KR102291265B1 - 심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법 - Google Patents

심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법 Download PDF

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Abstract

본 명세서에서는 유체가 저장되는 챔버, 상기 챔버와 연결되어 유체가 유입되는 제 1 관, 상기 챔버와 연결되어 유체가 유출되는 제 2 관 및 상기 제 1 관에 형성되어 자발적으로 유입관을 개폐시키는 밸브를 포함하고, 자가 수축을 하는 심장 오가노이드, 전술한 오가노이드 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법에 대하여 제공한다.

Description

심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법 {CARDIAC ORGANOIDS, METHOD FOR PREPARING THE SAME AND METHOD FOR EVALUATING DRUG TOXICITY USING THE SAME}
본 발명은 자가 수축을 할 수 있는 심장 오가노이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 생체 심장과 유사한 심실 및 판막 등의 구조를 가지며 자가 수축할 수 있는 심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법에 관한 것이다.
신약개발의 초기 단계에서는 정확한 독성 및 유효성 예측을 평가하는 모델이 필요하다. 현 기술로는 동물 모델이 신약의 독성 및 유효성에 대하여 가장 유사하게 모사할 수 있다. 그러나, 동물 실험은 시간, 금전적으로 부담이 크며 종 간의 유전적, 생화학적 및 대사과정의 차이로 인하여 인간의 생체 내 환경을 완전히 반영하기 어렵다. 또한, 기술적으로도 동물 내부에서 일어나는 일을 모니터링하는 것이 어렵고 윤리적으로도 문제가 될 수 있다.
이에, 인간의 조직에서 직접 분리하여 체외 배양된 일차 배양 세포가 표준 모델로 사용되고 있지만, 조직을 얻기에도 어렵고, 조직 세포가 체외에서 증식하지 못하는 실험적 한계가 있다. 나아가, 2차원 세포 기반 모델(cell based in vitro model)은 비용 및 노동력 측면에서 인간의 조직으로부터 유래된 일차 배양 세포보다 효율적이기 때문에 약물 독성 및 유효성 평가에 많이 사용되고 있다. 그러나, 2차원 세포 기반 모델은 세포-세포 및 세포-세포외 기질의 상호 작용으로 발생하는 생리 기능과 조직 복합성을 구현하기엔 불충분하다.
한편, 새로운 인체 모사 모델로 오가노이드가 주목을 받고 있다. 오가노이드란 줄기세포를 특정 세포로 자라게 하여 장기와 같은 입체 구조물로 형성된다. 오가노이드는 2차원의 세포 기반 모델과는 다르게 3차원의 환경에서 배양되어, 보다 장기간으로 배양될 수 있다. 또한, 오가노이드는 크기가 작을 뿐 구성 세포나 구조가 실제 장기와 흡사하다. 이에, 오가노이드는 신약 개발 과정에서 약물의 효능과 안정성을 알아보기에 최적인 실험체로 평가되고 있다. 나아가, 오가노이드 관련 분야는 신약 개발의 약물 독성 및 유효성 평가뿐만 아니라, 질병모델, 암 연구, 맞춤의학 및 재생 치료제 등에도 이용될 수 있는 잠재력이 높은 분야이다.
현재까지 위, 장, 초기 간, 갑상선, 폐, 뇌 등의 다양한 오가노이드가 성공적으로 개발되었다. 그러나, 현재까지 개발된 심장 오가노이드는 전기 생리적인 특성 등이 미성숙한 심근세포의 특성을 나타낸다. 또한, 현재까지의 심장 오가노이드는, 형태학적으로도 생체 심장과 유사하지 못하는 한계가 있다. 대부분의 심혈관 질환은 성인이 되거나 노화가 진행된 후 발병되기 때문에 성체 심근세포와 형태적 및 기능적으로 유사한 성숙 심근세포를 포함한 심장 오가노이드의 개발이 필요한 실정이다.
발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
오가노이드는 줄기세포의 분화에 따라 형성되는 기관 및 조직이 달라질 수 있다. 생체 내에서 배반포의 내부 세포 덩어리는 내배엽, 중배엽 및 외배엽으로 분화되며, 이들 각각은 결과적으로 다른 기관 및 조직을 형성한다.
