JP6704604B2 - 肝代謝物の毛細胆管様構造への蓄積と排泄を促進する肝細胞培養装置、並びに該肝細胞培養装置を用いた胆汁中又は血液中排泄感受性の候補化合物及び該候補化合物の肝代謝物の評価方法 - Google Patents

Description

本発明は、肝代謝物の毛細胆管様構造への蓄積と排泄を促進する肝細胞培養装置、並びに該肝細胞培養装置を用いた胆汁中又は血液中排泄感受性の候補化合物及び該候補化合物の肝代謝物の評価方法に関する。
本願は、２０１５年３月２７日に、日本に出願された特願２０１５−０６５８２６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

薬物又はその他の化合物は、口腔投与すると胃又は小腸で吸収され、血液中に流れ込み門脈等の血管を経て肝臓に入る。その後肝臓において、薬物又はその他の化合物は肝細胞内に吸収され代謝されるが、肝代謝物の排泄経路は次の二通り存在する。一つは、肝代謝物は胆汁と同様に毛細胆管内に排泄され胆のうに到達し、腸を経て便として体外に排泄される経路である。もう一つは、肝代謝物は類洞血管内に排泄され腎臓に到達し、尿として体外に排泄される経路である。この２つの肝代謝物の排泄経路は、肝細胞内に薬物又はその他の化合物を取り込むトランスポーターも肝代謝物を排泄するトランスポーターも異なることが知られており、肝代謝物の種類や量も動物によって異なる。

製薬業界においては、特にシトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）に着目し、薬物の研究開発が進められている。ＣＹＰ３Ａ４はシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）の分子種の一種であり、人体に存在する生体異物を代謝する酵素の主要なものの1つである。また、肝臓に存在するＣＹＰのうちの大部分を占める。
ＣＹＰ３Ａ４による薬物の代謝を解析する際に、ヒトの凍結肝細胞では、ＣＹＰ３Ａ４の活性に個人差があるため、ＨｅｐａＲＧ（登録商標）というフランス国立衛生医学研究所 （ＩＮＳＥＲＭ）で開発されたヒト肝腫瘍由来細胞株が用いられる。ＨｅｐａＲＧ（登録商標）細胞は、ＣＹＰ３Ａ４についてヒト肝臓の平均的な活性を有すると考えられている。

さらに、現在、胆汁中排泄感受性の候補化合物の評価可能な培養系として、Ｄｒ．Ｂｒｏｕｗｅｒらが開発したサンドイッチ培養法が唯一の手法となっている。この手法では，コラーゲンゲルなどの細胞外マトリクスを用いて肝細胞を挟み込み培養することで、肝細胞間に毛細胆管様構造の形成を促進させるものである。具体的には、カルシウムを含む標準培地と、カルシウムを含まない培地を用意し、それぞれで肝細胞をサンドイッチ培養し、化合物を曝露させる。この時、カルシウムを含まない培地では、肝細胞間に毛細胆管様構造が構築されないため、肝代謝物は細胞外へ排出されてしまう。よって、化合物の曝露後、カルシウムを含む標準培地と、カルシウムを含まない培地での肝代謝物の差を分析することで、胆汁中排泄感受性の候補化合物を解析できる。

特許文献１，２には、サンドイッチ培養法を活用した、胆汁中排泄感受性の候補化合物のスクリーニング方法が開示されている。

特許文献３には、サンドイッチ培養法を活用した、被験化合物の肝毒性を評価する方法が開示されている。

特許第４４５１５７０号公報 特許第４９５１５０６号公報 特開２０１３−１７４１１号公報

ヒト凍結肝細胞はＣＹＰ３Ａ４の活性に個人差があるだけでなく、高価でありコストがかかる。また、前記ＨｅｐａＲＧ（登録商標）細胞は、ＣＹＰ３Ａ４の活性を回復させるために、２週間程度ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）存在下で培養する必要があり、培養時間を要する。さらに、購入するためにコストがかかる。

前記サンドイッチ培養法では、毛細胆管様構造に排泄された肝代謝物を解析するために、比較対象としてカルシウムを含まない環境で培養する手法をとっており、得られた結果が必ずしも生体内を反映した環境とは言えない。さらに、サンドイッチ培養法では通常の培養皿内に作製されるため、予め単層培養した胆管由来細胞の上に共培養することは不可能である。

本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、肝代謝物の毛細胆管様構造への蓄積と排泄を促進する肝細胞培養装置、並びに該肝細胞培養装置を用いた胆汁中又は血液中排泄感受性の候補化合物及び該候補化合物の肝代謝物の評価方法を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、複数の肝細胞を含む第一細胞培養物を、前記第一細胞培養物において肝細胞間に毛細胆管様構造を構築させることができる培養容器であって、該培養容器の外側面に生理活性物質を透過可能な膜を有する可搬の培養容器に培養させた後に、前記第一細胞培養物において肝代謝物の排泄活性を上げることができる第二細胞培養物の上に配置させ共培養させることで、前記第一細胞培養物において肝細胞間の毛細胆管様構造および肝細胞内に蓄積された肝代謝物の排泄を促進する肝細胞培養装置を、短時間で安価に得られることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は下記のとおりである。
（１）肝代謝物の毛細胆管様構造への蓄積と排泄を促進する肝細胞培養装置において、
複数の肝細胞を含む第一細胞培養物と、
前記第一細胞培養物において肝細胞間に毛細胆管様構造を構築させることができる培養容器であって、該培養容器の外側面に生理活性物質を透過可能な膜を有する可搬の培養容器と、
前記第一細胞培養物における肝代謝物の排泄活性を上げることができる第二細胞培養物と、
を有し、
前記可搬の培養容器に培養された第一細胞培養物を前記第二細胞培養物の上に配置させ、共培養させることを特徴とする肝細胞培養装置。
（２）さらに、前記可搬の培養容器が前記第一細胞培養物の代謝活性を向上させるものである（１）に記載の肝細胞培養装置。
（３）前記肝代謝物の排泄活性は、前記第一細胞培養物における肝細胞間の毛細胆管様構造および肝細胞内に蓄積された肝代謝物を排泄する活性である（１）又は（２）に記載の肝細胞培養装置。
（４）前記肝細胞が、ヒト、ラット、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ニワトリおよびカモからなる群から選択された肝正常組織、肝がん組織又は幹細胞に由来する培養肝細胞である、（１）〜（３）のいずれか一つに記載の肝細胞培養装置。
（５）前記第二細胞培養物が、ヒト、ラット、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ニワトリおよびカモからなる群から選択された上皮、間充織又は内皮に由来する培養細胞であって、肝内胆管上皮細胞、肝外胆管上皮細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、および、これら細胞の培養上清液からなる群から選択されたものである（１）〜（４）のいずれか一つに記載の肝細胞培養装置。

