JP7005018B2 - 自発拍動心臓オルガノイド構築物およびそれを含む統合ボディ・オン・チップ装置 - Google Patents
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Description
本出願は、その開示がその全体として参照により本出願の一部をなすものである、2015年10月2日に出願した米国仮特許出願第62/236,348号の恩恵および優先権を主張するものである。
本発明は、宇宙海戦システム太平洋センター(Space and Naval Warfare Systems Center Pacific)(SSC PACIFIC)の国防脅威削減局(Defense Threat Reduction Agency)(DTRA)により授与された契約第N66001-13-C-2027号および国立がん研究所により交付された助成金第NCI CCSG P30CA012197号のもとでの政府支援によってなされた。米国政府は、本発明に対する一定の権利を有する。
(a)入口および出口を有する一次チャンバー、ならびに
(b)架橋フィブリンヒドロゲルおよび上記ヒドロゲル中で共に自発拍動する心臓細胞を含む、前記一次チャンバー内の心臓構築物
を含む装置である。
(d)前記一次チャンバーと流体連通した、少なくとも1つの二次チャンバー、および
(e)前記二次チャンバー内の生きた哺乳類肝臓組織構築物
をさらに含む。
(f)前記一次および/または前記二次チャンバーと(例えば、それらの間の導管を介して)流体連通した少なくとも1つの追加の二次チャンバー、ならびに
(g)前記追加の二次チャンバー内にそれぞれ独立に選択される少なくとも1つの追加の生きている組織構築物(例えば、肺、血管、腸、脳、結腸等)
をさらに含む。
本発明で用いる「細胞」は、一般的に、動物細胞、とりわけ哺乳類および霊長類細胞であり、その例には、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、サル、チンパンジー、ウシ、ブタ、ヤギが含まれるが、これらに限定されない。細胞は、好ましくは少なくとも一部は、肝臓、腸、膵臓、リンパ節、平滑筋、骨格筋、中枢神経、末梢神経、皮膚、免疫系等のような、特定の細胞または組織型に分化している。一部の細胞は、下でさらに議論するように、がん細胞であり得、その場合、それらは、これも下でさらに検討するように、任意選択であるが、好ましくは検出可能な化合物を(天然で、または組換え技術により)発現する。
本発明の組成物は、「バイオインク」中の生細胞を含み得るものであり、「バイオインク」は、さらに、架橋性ポリマー、堆積後架橋基または剤、および、他の任意選択の構成要素(増殖因子、(例えば、架橋の)開始剤、(バランスのための)水等を含むが、これらに限定されない)から構成される。組成物は、好ましくはヒドロゲルの形態である。組成物の様々な構成要素および特性は、下でさらに検討する。
上で言及したように、本発明を実施するために用いられる細胞は、好ましくは動物細胞(例えば、鳥、爬虫類、両生類等)であり、いくつかの実施形態において、好ましくは哺乳類細胞(例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、サル、類人猿、ヒト)である。細胞は、分化または非分化細胞であり得るが、いくつかの実施形態において、組織細胞(例えば、肝細胞のような肝臓細胞、膵臓細胞、心筋細胞、骨格筋細胞等)である。
本明細書で述べる方法に用いる場合、堆積後にその弾性係数を増加させるためにそれをさらに架橋させることができる限り、適切なプレポリマーを用いて、本発明を実施することができる。
いくつかの実施形態において、組成物は、堆積後架橋基(post-deposition crosslinking group)を含む。ポリエチレングリコールジアルキン、他のアルキン官能基化基、アクリレートまたはメタクリレート基等のようなマルチアームチオール反応性(multi-arm thiol-reactive)架橋剤を含むが、これらに限定されず、それらの組合せを含む、適切な架橋基を用いることができる。
本発明の組成物は、任意選択的に、ただし、いくつかの実施形態においては好ましくは、開始剤(例えば、熱または光開始剤)を含み得る。上記プレポリマーと第2の(または堆積後)架橋基との間の反応を触媒するあらゆる適切な開始剤を(例えば、加熱時または光への曝露時に)用いることができる。
本発明の組成物は、任意選択的に、ただし、いくつかの実施形態においては好ましくは、(例えば、含められる特定の細胞および/または生成される個別の組織代替物に適切な)少なくとも1つの増殖因子を含み得る。いくつかの実施形態において、増殖因子および/または他の増殖促進タンパク質は、その組織細胞に対応する組織に由来する脱細胞化細胞外マトリックス組成物(「ECM」)(例えば、生きている動物細胞が肝臓細胞である場合には、脱細胞化細胞外肝臓マトリックス;生きている動物細胞が心筋細胞である場合には、脱細胞化細胞外心筋マトリックス;生きている動物細胞が骨格筋である場合には、脱細胞化骨格筋マトリックス;等)に加えることができる。追加のコラーゲン、グリコサミノグリカン、および/またはエラスチン(例えば、細胞外マトリックス組成物を補うために加えることができる)等も含めることができる。
