的x6密度接种。该图显示了一种独立的iPS系（IMR90），其中将细胞在分析之前在支架上培养直到29天；培养方案f。
图5a
在Aggrewell上的hESC来源的肝细胞
培养在2D培养物或3D Aggrewell支架上的hESC来源的肝细胞的肝脏标志物的相对表达水平。Aggrewell涂覆有基质（纤连蛋白），然后用在2D中培养了11天的细胞进行接种；按照方案f）进行培养，并且细胞以每孔100或200个聚集体进行接种。该图显示了一种独立的hESC系（SA181），其中将细胞在分析之前在支架上培养直到25天。
图5b
在Aggrewell上的iPS来源的肝细胞
培养在2D培养物或3D Aggrewell支架上的iPS来源的肝细胞的肝脏标志物的相对表达水平。Aggrewell涂覆有基质（纤连蛋白），然后用在2D中培养了7天的细胞进行接种。该图显示了一种独立的iPS系（IMR90），其中将细胞在分析之前在支架上培养直到29天；培养方案i）。
图6
培养在聚L-赖氨酸3D支架（HAC）上的hESC来源的肝细胞的肝脏标志物的相对表达。将细胞在2D上部分分化7天，然后进行接种，并培养直到24天，然后分析标志物表达；培养方案g）。
图7.
在3D支架中的hESC来源的肝细胞的CYP活性。3D支架左＝Alvatex，3D支架右=Ultra Web。实验24，SA001ECD。
该图显示了培养在Alvatex、Ultraweb或2D对照上的hESC来源的肝细胞的相对CYP活性，其中用APAP、咪达唑仑或双氯芬酸处理细胞以诱导CYP反应并模拟肝代谢活性。
图8.
培养在常规的2D培养板或Alvatex支架中的hESC来源的肝细胞中的CYP诱导
该图显示了培养在Alvatex（Reinnervate）或2D对照上的hESC来源的肝细胞中的CYP反应，其中用双氯芬酸诱导细胞以模拟肝脏的肝活性。如所指出的，在第23天和第29天执行活性分析。
图9.
用于将hPS细胞分化成肝细胞的分化方案的示意图
方案a-e和各自的实验编号以及每个实验的持续时间
方案a：（exp113，114，118，119，120）。
2天ID1，5天ID2，2天P1，2天VH1，5天VH2，8天M1
方案b：（Exp104）
4天ID3，3天P1，2天VH1，3天VH2，2天VH2B，4天或8天M2（分别在第18天和第22天时分析细胞培养物）
方案c：（exp098）
5天ID3，3天P1，7天VH1，10天M3
方案d：（exp088，089）
2天ID1，2天ID2，3天P1，7天VH1，10天M4
方案e：（exp083）
1天ID4，5天ID5，6天P1，8天M5，15天M6
方案f：（exp169b，172，175SA181）
1天ID1，1天ID6，5天ID2，7天VH1，然后M1直至实验结束
方案g：（exp139、140、148，175SA121，177SA121，CYP3A诱导）
1天ID7，1天ID8，5天ID9，7天VH1，然后M1直至实验结束
方案h：（exp169a，177SA181，CYP3A诱导）
1天ID7，1天ID1，5天ID2，7天VH1，然后M1直至实验结束
方案i：（exp153）
1天ID10，1天ID11，2天ID3，7天VH1，然后M1直至实验结束
方案a至e中所使用的详细的生长培养基组成
初始分化（ID）
Figure BDA00002789320500291
Figure BDA00002789320500301
肝祖细胞培养基
Figure BDA00002789320500302
成熟培养基
Figure BDA00002789320500303
图10.
3D支架中CYP活性的诱导
在用或不用1mM苯巴比妥和10μM地塞米松（诱导/未诱导）诱导24小时之后，通过测定咪达唑仑的代谢产物4-OH咪达唑仑来评价CYP3A和CYP2C9活性的诱导。在24小时诱导期间，从培养基组成M1中省去地塞米松、DMSO和Bio。在诱导之后，按照在别处所描述的执行活性分析（参见实施例6）。
图11a.
验证在接种到3D支架上之前培养在2D上的hESC细胞的胚胎内胚层命运。
在接种到3D支架上之前以2D形式培养7天的hESC细胞中内胚层标志物（FoxA2，HHex，CxcR4，CER1）的诱导和多能性标志物（Sox7，Nanog，Oct4）的下调；按照方案a）培养在基质胶涂覆的2D表面上的两种独立的细胞系（SA121和SA181）。还显示了细胞的明视野形态。
图11b.