（６）前記生理活性物質を透過可能な膜がゲル化する細胞外マトリックス成分を含有する（１）〜（５）のいずれか一つに記載の肝細胞培養装置。
（７）前記ゲル化する細胞外マトリックス成分がコラーゲンである（６）に記載の肝細胞培養装置。
（８）肝細胞による胆汁中又は血液中排泄感受性の候補化合物及び該候補化合物の肝代謝物の評価方法であって、
複数の肝細胞を含む第一細胞培養物と、
前記第一細胞培養物において肝細胞間に毛細胆管様構造を構築させることができる培養容器であって、該培養容器の外側面に生理活性物質を透過可能な膜を有する可搬の培養容器と、
前記第一細胞培養物における肝代謝物の排泄活性を上げることができる第二細胞培養物と、
を有し、
（ａ）候補化合物を前記可搬の培養容器に培養された前記第一細胞培養物に曝露する工程と、
（ｂ）前記候補化合物を曝露された第一細胞培養物を、培養液のみを含む容器及び前記第二細胞培養物を含む容器の上にそれぞれ配置させ、培養する工程と、
（ｃ）前記第一細胞培養物の毛細胆管様構造の変化を確認し、さらに、前記可搬の培養容器中に排泄された物質と、培養液のみを含む容器及び前記第二細胞培養物を含む容器中にそれぞれ排泄された物質と、を回収する工程と、
（ｄ）前記回収物質から、排泄された肝代謝物及び量を解析する工程と、
を含む評価方法。
（９）さらに、前記可搬の培養容器が前記第一細胞培養物の代謝活性を向上させるものである（８）に記載の評価方法。
（１０）前記肝代謝物の排泄活性は、前記第一細胞培養物における肝細胞間の毛細胆管様構造および肝細胞内に蓄積された肝代謝物を排泄する活性である（８）又は（９）に記載の評価方法。

本発明の肝細胞培養装置によれば、短時間で安価に生体内を反映した環境において肝細胞で代謝された物質を得ることができる。肝細胞間に構築された毛細胆管様構造へ排泄された肝代謝物についても、肝細胞間のタイトジャンクションを破壊せずに合わせて回収することができる。
また、本発明の肝細胞培養装置を用いた胆汁中又は血液中排泄感受性の候補化合物及び該候補化合物の肝代謝物の評価方法によれば、活性化された薬物代謝酵素により代謝・排泄された胆汁中又は血液中への肝代謝物の種類、量、さらに前記候補化合物及び該候補化合物の肝代謝物の肝毒性について短時間で安価に評価することができる。

本発明における可搬の培養容器の一実施形態を例示した斜視図である。 本発明における第一細胞培養物の肝機能迅速賦活化工程について一態様を示す図である。図２中、ＰはＨｅｐＧ２細胞について拡大した模式図である。 実施例１における肝機能迅速賦活化後のＨｅｐＧ２細胞、並びに比較例としての固相および液相で培養したＨｅｐＧ２細胞のアルブミン産生レベル、尿素合成レベルおよびＣＹＰ３Ａ４活性レベルを示したグラフである。 実施例１における操作手順を例示した模式図である。図４中、ＱはＨｅｐＧ２細胞およびＴＦＫ−１細胞について拡大した模式図である。 実施例１の観察Ａ〜ＣにおけるＨｅｐＧ２細胞および当該細胞により代謝されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（励起波長：４９０ｎｍ、蛍光波長：５１４ｎｍ）を位相差顕微鏡（上段）および蛍光顕微鏡（下段）を用いて観察し、顕微鏡用デジタルカメラで撮影した写真である。 実施例２における条件ｉ）〜ｉｖ）の実験条件を例示した模式図である。 実施例３における培養時間３分、３０分、６０分でのＨｅｐＧ２細胞のみの単独培養（Ｈｏｍｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）におけるチャンバー内（上側）及びディッシュ内（下側）に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度、並びにＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞との共培養（Ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）におけるチャンバー内（上側）及びディッシュ内（下側）に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度を示すグラフである。 実施例４における培養時間３分、３０分、６０分、１８０分でのＨｅｐＧ２細胞のみの単独培養（Ｈｏｍｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）におけるチャンバー内（上側）及びディッシュ内（下側）に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度、並びにＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞との共培養（Ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）におけるチャンバー内（上側）及びディッシュ内（下側）に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度を示すグラフである。 実施例５における培養時間０時間、１時間、３時間、２３時間でのＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものと、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものについて、ＨｅｐＧ２細胞の細胞質中に残っていたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎおよびＨｅｐＧ２細胞の細胞間に構築された毛細胆管様構造に蓄積されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの経時的な変化を、蛍光顕微鏡を用いて観察し、顕微鏡用デジタルカメラで撮影した写真である。 実施例６におけるＨｅｐＧ２細胞のみの単独培養（Ｈｏｍｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）におけるチャンバー内（上側）及びディッシュ内（下側）に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞との共培養（Ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）におけるチャンバー内（上側）及びディッシュ内（下側）に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度、並びにＨｅｐＧ２細胞とＮＨＤＦｓとの共培養（Ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）におけるチャンバー内（上側）及びディッシュ内（下側）に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度を示すグラフである。 肝細胞及び毛細胆管に存在する膜タンパク質を示す模式図である。 実施例７におけるディッシュに直接ＨｅｐＧ２細胞を播種したもの、及びハイドロゲル膜チャンバーにＨｅｐＧ２細胞を播種し、賦活化したものでの、ＭＲＰ２及びＢＳＥＰに対する免疫染色を行った結果を示す画像である。

以下、実施形態を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。

［第一細胞培養物］
本発明の肝細胞培養装置において、第一細胞培養物は、複数の肝細胞を含む。前記肝細胞は、ヒト、ラット、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ニワトリおよびカモからなる群から選択された肝正常組織、肝がん組織又は幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間充織幹細胞等）に由来する培養肝細胞であることが好ましく、ヒトの凍結肝細胞であることがより好ましく、ヒト肝腫瘍由来細胞株であることがさらに好ましく、ヒト肝がん由来細胞株の一つであるＨｅｐＧ２細胞であることが最も好ましい。ＨｅｐＧ２細胞は、ヒト凍結肝細胞およびヒト肝腫瘍由来細胞株であるＨｅｐａＲＧ（登録商標）細胞と比べて安価であり、さらに後述の肝機能迅速賦活化により３日間という短期間でＣＹＰ３Ａ４の活性をヒト肝臓の平均的な活性を発現するＨｅｐａＲＧ細胞の２分の１程度まで上げることが可能である。

［生理活性物質を透過可能な膜を有する可搬の培養容器］
本発明の肝細胞培養装置において、前記第一培養物において肝細胞間に毛細胆管様構造を構築させるために、生理活性物質を透過可能な膜を外側面に有する可搬の培養容器を使用する。
本明細書において、「外側面」とは、培養容器の外側に接する全ての面を意味し、底面、側面、天井面を含む。中でも、本発明の肝細胞培養装置において、生理活性物質を透過可能な膜を底面に有することが好ましい。
生理活性物質を透過可能な膜を有する可搬の培養容器の具体的な実施形態を以下に示す。

図１は、本発明における生理活性物質を透過可能な膜を有する可搬の培養容器の一実施形態を例示した斜視図である。可搬の培養容器Ｘの具体的な構成および製造方法については、特開２０１２−１１５２６２号に開示されている。筒状の枠体１は、内部に細胞を保持するための空間を有している。枠体１の材料は、細胞培養に適した材料を適宜選択することができる。また、枠体１の形状も特に限定されず、例えば、円筒状や角筒状を例示することができる。具体的には、枠体１は、アクリル製やポリスチレン製の円筒チューブを好ましく例示することができる。

そして、この枠体１の一方の開放端面に接着剤で生理活性物質を透過可能な膜２が接着固定されている。開放端面の形状は特に限定されず、例えば、平面状や段差状、テーパー状、溝状などが例示することができるが、平面状が好ましい。さらにフィルム３と重層化している膜２を使用する場合には、膜２は枠体１と接着しているが、フィルム３を剥がして取り除くことができる。さらに、膜２が被覆固定されている枠体１の端面と対向する開放端面の外周縁部に、担体１の外側へ突出する係止部４を配設した。例えば、可搬の培養容器Ｘよりも大きな別の容器内にかけることで、容器内に培養容器Ｘを保持することができる。係止部４は、図１に例示した形態に限定されず、例えば、プラスチック材料等によって棒状、フランジ状などの形態とすることができる。

