JP5263756B2

JP5263756B2 - 細胞の培養方法および細胞培養物

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Publication number: JP5263756B2
Application number: JP2007537719A
Authority: JP
Inventors: 直哉小林; 紀章田中
Original assignee: 3D Matrix Ltd
Current assignee: 3D Matrix Ltd
Priority date: 2005-09-30
Filing date: 2006-09-29
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2026-09-29
Also published as: US20090221068A1; US8647867B2; WO2007037407A1; US20130029415A1; JPWO2007037407A1; US20140377862A1; US8697438B2

Description

本発明は、細胞の培養方法および細胞培養物に関する。

移植の対象となる臓器としては、例えば肝臓がある。肝臓は人体の中で最大の実質臓器である。その機能は糖質、蛋白質、脂肪の代謝を始めビリルビン代謝、薬物代謝、血液凝固因子の生成など多岐にわたり、生体において非常に重要な役割を果たしている。

このため、たとえ一時的なものであっても、重度の肝不全は患者の生命にとって極めて危険である。一方で、肝臓は旺盛な再生能を有するので、劇症肝不全で肝傷害を受けたとしても、一週間程度肝機能を代替することができれば患者は回復する。こうした重篤な肝疾患に対しては肝臓移植が最も効果的な治療法であるが、深刻なドナー不足のため万人がその恩恵を受けることはできない。現在の我が国の実情では、一時的に肝機能を代替する手段として持続濾過透析と血漿交換を組み合わせることである程度の救命率は得られているものの十分とは言い難く（安部ら、「Study of plasma exchange for liver failure: beneficial and harmful effects.」、The Apher Dial、2004、8、p.180-184参照）、より有効な治療法の確立が切実に求められている。

そこで期待されているのが治療用人工肝臓であり、中でも、生きた細胞の代謝能力やタンパク合成能を活用するために細胞を充填したバイオ人工肝臓の開発が注目されている。バイオ人工肝臓は肝細胞を担体に組み込んで固定しモジュール化したもので、生体内の肝臓を模倣した人工肝臓装置といえる。患者血液を当該装置内に導き、肝細胞の代謝能を利用して血液中の有害物質の除去と肝臓細胞に由来する凝固因子などの生理活性物質の供給を行うことができる。

本発明者らによるヒト肝細胞の培養実験の一例を示すと、ドナーは、交通事故による頭部外傷を受けた白人男性（56歳）で、死因はくも膜下出血であった。米国からの移送時間は、約39時間であった。コラゲナーゼ（collagenase）を用いた順行性灌流（normograde perfusion）にて肝細胞を分離した後、William's E培地（ウイリアムスメディウムイー（William's Medium E））にて冷保存し、千葉から岡山まで空輸した。当該肝細胞をWilliam's E培地を基本とした培養液中で、欠失型肝細胞増殖因子（dHGF）をＡ群） 0 ng/ml、Ｂ群） 10 ng/ml、Ｃ群） 100 ng/ml、Ｄ群） 1000 ng/mlの各種濃度で添加して培養し、MTTアッセイによる増殖能、アンモニア、リドカイン、ジアゼパム代謝能、アルブミン産生能からdHGFの効果を検討した。

dHGF添加群で有意に細胞増殖が良好であった。アンモニア、リドカイン、ジアゼパム代謝能、アルブミン産生能は、Ｂ、Ｃ群で有意に良好であったが、dHGF1000ng/mlのＤ群では細胞数あたりの薬物代謝能、アンモニア産生能は低下していた。肉眼的にもＢ、Ｃ群の肝細胞は敷石状の形態が良好に保持されていた。

欧米では、移植不適合肝臓から肝細胞が分離され、肝細胞移植やバイオ人工肝臓へ臨床応用されているが、本邦では移植不適合肝臓は焼却する規定になっているため、バイオ人工肝臓への活用は不可能である。そこで、米国で移植不適合（脂肪肝や線維化が強いなどの理由から）と判断されたドナー肝を、米国のナショナルディジーズリサーチインターチェンジ（National Disease Research Interchange（NDRI））からHAB研究機構附属研究所（千葉県市川市、担当者：鈴木聡（すずきさとし）先生）を通じて入手した肝臓ブロック130gを肝細胞に分離し機能的な培養法を検討した。唯一使用可能なこうした移植不適合ドナー肝から分離されたヒト肝細胞の機能的維持を目指した培養法の開発は極めて重要である。

また、健常ヒト肝細胞が使用できないといった問題の対策として、ヒト末梢血幹細胞、骨髄幹細胞、肝前駆細胞などから肝細胞への誘導が試みられてきた。しかし、これらの細胞は増殖能に乏しく、バイオ人工肝臓への応用に必要な細胞数（十億個以上）を確保するのは現実的ではない。そこで、欧米や中国では、ブタ肝細胞を使用したバイオ人工肝臓治験がヒトで行われている（ファンデケルホフ（van de Kerkhove）ら、「Phase I clinical trial with the AMC-bioartificial liver.」、Academic Medical Center Int J Artif Organs、2002、25、p.950-959、ドニーニ（Donini）ら、「Temporary neurological improvement in a patient with acute or chronic liver failure treated with a bioartificial liver device.」、Am J Gastroentrol、2000、95、p.1102-1104、マザリエゴス（Mazariegos）ら、「Safety observations in phase I clinical evaluation of the Excorp Medical Bioartificial Liver Support System after the first four patients.」ASAIO J、2001、47、p.471-475、ディン（Ding）ら、「The development of a new bioartificial liver and its application in 12 acute liver failure patients.」World J Gastroenterol、2003、9、p.829-832、デメトリウ（Demetriou）ら、「Prospective, randomized, multicenter, controlled trial of a bioartificial liver in treating acute liver failure.」、Ann Surgery、2004、239、p.660-670. 、ムント（Mundt）、「A method to assess biochemical activity of liver cells during clinical application of extracorporeal hybrid liver support.」、Int J Artif Organs、2002、25、p.542-548、モルシアニ（Morsiani）ら、「Early experiences with a porcine hepatocyte-based bioartificial liver in acute hepatic failure patients.」、Int J Artif Organs、2002、25、p.192-202、チェ（Xue）ら、「TECA hybrid artificial liver support system in treatment of acute liver failure.」、World J Gastroenterol、2001、7、p.826-829参照）。

細胞あるいは組織培養技術は、細胞移植、バイオ人工臓器をはじめ再生医療、細胞製剤、有用物質生産（バイオリアクター）、組織や器官・臓器の機能の調査・探索、新薬のスクリーニングや内分泌撹乱物質等の影響を評価するための動物実験代替法や細胞チップ等への産業上の利用が期待されている。

従来、接着性を持つ動物細胞の培養方法は、ポリスチレンやガラス等の培養ディッシュのような基材を用い、その表面を生体由来因子でコーティングしたり、あるいは化学的または物理化学的に処理したりして、その表面上で細胞を接着・伸展させる二次元培養法、いわゆる単層培養法が一般的であった。例えば、動物由来細胞間マトリックス成分であるコラーゲンをコートしたポリスチレンディッシュ上やプラズマ処理によって表面を親水化したポリスチレンディッシュ上で細胞を培養すると、細胞はその表面に付着、伸展し、細胞質が扁平状に伸展した細胞形態をとる。

一方、生体の組織や臓器等から単離した細胞、いわゆる初代細胞は、その由来する組織や臓器の特性や機能を保持している場合が多く、これらの細胞は産業上の利用価値が高い。しかし、ほとんどの場合、単層培養法では各種の細胞が持つ特性や機能が数日・数週の間に消失することが知られている。特に、初代細胞の中でも高度に分化し、複雑多岐な機能を持つ初代肝細胞の場合、単層培養ではその特性や機能が速やかに失われやすい。例えば、ラット肝臓より単離した肝細胞を単層培養すると、肝臓の重要な機能であるタンパク質合成機能や解毒機能、薬物代謝機能等は培養開始から数日内に低下あるいは消失してしまうことが知られている。これは、単層培養法の場合、細胞は細胞質が扁平な二次元状態となるため、本来生体内で細胞が有している細胞内構造や極性、隣接する細胞との結合による情報交換等の機構が低下・消失し、これに伴って細胞が本来持つ特性や機能が低下・消失するためであると考えられている（特開２００１−１２８６６０号公報参照）。

このような細胞が本来持つ特性や機能の低下や消失を回避するために、最近では細胞同士を集合化させ、生体組織に類似した三次元構造を構築させる、いわゆる「三次元培養法」が注目されている。このような三次元培養法の支持体としては二種類に大別される。一つは動物由来細胞間マトリックス成分であり、もう一つは合成ポリマーである。動物由来細胞間マトリックス成分としては、例えば、コラーゲンゲル、ラミニン、動物基底膜由来成分（商品名：マトリゲル（Matrigel）、ベクトンディッキンソンアンドカンパニー社製（構成成分：ラミニン56％、コラーゲンＩＶ31％およびエンタクチン8％））等が挙げられる。マトリゲルで例えばラット肝細胞を培養すると、スフェロイドが形成されることが報告されている（ビッセル（Bissell）ら、「Transcriptional regulation of the albumin gene in cultured rat hepatocytes. Role of basement-membrane matrix.」、 Mol Biol Med、1990、 7、p.187-197参照）。合成ポリマーとしては、ポリグルコース酸、ポリＬ乳酸等が挙げられる。ポリグルコース酸で例えばラット肝細胞を培養すると、スフェロイドが形成されることが報告されている（フィーゲル（Fiegel）ら、「Influence of flow conditions and matrix coatings on growth and differentiation of three-dimensionally cultured rat hepatocytes.」、Tissue Eng、2004、10、p.165-174参照）。

このように、二次元培養法によって培養された細胞と比較して、三次元培養法によって培養された細胞は、細胞が本来持つ特性や機能を高レベルで長期的に維持できることから、バイオ人工臓器、再生医療、細胞製剤、有用物質生産（バイオリアクター）、組織や器官・臓器の機能の調査・探索、新薬のスクリーニングや内分泌撹乱物質等の影響を評価するための動物実験代替法や細胞チップ等への産業上の利用のための有効な手段として期待されている。

しかしながら、前記三次元培養法の支持体には次に述べる問題点があった。動物由来細胞間マトリックス成分を支持体として用いる場合、ロット間差が大きいことから再現性が乏しいことがある。また、未知ウイルスなどの未知因子混入の可能性があり、臨床に用いる際に感染の惧れが懸念されている。合成ポリマーを支持体として用いる場合、ファイバー直径が10〜50μmと大きいため、細胞（5〜20μm）の大きさを考慮すると、実質的には平面培養と同じ環境となってしまう点がある。また、ファイバー間のサイズ（ポアサイズ）が10〜200μmと大きいため、細胞が産生した細胞間マトリックス成分が支持体中に留まらず、培養液中に拡散してしまう点がある。さらに、生体分解性が低いため、移植する場合異物として体内に留まってしまう点がある。

本発明は前記問題点に鑑み、ブタ肝細胞、ヒト肝細胞、ブタ膵島、ヒト膵島などの細胞を、細胞の生存、細胞形態および細胞機能が維持された状態で長期にわたって高次元培養する技術を提供することを課題とする。