내배엽은 주로 소화기관 및 호흡기관으로 분화될 수 있으며, 외배엽은 표피, 샘조직, 감각상피 및 신경계로 분화될 수 있다. 이러한 내배엽 및 외배엽 유래의 장기들에 대한 제작 방법은 이미 확립되어, 소장, 폐, 간 및 뇌 등의 다양한 오가노이드가 존재한다.
한편, 중배엽은 간엽, 조혈계, 근육, 뼈, 신장, 생식관 및 심장으로 분화될 수 있다. 중배엽으로 형성되는 기관들은 다양하게 분화된 세포들로 구성되는 복잡한 기관으로, 분화된 세포들의 3차원 배열이 기능적으로 중요하다. 그러나, 현재까지 개발된 심장 오가노이드는, 중배엽으로부터 분화된 심근세포들이 이질적이거나, 이온 채널의 구조가 상이하거나, 근절의 형성 및 배열이 불완전하여 생체 본래 성능 및 구조에 못 미친다. 나아가, 심근세포는 3차원 환경에서 배양하기 위하여 배양용기에서 떼어내는 과정에서 생존성이 매우 저하되어, 수율 및 성장 유지가 매우 어렵다. 이에, 심장 오가노이드에 대한 개발은 다른 오가노이드에 비하여 어려운 실정이다.
한편, 본 발명의 발명자들은 심장 오가노이드를 얻기 위해서 줄기세포를 원하고자하는 분화가 이루어질 수 있도록, 줄기세포의 분화에 요구되는 적합한 환경을 제공하는 것이 중요하다는 것을 인식하였다.
본 발명의 발명자들은, 만능 줄기세포로부터 자발적인 박동을 할 수 있는 심장 오가노이드를 생체 심장의 자연 발생과정(natural development)과 같은 분화 과정을 통하여 형성하고, 이를 통하여 구조 및 기능적으로 심장과 유사한 심장 오가노이드를 개발하는데 이르렀다.
이에, 본 발명이 해결하고 하는 과제는, 생체 심장과 유사한 심실 및 판막 등의 구조를 가지며, 전기적인 자극없이도 자가 수축을 할 수 있는 심장 오가노이드 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
나아가, 본 발명이 해결하고 하는 다른 과제는, 전술한 심장 오가노이드를 통해 신약 개발에 있어 약물에 대한 유효성 및 독성을 평가할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 만능 줄기세포(pluripotent stem cells, PSCs)를 심근세포(cardiomyocytes, CM)로 분화되도록 제 1 배양하는 단계, 융합 조직을 형성하도록 상기 심근세포와 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)을 제 1 유지 배지(maintenance media)에서 제 2 배양하는 단계 및 심장 오가노이드를 형성하도록 상기 융합 조직을 제 2 유지 배지에서 제 3배양하는 단계를 포함하는, 심장 오가노이드 제조 방법이 제공된다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어, "만능 줄기세포"는 몸을 구성하는 모든 세포로 분화하는 능력을 갖추고 있는 세포를 의미할 수 있으며, 일반적으로 다능성으로 분화한다는 공통적인 특징을 갖는 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)와 배아 줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 배아 줄기세포는 착상 이전 단계에 배반포(blastocyst)의 내부 세포 덩어리(inner cell mass)로부터 유도된다. 유도된 세포는 특정한 환경에서 유지되며, 무제한적인 배양 및 다능성 분화가 가능하다. 나아가, 유도 만능 줄기세포는 신체 체세포로부터 역분화되어 만들어지는 다능성 분화 세포를 의미할 수 있으며, 세포 융합, 핵 치환, 다분화성 조절 인자의 과발현과 같은 재프로그래밍(reprograming)이라는 과정을 통해 체세포를 배아 줄기세포와 매우 유사한 상태로 만들어줌으로써 형성된다. 나아가, 만능 줄기세포는 배아 줄기세포 및 유도 만능 줄기세포에 제한되는 것은 아니며, 분화 다능성 및 자기 복제능을 겸비한 세포를 모두 포함할 수 있다. 그러나, 바람직하게 만능 줄기세포는 포유동물의 세포, 더욱 바람직하게는 인간 유래의 만능 줄기세포일 수 있다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어, "심근 세포"는 심장을 이루는 세포를 의미한다. 심근 세포는 심장 구조에 따라서, 심방, 심실 및 노들 심근 세포로 나뉠 수 있으며, 심근 세포는 단핵 세포일 수 있고 출생 후 인체 내에서 분열 기능이 상실될 수 있다. 따라서, 손상된 심근 세포의 회복은 어려울 수 있다. 한편, 심근 세포는 심근 경색 또는 심근염 등의 스트레스에 노출되게 되면 손상되거나 소멸될 수 있다. 이에, 심근 세포의 손상 또는 소멸은 심근 기능의 저하를 유발하고, 이는 심장 질환을 유발할 수 있다. 