CN104782583A - 一种棘球蚴体外三维培养模型及其应用 - Google Patents

一种棘球蚴体外三维培养模型及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种棘球蚴体外三维培养模型及其应用。本发明所提供的用于培养棘球蚴的模型，包括培养池和设于所述培养池内的三维胶原支架；所述三维胶原支架上负载有饲养细胞；所述饲养细胞为原代肝实质细胞和骨髓间充质干细胞；所述培养池内含有生物培养液；所述生物培养液为用于培养所述棘球蚴和所述饲养细胞的溶液。利用本发明公开的棘球蚴体外三维培养模型可以研究棘球蚴的发育过程，并且利用该模型可对三维胶原支架中的宿主细胞和寄生虫组织细胞进行免疫荧光染色观察、电镜检测及RT-PCR分析，实现棘球蚴体外长期培养及发育相关研究，与现有的棘球蚴培养模型相比，具有显著的进步。

Description

一种棘球蚴体外三维培养模型及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种棘球蚴体外三维培养模型及其应用。
背景技术
多房棘球蚴病，又称泡型包虫病或泡球蚴病，是由棘球属中的多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)的幼虫——多房棘球蚴寄生于动物及人体内所致的一种严重影响人和动物健康的人兽共患寄生虫病，是人类最致命的蠕虫感染病之一，因患者死亡率高而有“虫癌”之称。目前，对该病的研究主要通过实验动物模型和原头蚴体外培养模型实现。动物模型是实验室对棘球绦虫传代保种的重要方法，该模型已被用于宿主-寄生虫的免疫学和分子相互作用的研究，各种潜在抗寄生虫药物的评估，绦虫cDNA文库的建立等。然而，因为动物模型的封闭性，宿主-寄生虫的相互紧密联系和相互作用的复杂性，使得实验动物模型不适合寄生虫组分分析和寄生虫自身生理学研究，不能用于幼虫分化的相关调节因素的分析，也不能用于寄生虫组分在宿主-寄生虫相互作用中的特殊功能分析及基因表达和调控的精细研究。因此，需要一个便于在分子水平上研究棘球蚴生物学特性的工具或模型，即可以在体外模拟寄生虫-宿主相互作用的模型。
棘球蚴为圆形囊状体，由囊壁(角质层、生发层)和囊内含物(生发囊、原头蚴、囊液等)组成，寄生于宿主的肝脏、肺、腹腔等内脏器官。原头蚴从囊内释放后可发育为棘球蚴或者成虫，即原头蚴具有双向发育能力，在不同宿主体内发育分化方向不同：在绵羊、人等中间宿主的体内，原头蚴向无性繁殖方向分化，形成包囊，发育为含有原头蚴的棘球蚴；在犬科动物等终末宿主体内，原头蚴向有性繁殖方向分化，形成可产卵的成虫，而中间宿主经口吞食的虫卵又可发育为棘球蚴。
目前报道的体外培养棘球蚴的方法，是将分离自小鼠的感染组织中的棘球蚴小包囊或原头蚴与单层培养的饲养细胞(二维空间的培养)在添加了胎牛血清的培养基中共培养，而原头蚴的生长、增殖所需的因子均依赖异源饲养细胞提供。饲养细胞可分为两种：(1)永生化细胞系，如Caco2、HepG2、Reuber RH-、CHO、HeLa、CCL-2、HEK293和SH-SY5Y细胞等；(2)原代培养细胞，主要为肝实质细胞。其中，肝实质细胞共培养体系更利于原头蚴的体外培养，肝实质细胞释放的可溶性低分子量因子更利于原头蚴的发育。
传统的肝细胞培养是在非自然条件下二维空间的培养，在培养几个小时内便会丧失其缝隙连接，一周后即迅速失去特异性肝细胞功能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于培养棘球蚴的体外三维培养模型。
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种用于培养棘球蚴的模型。