生理活性物質を透過可能な膜２を担体１に接着固定するための接着剤としては、接着性、細胞毒性を考慮して適宜選択することができ、具体的には、ウレタン系接着剤を好ましく例示することができる。例えば、ゴム系、シアンアクリレート系、アクリル系は、細胞毒性を示す場合があり、ホットメルト系は、生理活性物質を透過可能な膜２を熱変性させる場合があるため好ましくない。また、その他、生理活性物質を透過可能な膜２と枠体１とを接着固定する方法としては、生理活性物質を透過可能な膜２と枠体１との間に両面テープを介在させて接着固定する方法や、ヒートシーラーや熱板、超音波、レーザーなどを用いて生理活性物質を透過可能な膜２と枠体１とを熱溶着する方法などを例示することができる。

生理活性物質を透過可能な膜２が剥離可能なフィルム３としては、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、シリコン、サランラップ（登録商標）、ビニール、パラフィルム等の非吸水性のプラスチック製薄膜を例示することができ、特にシリコン処理ＰＥＴ薄膜が好ましい。シリコン処理ＰＥＴ薄膜は、撥水性に優れ、生理活性物質を透過可能な膜に対しての適度な接着性と剥離性が実現される（特願２０１４−１０９４９９号参照）。

本発明において、「生理活性物質」とは、培養液の成分および培養細胞の生産物質を意味しており、分子量の小さな物質から分子量２万以上の大きな物質まで含まれる。例えば抗生物質をはじめとする各種医薬品、細胞成長因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、またはゲル化しない細胞外マトリックス成分としてファイブロネクチン、エンタクチン、オステオポエチン等が挙げられる。

生理活性物質を透過可能な膜を構成する成分として、ハイドロゲルが好ましい。「ハイドロゲル」とは、高分子が化学結合によって網目構造をとり、その網目に多量の水を保有した物質を示し、より具体的には、天然物由来の高分子や合成高分子の人工素材に架橋を導入してゲル化させたものをいう。

ハイドロゲルの作製に用いられる天然物由来の高分子としては、ゲル化する細胞外マトリックス成分を含有することが好ましい。ゲル化する細胞外マトリックス成分としては、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型など）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどを含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカンなどを例示することができる。その他天然物由来の高分子として、ゼラチン、寒天、アガロースなどを使用することもできる。それぞれのゲル化に至適な塩等の成分、その濃度、ｐＨなどを選択しハイドロゲルを作製することが可能である。原料を組み合わせることで、様々な生体内組織を模倣した生理活性物質を透過可能な膜を得ることができる。

また、ハイドロゲルの作製に用いられる合成高分子としては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ｐｏｌｙ（ＩＩ−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅなどが挙げられる。また、これらの高分子を２種以上用いてハイドロゲルを作製することも可能である。ハイドロゲルの量は、作製する生理活性物質を透過可能な膜の厚さを考慮して調節することができる。

なかでも、ハイドロゲルの原料はコラーゲンが好ましく、更に、コラーゲンのなかでもより好ましい原料として、ネイティブコラーゲンを例示できる。一般に、アテロコラーゲンのゲルは、同濃度のネイティブコラーゲンのゲルよりも強度に劣るため、ネイティブコラーゲンを用いることで、取扱い性に優れた、生理活性物質を透過可能な膜を有する可搬の培養容器を製造することができる。

生理活性物質を透過可能な膜は、培養容器に挿入して動物細胞を培養する細胞培養担体として用いることができる。培養する動物細胞としては、初代培養細胞、株化細胞、受精卵、およびそれらの細胞に外来遺伝子を導入した細胞が挙げられる。さらにそれらの細胞が、未分化な幹細胞、分化過程にある細胞、終末分化した細胞、および脱分化した細胞であっても良い。また、それらの細胞の培養を開始する手段としては、細胞懸濁液、細切組織片、受精卵、または三次元再構築した多細胞性凝集塊の播種が挙げられる。つまり、既存の方法で培養できる接着性の細胞は生理活性物質を透過可能な膜上で培養することが可能である。
また、上述したような動物細胞を、生理活性物質を透過可能な膜の片面はもちろんのこと、両面に１種類以上の細胞を培養することが可能である。さらに、両面培養においては、各々の面に異種の細胞を培養することが可能である。特に、生理活性物質を透過可能な膜の一方の面には上皮系細胞、他方の面には間充織細胞を培養することで、上皮間充織相互作用を有した経皮吸収モデルや腸管吸収モデルなど、また、一方の面には血管内皮細胞、他方の面にはガン細胞を培養することで、血管新生モデルやガン浸潤モデルなどの細胞機能アッセイを可能とする。

図２および図４に示すように、本発明に係る生理活性物質を透過可能な膜を有する可搬の培養容器は、内部に細胞等の培養物が保持された状態のまま動かし、「液相−膜−固相」、「液相−膜−気相」、「液相−膜−液相」等異なる環境にて培養することができる。
このような可搬性を有することで、後述の肝代謝物の毛細胆管様構造への蓄積と排泄を促進する肝細胞培養装置を容易に構築することができる。

［第一細胞培養物の肝機能迅速賦活化］
本発明では、第一細胞培養物において肝細胞間に毛細胆管様構造を構築させるために、前記生理活性物質を透過可能な膜を有する可搬の培養容器を用いて第一細胞培養物を培養し、肝機能を賦活化させる必要がある。肝機能の賦活化とは、肝細胞の代謝活性を向上させることを示し、前記可搬の培養容器により前記第一細胞培養物を培養することにより、肝細胞の代謝活性を向上させることができる。
第一細胞培養物の肝機能迅速賦活化について、以下に具体的な実施形態を以下に示す。

図２は、本発明において、第一細胞培養物の肝機能迅速賦活化工程の一実施形態を例示したものである。使用する第一細胞培養物としては上述した肝細胞であればかまわないが、ＨｅｐＧ２細胞を使用した場合について例示している。

まず、前記生理活性物質を透過可能な膜を有する可搬の培養容器に、第一細胞培養物を培養液に懸濁したものを播種する。
本発明において、「培養液」とは、通常細胞を培養する際に用いられるものであれば問題なく、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ （ＤＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ（ＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ （ＩＭＤＭ）、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）等が挙げられるが、使用する細胞によって適宜変更することができる。このとき、可搬の培養容器の内側底面の膜上への細胞の接着に時間がかかることと、細胞が接着凝集しやすい場合があることから、底面が平面状であり、たわんでいない状態が好ましい。

次に、下面にフィルムが付着した状態、つまり、「液相−膜−固相」の状態で、細胞がコンフルエントになるまで培養する。用いる細胞によって培養時間は異なるが、例えばＨｅｐＧ２細胞では２日程度培養することが好ましい。

細胞がコンフルエントな状態になった後に、下面のフィルムを剥がし、可搬の培養容器よりも容量の大きな容器に可搬の培養容器をかけることで、膜下を気相として、さらに「液相−膜−気相」の状態で培養する。培養時間は、２０時間〜２４時間程度が好ましい。

肝機能を賦活化させるために、通常、ヒト凍結肝細胞又はＨｅｐａＲＧ（登録商標）細胞株又はヒトｉＰＳ細胞由来肝細胞では１０日〜１４日時間がかかるのに対し、細胞がコンフルエントな状態、且つ「液相−膜−気相」の状態で細胞を培養することで、例えば、ＨｅｐＧ２細胞では３日間という短期間で肝機能が賦活化する。