따라서, 심장 기능의 회복 또는 심장 질환의 치료를 위한 재생 세포치료에 있어서, 줄기세포로부터 분화된 심근세포가 이용될 수 있다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어, "오가노이드"는 조직 또는 기관의 형태와 기능 모두를 재현하는 작은 배양체를 의미한다. 보다 구체적으로, 오가노이드는 기관 또는 조직을 구성하는 여러 종류의 세포들 중 하나 이상의 세포 종류를 포함하고 있어야 하며, 각 기관이 갖는 특수한 기능을 재현할 수 있어야 하며, 세포들끼리 서로 뭉쳐서 공간적으로 기관과 유사한 형태로 조직되어야 한다. 이러한, 오가노이드는 단순한 세포들의 집합체가 아닌 계통을 이루고 있다는 점에서 스페로이드(speroid)와 차이를 가지며, 신약 개발, 인공 장기, 질병 치료제 및 질병 치료를 위한 환자별 모델로 이용될 수 있다.
본 발명의 특징에 따르면, 제 1 유지 배지는 인슐린을 포함하지 않으며, 제 2 유지 배지는 인슐린을 포함할 수 있다. 이때, 인슐린은 당과 아미노산을 세포 내로 흡수를 촉진하여 세포의 증식을 촉진시키는 인자(factor)일 수 있다. 그러나, 조건에 따라 오히려 세포의 증식을 억제하고 세포 분화를 유발시킴에 따라, 목적에 따라 포함 유무를 결정할 수 있다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어 "배지"는, 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(In vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 제 1 배양하는 단계는, 만능 줄기세포를 접종하는 단계, 접종된 만능 줄기세포를 제 1 유지 배지에서 유지하는 단계, 만능 줄기세포가 중배엽 세포 단계를 거쳐 심장 전구세포로 유도되도록 만능 줄기세포를 유도 배지(induction medium)에서 배양하는 단계 및 심장 전구세포가 성숙 심근세포로 분화되도록, 중배엽 세포를 제 1 유지 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 유도 배지는, IWR-1 endo, XAV-939, JW74, SEN461, ICG-001, LGK-974, IWP-2, IWP-4, Wnt-C59 및 WIKI4로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 이때, 다양한 실시예에서 IWR-1 endo가 사용될 수 있으며, 농도는 10 uM이상으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 심장 전구세포로 유도되도록 만능 줄기세포를 유도 배지에서 배양하는 단계는, 5 내지 7일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양할 수 있다. 이때, 5 내지 7일은 만능 줄기세포가 유지하는 단계를 거쳐 유도배지에서 배양을 시작하는일로부터의 5 내지 7일을 의미할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 심장 전구세포를 제 1 유지 배지에서 배양하는 단계는, 10 내지 21일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양할 수 있다. 이때, 5 내지 7일은 만능 줄기세포가 유지하는 단계를 거쳐 유도배지에서 배양을 시작하는일로부터의 10 내지 21일을 의미할 수 있다. 이에, 만능 줄기세포를 심근세포로 분화되도록 제 1 배양하는 단계는 10 내지 21일 중 적어도 하나의 기간 동안 수행될 수 있으며, 제 1 배양하는 단계를 통하여, 자발적으로 수축가능한 성숙한 심근세포를 형성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 세포외 기질은, 섬유아세포(fibroblast)로부터 획득될 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 제 2 배양 단계는, 28 내지 32일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 제 3 배양 단계는, 융합조직을 세절하는 단계, 및 세절된 상기 융합 조직을 부유배양하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 제 3 배양하는 단계는 부유 배양시작일로부터 25일 내지 3년 이하의 기간 중 적어도 하나의 기간동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 현재까지 개발된 심근 세포는 자발적인 수축이 나타난 뒤, 지속적인 생존 및 증식을 유지하지 못하고 2 내지 3주 정도의 짧은 생존 기간을 가졌다. 이에, 약물 유효성 및 독성평가에 2 내지 3주 정도의 기간 동안 배양된 2차원의 미성숙 심근 세포가 이용되어 왔다.