验证在接种到3D支架上之前培养在2D上的iPS细胞的胚胎内胚层命运。
在接种到3D支架上之前以2D形式培养7天的iPS细胞中内胚层标志物（FoxA2，HHex，CxcR4，CER1）的诱导；按照方案h（exp169a）和f（exp169b）培养的细胞系IMR90。
图12.
验证在接种到3D支架上之前培养在2D上的hESC细胞的肝祖细胞命运。
在接种到3D支架上之前以2D形式培养11天的hESC细胞中肝祖细胞标志物（AFP，EpCAM，FOXA2，HNF4-a，KRT19，KRT8）的诱导；按照方案g）培养的细胞系SA121和SA181。
参考文献
Baharvand，H.等（2006）人类胚胎干细胞在体外2D和3D培养系统中分化成肝细胞（Differentiation of human embryonic stem cells intohepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro）.（2006）50：645-652
Berthiaume，F.等（1996）细胞外基质拓扑学对细胞结构、功能和生理响应性的作用：以夹心构造培养的肝细胞（Effect ofextracellularmatrix topology on cell structure，function，and physiologicalresponsiveness：hepatocytes cultured in a sandwich configuration）.FASEB J.10：1471-1484
Blumenthal，B.等（2010）接种有遗传工程改造的骨胳成肌细胞的聚氨酯支架：有希望的心肌功能再生工具（Polyurethane scaffoldsseeded with genetically engineered skeletal myoblasts：a promising tool toregenerate myocardial function）.Artif.Organs 34：E46-54
a.Bokhari，M.等（2007）在三维聚苯乙烯支架上培养HepG2肝细胞增强了毒理激惹期间的细胞结构和功能（Culture of HepG2 livercells on three dimensional polystyrene scaffolds enhances cell structureand function during toxicological challenge）.J.Anat.211:567-576
b.Bokhari，M.等（2007）能够三维细胞生长和提高细胞功能的新型细胞培养装置（Novel cell culture device enabling three-dimensionalcell growth and improved cell function）.Biochem.Biophys.Res.Commun.354：1095-1100
Dunn，J.C.等（1991）成人肝细胞在胶原蛋白夹心构造中的长期体外功能（Long term in vitro function of adult hepatocytes in a collagensandwich configuration）.Biotechnol.Prog.7：237-245
Dvir-Ginzberg，M.等（2003）在藻酸盐支架内的肝脏组织工程：细胞接种密度对肝细胞存活率、形态和功能的作用（Liver tissueengineering within alginate scaffolds：effects of cell-seeding density onhepatocyte viability，morphology and function）.Tissue Eng.9：757-766
Dvir-Ginzberg，M.等（2008）新生肝细胞在大孔藻酸盐支架中诱导分化和成熟为功能性肝组织（Induced differentiation and maturation ofnewborn liver cells into functional hepatic tissue in macroporous alginatescaffolds）.FASEB J.22：1440-1449
Elkayam，T.等（2006）通过在藻酸盐支架内的组织工程提高人类肝细胞系C3A-a的药物代谢活性（Enhancing the drug metabolismactivities of C3A-a human hepatocyte cell line-by tissue engineeringwithin alginate scaffolds）.Tissue Eng.12：1357-1368
Hamilton，G.A.等（2001）通过细胞外基质和细胞-细胞相互作用调节人类肝细胞中的细胞形态和细胞色素P450表达（Regulation of cellmorphology and cytochrome P450 expression in human hepatocytes byextracellular matrix and cell-cell interactions）.Cell Tissue Res.306：85-99
Heins，N.等（2004）人类胚胎干细胞的获得、表征和分化（Derivation,characterization,and differentiation of human embryonicstem cells）.Stem Cells 22：367-376
Matsumoto，K.等（2008）小鼠胚胎干细胞在使用聚氨酯泡沫的三维培养系统中的肝分化（Hepatic differentiation of mouse embryonicstem cells in a three-dimensional culture system using polyurethane foam）.J.Biosci.Bioeng.105：350-354
Piryaei，A.等（2010）骨髓来源的间充质干细胞在纳米纤维上分化为肝细胞样细胞以及它们被移植到四氯化碳诱导的肝脏纤维变性模型中（Differentiation of Bone Marrow-derived mesenchymal stem cellsinto hepatocyte-like cells on nanofibers and their transplantation into acarbon tetrachloride-induced liver fibrosis model）.Stem Cell Rev.Feb 25（Epub ahead of print）