本发明所提供的用于培养棘球蚴的模型，包括培养池和设于所述培养池内的三维胶原支架；所述三维胶原支架上负载有饲养细胞；所述饲养细胞为原代肝实质细胞和骨髓间充质干细胞；所述培养池内含有生物培养液；所述生物培养液为用于培养所述棘球蚴和所述饲养细胞的溶液。
所述三维胶原支架的材料为Ⅰ型胶原蛋白，具有孔状结构，孔的直径为30-200μm。具体可按照文献(Chen L,Xiao Z,Meng Y,Zhao Y,Han J,Su G,Chen B,Dai J.Theenhancement of cancer stem cell properties of MCF-7cells in 3D collagen scaffolds formodeling of cancer and anti-cancer drugs.Biomaterials.2012，33(5):1437-1444.)报道的方法制备。
所述饲养细胞中所述原代肝实质细胞和所述骨髓间充质干细胞的数量比为(10-50)：1，具体为50:1。
所述饲养细胞的制备包括如下步骤：用所述生物培养液配制所述原代肝实质细胞的单细胞悬液，记作悬液A；用所述生物培养液配制所述骨髓间充质干细胞的单细胞悬液，记作悬液B；将所述悬液A和所述悬液B混合得到所述饲养细胞。
所述三维胶原支架为细胞培养基浸泡过的三维胶原支架，具体为DMEM培养基浸泡过的三维胶原支架。
所述生物培养液由溶剂和溶质组成；所述溶剂为低糖DMEM培养基，所述溶质为胎牛血清、青霉素、链霉素、胰岛素、肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子、维生素C、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸和L-谷氨酰胺；所述胎牛血清在所述生物培养液中的体积百分含量为8％～10％(如10％)，所述青霉素在所述生物培养液中的浓度为80U/mL～120U/mL(如100U/mL)，所述链霉素在所述生物培养液中的浓度为80U/mL～120U/mL(如100U/mL)，所述肝细胞生长因子在所述生物培养液中的浓度为0.8ng/mL～1.2ng/mL(如1.0ng/mL)，所述维生素C在所述生物培养液中的浓度为0.15mmol/L～0.25mmol/L(如0.2mmol/L)，所述脯氨酸在所述生物培养液中的浓度为1.12mmol/L～1.2mmol/L(如1.16mmol/L)，所述组氨酸在所述生物培养液中的浓度为0.16mmol/L～0.2mmol/L(如0.18mmol/L)，所述赖氨酸在所述生物培养液中的浓度为1.32mmol/L～1.4mmol/L(如1.36mmol/L)，所述L-谷氨酰胺在所述生物培养液中的浓度为250mg/L～350mg/L(如300mg/L)。
所述肝细胞生长因子具体为Pepro Tech公司产品，产品目录号为100-39。
所述表皮细胞生长因子具体为Sigma公司产品，产品目录号为E4127。
在本发明的一个实施例中，所述培养池具体为24孔培养板。相应的，所述三维胶原支架的形状如下：厚1mm，直径5mm的圆片。
本发明所提供的用于培养棘球蚴的模型具体是按照如下方法制备的。具体的制备方法也属于本发明的保护范围。
制备所述用于培养棘球蚴的模型的方法，具体可包括如下步骤：将所述三维胶原支架用细胞培养基(如DMEM培养基)浸泡，再将其置于所述培养池内，将所述饲养细胞接种于所述三维胶原支架上，在所述培养池内加入所述生物培养液，得到所述模型。
所述方法中，在所述“将所述饲养细胞接种于所述三维胶原支架上”和所述“在所述培养池内加入所述生物培养液”的步骤之间还包括对接种了所述饲养细胞的所述三维胶原支架进行孵育的步骤。