나아가, 생체 장기들과 보다 유사하게 모사하기 위하여, 심근 세포로부터 개발된 종래의 3차원 스페로이드(speroid) 및 오가노이드는 2차원의 심근 세포와 마찬가지로 지속적인 수축 운동이 이루어지지 않아 전기 자극을 공급해주어야 한다. 또한, 스페로이드 및 오가노이드 내부의 세포들은 외부환경과 교류를 할 수 없어, 영양을 공급받지 못하여 사멸하게 된다. 이러한, 3차원의 스페로이드는 2차원의 심근 세포와 마찬가지로 생존 능력이 안정적이지 못하다는 한계가 있다.
그러나, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드는 고도화로 조직화되어, 전기 자극없이 지속적인 수축운동을 할 수 있으며, 적정 배지가 유지될 경우, 장기간 성장이 가능하다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드는 형태학적으로 심장과 유사한 심실 즉, 오가노이드 내부가 비어있어 유체를 수용할 수 있는 챔버가 형성되어 있다. 이에 따라, 오가노이드 내부의 세포는 챔버에 수용된 유체 즉, 배지를 통하여 직접적으로 영양을 교류하고, 이에, 심장 오가노이드를 형성하고 있는 세포들은 생존을 유지하며 성장할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드는 종래의 약물 유효성 및 독성평가에 이용되어 왔던 모델들보다 향상된 생존 기간을 가지며, 성숙한 형태의 심장 오가노이드 및 심근 세포를 형성할 수 있음에 따라, 생체 장기와 형태 및 기능이 보다 유사할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 유체가 저장되는 챔버(chamber), 챔버와 연결되어 유체가 유입되는 제 1 관(track), 챔버와 연결되어 유체가 유출되는 제 2 관, 및 제 1 관에 형성되어 자발적으로 유입관을 개폐시키는 밸브(valve)를 포함하고, 자가 수축(spontaneous contraction)을 하는 심장 오가노이드가 제공된다.
이때, 본 발명의 특징에 따르면, 챔버는, TUBB3, TNNT2, PECAM1 및 MYL2를 발현하고, 육주화된 심근 세포가 챔버의 내관을 향하여 형성될 수 있다. 나아가, 챔버는 칼슘 트랜지언트가 형성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 전술한 심장 오가노이드와 약물을 반응시키는 단계, 약물 반응이 끝난 심장 오가노이드를 세척하는 단계, 세척된 심장 오가노이드를 배양하는 단계, 반응, 세척 및 배양하는 단계를 영상으로 촬영하는 단계, 촬영된 영상을 수득하는 단계 및 수득된 영상을 분석하는 단계를 포함하는, 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가 방법이 제공된다.
본 발명의 특징에 따르면, 상기 영상을 분석하는 단계는 심장 오가노이드의 수축 운동 시의 연속적으로 촬영된 영상에서 세포 영역과 배경 영역 간의 픽셀(pixel)값의 변화량 차이에 기초하여 전도 변위, 심박 변이 및 박동 속도를 측정할 수 있다. 예를 들어, cellogy pulse analysis을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명은 심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법을 제공하여, 신약 개발에 있어 약물에 대한 검증 즉, 유효성, 부작용 및 독성을 평가할 수 있는 효과가 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 생체 심장과 상이한 구조를 가졌던 종래의 오가노이드들과는 달리 심실, 유출입구 및 판막과 유사한 구조의 챔버, 유출입관 및 밸브를 가지고, 외부의 전기 자극 없이 자발적인 수축 운동을 할 수 있으며, 이에 따른 판막운동과 같은 밸브의 작용 및 외내부의 액체를 순환시킬 수 있다. 이에, 약물에 따른 심장의 구조적 이상을 확인할 수 있다.