本発明において、「肝機能」とは、アルブミン及び尿素の合成能および薬物動態関連の機能、例えば、ＣＹＰ３Ａ４の活性を示し、アルブミン及び尿素の合成能については、通常の肝細胞と同レベルまで活性化される。さらに、ＣＹＰ３Ａ４の活性については、ヒト肝臓の平均的な活性を発現するＨｅｐａＲＧ細胞の２分の１程度まで上げられる。
また、図２においてＰはＨｅｐＧ２細胞を拡大した模式図であるが、細胞間に毛細胆管様構造およびタイトジャンクションが構築されている。通常、肝細胞は、細胞間がタイトジャンクションにより結合され、細胞間にできた隙間が管状につながり毛細胆管となり、胆管へとつながっている。

肝細胞が賦活化されるプロセスについて、詳細は判明していないが、気相から膜を通して酸素が供給されることにより、高い細胞密度にも関わらず好気的な培養条件下で細胞が良好に成長し、結果的に肝細胞の自己組織化能を培養条件下で十分に引き出すことが可能となったためであると推察される。

［第二細胞培養物］
本発明の肝細胞培養装置において、第二細胞培養物は、前記第一細胞培養物における肝代謝物の排泄活性を上げることができるものであれば、通常の培養細胞群、マイトマイシンＣで処理したフィーダー細胞群、メタノール等で固定処理した死細胞群、又は通常の培養細胞群の馴化培養液でもよい。例えば、ヒト、ラット、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ニワトリおよびカモからなる群から選択された上皮、間充織又は内皮に由来する培養細胞であって、肝内胆管上皮細胞、肝外胆管上皮細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、および、これら細胞の培養上清液などが挙げられる。
前記肝代謝物の排泄活性とは、前記第一細胞培養物における肝細胞間の毛細胆管様構造および肝細胞内に蓄積された肝代謝物を排泄する活性を意味する。第一細胞培養物における肝代謝物の排泄活性の向上又は低下については、後述の肝細胞培養装置を用いて代謝及び排泄された肝代謝物の種類および量の変化を分析することで判別できる。

［肝細胞培養装置］
本発明の肝細胞培養装置は、複数の肝細胞を含む第一細胞培養物と、前記第一細胞培養物において肝細胞間に毛細胆管様構造を構築させることができる培養容器であって、該培養容器の外側面に生理活性物質を透過可能な膜を有する可搬の培養容器と、前記第一細胞培養物における肝代謝物の排泄活性を上げることができる第二細胞培養物と、を有し、前記可搬の培養容器に培養された第一細胞培養物を前記第二細胞培養物の上に配置させ、共培養させることを特徴とする。

図４は、後述の実施例１における操作手順を例示した模式図であるが、第二細胞培養物を含むシャーレ等の容器は、前記可搬の培養容器よりも大きく、前記可搬の培養容器をかけることができる程度の大きさであることが好ましい。このとき使用する培養液としては、第一細胞培養物と同様に、通常細胞を培養する際に用いられるものであれば問題ない。

図４中、Ｑはヒト肝がん由来細胞株の一つであるＨｅｐＧ２細胞およびヒト胆管がん由来細胞株の一つであるＴＦＫ−１細胞について拡大した模式図であるが、このとき第二細胞培養物であるＴＦＫ−１細胞と共培養させていないものと比較して、排泄される肝代謝物の全体量（上側排泄量＋下側排泄量）および下側排泄量の割合が増加する。これは、第二細胞培養物を共培養することで、第一細胞培養物において肝細胞間の毛細胆管様構造および肝細胞内に蓄積された肝代謝物の排泄が促進するためである。肝代謝物が胆汁排泄だけでなく尿中排泄されるものである場合には、肝代謝物の排泄は毛細胆管様構造からだけでなく、肝細胞の細胞質からも行われる。
よって、第一細胞培養物を第二細胞培養物とともに共培養することにより、肝細胞の代謝物の排泄量が増加する。

本発明の肝細胞培養装置において、第一細胞培養物を第二細胞培養物とともに共培養する時間は３分以上が好ましく、３０分以上がさらに好ましい。また培養物の生育状態の観点から、共培養時間は９日以内が好ましく、本肝細胞培養装置を用いることで、迅速に肝細胞における代謝物の排泄および胆汁中又は血液中排泄感受性の候補化合物及び該化合物の肝代謝物の毒性を評価することが目的であることから、共培養時間は２日以内がさらに好ましい。
また、共培養する際の温度条件は、通常細胞培養する際に推奨される温度で問題ないが、下限値は、３５℃以上が好ましく、３７℃以上がさらに好ましい。上限値は、４０℃以下が好ましく、３７℃以下がさらに好ましい。

［胆汁中又は血液中排泄感受性の候補化合物及び該候補化合物の肝代謝物の評価方法］
本発明の胆汁中又は血液中排泄感受性の候補化合物及び該候補化合物の肝代謝物の評価方法は、複数の肝細胞を含む第一細胞培養物と、前記第一細胞培養物において毛細胆管様構造を構築させることができる培養容器であって、該培養容器の外側面に生理活性物質を透過可能な膜を有する可搬の培養容器と、前記第一細胞培養物における肝代謝物の排泄活性を上げることができる第二細胞培養物と、を有し、以下（ａ）〜（ｄ）の工程を含む。
（ａ）候補化合物を前記可搬の培養容器に培養された前記第一細胞培養物に曝露する工程。
（ｂ）前記候補化合物を曝露された第一細胞培養物を、培養液のみを含む容器及び前記第二細胞培養物を含む容器の上にそれぞれ配置させ、培養させる工程。
（ｃ）前記第一細胞培養物の毛細胆管様構造の変化を確認し、さらに、前記可搬の培養容器中に排泄された物質と、培養液のみを含む容器及び前記第二細胞培養物を含む容器中にそれぞれ排泄された物質とを回収する工程。
（ｄ）前記回収物質から、排泄された肝代謝物及び量を解析する工程。

本発明において、「候補化合物」とは胆汁中又は血液中排泄感受性を有する可能性のある全ての化合物を示し、例えば、薬剤及びその他治療薬などの生体異物、発癌性物質、及び環境汚染物質、並びに、ステロイド、脂肪酸、及びプラスタグランジンなどの生体内物質などが挙げられる。

工程（ａ）において、候補化合物は培養液に分散させるなどして第一細胞培養物に曝露させることができる。曝露する時間は、候補化合物によるが、１時間〜２４時間程度が好ましいが、候補化合物の吸収、代謝および排泄の速度を考慮して決定することがより好ましい。曝露後、平衡塩溶液などで洗浄し、第一細胞培養内に取り込まれなかった候補化合物を除去する。このとき、肝細胞内には取り込まれた候補化合物、および、その肝代謝物が存在するが、既に肝代謝物の排泄も候補化合物によって始まっている。したがって、候補化合物を含有する培養液を除去して平衡塩溶液などで洗浄した後に、第一細胞培養物を新鮮な培養液を用いて引き続き培養すると、徐々に、取り込まれた候補化合物は代謝される。肝代謝物が胆汁中への排泄だけでなく尿中へも排泄される場合は、肝代謝物の排泄は毛細胆管様構造へ蓄積されるだけでなく、肝細胞の細胞質から培養液へも排泄される。ここで、毛細胆管様構造へ蓄積された肝代謝物は、毛細胆管様構造が閉鎖構造であれば培養液に排泄されることはない。