Rambhatla，L.等（2003）从人类胚胎干细胞产生肝细胞样细胞（Generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells）.Cell Transplant 12：1-11
Shapiro，L和Cohen，S.（1997）用于细胞培养和移植的新型藻酸盐海绵（Novel alginate sponges for cell culture and transplantation）.Biomaterials 18：583-90
Takahashi，K.等（2007）通过限定的因素从成年人类成纤维细胞诱导多能干细胞（Induction of pluripotent stem cells from adult humanfibroblasts by defined factors）.Cell 131：861-872
Thomson，J.A.等（1998）来源于人胚囊的胚胎干细胞系（Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts）.Science282：1145-1 147
Wang，S.等（2008）在合成的自组装肽水凝胶中原代肝细胞的三维培养（Three-dimensional primary hepatocyte culture in syntheticself-assembling peptide hydrogel）.Tissue Eng.Part A14：227-236
Yu，J.等（2007）来源于人类体细胞的诱导性多潜能干细胞系（Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells）.Science 318：1917-1920

Claims (31)

1.用于将人类多能干细胞（hPS）或肝细胞前体细胞分化成肝细胞祖细胞、肝细胞样细胞或成熟肝细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
i）在2维表面上接种和生长hPS或肝细胞前体细胞以起始分化
ii）将步骤i）的初始分化的细胞转移到3维（3D）支架上用于进一步分化和成熟。
2.权利要求1的方法，其中细胞在3D支架上的接种密度高于在2D培养物上的接种密度，例如高三倍或高五倍或高十倍。
3.权利要求1的方法，其中在细胞存活因子例如ROCK Rho激酶抑制剂的存在下接种细胞。
4.前述权利要求任一项的方法，其中在无饲养细胞的条件下执行步骤i）或ii）中的至少一个。
5.前述权利要求任一项的方法，其中在无异源的条件下执行步骤i）或ii）中的至少一个。
6.前述权利要求任一项的方法，其中hPS细胞或肝细胞前体细胞是无异源的细胞，例如来源于无异源的hPS细胞系。
7.前述权利要求任一项的方法，其中hPS细胞是人类胚胎干（hES）细胞。
8.前述权利要求任一项的方法，其中hPS细胞是诱导的多能干（iPS）细胞。
9.权利要求1-6任一项的方法，其中肝细胞前体细胞是定型内胚层（DE）细胞。
10.权利要求1-6任一项的方法，其中肝细胞前体细胞不是定型内胚层（DE）细胞。
11.权利要求1-6任一项的方法，其中肝细胞前体细胞具有胚胎内胚层的特征。
12.权利要求1-6任一项的方法，其中肝细胞前体细胞具有肝内胚层的特征。
13.前述权利要求任一项的方法，其中在2至25天、例如4至15天之后，将步骤i）中获得的细胞转移到3D支架上（步骤ii）。
14.前述权利要求任一项的方法，其中3D支架选自下列之一：
i）多孔藻酸盐海绵
ii）可生物降解的聚氨酯脲（PUUR）聚合物
iii）乳液模板型聚苯乙烯
iv）合成纳米纤维复合物
v）具有至少一个非直立侧壁的微孔装置
vi）由聚L-乳酸[PLLA]制造的多孔海绵。
15.权利要求14的方法，其中3D支架是孔径为50-200μΜ的多孔藻酸盐海绵。
16.权利要求14的方法，其中3D支架是孔径在0.11000μΜ、例如15-45μΜ范围内的乳液模板型聚苯乙烯支架。
17.前述权利要求任一项的方法，其中3D支架是未涂覆的。
18.权利要求1-16任一项的方法，其中用一种或多种细胞外基质组分预先涂覆3D支架。
19.权利要求18的方法，其中一种或多种细胞外基质组分选自：明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白、聚赖氨酸、玻连蛋白、透明质酸、透明质酸水凝胶、丝纤蛋白、壳聚糖、或任何前述项的复合物。
20.前述权利要求任一项的方法，其中支架被包含在合适的培养容器内，所述培养容器例如多孔板，包括但不限于6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板、1536孔板，或其他合适的细胞培养容器。
21.前述权利要求任一项的方法，其中如由一种或多种CYP标志物例如CYP2C9或CYP3A的表达增加所显示的，肝细胞或肝细胞祖细胞表现出代谢活性升高。
22.前述权利要求任一项的方法，其中肝细胞或肝细胞祖细胞表现出一种或多种肝相关转运蛋白例如BSEP、FABP1、MRP2、NTCP、OATP2、OCT1的表达增加。
23.前述权利要求任一项的方法，其中肝细胞或肝细胞祖细胞与非肝细胞相比的比例大于5%，例如10%、例如20%、例如30%、例如40%、例如50%、例如60%、例如70%、例如80%、例如90%、例如100%。
24.前述权利要求任一项的方法，其中将肝细胞或肝细胞祖细胞与至少一种其他细胞类型共同培养在3D支架上，所述其他细胞类型选自但不限于：星形肝细胞、肝免疫（Kuppfer）细胞、肝内皮细胞、胆管上皮细胞或成纤维细胞。
25.hPS来源的肝细胞、肝细胞样细胞或肝细胞祖细胞，其显示出选自下列的肝细胞相关遗传标志物的水平升高：CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7、CYP7A1、MRP2、白蛋白、UGT2B7、AAT、TAT。