上記課題を解決するため鋭意研究をおこなった結果、細胞をファイバーサイズおよびポアサイズが天然の細胞間マトリックスと同様であり、かつ生体適合性および生体内分解性があるペプチドハイドロゲルを支持体として使用し培養することによって前記課題が達成されることを見出し、本発明を完成するにいたった。

すなわち、本発明は、細胞をペプチドハイドロゲルを支持体として培養することを特徴とする細胞の培養方法に関する。

本発明の好ましい実施態様では、さらにインサートの存在下で培養する。

本発明のさらに好ましい実施態様では、前記細胞がブタ肝細胞、ヒト肝細胞、ブタ膵島、ヒト膵島よりなる群から選ばれる１種である。

本発明はまた、前記培養方法により得られる細胞およびペプチドハイドロゲルを含む細胞培養物に関する。

本発明の好ましい実施態様では、前記培養物中の細胞が、スフェロイドの形態を有する細胞培養物である。

本発明のさらに好ましい実施態様では、前記培養物中の細胞が、細胞接着装置および／または毛細胆管が形成されている肝細胞である。

本発明のさらに好ましい実施態様では、前記培養物中の細胞が、膵島の形態学的検査項目：形状、辺縁の形状、細胞統合性、および細胞直径についての評価値の合計が１２点以上である膵島であって、グルコース刺激に対して低グルコース濃度時と高グルコース濃度時のインスリン分泌の比が1.5倍以上である膵島からなる。

本発明はまた、肝細胞をペプチドハイドロゲルを支持体として培養した細胞培養物を含むバイオリアクターに関する。

本発明の好ましい実施態様においては、前記バイオリアクターが、アンモニア、ジアゼパム、またはリドカインを代謝するものである。

本発明はまた、膵島をペプチドハイドロゲルを支持体として培養した細胞培養物を含むバイオリアクターに関する。

本発明の好ましい実施態様においては、前記バイオリアクターが、インスリンを産生するものである。

本発明はさらに、細胞をペプチドハイドロゲルを支持体として培養した細胞培養物を含む細胞製剤に関する。

（a）は、本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法で用いる培養容器の一実施例を示す模式図である。符号１は培養皿を示し、符号２はインサートを示す。インサート２の底部にはフィルター３が設けられている。インサート２は培養皿１中に挿入される。インサート２のフィルター３上にペプチドハイドロゲルを敷き、その上に細胞を置いて培養を行う。(ｂ）は、（ａ）に示される培養容器を用いる本発明の培養方法の一実施態様を示す断面図である。符号４は細胞を示す。なお、ペプチドハイドロゲルは図示されていない。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（写真１、２および３）、および従来のコラーゲンを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（写真４、５および６）の培養状態を示す位相査顕微鏡像である。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（写真１、２および３）、および従来のコラーゲンを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（写真４、５および６）の培養状態を示す走査電子顕微鏡像である。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法において、インサートを用いて培養したブタ肝細胞が高次元培養物であることを示す該細胞の断面を示す透過電子顕微鏡像である。細胞間に細胞接着装置および毛細胆管が形成されている。図２（ｃ）における細胞接着装置および毛細胆管を説明するための図である。符号５は細胞接着装置を示し、符号６は毛細胆管を示す。また、符号７は細胞間の境界を示す。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（写真１、２および３）、および従来のコラーゲンを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（写真４、５および６）の生存状態を示す位相査顕微鏡像である。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（Ａ群）および従来のコラーゲンを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（Ｂ群）のアンモニア代謝能を比較したグラフである。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（Ａ群）、従来のコラーゲンを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（Ｂ群）、およびマトリゲルを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（Ｃ群）のアンモニア代謝能を比較したグラフである。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法（Ａ群）、従来のコラーゲンを支持体とする培養方法（Ｂ群）、マトリゲルを支持体とする培養方法（Ｃ群）、およびコラーゲンサンドイッチを支持体とする培養方法（Ｄ群）において、さらにそれぞれインサートを用いて培養したブタ肝細胞のアンモニア代謝能を比較したグラフである。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（Ａ群）、従来のコラーゲンを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（Ｂ群）のリドカイン代謝能を比較したグラフである。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（Ａ群）、従来のコラーゲンを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（Ｂ群）、およびマトリゲルを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（Ｃ群）のリドカイン代謝能を比較したグラフである。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法（Ａ群）、従来のコラーゲンを支持体とする培養方法（Ｂ群）、マトリゲルを支持体とする培養方法（Ｃ群）、およびコラーゲンサンドイッチを支持体とする培養方法（Ｄ群）において、さらにそれぞれインサートを用いて培養したブタ肝細胞のリドカイン代謝能を比較したグラフである。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（Ａ群）および従来のコラーゲンを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（Ｂ群）のジアゼパム代謝能を比較したグラフである。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（Ａ群）、従来のコラーゲンを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（Ｂ群）、およびマトリゲルを支持体とする培養方法で培養したブタ肝細胞（Ｃ群）のジアゼパム代謝能を比較したグラフである。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法（Ａ群）、従来のコラーゲンを支持体とする培養方法（Ｂ群）、マトリゲルを支持体とする培養方法（Ｃ群）、およびコラーゲンサンドイッチを支持体とする培養方法（Ｄ群）において、さらにそれぞれインサートを用いて培養したブタ肝細胞のジアゼパム代謝能を比較したグラフである。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法で培養したヒト肝細胞（写真１、２および３）、および従来のコラーゲンを支持体とする培養方法で培養したヒト肝細胞（写真４、５および６）の培養状態を示す位相査顕微鏡像である。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法でして培養したヒト肝細胞（写真１、２および３）、および従来のコラーゲンを支持体とする培養方法で培養したヒト肝細胞（写真４、５および６）の培養状態を示す走査電子顕微鏡像である。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法で培養したヒト肝細胞（Ａ群）および従来のコラーゲンを支持体とする培養方法で培養したヒト肝細胞（Ｂ群）のアンモニア代謝能を比較したグラフである。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法で培養したヒト肝細胞（Ａ群）、従来のコラーゲンを支持体とする培養方法で培養したヒト肝細胞（Ｂ群）、およびマトリゲルを支持体とする培養方法で培養したヒト肝細胞（Ｃ群）のアンモニア代謝能を比較したグラフである。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法で培養したブタ膵島（Ａ群）および従来のコラーゲンを支持体とする培養方法で培養したブタ膵島（Ｂ群）の培養状態を示す走査電子顕微鏡像である。（a）は、本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法で培養したブタ膵島（Ａ群）のインスリン産生能を示すグラフであり、（b）は、従来のコラーゲンを支持体とする培養方法で培養したブタ膵島（Ｂ群）のインスリン産生能を示すグラフである。本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法で培養したブタ膵島（Ａ群）および従来のコラーゲンを支持体とする培養方法で培養したブタ膵島（Ｂ群）の培養状態を示す走査電子顕微鏡像である。（a）は、本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法で培養したヒト膵島（Ａ群）のインスリン産生能を示すグラフであり、（b）は、従来のコラーゲンを支持体とする培養方法で培養したヒト膵島（Ｂ群）のインスリン産生能を示すグラフである。本発明のバイオリアクターの一実施態様を例に、作製工程を順に示す図である。（ａ）は、裏打ち１０が施された不織布１１の上に中空糸１２を並べた状態を示す概略図である。ここで、裏打ち１０が施された不織布１１にはスリット１３が設けられている。（ｂ）は、（ａ）に示されるシート状物をロール状に巻く工程を示す概略図である。（ｃ）は、（ｂ）のＸ−Ｘ線断面拡大図である。（ｄ）は、両端に液漏れ防止部材１４を設けた筒状容器１５に中空糸１２と不織布１１からなるロールを組み込んだバイオ人工肝臓等に利用可能なバイオリアクター１６を表わす概略図である。バイオリアクター１６には細胞注入口１７および細胞のサンプル採取を行なうことが可能な取り出し口１８が設けられており、スリット１３は、細胞注入口１７と連絡するように配置される。

本発明で対象となる細胞は、例えばブタ、猿、類人猿、ヒト等の哺乳類の肝細胞またはブタ、猿、類人猿、ヒト等の哺乳類の膵島などが挙げられる。なかでも、ブタ肝細胞、ヒト肝細胞、ブタ膵島、ヒト膵島よりなる群から選ばれる１種であるものが好ましい。

本発明では、ブタ肝細胞、ヒト肝細胞、ブタ膵島、ヒト膵島などの細胞を高次元培養する際に使用する支持体として、自己組織化ペプチドであるペプチドハイドロゲルを用いる。ペプチドハイドロゲルとしてはPuraMatrix（Ac−(RADA)₄−CONH₂）、EAK16（Ac−AEAEAKAKAEAEAKAK−CONH₂）RAD16（Ac−RARADADARARADADA−CONH₂）などが挙げられ、なかでも株式会社スリー・ディー・マトリックス・ジャパンから市販されているPuraMatrixが好ましいものとして挙げられる。

なおアミノ酸配列、アミノ酸残基数などがPuraMatriｘと異なる自己組織化ペプチドも支持体として使用することができる。好ましいアミノ酸配列としては、X−N−Y−Nの繰り返し（Xはアルギニン、リジン等塩基性アミノ酸、Nはアラニン、グリシン等中性アミノ酸、Yはアスパラギン酸、グルタミン酸等酸性アミノ酸）が挙げられる。

PuraMatrix等の自己組織化ペプチドは明らかな生理活性モチーフを持たないペプチド配列であるので、本来の細胞機能が損なわれる心配がない。生理活性モチーフは、転写など多くの細胞内現象の制御に関与しており、生理活性モチーフが存在するとは、そのモチーフを認識する酵素により細胞質内や細胞表面の蛋白質はリン酸化される。支持体中に生理活性モチーフが存在すると、各種機能蛋白質の転写活性化能が抑制される可能性がある。例えば、肝細胞では、アルブミン産生能や薬物代謝能が抑制されるといった副作用も起こりうる。生理活性モチーフを持たないPuraMatrix等の自己組織化ペプチドではこうした心配がない。よってPuraMatrix等の自己組織化ペプチドは物理的な細胞の足場のみとして機能する細胞培養に適した支持体である。

PuraMatrixはアミノ酸１６残基（Ac−(RADA)₄−CONH₂）で長さが約５ｎｍのオリゴペプチドであって、その溶液はｐＨ５．０以下であると液状を示すが、ｐＨ５．０以上に変化させることでペプチドの自己組織化が生じ、直径１０ｎｍほどのナノファイバーを形成し、結果としてペプチド溶液はゲル化する。

平均して前記ナノファイバーは直径１０〜２０ｎｍ、ポアサイズは５〜２００ｎｍである。この数値範囲は天然の細胞間マトリックスであるコラーゲンとほぼ同じ大きさであることから、自己組織化ペプチドは細胞培養に適した支持体である。

PuraMatrixはプラス電荷を帯びたアルギニンとマイナス電荷を帯びたアスパラギン酸、および疎水性を有するアラニンの残基が交互に繰り返すアミノ酸配列を有する両親媒性ペプチドであり、ペプチドの自己組織化はペプチドを構成するアミノ酸によるペプチド分子間のイオン結合と疎水結合に起因する。