所述孵育的条件为：37℃细胞培养箱静置；具体为37℃细胞培养箱静置1.5～3h，更具体为37℃细胞培养箱静置2h。
本发明还提供了一种培养棘球蚴的方法。
本发明所提供的培养棘球蚴的方法，具体可包括如下步骤：将原头蚴接种于所述模型中进行培养。
接种时，既可以直接接种于所述培养池中(所述三维胶原支架外)，也可以接种于所述三维胶原支架内。
在将所述原头蚴接种于所述模型中进行培养之前，还包括将培养所述模型中的饲养细胞的步骤。
所述“培养所述模型中的饲养细胞”，具体为：将所述模型置于37℃细胞培养箱内培养所述饲养细胞2～4天。
本发明还提供了一种用于培养棘球蚴的系统。
本发明所提供的用于培养棘球蚴的系统，包含培养池、能够设于所述培养池内的三维胶原支架，以及原代肝实质细胞和骨髓间充质干细胞。
其中，所述原代肝实质细胞和所述骨髓间充质干细胞可以分别独立包装，也可以按照数量比为(10～50)：1，具体如50:1的比例混合包装。
所述系统中还可包含所述生物培养液；
所述系统中还可包含记载在可读载体上的使用说明，说明中记载内容为上述培养棘球蚴的方法。
所述模型或所述系统在培养棘球蚴和/或在研究棘球蚴发育过程中的应用也属于本发明的保护范围。
所述培养棘球蚴的方法在研究棘球蚴发育过程中的应用也属于本发明的保护范围。
在本发明中，所述饲养细胞为所述棘球蚴提供促进其生长和/或发育的因子。
所述原代肝实质细胞和所述骨髓间充质干细胞为来源于哺乳动物(如啮齿动物)的原代肝实质细胞和骨髓间充质干细胞；所述啮齿动物首选为棘球蚴的中间宿主。在本发明中，所述原代肝实质细胞和所述骨髓间充质干细胞具体为鼠源原代肝实质细胞和鼠源骨髓间充质干细胞。
本发明提供的棘球蚴体外三维培养模型用原代肝实质细胞与骨髓间充质干细胞作为棘球蚴体外培养的饲养细胞实现棘球蚴体外三维共培养。
本发明提供的棘球蚴体外三维培养模型具有如下优点：
(1)相比于传统的肝细胞培养，该模型中的原代肝实质细胞显示了更好的肝细胞功能维持效果，效果是肝细胞分泌白蛋白和EROD酶的浓度更高，合成尿素的浓度更高，最高可达到传统培养的2倍以上；维持白蛋白和EROD酶分泌的时间延长到培养的第27天，合成高浓度尿素的时间延长到培养的第21天。
(2)相比于传统的肝细胞培养，该模型更能模拟棘球蚴在宿主体内的生活环境，可以用于研究棘球蚴的发育过程，如棘球蚴原头蚴发育至包囊过程的观察，并且可以进一步对三维胶原支架中的宿主细胞和寄生虫组织细胞进行免疫荧光染色观察、电镜检测及RT-PCR分析等，实现棘球蚴体外长期培养及发育相关研究。
附图说明
图1为肝实质细胞、骨髓间充质干细胞在三维胶原支架培养的观察结果。
图2为三维胶原支架中生长的肝实质细胞与骨髓间充质干细胞免疫荧光抗体染色图。
图3为肝实质细胞白蛋白分泌、EROD酶分泌及尿素合成分析。
图4为三维胶原支架中培养的肝实质细胞相关基因的RT-PCR产物电泳图。
图5为原头蚴与三维胶原支架中肝实质细胞-骨髓间充质干细胞共培养后发育为包囊。
图6为原头蚴与三维胶原支架中肝实质细胞-骨髓间充质干细胞共培养发育成的包囊与原头蚴的差异基因火山图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。
肝细胞生长因子：Pepro Tech公司产品，产品目录号：100-39。
表皮细胞生长因子具体为Sigma公司产品，产品目录号为E4127。