26.权利要求25的hPS来源的肝细胞、肝细胞样细胞或肝细胞祖细胞，其被培养在或已经被培养在3D支架中，并且当与生长在2D表面上的相应细胞相比时，显示出一种或多种以下标志物的水平升高：CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7、CYP7A1、MRP2、白蛋白、UGT2B7、AAT、TAT。
27.hPS来源的肝细胞或肝细胞祖细胞，其可通过权利要求1-24任一项描述的方法获得。
28.权利要求27的hPS来源的肝细胞或肝细胞祖细胞在治疗、再生医学、药物筛选、毒性测试或药物递送中的应用。
29.组合物，其包含可通过前述权利要求任一项描述的方法获得的hPS来源的肝细胞或肝细胞祖细胞。
30.权利要求29的组合物，其还包含3D支架，例如但不限于多孔藻酸盐海绵、可生物降解的聚氨酯脲（PUUR）聚合物、乳液模板型聚苯乙烯或合成纳米纤维复合物。
31.权利要求29-30任一项的组合物在治疗、再生医学、药物筛选、毒性测试或药物递送中的应用。
CN2011800372371A 2010-06-11 2011-06-14 用于提高多能干细胞分化成肝细胞的3维支架 Pending CN103097517A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35367810P 2010-06-11 2010-06-11
DKPA201000515 2010-06-11
DKPA201000515 2010-06-11
US61/353,678 2010-06-11
PCT/EP2011/059773 WO2011154552A1 (en) 2010-06-11 2011-06-14 3-dimensional scaffolds for improved differentiation of pluripotent stem cells to hepatocytes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103097517A true CN103097517A (zh) 2013-05-08

Family

ID=42309459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011800372371A Pending CN103097517A (zh) 2010-06-11 2011-06-14 用于提高多能干细胞分化成肝细胞的3维支架

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9127255B2 (zh)
EP (1) EP2580319B1 (zh)
JP (2) JP6025715B2 (zh)
CN (1) CN103097517A (zh)
AU (1) AU2011263652B2 (zh)
CA (1) CA2805165A1 (zh)
WO (1) WO2011154552A1 (zh)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104782583A (zh) * 2015-04-29 2015-07-22 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种棘球蚴体外三维培养模型及其应用
CN106075586A (zh) * 2016-07-19 2016-11-09 东华大学 基于成体干细胞‑再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法
CN106459895A (zh) * 2014-04-15 2017-02-22 银丝佛若有限公司 制备用于3d组织培养的细胞的方法
WO2017219232A1 (zh) * 2016-06-21 2017-12-28 江苏大学 一种基于三维体系的细胞重编程方法
CN107532144A (zh) * 2015-02-20 2018-01-02 国家健康科学研究所 层粘连蛋白用于使多能细胞分化成肝细胞谱系细胞的用途
CN107904207A (zh) * 2017-11-13 2018-04-13 广东艾时代生物科技有限责任公司 一种利用三维培养系统诱导人诱导性多能干细胞获得成熟肝细胞的方法
CN110213964A (zh) * 2016-11-22 2019-09-06 纽泰克温图斯公司 利用封闭微型细胞培养系统的个体化细胞生物制备
CN110431225A (zh) * 2017-03-10 2019-11-08 默克专利股份公司 受感染的细胞培养物
WO2020056935A1 (zh) * 2018-09-20 2020-03-26 中国人民解放军第二军医大学 用于乙肝病毒感染的原代肝细胞来源的肝前体样细胞模型、制备方法及应用
CN111467579A (zh) * 2020-04-03 2020-07-31 北京臻溪谷医学研究中心（有限合伙） 基于合金内核的治疗动脉瘤与血管狭窄用干细胞支架及其制法

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130280804A1 (en) * 2010-12-31 2013-10-24 Stephen Dalton Differentiation of human pluripotent stem cells to multipotent neural crest cells
US9157908B2 (en) 2011-04-22 2015-10-13 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Chitosan-alginate scaffold cell culture system and related methods
JP6024047B2 (ja) * 2012-06-04 2016-11-09 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞の培養方法及びそのための基材
USD933584S1 (en) 2012-11-08 2021-10-19 Sunpower Corporation Solar panel