自己組織化ペプチドの自己組織化条件は、生理的条件のpHおよび塩濃度があげられる。特に１価のアルカリ金属イオンが重要である。つまり、生体内に多量に存在するナトリウムイオンおよびカリウムイオンがゲル化の促進に寄与する。一度ゲル化すると通常のタンパク質の変性条件、例えば高温、酸、アルカリ、タンパク質分解酵素、尿素、グアニジン塩酸塩等の変性剤を用いても、ゲルは分解しない。

この自己組織化ペプチドは他のテクノロジーでは困難な三次元多孔性の支持体を容易に形成することができ、ナノファイバーの密度と孔の平均サイズは使用するペプチド溶液の濃度と関連する。自己組織化ペプチドの水溶液濃度に依存してゲルの強度は変化し、細胞を培養するのに適した培養条件を得ることができる。これにより細胞を三次元環境下に封入すること、もしくはペプチドハイドロゲル表面で細胞を良好に分化、増殖させることができる（Zhang, et al., Biomaterials, Dec;16(18): 1385-93, 1995、 Holmes, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. Jun 6;97(12): 6728-33, 2000、および Kisiday, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. Jul 23;99(15): 9996-10001, 2002 参照）。

このように自己組織化ペプチドは、コラーゲン、フィブロネクチン、マウス肉腫細胞外マトリックス等の動物由来細胞外マトリックスと同様またはそれ以上の効果を細胞培養技術において得ることができる。さらに、自己組織化ペプチドは化学合成により製造されることから動物由来細胞外マトリックスに起因する未知成分を含まない。この性質はBSEを始めとする感染の恐れがなく、医療用としても高い安全性を有することを示す。

天然のアミノ酸からなる自己組織化ペプチドは生体適合性および生体内分解性も良好なことから、例えばマウスの心筋にPuraMatrixを注入すると注入したPuraMatrixに細胞が浸潤し、正常組織が形成されることが報告されている。分解時間は注入場所等の条件によって異なるが、注入後およそ２〜８週間でファイバーが分解され、排出される。

本発明の対象とされる細胞としては、ヒトおよび動物から採取または市販の細胞が挙げられる。具体的には、ブタ肝細胞、ヒト肝細胞、ブタ膵島、ヒト膵島などが挙げられる。

本発明に使用する肝臓細胞は、ブタなどの動物から摘出する方法、ヒトドナー肝を使用する方法と共に、商業的にも入手可能である（例えば、三光純薬株式会社、大日本製薬株式会社など）。

本発明に使用するブタまたはヒトの膵島は、公知の方法に従ってブタまたはヒトの膵臓から分離することができる（Staudacher C, Ricordi C, Stella M, Socci C, Cammelli L, Ferrari G, Dicarlo V., Minerva Chir. 31: 1665-1668, 1985、Ricordi C, Finke EH, Lacy PE., Diabetes 35: 649-653, 1986、およびLakey JRT, Kobayashi N, Shapiro AMJ, Ricordi C, Okitsu T: Current human islet isolation protocol. Medical Review Co., Ltd, Osaka, Japan, 2004参照）。

細胞の培養方法、培養条件としては、各細胞の種類に応じて一般的な培養方法、条件が採用できる。例えば、培養方法としては、PuraMatrixと細胞を混合したものを培養液中で培養する混合培養などが挙げられ、PuraMatrixが培養液を新しいものに取り替えるときに培養液が直接PuraMatrixに当たってPuraMatrix自体に傷害を与える危険性を回避する点から、インサート（カルチャーインサートとも言う）を用いた培養が好ましい（図１(a)および(b)参照）。

インサート２は、底部にフィルター３（メンブレンとも言う）を有し、培養皿１の上に重ねた後に、インサートに細胞を播種して培養する、細胞または組織培養用機材である（図１(a)および(b)参照）。フィルターの材質としては、例えばポリエステル、ポリカーボネート、セルロース混合エステル、ポリエチレンテレフタレート等が挙げられ（ウエブサイト http://www.bdj.co.jp/labware/pdf/fbrochure.pdf#search=%22インサートカルチャー%22 参照）、フィルターのポアサイズは、細胞の大きさを考慮すると０．４〜３．０μｍが好ましい。インサートを用いることで、培養液交換に伴う機械的ダメージを軽減することが可能となる。また、細胞の分泌物の測定や細胞の薬剤取り込みを測定する場合にも用いられる。インサートは商業的に入手可能である（例えば、ベクトンディッキンスンバイオサイエンス社（ウエブサイト http://www.bdj.co.jp/pdf/35-06P143-146.pdf）、コーニングライフサイエンス社（ウエブサイト http://catalog.corning.com/lifesciences/category.aspx?p=Microplates@@@157@@@166&region=JP&language=EN）およびミリポア社（ウエブサイト http://www.millipore.com/publications.nsf/docs/tn2004en00?open&lang=ja）などが挙げられる）。

インサートを用いた自己組織化ペプチドと細胞の混合方法において、本発明では自己組織化ペプチドと細胞を混合したのちに、複数回（例えば２〜４回）培養液を新しいものに交換することが好ましい。この作業により、自己組織化ペプチドの低いｐＨ（ｐＨ１．０〜３．０）を生理的ｐＨ（ｐＨ６．０〜８．０）とし、結果として自己組織化ペプチドのゲル化が確実となる効果を奏する。また、生理的pHにすることにより細胞へのダメージも最小限に抑える効果を奏する。培養液交換のときは、インサートの培養液は交換せず、培養皿中の培養液のみ交換する。この手法により培地交換による自己組織化ペプチドへの機械的ダメージを最小限に抑えることが可能となる。

本発明の培養方法における自己組織化ペプチドおよび細胞の濃度はそれぞれ０．５〜１％および１×１０⁵〜３×１０⁵細胞／ｍｌであることが好ましく、０．５％および２×１０⁵細胞／ｍｌであることが最も好ましい。

本発明の細胞の培養方法において用いられる培地は、細胞を増殖させることができるものであればいかなる組成のものでもよく、無機質、糖、アミノ酸、ペプチド、ビタミン、有機酸、核酸、pH調整剤、酵素等の細胞の培養に必要な成分を含有するものであればよい。

例えば、肝細胞の培地としては、市販の肝細胞用培地、William's E培地（シグマ（SIGMA）社製、セントルイス、ミズーリ州）、細胞培地キットHCM BulletKit（製品コード CC-3198）（タカラ（Takara）社製、ウエブサイト http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C1280）、肝細胞培養用無血清培地HepatoZYME-SFM（カタログ番号17705-021）（インビトロジェン（Invitrogen）社製、ウエブサイト http://www.invitrogen.co.jp/products/cell_culture/17705001.shtml）、肝細胞維持用培地（Long-Term Culture Medium）（カタログ番号HE0306-5、HE0306）（株式会社ケー・エー・シー社製、ウエブサイト http://www.kacnet.co.jp/m01/m0104/06.html）ウシ胎仔血清を含有したWilliams’E培地などが挙げられ、価格の点から、William's E培地が好ましい。

前記肝細胞の培地には、ウシ胎仔血清、ヒト血清、各種細胞成長因子などを加えることが細胞の成長を考慮すると好ましい。さらに前記培地には、トランスフェリン（transferrin）、ヒドロコルチゾン（hydrocortisone）、アスコルビン酸（ascorbic acid）、インシュリン（insulin）、グルタミン（glutamine）、ニコチンアミド（nicotineamide）の１種または２種以上加えることが好ましく、全種類加えることがとくに好ましい。加える濃度としては、トランスフェリンでは2.5〜5.0μg/ml、ヒドロコルチゾンでは5〜10μg/ml、アスコルビン酸では1〜2mmol/l、インシュリンでは2.5〜5μg/mlでは、グルタミンでは2〜5mmol/l、ニコチンアミドでは1〜20mmol/lが好ましく、さらにトランスフェリンでは5.0μg/ml、ヒドロコルチゾンでは5μg/ml、アスコルビン酸では2mmol/l、インシュリンでは5μg/ml、グルタミンでは5mmol/l、ニコチンアミドでは10mmol/lであることがさらに好ましい。

例えば、膵島の培地としては、市販のRPMI-1640培地（シグマ社製）、William's E培地（シグマ社製）、CMRL1066培地（インビロトロジェン社製）、低グルコースDMEM（ギブコ社製）、高グルコースDMEM（ギブコ社製）、などが挙げられ、膵島からのインスリン分泌を抑制することで膵島細胞の疲弊を防御できる点から、低グルコースDMEMが好ましい。

前記膵島の培地には、ウシ胎仔血清、ヒト血清、各種細胞成長因子などを加えることが細胞の成長を考慮すると好ましい。さらに前記培地には、塩化カルシウム（calcium chloride）、グルタミン、2−[4−（2−ヒドロキシエチル）−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸（HEPES）、ニコチンアミド、トラジロール（trasylol）、硫酸亜鉛（zinc sulfate）、トログリタゾン（troglitazone）、エクスディン４（exendin-4）の１種または２種以上加えることが好ましく、全種類加えることがとくに好ましい。加える濃度としては、塩化カルシウムでは1〜3mmol/l、グルタミンでは1〜3mmol/l、HEPESでは10〜30μmol/l、ニコチンアミドでは1〜20mmol/l、トラジロールでは5,000〜20,000 IU/l、硫酸亜鉛では10〜20μmol/l、トログリタゾンでは1〜20μmol/l、エクスディン４では2〜100nmol/lであることが好ましく、さらに塩化カルシウムでは2.13mmol/l、グルタミンでは2mmol/l、HEPESでは20μmol/l、ニコチンアミドでは10mmol/l、トラジロールでは20,000 IU/l、硫酸亜鉛では16.7μmol/l、トログリタゾンでは10μmol/l、エクスディン４では10nmol/lであることであることがさらに好ましい。

本発明に係る肝細胞の高次元培養方法によれば、ブタまたはヒト由来の肝細胞を培養することにより、肝細胞に本来備わっている産生成分である血清アルブミンや各種凝固因子などの生理活性物質を効率良く産生することが可能となる。これらと共に、肝細胞の機能であるタンパク質産生能、糖新生能、尿素産生能、血液の解毒および浄化能、ならびにアミノ酸、糖質および脂質代謝能を有する肝細胞の提供が可能となる。前記肝細胞の培養方法によれば、解毒能が長期間に渡り高く維持される。例えば、インサートを使用して培養したブタ肝細胞（培養21日目）によるアンモニア代謝能は、平面培養と比較して約20〜30倍、マトリゲルと比較して約1.5〜2.5倍向上することができ、リドカイン代謝能は平面培養と比較して約25〜35倍、マトリゲルと比較して約1.5〜2.5倍向上することができ、ジアゼパム代謝能は、平面培養と比較して約20〜30倍、マトリゲルと比較して約1.3〜2.0倍向上することができる。インサートを使用せずに培養したヒト肝細胞（培養5日目）によるアンモニア代謝能は、平面培養と比較して約5〜10倍、マトリゲルと比較して約1.1〜1.5倍向上することができる。また、前記肝細胞の培養方法によれば、平面培養では困難であるスフェロイド形成（球形で、直径が100〜120μmである）が可能となる。

用語「スフェロイド」とは、三次元的球状細胞塊を意味する。スフェロイドを形成および／または維持することは、孤立細胞またはいびつなスフェロイドと比較して、前記スフェロイドの生理機能が生体組織により近いことを示す。