完全培养液：该完全培养液由溶剂和溶质组成；溶剂为低糖DMEM培养基，溶质为胎牛血清、青霉素、链霉素、胰岛素、肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子、维生素C、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸和L-谷氨酰胺；所述胎牛血清在完全培养液中的体积百分含量为10％，所述青霉素在完全培养液中的浓度为100U/mL，所述链霉素在完全培养液中的浓度为100U/mL，所述胰岛素在完全培养液中的浓度为2μg/mL，所述肝细胞生长因子在完全培养液中的浓度为1ng/mL，所述表皮细胞生长因子在所述生物培养液中的浓度为10ng/mL，所述维生素C在完全培养液中的浓度为0.2mmol/L，所述脯氨酸在所述生物培养液中的浓度为1.16mmol/L，所述组氨酸在所述生物培养液中的浓度为0.18mmol/L，所述赖氨酸在所述生物培养液中的浓度为1.36mmol/L，所述L-谷氨酰胺在完全培养液中的浓度为300mg/L。该完全培养液既可以用于培养鼠源原代肝实质细胞和骨髓间充质干细胞，又可以培养原头蚴。
SD大鼠：由兰州大学医学实验中心提供。
下述实施例中的三维胶原支架的材料为Ⅰ型胶原蛋白，具有孔状结构，孔的直径为30-200μm，按照文献(Chen L,Xiao Z,Meng Y,Zhao Y,Han J,Su G,Chen B,Dai J.Theenhancement of cancer stem cell properties of MCF-7cells in 3D collagen scaffolds formodeling of cancer and anti-cancer drugs.Biomaterials.2012，33(5):1437-1444.)报道的方法制备。具体步骤如下：将胶原蛋白膜(购自烟台正海生物技术有限公司，海奥生物膜)浸入装有0.5mol/L醋酸溶液的三角烧杯中，在4℃静置8h，随后将该溶液用磁力搅拌器搅拌，4mol/L NaOH调节溶液pH值至7.0～7.5，将该溶液置于透析袋中，在4℃条件下用去离子水透析后冻干，切成厚1mm，直径5mm的圆片，随后将圆片用1mg/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、0.6mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺进行交联处理，处理后重新冻干并用Co60辐照消毒，置于4℃冰箱储存、备用。
特异性抗体CK8和特异性抗体CD44均购自Abcam公司产品，产品目录号分别为ab137855和ab119348。
实施例1、棘球蚴体外三维培养模型的制备及检测
一、棘球蚴体外三维培养模型的制备
(一)鼠源原代肝实质细胞的制备
按照文献(Seglen PO.Preparation of isolated rat liver cells.Methods Cell Biol,1976,13:29-83.)报道的方法制备鼠源原代肝实质细胞，具体步骤如下：按照200mg/kg体重的剂量将巴比妥钠注射到SD大鼠腹腔进行麻醉；用体积百分含量为75％的乙醇水溶液将大鼠进行全身消毒，无菌剖开腹腔，暴露肝脏，肝门静脉和下腔静脉分别穿刺并结扎，用37℃预温并氧气饱和的无钙灌流缓冲液灌注10min，流速为4～5mL/min，随后用37℃预温的5mg/L胶原酶溶液灌注约10min，流速为4～5mL/min；取出肝脏小叶，剪碎小叶包膜，加入预温的胶原酶液，轻轻吹打离散的细胞，用200目钢网过滤，滤液中含有鼠源原代肝实质细胞；在鼠源原代肝实质细胞中添加PBS，离心洗涤2次(转速50g)，最后添加完全培养液制备鼠源原代肝实质细胞单细胞悬液并计数备用。
(二)骨髓间充质干细胞的制备