USD1009775S1 (en) 2014-10-15 2024-01-02 Maxeon Solar Pte. Ltd. Solar panel
US10183097B2 (en) 2013-11-27 2019-01-22 The Johns Hopkins University Engineered cardiac derived compositions and methods of use
JP6791756B2 (ja) * 2014-01-21 2020-11-25 ザ メディカル カレッジ オブ ウィスコンシン インクＴｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｉｎｃ． 多能性幹細胞の選択的な阻害のための方法
SG11201609916RA (en) 2014-05-30 2016-12-29 Kuraray Co Culture method and cell mass
USD999723S1 (en) 2014-10-15 2023-09-26 Sunpower Corporation Solar panel
USD896747S1 (en) 2014-10-15 2020-09-22 Sunpower Corporation Solar panel
USD913210S1 (en) 2014-10-15 2021-03-16 Sunpower Corporation Solar panel
USD933585S1 (en) 2014-10-15 2021-10-19 Sunpower Corporation Solar panel
WO2016104541A1 (ja) * 2014-12-24 2016-06-30 国立大学法人京都大学 内胚葉系細胞の製造方法、肝臓細胞の製造方法、膵臓細胞の製造方法、内胚葉系細胞の誘導促進剤、肝臓細胞の誘導促進キット、膵臓細胞の誘導促進キット、およびマイクロ流体デバイス
US20180147242A1 (en) * 2015-03-18 2018-05-31 The University Of Tokyo Hepatocytes and hepatic non-parenchymal cells, and methods for preparation thereof
US11732241B2 (en) 2015-10-15 2023-08-22 Wake Forest University Health Sciences Methods of producing in vitro liver constructs and uses thereof
EP3397753B1 (en) * 2015-12-30 2021-10-27 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Microtissue formation using stem cell-derived human hepatocytes
EP3414319A4 (en) * 2016-02-10 2019-08-28 Wake Forest University Health Sciences HEPATIC FIBROSIS MODEL SYSTEM AND METHOD FOR MANUFACTURING AND USING SAME
JP6711424B2 (ja) 2017-02-01 2020-06-17 株式会社島津製作所 細胞培養用ゲル組成物およびその製造方法、細胞培養方法ならびに細胞培養用基板
WO2018182356A1 (ko) * 2017-03-31 2018-10-04 (주)안트로젠 중간엽줄기세포 유래 고순도, 고농도 엑소좀을 포함하는 배양액 및 이의 제조방법
US11407979B2 (en) 2017-09-01 2022-08-09 Colorado State University Research Foundation Intermittent starvation techniques to prolong functional lifetime of liver cells in culture
WO2020186221A1 (en) * 2019-03-14 2020-09-17 Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute Biodegradable scaffold for hair growth and methods of use therefor
JP7354270B2 (ja) * 2019-09-30 2023-10-02 富士フイルム株式会社 肝細胞を培養するための培地、肝細胞の製造方法および肝細胞
WO2021200235A1 (ja) * 2020-03-31 2021-10-07 国立大学法人 東京大学 ３次元腸組織モデルの作製方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1844373A (zh) * 2006-04-28 2006-10-11 华东理工大学 由脐带血造血干细胞体外诱导肝细胞生成的方法
CN101428154A (zh) * 2008-12-04 2009-05-13 浙江大学 一种植入式人工肝脏

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05308953A (ja) * 1992-05-13 1993-11-22 Asahi Medical Co Ltd 細胞培養膜
US7282366B2 (en) 2000-04-27 2007-10-16 Geron Corporation Hepatocytes for therapy and drug screening made from embryonic stem cells
JP2007000038A (ja) * 2005-06-22 2007-01-11 Toray Ind Inc 閉鎖系循環回路型培養装置
MX2008013885A (es) 2006-04-28 2009-02-11 Reinnervate Ltd Substrato para el crecimiento de celulas cultivadas en tres dimensiones.