また、本発明に係る肝細胞の高次元培養方法によれば、マトリゲルなどの支持体を用いた従来の三次元培養では得られない効果が得られる。例えば、形態学的特徴としては、透過電子顕微鏡観察により、高次元培養である特徴として細胞接着装置（細胞間接着装置とも言う）、毛細胆管などが肝細胞間に形成されることなどが挙げられる（図２(ｃ)および図２(ｄ)参照）。

三次元培養とは、支持体中に立体的に細胞を播種後培養する手法をいう。従来の接着性を示す細胞の培養方法は、シャーレなどの容器平面上で細胞を培養する（二次元培養）ことを特徴とする。これに対し、三次元培養方法は立体的に細胞が存在するため、生体内環境を培養環境中で模倣し、組織を形成させ、その組織を観察できることが挙げられる。三次元培養方法としては、たとえば、コラーゲンサンドイッチ培養などが挙げられる（Chandra P, Lecluyse EL, Brouwer KL. Optimization of culture conditions for determining hepatobiliary disposition of taurocholate in sandwich-cultured rat hepatocytes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2001 Jun;37(6):380-5. 参照）。

高次元培養とは、個々の培養細胞が、お互いに協調・統合しつつ「組織化」された細胞集団を形成する培養のことである。肝臓や膵臓から分離され、取り出された細胞が、培養系において再構築されることで、高次機能を有する肝組織や膵ランゲルハンス氏島(膵島)などができるようになれば、肝疾患や糖尿病の再生治療につながる革新的な新技術となりうる。しいては、将来的には「組織・臓器の工業的生産」という人類の夢ともいえる極めて大きな社会的恩恵をもたらす可能性を有する培養手法であるとも言える。

三次元培養はこれまで平面で培養していたものを立体的に（三次元で）培養することを示すのに対し、高次元培養はさらに一歩踏み込んで、立体的かつ、組織としての働きを可能ならしめる培養法である。組織として機能を有するということは、単一ないし複数種の細胞（肝臓で言えば、肝細胞や星細胞など）が培養環境中で組織を構成し、対象とする臓器の機能を発現するものと説明し得る。このような高次元培養では、細胞接着装置や毛細胆管の形成が促進され、細胞の機能が最大限に発揮される。

細胞接着装置５とは、細胞が、細胞接着のために、接着分子を中心に細胞骨格を動員した結果形成される装置をいい、例えばアドヘレンス・ジャンクション（adherence junction）、タイトジャンクション（tight junction）、デスモソーム（desmosome）およびヘミデスモソーム（hemidesmosome）などが挙げられる（図２（ｃ）および２（ｄ）参照）。多細胞生物においては、個々の細胞は独立して存在しているのではなく、細胞同士が付着、あるいは細胞が細胞外マトリックスに付着している。細胞同士の結合、および細胞の細胞外マトリックスへの結合を細胞接着（cell adhesion）という。前者を細胞接着（細胞間接着（cell-to-cell adhesion）とも言う）、後者を細胞-マトリックス接着（cell-matrix adhesion）と呼んで、前者のみを狭義の細胞接着ということもある。細胞接着の基本は、細胞同士あるいは細胞とマトリックスが直接接触して付着しているということであるが、細胞は接着のために細胞骨格を動員した細胞接着のための装置を持つこともある。細胞接着は、細胞接着分子の分子間相互作用によって担われ、接着装置も接着分子を中心に形成される。細胞接着の様相は、細胞や組織の種類によって多様である。上皮では、一般に上皮細胞同士が強い接着を行い、アドヘレンス・ジャンクション、タイトジャンクション、デスモソームといった特殊化した接着構造を形成する一方、細胞外マトリックスである基底膜に接着しヘミデスモソームを形成している（ウエブサイト http://ja.wikipedia.org/wiki/細胞接着参照）培養細胞が細胞接着装置を持つことで、接着構造を安定化させ細胞全体の形態の維持、組織構造の維持を行うことができる。こうした接着構造は、細胞と細胞の間隙を充填することで、外界からの分子、細菌、ウイルスなどの侵入を防ぐという機能も発現できるようになる。更に、こうした接着を通じて、細胞内部にシグナルを伝え細胞分化、増殖といった細胞形質の発現も可能になる。

毛細胆管６とは、二つの肝細胞の間にできた間隙であり、直径約0．5〜1μmの管である（図２（ｃ）および２（ｄ）参照）。肝細胞で産生された胆汁は、毛細胆管内に分泌される。毛細胆管の形成は、高次元培養、すなわち肝臓に類似した組織が再構築されていることを示す。

本発明に係る膵島の高次元培養方法によれば、ブタまたはヒト由来の膵島を培養することにより、膵島に本来備わっている産生成分であるインスリンを効率よく産生することが可能となる。本発明の培養方法においては、得られる膵島のインスリン産生能（高グルコース培養）は、平面培養と比較して約5〜15倍となることが好ましい。インスリン産生量は培養液中のグルコース濃度を感知して調節できることが好ましく、低グルコース濃度、高グルコース濃度、ついで低グルコース濃度での培養時にそれぞれ0.4〜0.8μg/l（膵島10個）、0.7〜1.5μg/l（膵島10個）、0.5〜1.2μg/l（膵島10個）産生されることが好ましく、低グルコース濃度時と高グルコース濃度時におけるインスリン産生量の差が0.3μg/l（膵島10個）以上であることが好ましい。またグルコース刺激に対してインスリン分泌が低グルコース濃度時と比べ、高グルコース濃度時に1.5倍以上になることが好ましく、2.0倍以上になることがより好ましい。さらに、高グルコース濃度から低グルコース濃度に戻したときのインスリン産生量が低下することが好ましく、インスリン産生量の差が0.3μg/l（膵島10個）以上であることが好ましい。また、前記膵島の培養方法によれば、平面培養では困難であるスフェロイドの形状を良好に維持したまま、培養可能であることが好ましい。

培養膵島の検査方法としては、形態学的検査項目として下記４項目を5段階（１〜５点）評価する方法が挙げられる(文献：Matsumoto S, Qualley SA, Goel S, et al. Effect of the two-layer (University of Wisconsin solution- Perfluorochemical plus O2) method of pancreas preservation on human islet isolation as assessed by Edmonton isolation protocol. Transplantation 2002; 74: 1414.参照)。
１．形状（shape）：
「扁平(flat)：１点」、「ほぼ扁平：２点」、「いびつな球状：３点」、「ほぼ球状：４点」、および「球状(spherical)：５点」の５段階評価する。この中では、「球状：５点」が最も好ましい。
２．辺縁の形状（border）：
「不ぞろいの（irregular）：１点」、「ほぼ不ぞろいの：2点」、「やや均整のとれた：３点」、「ほぼ均整のとれた：４点」、および「均整のとれた（well-rounded）：５点」の５段階評価する。この中では、「均整のとれた：５点」が最も好ましい。
３．統合性（integrity）：
「断片化した（fragmented）：１点」、「ほぼ断片化した：２点」、「ややソリッド／コンパクト：３点」、「ほぼソリッド／コンパクト：４点」、および「ソリッド／コンパクト（solid/compact）：５点」の５段階評価する。この中では、「ソリッド／コンパクト：５点」が最も好ましい。
４．直径（diameter）：
「培養膵島の個々が100μm未満（all < 100 μm）：１点」、「培養膵島の個々が100〜150μm：２点」、「培養膵島の個々が125〜175μm：３点」、「培養膵島の個々が150〜200μm：４点」、および「培養膵島の個々中10%以上が200μmより大きい（> 10% > 200 μm）：５点」の５段階評価する。その中では、「培養膵島の個々中10%以上が200μmより大きい：5点」が最も好ましい。

本発明のペプチドハイドロゲルを支持体とする培養方法で得られる膵島は、形態学的には、形状が３点以上、辺縁の形状が３点以上、統合性が３点以上、直径が３点以上、評価値の合計が１２点以上であることが好ましく、形状が４点以上、辺縁の形状が４点以上、統合性が４点以上、直径が４点以上、評価値の合計が１６点以上であることがより好ましく、形状が５点以上、辺縁の形状が５点以上、統合性が５点以上、直径が５点以上、評価値の合計が２０点であることが最も好ましい。また、本発明の培養方法で得られる膵島の機能は、グルコース刺激に対してインスリン分泌が低グルコース時と比べ、高グルコース時に１．５倍以上になることが好ましく、２．０倍以上になることがより好ましい。

上記検査項目において、形状が「扁平」とは膵島を楕円状の球体とみなした際に、長軸／短軸比が１０以上であることを示し、「ほぼ扁平」とは前記長軸／短軸比が５以上１０未満であることを示し、「いびつな球状」とは前記長軸／短軸比が２以上５未満であることを示し、「ほぼ球状」とは前記長軸／短軸比が１．２以上２未満であることを示し、「球状」とは前記長軸／短軸比が１．２未満であることを示す。

辺縁の形状が「不ぞろいの」とは膵島の辺縁の９割以上がでこぼこしており滑らかさを欠いた辺縁であることを示し、「ほぼ不ぞろいの」とは膵島の辺縁の５割以上〜９割未満が不ぞろいであることを示し、「やや均整のとれた」とは膵島の辺縁の２割以上〜５割未満が不ぞろいであることを示し、を示し、「ほぼ均整のとれた」とは膵島の辺縁の１割以上〜２割未満が不ぞろいであることを示し、「均整がとれた」とは膵島の辺縁の１割未満が不ぞろいであることを示す。

統合性が「断片化した」とは膵島の中にくびれがあるものが全体の８割以上であることを示し、「ほぼ断片化した」とは膵島の中にくびれがあるものが全体の６〜８割であることを示し、「ややソリッド／コンパクト」とは膵島の中にくびれがあるものが全体の4〜６割であることを示し、「ほぼソリッド／コンパクト」とは膵島の中にくびれがあるものが全体の２〜４割であることを示し、「ソリッド／コンパクト」とは膵島の中にくびれがあるものが全体の２割以下であることを示す。

直径について、「培養細胞の個々が100μ未満」とは培養膵島個々の直径が全て100μm未満であることを示し、「培養膵島の個々が100〜150μm」とは培養膵島個々の直径が100〜150μmの範囲であることを示し、「培養膵島の個々が125〜175μm」とは培養膵島個々の直径が125〜175μmの範囲であることを示し、「培養膵島の個々が150〜200μm」とは培養膵島個々の直径が150〜200μmの範囲であることを示し、「培養膵島の個々中10%以上が200μmより大きい」とは培養膵島個々中10%以上が200μmより大きいことを示す。

グルコース刺激に対するインスリン分泌（グルコース応答性インスリン分泌とも言う）とは、膵島が、例えば培養液中において低グルコース濃度から高グルコース濃度への変化（グルコース刺激）を感知してインスリン分泌を促進させることを言う。インスリンは、血糖を下げる方向に作用する唯一のホルモンであり、血中のグルコース濃度に応答して膵臓のランゲルハンス氏島（膵島）のβ細胞から分泌される。膵島機能が良好であれば、グルコース濃度の変動に応じて、適切にインスリンが分泌されるが、膵島機能が不良であれば、こうしたグルコース応答性が不良となる（ウエブサイト http://homepage.mac.com/yamajinaoki/toub/budou/budou.html 参照）。培養膵島では、膵島機能を評価するために、高グルコース濃度時に分泌されるインスリン分泌量に対する低グルコース濃度時に分泌されるインスリン分泌量の比率(高グルコース濃度時のインスリン分泌量／低グルコース濃度時のインスリン分泌量）（stimulation index；ＳＩ）として表し比較検討されており（Bergert H, Knoch KP, Meisterfeld R, Jager M, Ouwendijk J, Kersting S, Saeger HD, Solimena M,. Effect of oxygenated perfluorocarbons on isolated rat pancreatic islets inculture.Cell Transplant. 2005;14(7):441-8 参照）、ＳＩ値が1.5以上であることが好ましく、2.0以上であることがより好ましい。