工程（ｂ）において、前記候補化合物を曝露された第一細胞培養物は、第二細胞培養物と共培養することにより肝代謝物の全排泄（上側排泄量＋下側排泄量）および下側排泄の割合が促進される。一方、培養液のみを含む容器にて培養された第一細胞培養物においても、肝代謝物の排泄は行われるが、第二細胞培養物と共培養したものと比較して、全排泄量（上側排泄量＋下側排泄量）および下側排泄量の割合が少ない。ここでいう上側排泄量とは、例えば、図４中の可搬の培養容器内に培養された第一細胞培養物の上側、つまり前記可搬の培養容器内に排泄された肝代謝物の量を示し、下側排泄量とは、可搬の培養容器内に培養された第一細胞培養物の下側、つまり可搬の培養容器の生理活性物質を透過可能な膜を通過して、可搬の培養容器の外側の容器内に排泄された肝代謝物の量を示す。
この時の培養時間および温度条件は、前述のとおりである。

工程（ｃ）において、第一細胞培養物のみの場合は、毛細胆管様構造へ蓄積された肝代謝物の減量には１日以上の時間が必要であり、毛細胆管様構造はほぼ閉鎖構造を維持していると考えられるため、前記可搬の培養容器中に排泄された物質も培養液のみを含む容器に排泄された物質も、大半は通常生体内で尿中排泄されるものである（図４Ｑ参照）。一方、第一細胞培養物と第二細胞培養物との共培養の場合は、毛細胆管様構造へ蓄積された肝代謝物の減量は１時間以内に認められ毛細胆管様構造は開口したと考えられる。ここで生体の肝構造を反映していれば、毛細胆管様構造の開口部は第二細胞培養物の胆管上皮モデルがある下側のみである。
したがって、前記可搬の培養容器中に排泄された物質の大半は通常生体内で尿中排泄されるものを含み、また、前記第二細胞培養物を含む容器に排泄された物質は、第１細胞培養物の細胞質の下側から排泄されたものと、第一細胞培養物の毛細胆管様構造から排泄されたものとを含み、通常生体内で尿中排泄されるものおよび胆汁排泄されるものを合わせて含んでいる。しかし、生体の肝構造を反映していなければ、毛細胆管様構造の開口部は上側のみ、あるいは上側と下側の両側となる。したがって、前記可搬の培養容器中に排泄された物質は、第１細胞培養物の細胞質の上側から排泄されたものと、第一細胞培養物の毛細胆管様構造から排泄されたものとを含み、通常生体内で尿中排泄されるものおよび胆汁排泄されるものを合わせて含んでいることになる。また、前記第二細胞培養物を含む容器に排泄された物質は、毛細胆管様構造の開口部が上側のみであれば、第１細胞培養物の細胞質の下側から排泄されたもののみで通常生体内で尿中排泄されるもののみとなるが、毛細胆管様構造の開口部が上側と下側の両側であれば、第１細胞培養物の細胞質の下側から排泄されたものと、第一細胞培養物の毛細胆管様構造から排泄されたものであり、通常生体内で尿中排泄されるものおよび胆汁排泄されるものを合わせて含んでいることになる。
なお、胆汁中排泄感受性の候補化合物及び該候補化合物の肝代謝物に毛細胆管様構造に特異的な肝毒性がある場合は、前記第一細胞培養物の毛細胆管様構造の減少や破壊が起こるので、排泄経路の評価は行えなくなる。しかし、毛細胆管様構造に特異的な肝毒性は、毛細胆管様構造の減少や破壊等の変化を定量することで評価できることになる。

排泄された物質は、可搬の培養容器中の培養液と、培養液のみを含む容器及び前記第二細胞培養物を含む容器中の培養液を回収することで得られる。この時、あらかじめ各々の培養容器に添加する培養液の量をそろえておくことで、後の工程（ｄ）において得られた排泄物質の総量を比較することができる。

工程（ｄ）において、排泄された肝代謝物及び量は、あらかじめ候補化合物をラベル化しておくことで解析することができる。蛍光又は化学発光分光測定法、シンチレーション分光法、クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）、及び比色分析などの標準的な検出技術を用いて容易に検出することができる化合物を用いて標識しておくことが好ましい。従って、標識化合物には、蛍光発生または蛍光化合物、化学発光化合物、比色定量用化合物、ＵＶ／ＶＩＳ吸収化合物、放射性物質、及びそれらの組み合わせがあるが、これらに制限されない。
また、胆汁中又は血液中排泄感受性の候補化合物及び該候補化合物の肝代謝物の肝毒性は、可搬の培養容器中の培養液と、培養液のみを含む容器及び前記第二細胞培養物を含む容器中の培養液に含まれるＬＤＨ，ＧＯＴ，ＧＰＴを始めとする逸脱酵素などの肝障害指標物質を定量することで評価できる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［ＨｅｐＧ２細胞の肝機能迅速賦活化］
脱着可能なシリコン処理されたＰＥＴフィルムを付着したハイドロゲル膜チャンバー（関東化学社製、ａｄ−ＭＥＤ ビトリゲル（登録商標））に、１０％ ＦＢＳ，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン含有のＤＭＥＭ培養液０．５ｍＬに懸濁したＨｅｐＧ２細胞（理化学研究所バイオリソースセンターより購入、ＲＣＢ１６４８、Ｌｏｔ．００４）を５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２となるように播種し、２日間培養した。その後、ハイドロゲル膜チャンバーの下面よりフィルムを取り外して１２−ウェルプレートのウェルにチャンバーを装着し、下面が空気に触れた状態で１日間培養した（図２参照）。前記培養液０．５ｍＬの交換は、播種後、毎日行った。
ＨｅｐＧ２細胞の肝機能を調べたところ、アルブミン及び尿素合成能を有し、ＣＹＰ３Ａ４の活性は、ヒト肝臓の平均的な活性を発現するＨｅｐａＲＧ細胞の２分の１程度を示した（図３参照）。図３では、コントロールとしてＭｉｌｌｃｅｌｌ（登録商標）セルカルチャーインサートを用いて、前記培養液中でＨｅｐＧ２細胞を培養したものを用いた。比較例として、固相はハイドロゲル膜チャンバーのフィルムを取り外さずに培養したものを示し、液相は前記培養液を含む１２−ウェルプレートのウェルにチャンバーを装着し、培養したものを示している。それぞれ３日間培養した後に、アルブミン産生レベルは測定キットとしてＨｕｍａｎ Ａｌｂｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｓｅｔを用いて、尿素合成レベルは測定キットとして尿素窒素テストワコーを用いて、ＣＹＰ３Ａ４活性レベルは測定キットとしてＰ４５０−Ｇｌｏ ＣＹＰ３Ａ４ ａｓｓａｙ ｗｉｔｈ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−ＩＰＡを用いて測定した。ハイドロゲル膜チャンバーを用いることで、ＨｅｐＧ２細胞の肝機能を迅速（３日間）に賦活化することが確認された。