US20110086375A1 (en) 2007-03-02 2011-04-14 Mark Ungrin Devices and methods for production of cell aggregates
WO2008112904A2 (en) 2007-03-15 2008-09-18 Invitrogen Corporation Adhering surfaces
JP5620631B2 (ja) * 2007-05-23 2014-11-05 三菱レイヨン株式会社 細胞培養用足場材料、その製造方法、細胞培養用モジュール
EP2179034A1 (en) * 2007-07-20 2010-04-28 Cellartis AB A novel population of hepatocytes derived via definitive endoderm (de-hep) from human blastocysts stem cells
EP2183289A2 (en) 2007-08-31 2010-05-12 Corning Incorporated Reactive surface on a polymeric substrate
GB0817990D0 (en) 2008-10-02 2008-11-05 Reinnervate Ltd Cell culture vessel
US20100297675A1 (en) 2008-11-24 2010-11-25 Huayun Deng Substrate and method for culturing breast cells
EP2443230B1 (en) * 2009-06-18 2017-07-26 Takara Bio Europe AB 3D CULTURING SYSTEMS FOR GROWTH AND DIFFERENTIATION OF HUMAN PLURIPOTENT STEM (hPS) CELLS

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1844373A (zh) * 2006-04-28 2006-10-11 华东理工大学 由脐带血造血干细胞体外诱导肝细胞生成的方法
CN101428154A (zh) * 2008-12-04 2009-05-13 浙江大学 一种植入式人工肝脏

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BENJAMIN C.U. TAI等: "The use of a polyelectrolyte fibrous scaffold to deliver differentiated hMSCs to the liver", 《BIOMATERIALS》, vol. 31, no. 1, 31 January 2010 (2010-01-31), pages 28 - 57, XP002591585, DOI: doi:10.1016/j.biomaterials.2009.09.022 *
HOSSEIN BAHARVAND等: "Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF DEVELOPMENTAL BIOLOGY》, vol. 50, no. 7, 31 December 2006 (2006-12-31), pages 645 - 652, XP002591586, DOI: doi:10.1387/ijdb.052072hb *
JUSTIN G LEES等: "Transplantation of 3D scaffolds seeded with human embryonic stem cells: biological features of surrogate tissue and teratoma-forming potential", 《REGENERATIVE MED》, vol. 2, no. 3, 31 May 2007 (2007-05-31), pages 289 - 300, XP002591584, DOI: doi:10.2217/17460751.2.3.289 *
WILLIAM S. TURNER等: "Human Hepatoblast Phenotype Maintained by Hyaluronan Hydrogels", 《JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH》, vol. 82, no. 1, 31 July 2007 (2007-07-31), pages 156 - 168, XP002591587, DOI: doi:10.1002/jbm.b.30717 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106459895B (zh) * 2014-04-15 2021-06-01 银丝佛若有限公司 制备用于3d组织培养的细胞的方法
CN106459895A (zh) * 2014-04-15 2017-02-22 银丝佛若有限公司 制备用于3d组织培养的细胞的方法
CN107532144A (zh) * 2015-02-20 2018-01-02 国家健康科学研究所 层粘连蛋白用于使多能细胞分化成肝细胞谱系细胞的用途
CN104782583A (zh) * 2015-04-29 2015-07-22 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种棘球蚴体外三维培养模型及其应用
WO2017219232A1 (zh) * 2016-06-21 2017-12-28 江苏大学 一种基于三维体系的细胞重编程方法
CN110312788A (zh) * 2016-06-21 2019-10-08 江苏大学 一种基于三维体系的细胞重编程方法
CN106075586B (zh) * 2016-07-19 2019-05-24 东华大学 基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法
CN106075586A (zh) * 2016-07-19 2016-11-09 东华大学 基于成体干细胞‑再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法
CN110213964A (zh) * 2016-11-22 2019-09-06 纽泰克温图斯公司 利用封闭微型细胞培养系统的个体化细胞生物制备
CN110431225A (zh) * 2017-03-10 2019-11-08 默克专利股份公司 受感染的细胞培养物
CN110431225B (zh) * 2017-03-10 2024-04-12 默克专利股份公司 受感染的细胞培养物