나아가, 본 발명은 신경 세포의 확인 마커인 TUBB3, 심근 세포의 확인 마커인 TNNT2, 혈관 내피세포의 확인 마커인 PECAM1 및 심실 확인 마커인 MYL2를 발현함에 따라, 생체 심장의 혈관 및 신경과 같은 세부적인 기능에 대해서도 약물에 따른 유효성, 부작용 및 독성을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 심장 오가노이드는, 생체 심장과 기능적 및 구조적으로 유사한 인체 모사 모델로서 약물의 부작용, 독성 및 유효성 평가에 이용될 수 있다.
나아가, 본 발명의 심장 오가노이드는 신약 개발에 있어 약물 후보 물질 스크리닝에 활용되어 소요되는 비용 및 시간을 획기적으로 줄일 수 있으며, 심장암의 생리학적 연구 및 임상시험에 활용될 수 있다. 더 나아가, 본 발명은 발명의 다양한 원인에 대한 실험이 가능하여 불필요한 약의 복용을 막아 치료에 대한 비용을 줄일 수 있는 개인별 맞춤 진단에 활용될 수 있다.
또한, 오가노이드는 종양원성이 낮고 재생능력이 뛰어나기 때문에, 본 발명의 심장 오가노이드는 손상된 심장에 이식되어 심장을 재생시킬 수 있는 재생치료제로 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법의 절차를 도시한 것이다.
도 2a 내지 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법에서의 제 1 배양하는 단계의 절차를 도시한 것이다.
도 3a 내지 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법에서의 제 2 배양하는 단계의 절차를 도시한 것이다.
도 4a 내지 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법에서 사용되는 세포외 기질을 생산하는 방법에 대한 절차를 도시한 것이다.
도 5a 내지 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법에서의 제 3 배양하는 단계의 절차를 도시한 것이다.
도 6a 내지 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드의 심근에 대한 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 7을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드의 결환 내피세포에 대한 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 8a 내지 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드의 생체 심장의 심실과 유사한 기관인 챔버에 대한 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 9a 내지 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드의 신경 세포에 대한 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 10a 내지 10c는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드의 유출입관 및 밸브에 대한 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 11a 내지 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드의 자발적인 수축 운동에 대한 결과를 도시한 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가 방법의 절차를 도시한 것이다.
도 13a 내지 13d는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 및 유효성 평가에 대한 결과를 도시한 것이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 분화(Differentiation) "는 세포가 특별한 기능을 갖는 특정한 세포나 조직의 복합체 또는 개체의 수준으로 발달하는 것을 의미한다.
실시예 1. 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통한 심장 오가노이드의 형성 과정
이하에서는 도 1 내지 10c를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통한 심장 오가노이드의 형성 과정에 대하여 구체적으로 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법의 절차를 도시한 것이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법은, 만능 줄기세포(pluripotent stem cells, PSCs)를 심근세포(cardiomyocytes, CM)로 분화되도록 제 1 배양하는 단계, 분화된 심근세포와 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)이 융합 조직을 형성하도록 제 1 유지 배지(maintenance media)에서 제 2 배양하는 단계 및 형성된 융합 조직이 심장 오가노이드를 형성하여 성장하도록 제 3 유지 배지에서 제 3 배양하는 단계를 포함한다.
이때, 본 명세서에서 사용되는 용어 "제 1 유지 배지"는, 동물세포를 유지 및 성장시키기 위해 사용되는 인슐린을 포함하지 않은 천연 또는 인공의 무혈청 배지를 의미한다. 보다 구체적으로, 제 1 유지 배지는 인슐린을 의도적으로 배제하여 만능 줄기세포 유래의 심근세포 형성에 있어, 심근이 형성되기 전 과정인 심중배엽 형성을 억제할 수 있으며, 항상화 물질을 포함하여 활성 산소에 의한 세포 손상을 억제할 수 있다. 나아가, 제 1 유지 배지는 인슐린을 포함하지 않는 최소 필수 배지(Minimal essential medium, MEM), 이글 최소 필수 배지(Eagle's MEM), 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM), Ham's F 12, SF 12 및 RPMI 1640 등과 같은 다양한 무혈청 배지 및 이들의 변이형을 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 인슐린을 포함하지 않는 RPMI 1640일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가, 배양 환경 조건에서 온도는 36 ℃내지 38 ℃바람직하게는 36.5 ℃내지 37.5 ℃이며, 공급 산소(O2)는 1 % 내지 25 %이며, 공급 이산화탄소(CO2)는 1 % 내지 15 %일 수 있다.