按照文献(Haidara MA,Assiri AS,Youssef MA,Mahmoud MM,Ahmed M SE,Al-Hakami A,Chandramoorthy HC.Differentiated mesenchymal stem cells amelioratecardiovascular complications in diabetic rats.Cell Tissue Res,2015,359:565-575.)报道的方法制备骨髓间充质干细胞，具体步骤如下：将SD大鼠处死后无菌条件下取胫骨和股骨，将其两端干骺端切除，显露骨髓腔，用添加胎牛血清的DMEM冲洗骨髓腔，使骨髓细胞充分分散制成骨髓单细胞悬液，将所获得的骨髓单细胞悬液用Percoll细胞分离液离心分离后吸取中间细胞层，即为骨髓间充质干细胞。将分离得到的骨髓间充质干细胞用完全培养液洗涤，最后添加完全培养液制备骨髓间充质干细胞单细胞悬液并计数备用。
(三)棘球蚴体外三维培养
将三维胶原支架用DMEM培养基浸泡过夜后取出，用滤纸将该支架上黏附的多余的DMEM培养基吸除，将该支架放置于24孔板的孔内；将步骤(一)制备的含有1×106个原代肝实质细胞的原代肝实质细胞单细胞悬液和步骤(二)制备的含有2×104个骨髓间充质干细胞的骨髓间充质干细胞单细胞悬液混匀得到30μL左右的混合液，将该混合液接种于24孔板的每个三维胶原支架上，37℃孵箱(细胞培养箱)内静置2h后，在24孔板的每孔中加入2mL完全培养液培养2～4天，再将200个原头蚴接种于放置该三维胶原支架的24孔板的孔中共培养，每间隔3天对孔中的完全培养液进行半量换液(或者“接种于该三维胶原支架上进行共培养”。当将原头蚴接种于三维胶原支架上培养时，在原头蚴发育成包囊的过程中会从支架上脱离下来，与支架上的饲养细胞分离)。该培养模型即为棘球蚴体外三维培养模型，在该模型中原代肝实质细胞和骨髓间充质干细胞共同作为饲养细胞。
该棘球蚴体外三维培养模型包括培养池和设于该培养池内的三维胶原支架，该三维胶原支架上负载有饲养细胞，饲养细胞为原代肝实质细胞和骨髓间充质干细胞，饲养细胞的制备具体为将步骤(一)制备的含有1×106个原代肝实质细胞的原代肝实质细胞单细胞悬液和步骤(二)制备的含有2×104个骨髓间充质干细胞的骨髓间充质干细胞单细胞悬液混匀得到的30μL左右的混合液，培养池内含有完全培养液。
二、棘球蚴体外三维培养模型中饲养细胞的检测
(一)饲养细胞形态的观察
将棘球蚴体外三维培养模型每间隔3天对培养池中的完全培养液进行半量换液，在37℃、5％CO2培养箱中培养第21天，取出三维胶原支架将其放入体积百分含量为2％戊二醛的磷酸盐缓冲溶液固定，得到固定的三维胶原支架及饲养细胞，对其进行扫描电镜观察。
肝实质细胞、骨髓间充质干细胞在三维胶原支架培养的观察结果如图1所示。
图1中，A为三维胶原支架；B为扫描电镜显示的三维胶原支架的超微结构；C为扫描电镜显示的三维胶原支架中的培养的肝实质细胞和骨髓间充质干细胞表面形态。
图1中C表明，肝实质细胞和骨髓间充质干细胞在三维胶原支架上紧密生长，细胞形态呈圆形及梭状。
(二)饲养细胞的特异性鉴定
用特异性抗体CK8和特异性抗体CD44对步骤(一)固定的三维胶原支架进行免疫荧光抗体染色鉴定饲养细胞。其中，特异性抗体CK8将肝实质细胞特异标记为绿色，特异性抗体CD44对骨髓间充质干细胞特异标记为红色。
三维胶原支架中生长的肝实质细胞与骨髓间充质干细胞免疫荧光抗体染色图如图2所示。
图2表明，三维胶原支架上生长的细胞团含有特异性表达CK8的肝实质细胞和特异性表达CD44的骨髓间充质干细胞。
实施例2、棘球蚴体外三维培养模型中肝实质细胞功能的研究
对实施例1得到的棘球蚴体外三维培养模型的肝实质细胞的功能进行分析，包括如下检测：