［実施例１］
［１］前記賦活化されたＨｅｐＧ２細胞を有するハイドロゲル膜チャンバーの培養液を除去後、２５０μｇ／ｍＬ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＦＤ）を含む前記培養液０．５ｍＬを添加し、ＣＯ_２インキュベーターにて３７℃１時間培養した（図４及び図５観察Ａ、参照）。
ＦＤは、そのままでは蛍光を発しないが、肝細胞内のエステラーゼ活性によりエステル結合が切れることで、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの緑色蛍光（励起波長：４９０ｎｍ、蛍光波長：５１４ｎｍ）が観察される。
［２］チャンバー内に残ったＦＤを含む培養液を除去後、Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ハンクス平衡塩類溶液：ＨＢＳＳ）０．５ｍＬで２回洗浄し、前記培養液０．５ｍＬをチャンバー内に添加し、ＣＯ_２インキュベーターにて３７℃１時間培養した（図５観察Ｂ、参照）。
［３］続いて、チャンバー内に残った培養液を除去後、新たに前記培養液０．５ｍＬをチャンバー内に添加した。さらに、予め直径３５ｍｍのディッシュ内に、１０％ ＦＢＳ，１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン含有のＲＰＭＩ１６４０培養液２．０ｍＬに懸濁したＴＦＫ−１細胞（理化学研究所バイオリソースセンターより購入、ＲＣＢ２５３７、Ｌｏｔ．００２）を７ｘ１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２となるように播種し、３日間培養して単層細胞層を作製しておいたディッシュ内の培養液を除去した後、ＨｅｐＧ２細胞用の前記培養液０．５ｍＬを添加した。この直径３５ｍｍのディッシュ内のＴＦＫ−１細胞の単層細胞層上に、チャンバーを装着し、ＣＯ_２インキュベーターにて３７℃１時間共培養した（図５観察Ｃ、参照）。
［４］チャンバー内及びディッシュ内の培養液中のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度を測定した。各々３回ずつ測定し、平均値を下記表１に示した。表１中、ＦＤ（−）とは、ＦＤを添加せず培養したＨｅｐＧ２細胞を有するチャンバーを用いて、バックグラウンドの値として測定したものである。

表１は、チャンバー内及びディッシュ内の培養液中のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度を示したものである。ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎがＨｅｐＧ２細胞外へ排泄される経路としては、ＨｅｐＧ２細胞の上側であるチャンバー内の培養液中へ排出される経路、ＨｅｐＧ２細胞の下側であるＴＦＫ−１細胞があるディッシュ内の培養液中へ排出される経路、ＨｅｐＧ２細胞間の毛細胆管様構造に蓄積され、ＴＦＫ−１細胞の存在により毛細胆管様構造が開口して排出される経路の３通りあると推察される。
表１からチャンバー内のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度は１７７６であり、これはＨｅｐＧ２細胞の上側であるチャンバー内の培養液中へ排出されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの量を示している。また、ディッシュ内のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度は５１１であり、これはＨｅｐＧ２細胞の下側であるＴＦＫ−１細胞があるディッシュ内の培養液中へ排出されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの量を示している。
また、図５観察ＢおよびＣより、毛細胆管様構造に蓄積されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎが、ＴＦＫ−１細胞と共培養することで排泄され減少したことが観察された。このことは、ＴＦＫ−１細胞との共培養により、毛細胆管様構造が開口（下側のみ、上側のみ、あるいは下側と上側の両側）したことを示唆する。
次に、ＴＦＫ−１細胞の存在有無によるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの排泄量の変化について確認した。

［実施例２］
［１］ＨｅｐＧ２細胞を播種し、賦活化したハイドロゲル膜チャンバーを１２セット準備し、内６セットについては実施例１の［１］〜［２］と同様の手順にてＦＤを培養液に添加して培養した。
［２］続いて、チャンバー内に残った培養液を除去後、新たに前記培養液０．５ｍＬをチャンバー内に添加した。続いて、下記４つの条件で、各３セットずつＣＯ_２インキュベーターにて３７℃１時間培養した（図６参照）。
ｉ）ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したもの（ＦＤを添加したもの）
ｉｉ）ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したもの（ＦＤを添加しなかったもの）ｉｉｉ）ＨｅｐＧ２細胞を培養液のみを含むディッシュ上で単独培養したもの（ＦＤを添加したもの）
ｉｖ）ＨｅｐＧ２細胞を培養液のみを含むディッシュ上で単独培養したもの（ＦＤを添加しなかったもの）
［３］ｉ）〜ｉｖ）のチャンバー内およびディッシュ内の培養液を回収し、蛍光強度を測定した。各々３回ずつ測定し、平均値を下記表２に示した。

表２は、チャンバー内及びディッシュ内の培養液中のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度を示したものである。ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものと、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものとそれぞれについて、チャンバー内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの量およびディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの量の合計を１００％とし、ＦＤ（＋）−ＦＤ（−）の値の百分率を括弧内に示した。例えば、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものでは、チャンバー内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの量は、ＨｅｐＧ２細胞が排泄したＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎのうち、６６３÷（６６３＋１０７）×１００で計算され、約８６％である。
表２から、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものは、チャンバー内およびディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の合計が７７０であるのに対し、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものでは、チャンバー内およびディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の合計が６０９であり、排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの総量が約２６％増加していることが明らかになった。
この差は、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものでは、ＴＦＫ−１細胞により排泄が促進されて、ＨｅｐＧ２細胞の細胞質中に残っていたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎおよびＨｅｐＧ２細胞の細胞間に構築された毛細胆管様構造に蓄積されていたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの排泄（下側のみ、上側のみ、あるいは下側と上側の両側）が促進されたためであると推察できる。
また、表２から、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものは、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものと比較して、ディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの量が４％多いことが明らかになった。したがって、ＨｅｐＧ２細胞の細胞質からＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの上側（チャンバー内）および下側（ディッシュ内）への排泄割合は、ＴＦＫ−１細胞との共培養により変化しないと仮定すれば、ＴＦＫ−１細胞との共培養によりＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの下側への排泄割合が４％向上したことは、ＨｅｐＧ２細胞の細胞間に構築された毛細胆管様構造に蓄積されていたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの排泄が下側のみに促進されたことに起因すると考えることが妥当である。

［実施例３]
［１］ＨｅｐＧ２細胞を播種し、賦活化したハイドロゲル膜チャンバーを３６セット準備し、内１８セットについては実施例１の［１］〜［２］と同様の手順にてＦＤを培養液に添加して培養した。
［２］[１]にて細胞を播種し培養した３６セットのハイドロゲル膜チャンバーについて、チャンバー内に残った培養液を除去後、新たに前記培養液０．５ｍＬをチャンバー内に添加した。続いて、実施例２と同様に４つの条件ｉ）〜ｉｖ）で、各３セットずつＣＯ_２インキュベーターにて、３７℃で、培養時間を３分、３０分、６０分（各１２セットずつ）とふって、培養した。
［３］ｉ）〜ｉｖ）のチャンバー内およびディッシュ内の培養液を培養開始から３分後、３０分後及び６０分後に回収し、蛍光強度を測定した。各々３回ずつ測定し、平均値を下記表３（培養時間３分）、表４（培養時間３０分）、表５（培養時間６０分）に示す。また、表３〜表６をグラフにまとめたものを図７に示す。図７中、「Ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ」とは、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものを意味し、「Ｈｏｍｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ」とは、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものを意味する。

表３〜５は、表２と同様に、チャンバー内及びディッシュ内の培養液中のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度を示したものである。ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものと、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものとそれぞれについて、チャンバー内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの量およびディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの量の合計を１００％とし、ＦＤ（＋）−ＦＤ（−）の値の百分率を括弧内に示した。

表３〜５及び図７から、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものは、培養時間３分の時点ですでに、排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の合計が、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものにおけるチャンバー内およびディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の合計よりも多いことが明らかとなった。また、培養時間３０分、６０分においても、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものは、チャンバー内およびディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の合計が、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものにおけるチャンバー内およびディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の合計に対して、多いことが明らかとなった。
また、図７から、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものも、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものも、チャンバー内およびディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の合計は経時的に増加した。ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものにおけるチャンバー内およびディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の合計は、培養時間３０分を超えると、ほぼ平衡状態になることが明らかとなった。
さらに、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものでは、経時的にディッシュ内（下側）に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の割合が上昇しており、一方、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものでは、経時的にディッシュ内（下側）に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の割合が減少していた。また、培養時間６０分において、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものは、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものと比較して、ディッシュ内（下側）に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの量が４３％多いことが明らかになった。
したがって、実施例２と同様に、ＨｅｐＧ２細胞の細胞質からＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの上側（チャンバー内）および下側（ディッシュ内）への排泄割合は、ＴＦＫ−１細胞との共培養により変化しないと仮定すれば、ＴＦＫ−１細胞との共培養によりＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの下側への排泄割合が４６％向上したことは、ＨｅｐＧ２細胞の細胞間に構築された毛細胆管様構造に蓄積されていたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの排泄が下側のみに促進されたことに起因すると考えることが妥当である。