高グルコース培養とは、培養液中のグルコース濃度が360g/l〜450g/lであり、低グルコース培養とは、培養液中のグルコース濃度が60g/l〜100g/lである培養条件を示す。

上記のように培養して得られる細胞培養物は、細胞移植、バイオ人工肝臓、バイオ人工膵島などの人工臓器をはじめ再生医療、細胞製剤、有用物質生産（バイオリアクター）、組織や器官・臓器の機能の調査・探索、新薬のスクリーニングや内分泌撹乱物質等の影響を評価するための動物実験代替法や細胞チップ等に好適に適用できる。

用語「細胞培養物」とは本発明のペプチドハイドロゲルを支持体として培養した細胞を前記支持体と共に培地、等張液、または緩衝液に懸濁した懸濁液を示す。培地、等張液、または緩衝液は、前記細胞に適合するよう適宜選択される。

本明細書において細胞製剤とは、前記細胞培養物をそのまま、もしくはフィルター濾過などにより濃縮したペレットなどの細胞塊などがあげられる。さらに、前記細胞製剤は、DMSOなどの保護剤を加え、凍結保存することもできる。細胞製剤として、より安全に利用するために、加熱処理、放射線処理、あるいはマイトマイシンC処理など、細胞製剤としての機能を残しつつ、病原細胞のタンパク質が変性する程度の条件下で処理をすることができる。

前記肝細胞または膵島を用いた細胞製剤の投与形態（移植方法）としては、例えば、右下腹部に小切開を置き、腸間膜の細い血管を露出して直視下にカテーテルを挿入して細胞を移植する方法、エコーにて肝臓の門脈を同定して、カテーテルを穿刺して細胞を移植する方法、または腹部エコーガイド下に脾臓を直接穿刺することにより脾臓に移植する方法（Nagata H, Ito M, Shirota C, Edge A, McCowan TC, Fox IJ: Route of hepatocyte delivery affects hepatocyte engraftment in the spleen. Transplantation, 76(4):732-4, 2003. 参照）が挙げられる。なかでも、エコーにて細胞移植を行なう方法の方が、侵襲が少ないため好ましく、腹部エコーガイド下に脾臓を直接穿刺することにより脾臓に移植する方法が最も好ましい。細胞製剤の投与量（移植量）は、1×10⁸〜1×10¹⁰細胞／個体が好ましく、5×10⁸〜1×10¹⁰細胞／個体がさらに好ましく、1×10⁸〜1×10¹⁰細胞／個体が最も好ましい。また、投与量（移植量）は、投与される患者の年齢、体重、症状などによって適宜変更することができる。

本発明により得られた肝細胞および膵島は、それぞれ肝不全等および糖尿病等を標的としたバイオ人工肝臓およびバイオ人工膵島のソースとして利用できる。

前記肝細胞または膵島を用いたバイオ人工臓器としては、例えば、本発明のペプチドハイドロゲルを支持体として培養した細胞を前記支持体と共に高分子素材で作成したデバイス中に封入した、拡散チャンバー型、マイクロカプセル型、中空糸型のバイオリアクターを使用するハイブリッド型の人工臓器などが挙げられる。バイオ人工臓器は、体外に装着して血管に接続するもの、体内に留置して血管に接続するもの、または血管に接続せずに腹腔内に留置するものの三つの形態がある。本発明の手法により得られた肝細胞または膵島は、いずれの形態のバイオ人工臓器にも使用可能である。

バイオ人工臓器として用いるバイオリアクターとしては、市販されているものを使用することが出来る。例えば、サーシバイオメディカル社（Circe Biomedical Inc.）（レキシントン、マサチューセッツ州、米国）の支援下でシダーズサイナイ医療センター（Cedars-Sinai Medical Center）（ロサンジェルス、カリフォルニア州、米国）のディメトリュー（Demetriou）らを中心としたブタ肝細胞を用いたバイオ人工肝臓治療用のヘパトアシスト（HepatAssist）（Hui T, Rozga J, Demetriou AA. J Hepatobiliary Pancreat Surg 2001; 8: 1-15. 参照）や、ブタ肝細胞を使用したドイツのGerlachらのＭＥＬＳ（モジュラー体外肝臓システム（Modular Extracorporeal Liver System））など、様々なタイプが知られている。これらのリアクターは、もちろん本発明において使用することができるが、細胞が付着するための足場が無いため、細胞はただ単に、中空糸内スペースか、中空糸外スペースに充填されるのみで浮遊した状態となる傾向がある。一般的に細胞は、浮遊状態では、分化機能が充分に発現されない傾向があり、さらに周りの細胞と衝突し、ストレス刺激を受けやすい。

したがって、本発明においては、肝細胞に足場が提供できるよう、中空糸、不織布およびペプチドハイドロゲルからなるバイオリアクターが好ましい。

中空糸膜としては、膜表面に細胞が付着して物質交換が妨げられることがなければどのようなものでも使用することができ、具体的には、従来医療用に用いられている市販の物、例えば、ポリスルフォン膜、エチレン−酢酸ビニルランダム共重合体けん化物膜（例えば、商品名：エバール、クラレメディカル株式会社製など）などが好ましい。市販の中空糸膜のポアサイズは、その用途から透析膜（〜5nm）、血漿成分分離膜（20〜30nm）、血漿分離膜（30〜200nm）などがある。物質の透過性の点からは、血漿分離膜（30〜200nm）が好ましい。

不織布としては、細胞が接着することが出来るように加工・修飾されているものが好ましい。なかでも、その加工のしやすさの点から、ポリ四フッ化エチレン（ＰＴＦＥ）にポリアミノ酸ウレタン（ＰＡＵ）加工を施したものが好ましい。また、基底膜加工されたものも好ましい（持立克身ら、基底膜形成テクノロジーを用いた人工組織の構築.再生医療.Ｖｏｌ.5.Ｎｏ.3.ｐ57-63.2006参照）。

本発明のバイオリアクターの一実施態様を例に、その作製工程を図１３に示す。裏打ち１０が施された不織布１１の上に中空糸１２を並べる（図１３（a）参照）。ここで、裏打ち１０が施された不織布１１にはスリット１３が設けられている。これをロール状に巻く（図１３（ｂ）参照）。そのＸ−Ｘ線断面が図１３（ｃ）である。得られたロールを両端に液漏れ防止部材１４を設けた筒状容器１５に組み込み、バイオリアクター１６を得る。バイオリアクター１６には細胞注入口１７および細胞のサンプル採取を行なうことが可能な取り出し口１８が設けられており、スリット１３は、細胞注入口１７と連絡するように配置される。さらに、バイオリアクター１６には、流体入口１９および流体出口２０が設けられている。流体入口１９および流体出口２０は、中空糸１２の内部と連通している。流体入口１９および流体出口２０は、バイオ人工臓器においてはそれぞれ血液の流入口、流出口となる。

バイオリアクターに細胞または細胞培養物を充填させる方法としては、例えば、試験管内で細胞を培養し必要な細胞数をバイオリアクターに充填させる方法と、バイオリアクター内部をPuraMatrixであらかじめ加工しておき、そのなかで細胞を培養する方法とがある。いずれの場合も、細胞の充填には、細胞懸濁液を10〜50mlの注射器を使用して、リアクターに装着されている細胞注入口より注入することが好ましい。

また、このようなバイオリアクターを使用するバイオ人工臓器による治療は、安全かつ科学的に施行するために、１）人工臓器リアクターの流入圧と流出圧のリアルタイムでのモニタリング、２）気泡が発生した際のアラームの作動、３）リアクターの温暖化（37℃）などができる機能を一体化した装置で実施されることが好ましい。

本発明のバイオリアクターはまた、有用物質生産、組織や器官・臓器の機能の調査・探索、新薬のスクリーニングや内分泌撹乱物質等の影響を評価するための動物実験代替法等にも好適に適用できる。

本発明のバイオリアクターは、肝細胞の機能であるタンパク質産生能、糖新生能、尿素産生能、血液の解毒および浄化能、ならびにアミノ酸、糖質および脂質代謝能を有するバイオリアクターとして使用することができる。解毒としては、例えば、アンモニア、ジアゼパムおよびリドカインを代謝することができ、代謝率としては、ブタ肝細胞ではそれぞれ20〜100％、15〜100％、20〜100%代謝できることが好ましく、それぞれ30〜100％、25〜100%、25〜100%代謝できることがより好ましい。ヒト肝細胞のアンモニア代謝率としては、15〜100%代謝できることが好ましく、20〜100%代謝できることがより好ましい。

本発明のバイオ人工膵島は、例えば、膵島の機能であるインスリンの製造に使用することができる。インスリン産生量は培養液中のグルコース濃度を感知して調節できることが好ましく、低グルコース濃度、高グルコース濃度、ついで低グルコース濃度での培養時にそれぞれ0.4〜0.8μg/l（膵島10個）、0.7〜1.5μg/l（膵島10個）、0.5〜1.2μg/l（膵島10個）産生されることが好ましく、低グルコース濃度時と高グルコース濃度時におけるインスリン産生量の差が0.3μg/l（膵島10個）以上であることが好ましい。またグルコース刺激に対してインスリン分泌が低グルコース濃度時と比べ、高グルコース濃度時に1.5倍以上になることが好ましく、2.0倍以上になることがより好ましい。さらに、高グルコース濃度から低グルコース濃度に戻したときのインスリン産生量が低下することが好ましく、インスリン産生量の差が0.3μg/l（膵島10個）以上であることが好ましい。

本発明のバイオ人工肝臓は、例えば、肝細胞に本来備わっている産生成分である血清アルブミンや各種凝固因子などの生理活性物質の製造に使用することができる。血清アルブミンの製造は、得られた培養液をアフィニティーカラムなど、通常タンパク質の精製に使用される方法によって精製することにより行なうことができる。

本発明のバイオ人工膵島は、例えば、膵島に本来備わっている産生成分であるインスリンの製造に使用することができる。インスリンの製造は、得られた培養液をアフィニティーカラムなど、通常タンパク質の精製に使用される方法によって精製することにより行なうことができる。