이하에서는 전술한 제 1 배양하는 단계, 제 2 배양하는 단계 및 제 3 배양하는 각 단계에 대하여 구체적으로 설명한다.
(1) 심근세포 형성을 위한 제 1 배양 단계
먼저, 도 2a는, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법에서의 제 1 배양하는 단계의 절차를 도시한 것이다. 이하에서는 설명의 편의를 위해서 2b를 참조하여 설명한다.
도 2a를 참조하면, 제 1 배양하는 단계는, 만능 줄기세포를 접종하는 단계, 접종된 만능 줄기세포를 제 1 유지 배지에서 유지하는 단계, 만능 줄기세포가 중배엽 세포 단계를 거쳐 심장 전구세포로 유도되도록 만능 줄기세포를 유도 배지(Mesodermal induction medium)에서 배양하는 단계 및 심장 전구세포가 성숙 심근세포로 분화되도록 심장 전구세포를 제 1 유지 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 만능 줄기세포를 접종하는 단계에서는, 미분화 상태의 만능 줄기세포를 단백질 분해 효소를 이용하여 조직에서 분리한 후, 제 1 유지 배지와 현탁하여 만능 줄기세포의 밀도가 3 내지 6 × 104 /cm2 되도록 플레이트상에 접종(Seeding)시킨다. 이때, 접종된 만능 줄기세포의 밀도는 3 내지 6 × 104 /cm2 인 것으로 나타나지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 5 × 104 /cm2일 수 있다.
나아가, 본 명세서에서 사용되는 용어 "단백질 분해 효소"는, 생체 조직에 포함되는 세포 또는 세포 집합체를 유리시키기 위해서 세포간 기질을 단리시킬 수 있는 효소를 의미하며, 조직으로부터 만능 줄기세포를 분리 또는 세포 및 세포 집합체를 분리하기 위하여 콜라제네이즈(Collagenase), 디스페이즈(Dispase), 프로테아제(Protease) 및 트립신(Trypsin) 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더 나아가, 본 명세서에서 사용되는 용어 "플레이트"는, 세포 배양이 이루어질 수 있는 것이라면 한정되지 않고, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬, 페트리디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 팸버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이 및 배양 백 등 다양한 모양의 플레이트가 이용될 수 있으며, 상부 표면에 세포 부착층 코팅막을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 플레이트의 코팅막은, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미딘, 라미딘 프래그먼트, 비트로넥린, 기저막 매트릭스, 젤라틴, 히알루론산, 폴리리신, 비트로넥린 및 마트리겔 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 만능 줄기세포는 코팅막을 포함하는 플레이트에 배양됨에 따라 세포의 접착 및 신전이 촉진되어, 중배엽 계통 세포의 분화 효율이 증가될 수 있다.
그 다음, 접종된 만능 줄기세포를 제 1 유지 배지에서 유지하는 단계는 접종된 만능 줄기세포를 적응 및 안정화를 위한 단계로서, 2 내지 3일간 제 1 유지 배지를 매일 교체해주며 만능 줄기세포를 배양한다. 이에, 도 2b를 참조하면, 제 1 유지 배지에서 유지하는 단계를 통하여 만능 줄기세포가 안정화되어, 배양 시작일(D0)에는 구형의 만능 줄기세포가 플레이트에 부착된 것으로 나타난다.
그 다음, 만능 줄기세포가 중배엽 세포 단계를 거쳐 심장 전구세포로 유도되도록 만능 줄기세포를 유도 배지에서 배양하는 단계에서는, 0.1 내지 8 μM의 CHIRR99021, 50 내지 150 ng/ml의 Activin A, 1 내지 10 ng/ml의 BMP4, 0.01 내지 3 μM의 Wnt 저해제 및 제 1 유지 배지를 포함하는 유도 배지에서 만능 줄기세포가 배양됨으로써, 중배엽 세포가 유도될 수 있다.
보다 구체적으로, 플레이트에 부착된 만능 줄기세포는 배양 시작일(D0)에 0.1 내지 8 μM의 CHIRR99021 및 제 1 유지 배지를 포함하는 배지에서 2일간 배양된다. 이때, CHIRR99021의 함량은 0.5 내지 8μM일 수 있으나, 바람직하게, 배양 시작일(D0)에 만능 줄기세포의 생존 및 증식의 효과를 향상시킬 수 있는 CHIRR99021의 함량은 5 내지 7uM일 수 있다.