［実施例４]
ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものにおいて、培養時間を延ばすことにより、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの排泄量は引き続き増加し続けるか否かについて検証するために、実施例３とは独立した試験を行った。

［１］まず、ＨｅｐＧ２細胞を播種し、賦活化したハイドロゲル膜チャンバーを４８セット準備し、内２４セットについては実施例１の［１］〜［２］と同様の手順にてＦＤを培養液に添加して培養した。
［２］[１]にて細胞を播種し培養した４８セットのハイドロゲル膜チャンバーについて、チャンバー内に残った培養液を除去後、新たに前記培養液０．５ｍＬをチャンバー内に添加した。続いて、実施例２と同様に４つの条件ｉ）〜ｉｖ）で、各３セットずつＣＯ_２インキュベーターにて、３７℃で、培養時間を３分、３０分、６０分、１８０分（各１２セットずつ）とふって、培養した。
［３］ｉ）〜ｉｖ）のチャンバー内およびディッシュ内の培養液を培養開始から３分後、３０分後、６０分後及び１８０分後に回収し、蛍光強度を測定した。各々３回ずつ測定し、平均値を下記表６（培養時間３分）、表７（培養時間３０分）、表８（培養時間６０分）及び表９（培養時間１８０分）に示す。また、表６〜表９をグラフにまとめたものを図８に示す。図８中、「Ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ」とは、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものを意味し、「Ｈｏｍｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ」とは、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものを意味する。

表６〜９は、表２と同様に、チャンバー内及びディッシュ内の培養液中のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度を示したものである。ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものと、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものとそれぞれについて、チャンバー内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの量およびディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの量の合計を１００％とし、ＦＤ（＋）−ＦＤ（−）の値の百分率を括弧内に示した。

表６〜９及び図８から、いずれの培養時間においても、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものは、チャンバー内およびディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の合計が、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものにおけるチャンバー内およびディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の合計に対して、多いことが明らかとなった。
また、図８から、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものも、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものも、チャンバー内およびディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の合計は経時的に増加した。実施例３と同様に、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものにおけるチャンバー内およびディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の合計は、培養時間３０分を超えると、ほぼ平衡状態になっていた。
また、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものにおけるチャンバー内およびディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の合計は、培養時間６０分を超えると、ほぼ平衡状態になることが明らかとなった。
さらに、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものでは、経時的にディッシュ内（下側）に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の割合が上昇しており、一方、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものでは、経時的にディッシュ内（下側）に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の割合が減少していた。また、培養時間１８０分において、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものは、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものと比較して、ディッシュ内（下側）に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの量が３６％多いことが明らかになった。
したがって、実施例２及び実施例３と同様に、ＨｅｐＧ２細胞の細胞質からＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの上側（チャンバー内）および下側（ディッシュ内）への排泄割合は、ＴＦＫ−１細胞との共培養により変化しないと仮定すれば、ＴＦＫ−１細胞との共培養によりＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの下側への排泄割合が３６％向上したことは、ＨｅｐＧ２細胞の細胞間に構築された毛細胆管様構造に蓄積されていたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの排泄が下側のみに促進されたことに起因すると考えることが妥当である。

実施例２〜４の結果から、本発明の評価方法を用いることで、胆汁中又は血液中排泄感受性の候補化合物の排泄を経時的に観察することができることが明らかとなった。
よって、本発明の評価方法は、腸胆管循環を繰り返すような胆汁中排泄感受性の候補化合物の評価の応用研究に展開することが可能であることが推察できる。

［実施例５］
ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものにおいて、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの排泄するタイミングについて検証する試験を行った。

［１］まず、ＨｅｐＧ２細胞を播種し、賦活化したハイドロゲル膜チャンバーを２セット準備し、実施例１の［１］〜［２］と同様の手順にてＦＤを培養液に添加して培養した。
［２］[１]にて細胞を播種し培養した２セットのハイドロゲル膜チャンバーについて、チャンバー内に残った培養液を除去後、新たに前記培養液０．５ｍＬをチャンバー内に添加した。続いて、実施例２に記載の条件ｉ）及びｉｉｉ）で、各１セットずつ培養開始（排泄開始）から０時間後（排泄直後）、１時間後、３時間後、２３時間後におけるＨｅｐＧ２細胞の細胞質中に残っていたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎおよびＨｅｐＧ２細胞の細胞間に構築された毛細胆管様構造に蓄積されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの経時的な変化を蛍光顕微鏡で観察した。結果を図９に示す。図９中、「Ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ」とは、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものを意味し、「Ｈｏｍｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ」とは、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものを意味する。

図９から、培養開始直後、すなわち排泄直後（０時間）では、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの緑色蛍光は毛細胆管様構造と一部の細胞の細胞質中に豊富に確認できる。排泄１時間後において、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの緑色蛍光の減量は、単独培養ではあまり認められないのに対して共培養では顕著に認められたが、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの緑色蛍光は、単独培養でも共培養でも毛細胆管様構造のみならず極一部の細胞の細胞質中にも確認できた。また、共培養では、排泄３時間後および排泄２３時間後においては、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの緑色蛍光は確認できなかった。単独培養では、排泄３時間後には、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの緑色蛍光の減量は顕著に認められ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの緑色蛍光は毛細胆管様構造と極一部の細胞の細胞質中に確認できた。排泄２３時間後の単独培養では、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの緑色蛍光は、減量が促進され細胞質中では確認できなくなったが、毛細胆管様構造には残存していることが確認された。
したがって、単独培養の場合は、毛細胆管様構造へ蓄積されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの減量には１日以上の時間が必要であり、毛細胆管様構造はほぼ閉鎖構造を維持していると考えられた。また、共培養の場合は、毛細胆管様構造へ蓄積されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの減量は１時間以内に認められたことから、毛細胆管様構造は開口したと考えられた。この毛細胆管様構造の開口部は、図７および図８の共培養の結果から、ＴＦＫ−１細胞がある下側が大半であると考えられた。

［実施例６］
ディッシュに培養する細胞をＴＦＫ−１細胞以外の細胞を用いた場合における、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの排泄量について検証する試験を行った。

［１］まず、ＨｅｐＧ２細胞を播種し、賦活化したハイドロゲル膜チャンバーを１８セット準備し、内９セットについては実施例１の［１］〜［２］と同様の手順にてＦＤを培養液に添加して培養した。
［２］[１]にて細胞を播種し培養した１８セットのハイドロゲル膜チャンバーについて、チャンバー内に残った培養液を除去後、新たに前記培養液０．５ｍＬをチャンバー内に添加した。続いて、実施例２と同様に４つの条件ｉ）〜ｉｖ）と、さらに追加で、下記に示す条件ｖ）及びｖｉ）で、各３セットずつＣＯ_２インキュベーターにて、３７℃１時間培養した。
ｖ）ＨｅｐＧ２細胞とヒト真皮線維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ＮＨＤＦｓ）を共培養したもの（ＦＤを添加したもの）
ｖｉ）ＨｅｐＧ２細胞とＮＨＤＦｓを共培養したもの（ＦＤを添加しなかったもの）
［３］ｉ）〜ｖｉ）のチャンバー内およびディッシュ内の培養液を回収し、蛍光強度を測定した。各々３回ずつ測定し、平均値を下記表１０に示す。また、表１０をグラフにまとめたものを図１０に示す。図１０中、「Ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ（ｉ）」とは、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したものを意味し、「Ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ（ｉｉ）」とは、ＨｅｐＧ２細胞とＮＨＤＦｓを共培養したものを意味し、「Ｈｏｍｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ」とは、ＨｅｐＧ２細胞のみを単独培養液を含むディッシュ上で培養したものを意味する。