(1)白蛋白检测：定期收集棘球蚴体外三维培养模型中的培养液，并离心(100g，5min)后取培养液上清液(无细胞成分)，用Albumin ELISA Quantitation Kit(BethylLaboratories,Inc产品,产品目录号为E110-125)试剂盒检测肝实质细胞分泌的白蛋白含量。具体操作参照试剂盒说明书进行。
(2)7-乙氧基-3-异吩恶唑酮-脱乙基酶(EROD)检测：定期在37℃、5％CO2培养箱中培养的棘球蚴体外三维培养模型的完全培养液中添加7-乙氧基异吩恶唑(终浓度为39.2mmol/L)，孵育6h后收集培养液，并离心(100g，5min)，得到的培养液上清液，根据文献报道的方法检测肝实质细胞分泌的EROD含量(Du Y,Han R,Wen F,Ng San San S，Xia L，Wohland T，Leo HL，Yu H.Synthetic sandwich culture of 3Dhepatocyte monolayer.Biomaterials,2008,29(3):290-301.)。具体操作参照文献中记载进行。
(3)尿素检测：定期在37℃、5％CO2培养箱中培养的棘球蚴体外三维培养模型的完全培养液中添加NH4Cl(终浓度为2mmol/L)，孵育4h后收集培养液，并离心(100g，5min)，得到的培养液上清液，用QuantiChrom TM Urea Assay Kit(Bio-Assay Systems,USA,产品目录号为DRUR-500)试剂盒检测肝实质细胞分泌的尿素含量。具体操作参照试剂盒说明书进行。
将实施例1中步骤(一)制备的含有1×106个原代肝实质细胞的原代肝实质细胞单细胞悬液和实施例1中步骤(二)制备的含有2×104个骨髓间充质干细胞的骨髓间充质干细胞单细胞悬液混匀得到30μL左右的混合液，将其接种于预先用鼠尾胶原蛋白处理的24孔板的每个孔中，再在每孔中加入2mL完全培养液培养2天，再将200个原头蚴接种于24孔板的孔中共培养，得到棘球蚴体外二维培养模型，作为对照。将与上述棘球蚴体外三维培养模型培养天数相同的棘球蚴体外二维培养模型进行上述同样的白蛋白检测、EROD检测和尿素检测。
肝实质细胞白蛋白分泌、EROD酶分泌及尿素合成分析检测结果如图3所示。
图3中，2D代表棘球蚴体外二维培养模型，3D代表棘球蚴体外三维培养模型。
图3表明，棘球蚴体外三维培养模型的三维胶原支架上与骨髓间充质干细胞共培养的肝实质细胞在培养过程中分泌的白蛋白、EROD及尿素合成浓度均分别高于棘球蚴体外二维培养模型的肝实质细胞在培养过程中分泌的白蛋白、EROD及尿素合成浓度，且分泌和合成功能持续的时间更长。
实施例3、棘球蚴体外三维培养模型与棘球蚴体外二维培养模型的比较
一、棘球蚴体外三维培养模型中肝实质细胞的功能基因的表达检测
将实施例1中步骤一制备的棘球蚴体外三维培养模型，从培养第3天开始每间隔4天收集三维胶原支架上培养的细胞(即肝实质细胞与骨髓间充质干细胞)，提取不同时间点收集的肝实质细胞与骨髓间充质干细胞的RNA，并反转录为cDNA，分别以不同时间点的肝实质细胞与骨髓间充质干细胞的cDNA为模板，分别以AFP F和AFP R、G6P F和G6P R、α1-AT F和α1-AT R为引物，进行实时定量PCR，对应检测肝实质细胞中的功能基因AFP、G6P、α1-AT的表达情况，以GAPDH为内参基因。
AFP F：5’-CGT TAG ATT CCT CCC AGT G-3’；
AFP R：5’-TTC AGG TTT GAC GCC ATT-3’。
G6P F：5’-AAT CTC CTC TGG GTG GCA-3’；
G6P R：5’-GCA TGG CGG TTG ACT TTA-3’。
α1-AT F：5’-GCAGCATCT GGAGCAAAC-3’；
α1-AT R：5’-CAT CGT AGG GTG GTC ATT-3’。