本発明のバイオ人工肝臓は、新薬のスクリーニングなど、臨床実験における動物実験代替法に使用することができる。例えば、新規医薬候補化合物が臨床試験でドロップアウトする原因の1/3は、ラットやイヌを用いた動物で予測された薬物動態がヒトで再現しないことによるものである。その原因は代謝種差が大きく関与しているためである。そこで、フェニックスバイオ（株）では、第一製薬と共同して、ヒト肝細胞を持つキメラマウスを用いたADME試験（動物にRI標識化合物を投与して吸収・分布・代謝・排泄を調べる試験）でヒトにおける薬物代謝を予測することによって、研究期間を短縮し、医薬品開発の成功確率を高めることを目的にビジネスがスタートしている（ウエブサイト http://home.hiroshima-u.ac.jp/kohog/press/h16/040716b-1.html 参照）。彼らは、1億3千万円の売り上げを計画していることからも伺えるように、医薬品開発ではヒトでのデータを予測できるバイオ人工肝臓は非常に有用であることわかる。しかし、このヒト肝細胞キメラマウスでは、肝臓の80〜90％をヒト肝細胞で置き換えたものであり、げっ歯類の代謝活性はヒトの10倍あるため、90％置き換わっても、活性レベルでマウスとヒトが同じ程度になってしまうため、代謝に種差が無い化合物の評価には使えない欠点ある。さらに、ヒト肝細胞キメラマウスは、免疫不全のSCIDマウスを使用しているために、通常のマウスに対する毒性用量よりも低い投与量でも、キメラマウスが死亡するケースが多いことも問題であると言われている。また、１）動物にヒト肝細胞を移植する必要、２）動物を飼育する煩雑性が伴うため、我々が提案するプロジェクトは、キメラマウスより優位性があるため好ましい。また、動物愛護の点からも好ましい。

本発明のバイオ人工膵島は、例えば、国内のみならず国際的にも年々増加の一途をたどっている糖尿病患者に移植が可能である。ヒト糖尿病の予防と制圧が、21世紀における人類の大きな課題であるといっても過言ではない。そこで、多くの製薬メーカーが糖尿病薬の開発に取り組んでいる（ウエブサイト http://homepage3.nifty.com/saio/Priority-b.pdf 参照）。
近年、トラスジェニック（Tg）動物の作成が容易になり、種々のユニークな特性を持つ糖尿病Tg動物が誕生している。これらのTg動物の場合、系統の確立、維持、繁殖、供給は大変な作業である。モデル動物の確立には多年月と多大な労力・忍耐がかかり、近年のように時の流れが速くなるなかなかじっくりと取り組める課題ではなくなってきている。さらに、系統の繁殖・維持にはマンパワーと設備が必要であり、役割が終了したモデル動物の場合、消滅してしまう危険もある。また、ヒト糖尿病と糖尿病モデル動物との相違点から、開発医薬品の臨床試験段階でのドロップアップが多いのが問題となっている。本発明のバイオ人工膵島は、こうした問題点を解決できるため好ましい。

本発明を以下に実施例をあげて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１
＜ブタ肝細胞の分離および培養＞
ラージホワイト種の雄性ブタ（体重15〜20kg）を用いた。筋注用ケタラール1.5mlを注射し鎮静後、耳介静脈を確保しイソゾール５mg/kg、マスキュラックス1mg/kgを静脈内投与することで筋弛緩を得た。気管内送管後、人工呼吸器による調節呼吸下にセボフルレンによる全身麻酔で開腹手術を施行した。ブタの肝外側を外科的に切除（約80g）し、切除断面門脈および肝静脈より灌流をおこなった。まず、摘出された肝臓を１次灌流液（塩化ナトリウム9g/L、塩化カリウム0.42g/L、炭酸水素ナトリウム2.1g/L、グルコース0.9g/L、HEPES4.78g/L、エチレンジアミン四酢酸（EGTA）0.37g/L）にて灌流し、引き続きEDTAをのぞいた２次灌流液（塩化ナトリウム9g/L、塩化カリウム0.42g/L、炭酸水素ナトリウム2.1g/L、グルコース0.9g/L、HEPES4.78g/L）で灌流した．その後、肝臓を39℃に加温しつつ、ジスパーゼ（dispase）液（塩化ナトリウム9g/L、塩化カリウム0.42g/L、炭酸水素ナトリウム2.1g/L、グルコース0.9g/L、HEPES4.78g/L、ジスパーゼ8.4g/L）（合同酒精、東京、日本））で灌流し、最後にコラゲナーゼ液（塩化ナトリウム9g/L、塩化カリウム0.42g/L、炭酸水素ナトリウム2.1g/L、グルコース0.9g/L、HEPES4.78g/L、コラゲナーゼ0.5g/L（新田ゼラチン、大阪、日本）、塩化カルシウム一水和物0.55g/L）で灌流した。灌流後肝被膜を細切し肝細胞をコラゲナーゼ液中で分散、細胞浮遊液を75μmメッシュで濾過し、これを低速遠心（50g、2分）した。ペレットを一次洗浄液（塩化ナトリウム7g/L、塩化カリウム0.46g/L、塩化カルシウム一水和物0.13g/L、HEPES2.38g/L、ウシ血清アルブミン（BSA）1.0g/L（シグマ社製）、塩化マグネシウム六水和物0.1g/L、塩化マグネシウム七水和物0.1g/L、デオキシリボヌクレアーゼ（DNaseI）0.1g/L（ロッシュマンハイム社製ドイツ（Roche Mannheim Germany）））に再拡散して更に低速遠心（50g、75秒）した。この操作を３回繰り返した後、二次洗浄液（塩化ナトリウム7g/L、塩化カリウム0.46g/L、塩化カルシウム一水和物0.13g/L、HEPES2.38g/L、ウシ血清アルブミン1.0g/L（シグマ社製）、塩化マグネシウム六水和物0.1g/L、塩化マグネシウム七水和物0.1g/L）に分散した。分離されたブタ肝細胞は、肝細胞培養培地（William's E培地（シグマ社製）、10% ウシ胎仔血清（シグマ社製）、インシュリン1×10^-7mol/L（GIBCOBRL13007-018）（ギブコBRL社製）、上皮細胞成長因子（EGF）25μg/L（シグマ社製）、デキサメタゾン（dexametazone）1×10^-6mol/L（シグマ社製）、ペニシリン（penicillin）1×10⁵U/L、ストレプトマイシン（streptomycin） 1×10⁵μg/L）に拡散したのち、インサート不使用培養またはインサート使用培養をおこなった。

（インサート不使用培養）
PuraMatrix（Ａ群）、コラーゲンタイプI（単層）（Ｂ群）、またはマトリゲル（Ｃ群）でコートした１２穴プレート（バイオコート（BIOCOAT）ベクトンディッキンスンラブウエアー社製（Becton Dickinson Labware））に播種（2×10⁵細胞/穴）したのち、18時間37℃、5％CO₂下で培養したブタ肝細胞を下記実施例２〜６に用いた。なお、培地の交換は２日毎に行った。

（インサート使用培養）
インサート（ベクトンディッキンスンバイオサイエンス社）を使用し、インサートのフィルター上で細胞培養を行った。この手法は培養液を新しい液と交換する際に、インサートを取って、培養液の交換ができる。その結果、培地交換に伴う支持体への機械的なダメージの軽減することが可能となる。PuraMatrix（Ａ群）、コラーゲンタイプＩ（単層）（インサートの上にコラーゲンを添加し、培養液に室温で一晩浸透させた後に細胞を播種）（Ｂ群）、マトリゲル（インサートの上にマトリゲルを添加し、培養液に室温で一晩浸透させた後に細胞を播種）（Ｃ群）、またはコラーゲンサンドイッチ（コラーゲン単層の間に肝細胞を培養するものであって、まずコラーゲン単層を敷いて、そして肝細胞をその上に播種し、最後にコラーゲン単層をその上に敷くことで三次元培養に近い環境を細胞に提供）（Ｄ群）と細胞を播種（2×10⁵細胞/インサート）したのち、18時間37℃、5％CO₂下で培養したブタ肝細胞を下記実施例２〜６に用いた。なお、培地の交換は２日毎におこなった。なお、PuraMatrixを支持体とした培養（Ａ群）では、下記の工程により細胞を播種する方法を採用した。
１）室温（RT温度）にて、PuraMatrixを燐酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline (PBS))で0.5％に希釈したものを調製した。
２）PBS（RT温度）に肝細胞を希釈（2×10⁵細胞/ml）し、これと同量の0.5％濃度の前記PuraMatrixと混合後、素早く（5秒以内に）200μｌのチューブにてピペティングを行い、インサートの底に、PuraMatrix＋PBSにて希釈した肝細胞を混ぜたものを播種した。

このとき、PuraMatrixのpHが低いために細胞障害が惹起されるのを極力避けるために、インサートを入れるための培養皿12穴プレートにあらかじめ肝細胞培養培地を満たしておいた。それにて、ｐHが生理的pHに調節される。
３）5分間RT温度にて、インサートをおいた後に、インサートを取り出し、素早く培養皿12穴プレートの肝細胞培養培地を新しいものに変えた。そして、インサートを乗せた。
４）10分間RT温度にて、そのままの状態で、PuraMatrixのpHの調節を行った。
５）さらにRT温度にて、インサートを取り出し、素早く培養皿12穴プレートの肝細胞培養培地を新しいものに変えた。そして、インサートを乗せた。
６）４〜５）の作業を再度行った後に37℃、5％CO₂下の培養器で、そのまま培養を施行した。

実施例２
＜位相差顕微鏡および電子顕微鏡による培養ブタ肝細胞の形態学的検討＞
（インサート不使用培養）
培養ブタ肝細胞の培養状態を培養１、７および１４日目に位相差顕微鏡下にて観察しＡ、Ｂ群間で比較した。PuraMatrix（Ａ群）を使用した群では、細胞は球状の形態を保持し、個々の細胞は凝集塊を徐々に形成した（図２（ａ）の写真１、２および３参照）。そして、培養5日目のブタ肝細胞の培養状態を電子顕微鏡下にて観察した結果、三次元的なスフェロイドを肝細胞が形成していることが確認された（図２（ｂ）の写真１：PuraMatrixのみ、写真２：PuraMatrix上を一杯に覆うブタ肝細胞、写真３：PuraMatrix上で三次元的なスフェロイドを形成するブタ肝細胞、写真４：PuraMatrix上で三次元的なスフェロイドを形成し始めるブタ肝細胞、写真５：写真４の弱拡大像、写真６：PuraMatrix上で三次元的なスフェロイドを形成するブタ肝細胞）。近年、スキャフォールド上で細胞を三次元培養すると細胞機能が向上、維持されることが知られてきており、培養ブタ肝細胞においても三次元的なスフェロイドを形成することから、PuraMatrixでブタ肝細胞を培養することが機能の向上に有用であることが強く示唆された。一方、コラーゲンタイプI（単層）（Ｂ群）で培養したブタ肝細胞は平坦に培養フラスコの表面に付着した（図２（ａ）の写真４参照）。そして、経時的に細胞数は減少しスフェロイド形成は観察されなかったことから（図２（ａ）の写真４、５および６参照）ブタ肝細胞の培養にはPuraMatrixがより適していることが明らかとなった。

（インサート使用培養）
培養ブタ肝細胞の培養状態を培養3日目に透過電子顕微鏡下にて観察した（図２（ｃ）および２（ｄ）参照）。PuraMatrix（Ａ群）を使用した群では、透過電子顕微鏡下に、細胞接着装置５、毛細胆管６が肝細胞間に形成された。これは、細胞培養が高次元培養であることを示す。一方、Ｂ、Ｃ、Ｄ群で培養したブタ肝細胞ではこれらの形成は認められなかったことから、ブタ肝細胞の培養にはPuraMatrixおよびインサートの使用がより適していることが明らかとなった。