이때, CHIRR99021는 GSK(Glycogen synthase kinase)-3β의 활성을 억제하는 물질이다. 보다 구체적으로, GSK-3β가 억제됨에 따라 세포 증식에 관여하는 신호전달체계의 ß-catenin이 GSK-3β에 의해 분해되지 않아 세포 증식에 관여하는 유전자 발현량이 증가되어, 세포의 생존 및 증식이 향상될 수 있다.
또한, Activin A 및 BMP4는 TGF-β그룹에 속하는 성장 및 분화인자로서, 배아 발생과정 중 중요한 세포신호 체계인 BMP 및 Activin/Nodal 신호를 활성화하여 외배엽성 신경계로의 분화는 억제하고 중배엽성 계통으로의 분화를 촉진시킬 수 있다.
또한, Wnt 저해제는 세포내 신호 전달 시스템에 기여하는 Wnt 단백질을 저해하는 물질로서, GSK-3β를 활성시켜 중배엽 세포를 심장 전구세포로 분화시킬 수 있다. 나아가, Wnt 저해제는 IWR-1 endo, XAV-939, JW74, SEN461, ICG-001, LGK-974, IWP-2, IWP-4, Wnt-C59 및 WIKI4로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, Wnt 신호 체계를 저해하여 GSK-3β를 활성시킬 수 있는 모든 물질을 포함할 수 있다. 이러한, Wnt 저해제의 처리를 통하여 중배엽 세포는 심근 세포의 구성 단백질 중 하나인 cTnT(cardiac troponin T) 양성률이 80 내지 98 %인 고순도의 심장 전구세포로 분화될 수 있다.
그 다음, 배양 2일째의 만능 줄기세포(D2)는 CHIRR99021가 제거되고, 50 내지 150 ng/ml의 Activin A 및 마트리겔과 1 : 40의 부피비를 이루도록 혼합된 제 1 유지 배지를 포함하는 배지로 교체되어 1일간 배양된다.
그 다음, 배양 3일째의 만능 줄기세포(D3)는 0.5 내지 8 μM의 CHIRR99021, 1 내지 10 ng/ml의 BMP4 및 제 1 유지 배지를 포함하는 배지로 교체되어 2일간 배양되어 중배엽 세포로 유도될 수 있다. 이때, CHIRR99021의 함량은 0.5 내지 8μM일 수 있으나, 바람직하게, 배양 3일째(D3)에 만능 줄기세포의 생존 및 증식의 효과를 향상시킬 수 있는 CHIRR99021의 함량은 0.5 내지 2uM일 수 있다.
그 다음, 중배엽 세포로 유도된 배양 5일째의 만능 줄기세포(D5)는 0.01 내지 3 μM의 Wnt 저해제 및 제 1 유지 배지를 포함하는 배지로 교체되어 2일간 배양된다.
이에, 전술한 방법에 의하여, 7일간 배양된 만능 줄기세포(D7)는 중배엽 세포 단계를 거쳐 심장 전구세포(cardiac progenitor)로 유도 분화될 수 있다. 보다 구체적으로, 도 2b를 참조하면, 만능 줄기세포는 플레이트에 부착된 형태로 배양되어(D0), 중배엽 세포 단계(D2 내지 D3)을 거쳐, 심장 전구세포(D5)로 유도 분화될 수 있다.
그 다음, 분화된 심장 전구세포는 성숙한 심근세포로 분화되도록 제 1 유지 배지에서 배양된다. 보다 구체적으로, 도 2b를 참조하면, 심장 전구세포는 배양 5일째(D10)부터 자가 수축(spontaneous contraction)하는 성숙한 심근세포가 출현하기 시작하며, 성숙한 심근세포의 출현 이후, 제 1 유지 배지에서 4 내지 5일간의 배양을 통하여 심근세포를 증식 및 성장시킬 수 있다. 이때, 심근세포의 증식 및 성장을 위한 배양의 기간이 4 내지 5일을 경과할 경우, 심근세포의 수가 줄어들 수 있다. 이에, 심근세포의 수율이 극대화될 수 있는 배양기간은 바람직하게 4 내지 5일(만능 줄기세포로부터 배양된지 14 내지 15일)일 수 있다.