組成物は、好ましくは、どのような堆積方法が用いられるとしても(例えば、押出堆積)、操作して基材上に堆積させることができるような、室温かつ大気圧で十分に低い弾性係数を有する。さらに、任意選択的に、ただし、いくつかの実施形態においては好ましくは、それが、後に架橋するまで(架橋が自発的、熱または光開始等かを問わず)、堆積された形状または構造を実質的に保持するように再び室温かつ大気圧で十分に高い弾性係数を有する。いくつかの実施形態において、組成物は、堆積の前に、室温かつ大気圧で0.05、0.1または0.5から1.5または10キロパスカルまで、またはそれ以上の剛性を有する。
上述のように、本発明は、心臓構築物を製造する方法であって、中間心臓構築物を形成させるために、生きた哺乳類の心臓細胞(例えば、個々の細胞、オルガノイドまたはスフェロイド)、フィブリノーゲン、ゼラチンおよび水を含む混合物を支持体上に堆積させるステップと;任意選択的に、前記中間構築物を支持するように、構造支持材(例えば、ポリカプロラクトン)を前記混合物とともに共堆積させるステップと;次いで、フィブリノーゲンを架橋し、フィブリンヒドロゲル中で共に自発拍動する生きた心臓細胞から構成される心臓構築物を(最初の心臓細胞の成熟状態によって、必要に応じて介在インキュベーションとともに)作製するのに有効な量のトロンビンを、前記構築物に接触させるステップとを含む方法を提供する。
非限定的であるが、好ましい1つの使用方法において、組成物は、本明細書で述べたデバイスにおける各個別の構築物を製造する方法に用いられる。そのような方法は、
(a)上述の押出し可能なヒドロゲル組成物を含む貯槽を用意するステップと、次いで
(b)ヒドロゲル組成物を基材上に(例えば、注射器による押出しにより)堆積させるステップと、次いで
(c)一般的な組成物およびそれらの組織構築物について、(適切な手段により二次構築物を製造することができるので)任意選択的に、上記ヒドロゲルの剛性を増加させ、上記3次元臓器構築物を形成するのに十分な量で第2の架橋基によりプレポリマーを架橋するステップ(例えば、ヒドロゲルを加熱する、ヒドロゲル組成物に光(例えば、環境光、UV光)を照射する、ヒドロゲルのpHを変化させる等)、ならびに
(d)心臓構築物組成物について、上述のように、フィブリノーゲンを架橋し、フィブリンヒドロゲルを形成するために、ヒドロゲルをトロンビンと接触させるステップ
を含む。
上述の部分的組合せまたは「カートリッジ」は、製造された後、直ちに使用されてもよいし、または、貯蔵および/もしくは輸送のために準備されてもよい。
上述の装置は、
(a)上述の装置を用意するステップと、
(b)任意選択的に、第1のチャンバーから第2のチャンバーに増殖培地を循環させるステップと、
(c)(例えば、試験化合物を増殖培地に加えることにより)少なくとも1つの試験化合物を構築物に投与するステップと、
(d)典型的には、試験化合物を投与しない場合に観測されたものと比較し、(例えば、心臓モニターにより)心臓構築物の拍動頻度の変化を判定するステップと
により、少なくとも1つの試験化合物を、生理学的活性についてスクリーニングするために用いることができる。
この試験では、本発明者らは、薬物および毒性試験に対する生理学的反応を評価するための肝臓および心臓の二連オルガノイド・オン・チップシステムの開発および試験について述べる。これを遂行するために、本発明者らは、ヒドロゲル「バイオインク」および3Dバイオプリンティング技術により流体デバイスシステムに統合される、2種類の高機能性組織オルガノイドを開発した。このマルチオルガノイドボディ・オン・チップシステム上において、オルガノイドは、統合されたバイオセンサーシステムを環境および生物学的モニタリングに用いることができる、人体に見出される臓器動力学と同様に、様々な外部刺激に独立してまたは協調的に反応することができる20。
オルガノイドの形成および構造の特徴付け。懸滴培養法を用いて生成させた肝臓オルガノイドは、直径が約250μmの球状凝集体を一貫して形成し、28日間の培養期間を通して確実に+/-10μmのままであった(データは示さず)。特定の細胞型の混合物を用いた、1500細胞/オルガノイドの最初の播種は、所望の直径を確実に生じさせる。オルガノイドは、低酸素および壊死性コアの形成をもたらし得る溶質潅流制限21と生物学的機能を均衡させるような、細胞数によって決定されるサイズを維持するように設計された。
有効な新薬候補の開発は、ヒトベースの組織をin vitroで正確に具現化することができないため、限定的であり、信じられないほど費用がかかるものとなっていた。動物モデルは、限定的な操作とこれらの機序の試験を可能にするにすぎず、ヒトにおける結果を必ずしも予測するものではない。伝統的に、in vitroの薬物および毒性試験は、2D培養における細胞株を用いて実施されてきた。薬剤における多くの発見が得られたにもかかわらず、2D培養は、in vivo組織の3D微小環境を正確に再現することができない5,7,8。3D組織オルガノイドに移行することによって、これらの欠点の多くを克服し得る。3Dオルガノイドは、サイズが小さいが、in vivo組織とより類似した拡散特性を有し、さらに天然に存在する細胞間および細胞-マトリックス相互作用の多くが生じることも可能にする。本発明者らが、本発明者らのオルガノイド特徴付けデータにおいて示したように、そのようなオルガノイドは、それらの2D対応物と比較して劇的に改善された組織固有の機能性を有する。より重要なことに、これらのオルガノイドは、実際のヒト臓器と同様に薬物および毒素に反応する能力を有し、したがって、それらは、薬物スクリーニング応用のための改善されたプラットフォームとなる。