GAPDH F：5’-TCAACG GCACAG TCAAGG-3’；
GAPDH R：5’-AAG TCG CAG GAG ACAACC-3’。
二、棘球蚴体外二维培养模型中肝实质细胞的功能基因的表达检测
同时以实施例2中的棘球蚴体外二维培养模型作为对照，从培养第3天开始每间隔4天收集孔中培养的细胞(肝实质细胞和骨髓间充质干细胞)，根据步骤一相同的RT-PCR方法检测肝实质细胞中的功能基因Cldn-3、Bsep、AFP、G6P和α1-AT的表达情况。
RT-PCR检测肝实质细胞中的功能基因AFP、G6P和α1-AT的表达情况结果如图4所示。
图4中，由上至下，第一行中3d、7d、11d、15d、19d、23d、27d分别代表培养的第3天、第7天、第11天、第15天、第19天、第23天、第27天；第二行中1、2分别代表棘球蚴体外二维培养模型、棘球蚴体外三维培养模型；AFP、G6P、α1-AT分别代表AFP、G6P、α1-AT，GAPDH为内参基因。
图4表明，与棘球蚴体外二维培养模型相比，棘球蚴体外三维培养模型中的肝实质细胞在培养11天后可显著表达AFP、G6P和α1-AT基因。
实施例4、棘球蚴体外三维培养模型与棘球蚴体外二维培养模型培养棘球蚴的比较
一、原头蚴的制备
按照文献(李红卫，袁芳，李燕兵，郭凤英，胡尚品，张炜，杨玉荣.昆明种小鼠棘球蚴病感染动物模型的建立.宁夏医科大学学报,2011,5:411-413.)报道的方法制备多房棘球蚴小鼠感染动物模型，将多房棘球蚴小鼠感染动物模型处死后，无菌摘取感染组织，将组织置于滤网研磨，并用PBS冲洗，分离得到原头蚴。
二、设立如下各组：
实验组：在实施例1中制备的棘球蚴体外三维培养模型培养3天后，按照200个/孔的比例将200个步骤一分离的原头蚴接种于该模型的三维胶原支架所在的孔中继续培养，每孔观察原头蚴的发育。
对照组：在实施例2中制备的棘球蚴体外二维培养模型培养3天后，按照200个/孔的比例将200个步骤一分离的原头蚴接种于该模型的孔中继续培养，并将无细胞接种的三维胶原支架材料也放置于孔中，每孔观察原头蚴的发育。
各组中原头蚴发育为包囊的结果如图5所示。
图5中，A为对照组中第0天的原头蚴；B为对照组中培养42天的原头蚴发育为的包囊；C为实验组中第0天的原头蚴；D为实验组中培养42天的原头蚴发育为的包囊；E为培养不同天数时，对照组与实验组的原头蚴发育的包囊数量占最初接种原头蚴数量的百分数，其中共培养模型为实验组。
图5表明，与对照组相比，接种在棘球蚴体外三维培养模型的实验组的原头蚴发育为包囊的数量较多，且包囊发育尺寸较大。
实施例5、棘球蚴体外三维培养模型培养原头蚴发育成的包囊的转录组分析
在实施例1中制备的棘球蚴体外三维培养模型培养3天后，按照200个/孔的比例将200个实施例4的步骤一分离的原头蚴接种于该模型中三维胶原支架所在的孔中继续培养，培养42天后，收集直径大于3mm包囊，用PBS洗涤后，与接种的原头蚴按照文献报道的方法，进行转录组比较分析(Cui XG,Hou YL,Yang SH,Xie Y,Zhang SL,Zhang Y,Zhang Q,Lu XM,Liu GE,Sun DX.Transcriptional profiling of mammary gland inHolstein cows with extremely different milk protein and fat percentage using RNAsequencing.BMC Genomics,2014,15:226)。其中包囊样品的高通量测序得到的序列，经过过滤后的数量统计(Clean data)能定位到基因组上的测序序列的数量的百分比高于80％(一般情况下，如果不存在污染并且参考基因组选择合适的情况下，这部分数据的百分比大于70％)，说明其无共培养的饲养细胞的RNA污染，该模型可用于原头蚴发育后的分子生物学研究。