表１０及び図１０から、ＨｅｐＧ２細胞とＮＨＤＦｓを共培養したものにおけるチャンバー内およびディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度の合計は、ＨｅｐＧ２細胞のみを培養液を含むディッシュ上で単独培養したものとほぼ同程度であった。また、ＨｅｐＧ２細胞とＮＨＤＦｓを共培養したものにおけるディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの量は、ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞を共培養したにおけるディッシュ内に排泄されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの量よりも、５４％低いことが明らかとなった。よって、共培養する細胞は、ＴＦＫ−１細胞等、肝細胞からの排泄を促進する作用を有する細胞を選択することが好ましいことが示唆された。

［実施例７］
本発明の肝細胞培養装置において、毛細胆管様構造が形成されていることを確かめるために、毛細胆管側膜に局在（細胞質内へ内在化することもある）しているトランスポーター（ＭＲＰ２（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）及びＢＳＥＰ（Ｂｉｌｅ ｓａｌｔ ｅｘｐｏｒｔ ｐｕｍｐ））（図１１Ａ参照）の有無を評価した。

［１］まず、ディッシュに直接ＨｅｐＧ２細胞を播種したものと、ハイドロゲル膜チャンバーにＨｅｐＧ２細胞を播種し、賦活化したものを準備した。
［２］続いて、毛細胆管側膜に局在（細胞質内へ内在化することもある）しているトランスポーターであるＭＲＰ２及びＢＳＥＰに対する免疫染色を行った。１次抗体としては、マウス抗ＭＲＰ２抗体（サンタクルーズ社製）又はヤギ抗ＢＳＥＰ抗体（サンタクルーズ社製）を用い、２次抗体としては、緑色の蛍光を呈すＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（サンタクルーズ社製）又はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ結合ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（サンタクルーズ社製）を用いた。対比染色として、青色の蛍光を呈すＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学社製）を用いて、核を染色した。結果を図１１Ｂに示す。図１１Ｂ中、「Ｐｌａｓｔｉｃ ｄｉｓｈ」とは、ディッシュに直接ＨｅｐＧ２細胞を播種したものを意味し、「ＣＶＭ」とは、ハイドロゲル膜チャンバーにＨｅｐＧ２細胞を播種し、賦活化したものを意味する。また、図１１Ｂにおいて、白黒写真中、青色の染色された核は、灰色になっており、緑色に染色されたＢＳＥＰ及びＭＲＰ２は白色になっている。

図１１Ｂから、ディッシュに直接ＨｅｐＧ２細胞を播種したものでは、ＭＲＰ２及びＢＳＥＰの蛍光は検出されず、ハイドロゲル膜チャンバーにＨｅｐＧ２細胞を播種し、賦活化したものでは、ＭＲＰ２及びＢＳＥＰの蛍光が検出された。よって、ハイドロゲル膜チャンバーにＨｅｐＧ２細胞を播種し、賦活化したものでは、胆汁排泄に係わるトランスポーターとしてＭＲＰ２及びＢＳＥＰが発現していることが確かめられた。

以上のことから、本発明によれば、肝代謝物の毛細胆管様構造への蓄積と排泄を促進する肝細胞培養装置を提供できることは明らかである。

本発明の肝細胞培養装置によれば、短時間で安価に生体内を反映した環境において肝細胞で代謝された物質を得ることができる。肝細胞間に構築された毛細胆管様構造へ排泄された肝代謝物についても、肝細胞間のタイトジャンクションを破壊せずに合わせて回収することができる。
また、本発明の肝細胞培養装置を用いた胆汁中又は血液中排泄感受性の候補化合物及び該候補化合物の肝代謝物の評価方法によれば、活性化された薬物代謝酵素により代謝・排泄された胆汁中又は血液中への肝代謝物の種類、量、さらに前記候補化合物及び該候補化合物の肝代謝物の肝毒性について短時間で安価に評価することができる。

１ 筒状の担体
２ 生理活性物質を透過可能な膜
３ フィルム
４ 係止部
５ ハイドロゲル膜
６ シリコン処理されたＰＥＴフィルム
７ ＨｅｐＧ２細胞
８ １０％ ＦＢＳ，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン含有のＤＭＥＭ培養液
９ １２−ウェルプレートのウェル
１０ 毛細胆管様構造
１１ タイトジャンクション
１２ ＦＤ含有の８に記載の培養液
１２ａ ＨｅｐＧ２細胞のみの単独培養（Ｈｏｍｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）における上側に排泄されたＦＤ含有の８に記載の培養液
１２ｂ ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞との共培養（Ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）における上側に排泄されたＦＤ含有の８に記載の培養液
１２ｃ ＨｅｐＧ２細胞とＨＤＦ細胞との共培養（Ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）における上側に排泄されたＦＤ含有の８に記載の培養液
１３ シャーレ
１４ ＴＦＫ−１細胞
１５ａ ＨｅｐＧ２細胞のみの単独培養（Ｈｏｍｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）における下側に排泄されたＦＤ含有の８に記載の培養液
１５ｂ ＨｅｐＧ２細胞とＴＦＫ−１細胞との共培養（Ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）における下側に排泄されたＦＤ含有の８に記載の培養液
１５ｃ ＨｅｐＧ２細胞とＨＤＦ細胞との共培養（Ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）における下側に排泄されたＦＤ含有の８に記載の培養液
１６ ＮＨＤＦｓ（正常ヒト真皮由来線維芽細胞）
Ｘ 可搬の培養容器
Ｙ ハイドロゲル膜チャンバー

Claims (3)

1. 肝細胞による胆汁中又は血液中排泄感受性の候補化合物及び該候補化合物の肝代謝物の評価方法であって、
   複数の肝細胞を含む第一細胞培養物と、
   前記第一細胞培養物において肝細胞間に毛細胆管様構造を構築させることができる培養容器であって、該培養容器の外側面に生理活性物質を透過可能な膜を有する可搬の培養容器と、
   前記第一細胞培養物における肝代謝物の排泄活性を上げることができる第二細胞培養物と、
   を有し、
   （ａ）候補化合物を前記可搬の培養容器に培養された前記第一細胞培養物に曝露する工程と、
   （ｂ）前記候補化合物を曝露された第一細胞培養物を、培養液のみを含む容器及び前記第二細胞培養物を含む容器の上にそれぞれ配置させ、培養する工程と、
   （ｃ）前記第一細胞培養物の毛細胆管様構造の変化を確認し、さらに、前記可搬の培養容器中に排泄された物質と、培養液のみを含む容器及び前記第二細胞培養物を含む容器中にそれぞれ排泄された物質と、を回収する工程と、
   （ｄ）前記回収物質から、排泄された肝代謝物及び量を解析する工程と、
   を含む評価方法。
2. さらに、前記可搬の培養容器が前記第一細胞培養物の代謝活性を向上させるものである請求項１に記載の評価方法。
3. 前記肝代謝物の排泄活性は、前記第一細胞培養物における肝細胞間の毛細胆管様構造および肝細胞内に蓄積された肝代謝物を排泄する活性である請求項１又は２に記載の評価方法。