実施例３
＜ブタ肝細胞の生存能の測定＞
（インサート不使用培養）
生存試験（live/dead test）（キット名：Live/Dead Double Staining Kit、カタログ番号QIA76、コスモ・バイオ社製（東京都江東区））にて培養１、７および１４日目のブタ肝細胞の生存能をＡ、Ｂ群について測定し比較した。生きている細胞は細胞全体が緑色に、死滅している細胞は細胞全体が赤色に染まる。PuraMatrix（Ａ群）を使用した群では、ほとんどの細胞は緑色を呈しており、生存していることが明らかであった（図３の写真１、２および３参照）。一方、コラーゲンタイプI（単層）（Ｂ群）で培養したブタ肝細胞は、培養１日目では緑色を呈しており生存を確認できたが（図３の写真４参照）、培養７および１４日目では、死細胞である赤色を呈する細胞のみとなった（図３の写真５および６参照）ことから、ブタ肝細胞の培養にはPuraMatrixがより適していることが明らかとなった。なお、添付の写真は白黒２階調に変換したものであるので、染色された色は表現されていない。

実施例４
＜アンモニア代謝能の測定＞
（インサート不使用培養）
培養ブタ肝細胞のアンモニア代謝能をＡ、Ｂ群間で測定し比較した。培養１、７および１４日目のブタ肝細胞培地に硫酸アンモニウム（0.56mM）を負荷し、24時間後の培地のアンモニアの濃度を計測（富士ドライケムスライド（Fuji Co., Tokyo, Japan））し、代謝率を算出し、その結果を図４（ａ）および表１（ａ）に示した。ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（Ａ群）を使用した群で有意にアンモニアの代謝率がコラーゲンタイプＩ（単層）（Ｂ群）と比較して良好であった。なお図および表中の培養液のみ、とは培養液のみで細胞をふくまないことを意味しており、有意差検定には、ANNOVA検定を施行している。

（インサート不使用培養）
培養ブタ肝細胞のアンモニア代謝能をＡ、Ｂ、Ｃ群間で測定し比較した。培養１、７および１４日目のブタ肝細胞培地に硫酸アンモニウム（0.56mM）を負荷し、24時間後の培地のアンモニアの濃度を計測（富士ドライケムスライド）し、代謝率を算出し、その結果を図４ｂおよび表１ｂに示した。PuraMatrix（Ａ群）を使用した群で有意にアンモニアの代謝率がコラーゲンタイプＩ（単層）（Ｂ群）マトリゲル（Ｃ群）と比較して良好であった。なお図および表中の培養液のみ、とは培養液のみで細胞をふくまないことを意味しており、有意差検定には、ANNOVA検定を施行している。

（インサート使用培養）
培養ブタ肝細胞のアンモニア代謝能をＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ群間で測定し比較した。培養１、７、１４および２１日目のブタ幹細胞培地に硫酸アンモニウム（0.56mM）を負荷し、24時間後の培地のアンモニアの濃度を計測（富士ドライケムスライド）し、代謝率を算出し、その結果を図４ｃおよび表１ｃに示した。PuraMatrix（Ａ群）を使用した群で有意にアンモニアの代謝率がコラーゲンタイプＩ（単層）（Ｂ群）マトリゲル（Ｃ群）、コラーゲンサンドイッチ（Ｄ群）と比較して良好であった。なお図および表中の培養液のみ、とは培養液のみで細胞をふくまないことを意味しており、有意差検定には、ANNOVA検定を施行している。

実施例５
＜リドカイン代謝能の測定＞
（インサート不使用培養）
培養ブタ肝細胞のリドカイン代謝能をＡ、Ｂ群間で測定し比較した。培養１、７および１４日目のブタ肝細胞培地にリドカイン（1mg/ml）を負荷し、24時間後の培地のリドカインの濃度を計測（SRL株式会社に依頼）し、代謝率を算出し、その結果を図５および表２に示した。PuraMatrix（Ａ群）を使用した群で有意にリドカインの代謝率がコラーゲンタイプＩ（単層）（Ｂ群）と比較して良好であった。なお図および表中の培養液のみ、とは培養液のみで細胞をふくまないことを意味しており、有意差検定には、ANNOVA検定を施行している。

（インサート不使用培養）
培養ブタ肝細胞のリドカイン代謝能をＡ、Ｂ、Ｃ群間で測定し比較した。培養１、７および１４日目のブタ肝細胞培地にリドカイン（1mg/ml）を負荷し、24時間後の培地のリドカインの濃度を計測（SRL株式会社に依頼）し、代謝率を算出し、その結果を図５ｂおよび表２ｂに示した。PuraMatrix（Ａ群）を使用した群で有意にリドカインの代謝率がコラーゲンタイプＩ（単層）（Ｂ群）、マトリゲル（Ｃ群）と比較して良好であった。なお図および表中の培養液のみ、とは培養液のみで細胞をふくまないことを意味しており、有意差検定には、ANNOVA検定を施行している。

（インサート使用培養）
培養ブタ肝細胞のリドカイン代謝能をＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ群間で測定し比較した。培養１、７、１４および２１日目のブタ肝細胞培地にリドカイン（1mg/ml）を負荷し、24時間後の培地のリドカインの濃度を計測（SRL株式会社に依頼）し、代謝率を算出し、その結果を図５ｂおよび表２ｂに示した。PuraMatrix（Ａ群）を使用した群で有意にリドカインの代謝率がコラーゲンタイプＩ（単層）（Ｂ群）、マトリゲル（Ｃ群）、コラーゲンサンドイッチ（Ｄ群）と比較して良好であった。なお図および表中の培養液のみ、とは培養液のみで細胞をふくまないことを意味しており、有意差検定には、ANNOVA検定を施行している。

実施例６
＜ジアゼパム代謝能の測定＞
（インサート不使用培養）
培養ブタ肝細胞のジアゼパム代謝能をＡ、Ｂ群間で測定し比較した。培養１、７および１４日目のブタ肝細胞培地にジアゼパム（1μg/ml）を負荷し、24時間後の培地のジアゼパムの濃度を計測（SRL株式会社に依頼）し、代謝率を算出し、その結果を図６ａおよび表３ａに示した。PuraMatrix（Ａ群）を使用した群で有意にジアゼパムの代謝率がコラーゲンタイプＩ（単層）（Ｂ群）と比較して良好であった。なお図および表中の培養液のみ、とは培養液のみで細胞をふくまないことを意味しており、有意差検定には、ANNOVA検定を施行している。

（インサート不使用培養）
培養ブタ肝細胞のジアゼパム代謝能をＡ、Ｂ、Ｃ群間で測定し比較した。培養１、７および１４日目のブタ肝細胞培地にジアゼパム（1μg/ml）を負荷し、24時間後の培地のジアゼパムの濃度を計測（SRL株式会社に依頼）し、代謝率を算出し、その結果を図６ｂおよび表３ｂに示した。PuraMatrix（Ａ群）を使用した群で有意にジアゼパムの代謝率がコラーゲンタイプＩ（単層）（Ｂ群）、マトリゲル（Ｃ群）と比較して良好であった。なお図および表中の培養液のみ、とは培養液のみで細胞をふくまないことを意味しており、有意差検定には、ANNOVA検定を施行している。

（インサート使用培養）
培養ブタ肝細胞のジアゼパム代謝能をＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ群間で測定し比較した。培養１、７、１４および２１日目のブタ肝細胞培地にジアゼパム（1μg/ml）を負荷し、24時間後の培地のジアゼパムの濃度を計測（SRL株式会社に依頼）し、代謝率を算出し、その結果を図６ｃおよび表３ｃに示した。PuraMatrix（Ａ群）を使用した群で有意にジアゼパムの代謝率がコラーゲンタイプＩ（単層）（Ｂ群）、マトリゲル（Ｃ群）、コラーゲンサンドイッチ（Ｄ群）と比較して良好であった。なお図および表中の培養液のみ、とは培養液のみで細胞をふくまないことを意味しており、有意差検定には、ANNOVA検定を施行している。

実施例７
＜ヒト肝細胞の分離および培養＞
米国で移植不適合と判断されたドナー肝を、米国のナショナルディジーズリサーチインターチェンジからＨＡＢ研究機構附属研究所（千葉県市川市、担当者：鈴木聡（すずきさとし）先生）を通じて入手した肝臓ブロック130ｇを上記実施例１のブタ肝細胞の分離と同様な手法で肝細胞へと分離し、PuraMatrix（Ａ群）またはコラーゲンタイプI（単層）（Ｂ群）でコートした６穴プレート（インサート不使用）に播種（5×10⁵細胞/穴）したのち、18時間37 ℃ 5％ CO₂下で培養しヒト肝細胞を下記実施例８および９に用いた。なお、培地の交換は2日毎に行った。

実施例８
＜位相差顕微鏡および電子顕微鏡による培養ヒト肝細胞の形態学的検討＞
培養ヒト肝細胞の培養状態を培養１および５日目に位相査顕微鏡下にて観察しＡ、Ｂ群間で比較した。PuraMatrix（Ａ群）を使用した群では、細胞は球状の形態を保持し、個々の細胞は凝集塊を徐々に形成した（図７ａの写真３および４参照）。そして、培養5日目のヒト肝細胞の培養状態を電子顕微鏡下にて観察した結果、三次元的なスフェロイドを肝細胞が形成していることが確認された（図７ｂの写真１：PuraMatrix上を一杯に覆うヒト肝細胞、写真２：PuraMatrix上で三次元的なスフェロイドを形成し始めるヒト肝細胞、写真３：写真１の拡大像、写真４：PuraMatrix上で三次元的なスフェロイドを形成するヒト肝細胞）。近年、スキャフォールド上で細胞を三次元培養すると細胞機能が向上、維持されることが知られてきており、培養ヒト細胞においても三次元的なスフェロイドを形成することから、PuraMatrixでヒト肝細胞を培養することが機能の向上に有用であることが強く示唆された。一方、コラーゲンタイプI（単層）（Ｂ群）で培養したヒト肝細胞は平坦に培養フラスコの表面に付着した（図７ａの写真１参照）。そして、経時的に細胞数は減少しスフェロイド形成は観察されなかったことから（図７ａの写真１および２参照）ことから、ヒト肝細胞の培養にはPuraMatrixがより適していることが明らかとなった。

実施例９
＜アンモニア代謝能の測定＞
培養ヒト肝細胞のアンモニア代謝能をＡ、Ｂ群間で測定し比較した。インサート不使用培養１、３および５日目のヒト肝細胞培地に硫酸アンモニウム（0.56mM）を負荷し、24時間後の培地のアンモニアの濃度を計測（富士ドライケムスライド）し、代謝率を算出し、その結果を図８ａおよび表４ａに示した。PuraMatrix（Ａ群）を使用した群で有意にアンモニアの代謝率がコラーゲンタイプＩ（単層）（Ｂ群）と比較して良好であった。なお図および表中の培養液のみ、とは培養液のみで細胞をふくまないことを意味しており、有意差検定には、ANNOVA検定を施行している。