原头蚴在棘球蚴体外三维培养模型中培养后发育成的包囊与原头蚴的差异基因火山图如图6所示。
图6表明，原头蚴在棘球蚴体外三维培养模型中培养后发育成的包囊与原头蚴相比有得到807个差异基因。与原头蚴相比，包囊中有165个基因表达上调，642个基因表达下调。

Claims (10)

1.用于培养棘球蚴的模型，包括培养池和设于所述培养池内的三维胶原支架，其特征在于：所述三维胶原支架上负载有饲养细胞；
所述饲养细胞为原代肝实质细胞和骨髓间充质干细胞；
所述培养池内含有生物培养液；
所述生物培养液为用于培养所述棘球蚴和所述饲养细胞的溶液。
2.根据权利要求1所述的模型，其特征在于：所述饲养细胞中所述原代肝实质细胞和所述骨髓间充质干细胞的数量比为(10-50)：1。
3.根据权利要求2所述的模型，其特征在于：所述生物培养液由溶剂和溶质组成；所述溶剂为低糖DMEM培养基，所述溶质为胎牛血清、青霉素、链霉素、胰岛素、肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子、维生素C、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸和L-谷氨酰胺；所述胎牛血清在所述生物培养液中的体积百分含量为8％～10％，所述青霉素在所述生物培养液中的浓度为80U/mL～120U/mL，所述链霉素在所述生物培养液中的浓度为80U/mL～120U/mL，所述胰岛素在所述生物培养液中的浓度为1.5μg/mL-2.5μg/mL，所述肝细胞生长因子在所述生物培养液中的浓度为0.8ng/mL～1.2ng/mL，所述表皮细胞生长因子在所述生物培养液中的浓度为8ng/mL-12ng/mL，所述维生素C在所述生物培养液中的浓度为0.15mmol/L～0.25mmol/L，所述脯氨酸在所述生物培养液中的浓度为1.12mmol/L～1.2mmol/L，所述组氨酸在所述生物培养液中的浓度为0.16mmol/L～0.2mmol/L，所述赖氨酸在所述生物培养液中的浓度为1.32mmol/L～1.4mmol/L，所述L-谷氨酰胺在所述生物培养液中的浓度为250mg/L～350mg/L。
4.根据权利要求1-3任一所述的模型，其特征在于：所述模型按照权利要求5或6所述的方法构建。
5.构建权利要求1-3任一所述的模型的方法，包括如下步骤：将所述三维胶原支架用细胞培养基浸泡，然后置于所述培养池内，将所述饲养细胞接种于所述三维胶原支架上，在所述培养池内加入所述生物培养液，得到所述模型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述“将所述饲养细胞接种于所述三维胶原支架上”和所述“在所述培养池内加入所述生物培养液”的步骤之间还包括对接种了所述饲养细胞的所述三维胶原支架进行孵育的步骤；
所述孵育的条件为：37℃细胞培养箱静置；具体为37℃细胞培养箱静置1.5～3h，更具体为37℃细胞培养箱静置2h。
7.培养棘球蚴的方法，包括如下步骤：将原头蚴接种于权利要求1-4任一所述的模型中进行培养。
8.用于培养棘球蚴的系统，其特征在于：所述系统包含培养池和能够设于所述培养池内的三维胶原支架，以及原代肝实质细胞和骨髓间充质干细胞。
9.权利要求1-4任一所述的模型或权利要求8所述的系统在培养棘球蚴和/或在研究棘球蚴发育过程中的应用。
10.权利要求7所述的方法在研究棘球蚴发育过程中的应用。
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