CN107904207A (zh) * 2017-11-13 2018-04-13 广东艾时代生物科技有限责任公司 一种利用三维培养系统诱导人诱导性多能干细胞获得成熟肝细胞的方法
WO2020056935A1 (zh) * 2018-09-20 2020-03-26 中国人民解放军第二军医大学 用于乙肝病毒感染的原代肝细胞来源的肝前体样细胞模型、制备方法及应用
CN111467579A (zh) * 2020-04-03 2020-07-31 北京臻溪谷医学研究中心（有限合伙） 基于合金内核的治疗动脉瘤与血管狭窄用干细胞支架及其制法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2011263652B2 (en) 2014-11-20
US9127255B2 (en) 2015-09-08
AU2011263652A1 (en) 2013-01-24
WO2011154552A1 (en) 2011-12-15
JP2013532966A (ja) 2013-08-22
US20130336933A9 (en) 2013-12-19
JP2016171820A (ja) 2016-09-29
JP6025715B2 (ja) 2016-11-16
US20130164266A1 (en) 2013-06-27
EP2580319B1 (en) 2016-07-20
EP2580319A1 (en) 2013-04-17
CA2805165A1 (en) 2011-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103097517A (zh) 用于提高多能干细胞分化成肝细胞的3维支架
Badenes et al. Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems
CN102083967B (zh) 经由定型内胚层(DE-hep)衍生自人胚泡衍生干细胞的新肝细胞群体
Talkhabi et al. Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art
Jensen et al. Human embryonic stem cell technologies and drug discovery
Ruoß et al. Towards improved hepatocyte cultures: Progress and limitations
Azarin et al. Development of scalable culture systems for human embryonic stem cells
CN101605885B (zh) 能够使多能干细胞增殖的组合物及方法
Szkolnicka et al. Concise review: advances in generating hepatocytes from pluripotent stem cells for translational medicine
US8278105B2 (en) Induction, propagation and isolation of liver progenitor cells
US20180305669A1 (en) Microtissue formation using stem cell-derived human hepatocytes
Lewandowski et al. Techniques for the induction of human pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes
Chen et al. Developmental insights from early mammalian embryos and core signaling pathways that influence human pluripotent cell growth and differentiation
Thompson et al. Human liver model systems in a dish
Khademhosseini et al. Embryonic stem cells as a cell source for tissue engineering
WO2014168157A1 (ja) 肝幹前駆様細胞の培養方法及びその培養物
KR20130131363A (ko) 기질에 대한 세포의 결합을 제어하기 위한 방법
Lee et al. Clump-passaging-based efficient 3D culture of human pluripotent stem cells under chemically defined conditions
Vallabhaneni et al. Suspension culture on microcarriers and as aggregates enables expansion and differentiation of pluripotent stem cells (PSCs)
Class et al. Patent application title: 3-DIMENSIONAL SCAFFOLDS FOR IMPROVED DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT STEM CELLS TO HEPATOCYTES Inventors: Janne Jensen (Gothenburg, SE) Assignees: Cellartis AB
Pettinato et al. Human embryoid bodies to hepatocyte-like clusters: Preparing for translation
Launonen In vitro hepatocyte co-culture methods
Radhakrishnan et al. Charting the explicit path: Translational dynamics of hepatic bioengineering from experimental benchmarks to practical bedside applications. Medliber Regener Med. 2024; 2 (1): 1-18. Subathra Radhakrishnan1
WO2022254961A1 (ja) 幹細胞を作製するための細胞培養補助剤、及び幹細胞の作製方法
Mesquita et al. Strategies for iPSC expansion: from feeder cells to laminin

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20130508