培養ヒト肝細胞のアンモニア代謝能をＡ、Ｂ、Ｃ群間で測定し比較した。インサート不使用培養１、３および５日目のヒト肝細胞培地に硫酸アンモニウム（0.56mM）を負荷し、24時間後の培地のアンモニアの濃度を計測（富士ドライケムスライド）し、代謝率を算出し、その結果を図８ｂおよび表４ｂに示した。PuraMatrix（Ａ群）を使用した群で有意にアンモニアの代謝率がコラーゲンタイプＩ（単層）（Ｂ群）マトリゲル（Ｃ群）と比較して良好であった。なお図および表中の培養液のみ、とは培養液のみで細胞をふくまないことを意味しており、有意差検定には、ANNOVA検定を施行している。

実施例１０
＜ブタ膵島の培養＞
実施例１と同様にラージホワイト種の雄性ブタ（体重15〜20kg）を用いた。筋注用ケタラール1.5mlを注射し鎮静後、耳介静脈を確保しイソゾール５mg/kg、マスキュラックス1mg/kgを静脈内投与することで筋弛緩を得た。気管内送管後、人工呼吸器による調節呼吸下にセボフルレンによる全身麻酔で開腹手術を施行した。ブタ膵島を単離する工程は、ヒト膵島を分離する手法に準じ（Lakey JRT, Kobayashi N, Shapiro AMJ, Ricordi C, Okitsu T: Current human islet isolation protocol. Medical Review Co., Ltd, Osaka, Japan, 2004. 参照）、公知文献（Yonekawa Y, Matsumoto S, Okitsu T, Arata T, Iwanaga Y, Noguchi H, Nagata H, O'Neil JJ, Tanaka K: Effective islet isolation method with extremely high islet yields from adult pigs. Cell Transplant. 14(10):757-62, 2005. 参照）の手法に従った。当業者であれば、当該文献を参照する事で膵島の単離は可能である。単離したブタ膵島を、William's E培地に10％ウシ胎仔血清、インスリン10^-7mol／l（シグマ社）、デキサメタゾン10^-6mol／l（シグマ社）、EGF25μg／ml、ニコチンアミド10mM（シグマ社）、抗生物質のペニシリンＧ/ストレプトマイシン（シグマ社）の組成のものに拡散させ、PuraMatrix（Ａ群）またはコラーゲンタイプI（単層）（Ｂ群）でコートした６穴プレート（インサート不使用）に膵島10個を播種したのち、18時間37 ℃ 5％ CO₂下で培養した。

実施例１１
＜電子顕微鏡による培養ブタ膵島の形態学的検討＞
培養ブタ膵島の培養状態を培養５日目に電子顕微鏡下にて観察しＡ、Ｂ群間で比較した（図９参照）。図９中のスケールバーはＡ、Ｂ群共に１００μｍを示す。PuraMatrix（Ａ群）を使用した群では、細胞は球状の形態を保持しており形態学的には、１．形状が「球状：５点」、２．辺縁の形状が「均整のとれた：５点」、３．統合性が「ソリッド／コンパクト：５点」、４．直径が「培養膵島の全体が125〜175μm：３点」、評価値の合計が18点であった（図９のＡ群参照）。一方、コラーゲンタイプI（単層）（Ｂ群）で培養したブタ膵島は形がくずれていびつになっており形態学的には、１．形状が「いびつな球状：３点」、２．辺縁の形状が「ほぼ不ぞろいの：2点」、３．統合性が「ほぼ断片化した：２点」、４．直径が「培養膵島の全体が100μm未満：１点」、評価値の合計が8点であった（図９のＢ群参照）。

実施例１２
＜インスリン産生能の測定＞
培養ブタ膵島のインスリン産生能をＡ、Ｂ群間で測定し比較した。低グルコースDMEM(グルコース濃度：100g/l)（ギブコ社、オークランド、ニュージャージー州）に10%FCS、ニコチンアミド10mM、ペニシリンＧ／ストレプトマイシンの組成のものを用いて、細胞が60%密集となるまで24時間培養した（低グルコース）。つぎに培地を高グルコースDMEM(グルコース濃度：450g/l)（ギブコ社、オークランド、ニュージャージー州）に10%FCS、ニコチンアミド10mM、ペニシリンＧ／ストレプトマイシンの組成のものに交換し、6時間培養した（高グルコース）。高グルコース培養後、培地を低グルコースDMEMに交換し6時間培養した（低グルコース（after））。それぞれの培養終了後、ウサギ抗ヒトインスリン抗体（ダコ・サイトメーション（株）製、京都、日本）を用いる免疫染色法にて、培養液中におけるインスリンの産生量（μg/l）を測定した。染色結果を図１０および表５に示す。培養５日目において、PuraMatrix（Ａ群）を使用した群では、高グルコース濃度時にインスリン分泌量が増加し、低グルコース濃度時にはインスリン分泌量が低下した。この結果により、本発明により得られた膵島は、従来法であるコラーゲンタイプＩ（単層）（Ｂ群）を使用し培養した膵島と比較して、グルコース濃度を感知しインスリンを分泌する機能をより長期間保持することが明らかとなった。なお図および表中の培養液のみ、とは培養液のみで細胞をふくまないことを意味しており、有意差検定には、ANNOVA検定を施行している。

実施例１３
＜ヒト膵島の培養＞
カナダのアルバータ大学から提供された健常分離ヒト膵島（カナダ、アルバータ大学、ヒト膵島移植プログラム、ジョナサンレイキー（Jonathan RT. Lakey）博士より、当業者は入手可能である）をT25培養フラスコに播いた。低グルコースDMEMに10%ウシ胎仔血清、インスリン10^-7mol／l、デキサメタゾン10^-6mol／l、EGF25μg／ml、ニコチンアミド10mM、抗生物質のペニシリンＧ/ストレプトマイシンの組成のものにヒト膵島を拡散させ、PuraMatrix（Ａ群）またはコラーゲンタイプI（単層）（Ｂ群）でコートした6穴プレート（インサート不使用）に膵島10個を播種したのち、18時間37 ℃ 5％ CO₂下で培養した。

実施例１４
＜電子顕微鏡による培養ヒト膵島の形態学的検討＞
培養ヒト膵島の培養状態を培養５日目に電子顕微鏡下にて観察しＡ、Ｂ群間で比較した（図１１参照）。図１１中のスケールバーはそれぞれ５０μｍ（Ａ群）および１００μｍ（Ｂ群）を示す。PuraMatrix（Ａ群）を使用した群では、細胞は球状の形態を保持しており形態学的には、１．形状が「球状：５点」、２．辺縁の形状が「いびつな球状：３点」、３．統合性が「ソリッド／コンパクト：５点」、４．直径が「培養膵島の全体が125〜175μm：３点」、評価値の合計が16点であった（図１１のＡ群参照）。一方、コラーゲンタイプI（単層）（Ｂ群）で培養したブタ膵島は形がくずれていびつになっており形態学的には、１．形状が「ほぼ扁平：２点」、２．辺縁の形状が「不ぞろいの：１点」、３．統合性が「ややソリッド／コンパクト：３点」、４．直径が「培養膵島の全体が125〜175μm：３点」、評価値の合計が9点であった（図１１のＢ群参照）。

実施例１５
＜インスリン産生能の測定＞
培養ヒト膵島のインスリン産生能をＡ、Ｂ群間で測定し比較した。低グルコースDMEM(グルコース濃度：100g/l)（ギブコ社、オークランド、ニュージャージー州）に10%FCS、ニコチンアミド10mM、ペニシリンＧ／ストレプトマイシンの組成のものを用いて、細胞が60%密集となるまで24時間培養した（低グルコース）。つぎに培地を高グルコースDMEM(グルコース濃度：450g/l)（ギブコ社、オークランド、ニュージャージー州）に10%FCS、ニコチンアミド10mM、ペニシリンＧ／ストレプトマイシンの組成のものに交換し、6時間培養した（高グルコース）。高グルコース培養後、培地を低グルコースDMEMに交換し6時間培養した（低グルコース（after））。それぞれの培養終了後、ウサギ抗ヒトインスリン抗体（ダコ・サイトメーション（株）製、京都、日本）を用いる免疫染色法にて、培養液中におけるインスリンの産生量（μg/l）を測定した。染色結果を図１２および表６に示す。培養７日目において、PuraMatrix（Ａ群）を使用した群では、高グルコース濃度時にインスリン分泌量が増加し、低グルコース濃度時にはインスリン分泌量が低下した。この結果により、本発明により得られた膵島は、従来法であるコラーゲンタイプＩ（単層）（Ｂ群）を使用し培養した膵島と比較して、グルコース濃度を感知しインスリンを分泌する機能をより長期間保持することが明らかとなった。なお図および表中の培養液のみ、とは培養液のみで細胞をふくまないことを意味しており、有意差検定には、ANNOVA検定を施行している。

本発明によれば、ブタ肝細胞、ヒト肝細胞、ブタ膵島、ヒト膵島などの細胞をペプチドハイドロゲルを支持体として用いて培養することにより、細胞の生存、細胞形態および細胞機能が維持された状態で長期に渡って高次元培養することが可能となる。

配列番号１：PuraMatrix
配列番号２：EAK16
配列番号３：RAD16

Claims

ブタ初代肝細胞、ヒト初代肝細胞、ブタ初代膵島、ヒト初代膵島よりなる群から選ばれる１種の細胞を、自己組織化ペプチドハイドロゲルを支持体として培養することを特徴とする細胞の培養方法であって、該自己組織化ペプチドが、Ａｃ−（ＲＡＤＡ） ₄ −ＣＯＮＨ ₂ （配列番号１）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる培養方法。
前記細胞がブタ初代肝細胞またはヒト初代肝細胞であって、さらにインサートの存在下で培養することを特徴とする請求項１記載の培養方法。
前記細胞がブタ初代膵島またはヒト初代膵島であって、さらにインサートの存在下で培養することを特徴とする請求項１記載の培養方法。
請求項１または２記載の培養方法であって、培養された細胞が、スフェロイドの形態を有する肝細胞である培養方法。
請求項１、２または４記載の培養方法であって、培養された細胞が、細胞接着装置および／または毛細胆管が形成されている肝細胞である培養方法。
請求項１または３記載の培養方法であって、培養された細胞が、膵島の形態学的検査項目：形状、辺縁の形状、細胞統合性、および細胞直径についての評価値の合計が１２点以上である膵島であって、グルコース刺激に対して低グルコース濃度時と高グルコース濃度時のインスリン分泌の比が１．５倍以上である特徴を有する膵島である培養方法。
ブタ初代肝細胞またはヒト初代肝細胞と、自己組織化ペプチドハイドロゲルとを含むバイオリアクターであって、該自己組織化ペプチドが、Ａｃ−（ＲＡＤＡ） ₄ −ＣＯＮＨ ₂ （配列番号１）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなるバイオリアクター。
アンモニア、ジアゼパム、またはリドカインを代謝する請求項７記載のバイオリアクター。
ブタ初代膵島またはヒト初代膵島と、自己組織化ペプチドハイドロゲルとを含むバイオリアクターであって、該自己組織化ペプチドが、Ａｃ−（ＲＡＤＡ） ₄ −ＣＯＮＨ ₂ （配列番号１）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなるバイオリアクター。
インスリンを産生する請求項９記載のバイオリアクター。
前記自己組織化ペプチドハイドロゲルがＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）であることを特徴とする請求項１記載の培養方法。