オルガノイドの製造および維持。オルガノイドは、GravityPlus懸滴培養プレート(inSphero AG)を用いて凝集させた。細胞を、90%HCM培地(Lonza)、10%熱不活性化ウシ胎児血清(Gibco)およびラット尾コラーゲンI(10ng/μl、Corning)から構成される細胞播種混合物中に混ぜ合わせた。肝臓オルガノイドは、80%肝細胞(Triangle Research Labs)、10%肝星細胞(ScienCell)および10%クッパー細胞(Gibco)の混合物を用いて製造した。40μLの培地当たり約1500個の細胞を用いて、懸滴培養で凝集体を形成した。心臓オルガノイドは、培養の純度および分化を維持するために100%心筋細胞(Stem Cell Theranostics)を用いて心筋細胞維持培地(Stem Cell Theranostics)中で同様に製造した。37℃で5%CO2を用いた4日間の培養の後、オルガノイドを下流応用(applications)のために移し、それらの各培地中で80μl/ウェルで培養した。
肝臓細胞の供給源および培養。用いたすべての細胞は、商業的に調達されたヒト初代細胞であった。オルガノイドの形成に用いるための肝星細胞(HSCs)(ScienCell)は、冷凍保存の前に2継代にわたって増殖培養した。増殖中、HSCsは、37℃、5%CO2条件下、ラット尾コラーゲンIコーティング(10ng/cm2、Corning)上で、90%高グルコースDMEM(Gibco)および10%ウシ胎児血清(Atlanta Bio.)中にて培養した。初代ヒト肝細胞(Triangle Research Labs)は、Hepatocyte Thawing Medium(Triangle Research Labs)を用いて製造業者の取扱説明書に従って解凍した。クッパー細胞も製造業者の取扱説明書(Gibco)に従って解凍した。2次元肝細胞サンドイッチ培養は、肝臓オルガノイドとの比較として用いた。初代ヒト肝細胞(Triangle Research Labs)は、上述のように解凍し、次いで、約150,000細胞cm2/の密度でHepatocyte Plating medium(Triangle Research Labs)を用いて、コラーゲン被覆(10ng/cm2、Corning)6ウェル培養プレート上で平板培養した。細胞は、マトリゲルを重層(BD)として加える前に37℃で5%CO2を用いて4時間インキュベートした。さらに24時間インキュベートした後、新たなHCM培地(Lonza)を加えた。
<ラット心臓組織の3Dバイオプリンティング>
本試験では、機能性かつ収縮性の心臓組織構築物を作製するために、3Dバイオプリンティングを適用した。ラット新生児の心臓組織を得て、心筋細胞を単離し、細胞をフィブリンベースのヒドロゲルバイオインクに懸濁した。細胞を添加したヒドロゲルを、空気圧により300μmノズルを介して印刷した。バイオプリントされた心臓組織構築物は、印刷後の3日後に自発収縮を示し、培養14日後に同期収縮を示し、心臓組織の発達および成熟が示された。心臓組織の形成は、α-アクチニンおよびコネキシン43に特異的な抗体による免疫染色により確認され、これにより、整列した高密度の成熟心筋細胞が示された。バイオプリントされた心臓組織構築物は、公知の心臓薬(アドレナリンおよびカルバコール)に対する生理学的反応(拍動頻度および収縮力)も示した。さらに、印刷心臓組織の組織発達は、ノッチシグナル遮断により加速され得る。これらの結果は、モデル薬理学的応用に用いることができる機能性心臓組織の印刷の実現可能性を示すものであった。
Claims (5)
- 心臓構築物を作製する方法であって、
中間心臓構築物を形成させるために、生きた哺乳類の心臓細胞、フィブリノーゲン、ゼラチンおよび水を含む混合物を支持体上に堆積させるステップと、ここで、前記心臓細胞が凝集してオルガノイドを形成しており、
フィブリノーゲンを架橋し、フィブリンヒドロゲル中で共に自発拍動する生きた心臓細胞から構成される心臓構築物を作製するのに有効な量のトロンビンを、前記構築物に接触させるステップと
を含む方法。 - 前記中間構築物を支持するように、構造支持材を前記混合物とともに共堆積させるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記心臓細胞が、オルガノイドの形態である心筋細胞が、懸滴培養および/またはその3dバイオプリンティングにより生成される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記心臓構築物が、有効量のイソプロテレノールの投与によって頻度が増加し、有効量のキニジンの投与によって頻度が減少する自発拍動を示す、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記心臓構築物の心臓細胞がVEGF、アクチニンおよび/または心筋トロポニンTを発現する、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
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