이상의 제 1 배양하는 단계를 통해, 만능 줄기세포는 자가 수축할 수 있는 성숙한 심근 세포를 고수율로 분화시킬 수 있는 효과가 있다. 나아가, 이러한 성숙한 심근세포는 심장 근육세포의 근본적 치료제로 활용할 수 있다. 예를 들어, 심장 기능의 회복 또는 심장 질환의 치료를 위한 재생 세포치료에 이용될 수 있다. 또한, 제 1 배양하는 단계를 통해 형성된 심근 세포는 신약 개발 과정에서 후보물질의 심장 독성에 대한 안정성 및 효과 판별 실험에도 사용될 수 있다.
(2) 융합 조직 형성을 위한 제 2 배양 단계
먼저, 도 3a는, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법에서의 제 2 배양하는 단계의 절차를 도시한 것이다. 이하에서는 설명의 편의를 위해서 3b 내지 4b를 참조하여 설명한다.
도 3a을 참조하면, 제 2 배양하는 단계는, 만능 줄기세포가 성숙한 심근세포로 분화되도록 제 1 배양하는 단계 이후에 수행되며, 제 1 배양단계를 통하여 형성된 성숙한 심근세포를 포집하여 세포외 기질이 위에 얹고, 제 1 유지 배지를 첨가하여 심근세포와 세포외 기질이 융합 조직을 형성하도록 28 내지 32일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양한다.
보다 구체적으로, 도 3b를 참조하면, 제 2 배양 첫날(D0)에서는 심근 세포와 세포외 기질이 서로 구분되어 떨어져 있는 것으로 나타난다. 그러나, 세포 배양이 진행될수록, 심근세포와 세포외 기질은 서로 단단히 융합되어 세포 집괴(cell clump)가 형성되고, 30일 동안 배양하였을 때, 세포 집괴가 세포외 기질에 넓게 퍼져 패치(patch) 형태의 융합 조직이 형성된 것으로 나타난다.
이때, 본 명세서에서 사용되는 용어 "세포외 기질(extracellular matrix, ECM) "은 세포의 증식, 분화 및 사멸 등의 여러가지 세포 대사경로에서 영향을 미치는 신호를 제공하는데 중요한 역할을 하는 3차원 구조의 조직의 발달에 지지체를 의미한다. 세포외 기질은 세포가 성장하고 분화하는데 필요한 화학적 인자(biochemical factors)들을 저장하고, 공급해줌과 동시에 세포가 인식할 수 있는 물리적 환경을 제공할 수 있다. 세포외 기질은 각 조직을 구성하는 세포들이 필요에 의해서 만들어낸 산물로서, 콜라겐(collagen) 및 엘라스틴(elastin)과 같은 구조체 단백질(structural protein), GAG(glycosaminoglycan)과 같은 다당류, 세포의 부착을 돕는 부착 단백질(adhesive proteins) 및 성장인자들을 포함하고 있다. 이러한, 세포외 기질은 유래되는 조직 및 세포에 따라 서로 다른 성분으로 구성되어 있으며, 특수한 물리적 성질을 지니고 있다.
이에, 본 발명의 일 실시예에서 사용되는 세포외 기질은 섬유아세포로부터 획득될 수 있으며, 바람직하게는 심장 조직에서 유래한 섬유아세포로부터 획득될 수 있다.
보다 구체적으로, 도 4a를 참조하면, 먼저, 심장 조직으로부터 획득된 섬유아세포를 8 내지 10 %의 FBS, 0.5 내지 2 %의 glutamax, 0.5 내지 2 %의 non-essential amino acids, 0.5 내지 2 %의 antibiotix-antimycotix, 1 내지 3 mM의 acetic acid, 0.1 내지 0.3 mM의 ascorbic acid 및 5 내지 15 ng/ml의 BMP4를 포함하는 저혈청 배지(Advanced DMEM/F12)에서 3주간 배양하여, 섬유아세포로부터 세포외 기질을 배출시킨다. 그 다음, 세포외 기질이 배출되어, 섬유아세포와 패치 형태로 결합되어 있는 조직을 탈세포화(decellularization) 과정을 통하여 세포외 기질만 추출한다. 이때, 탈세포화 과정은 패치 형태로 결합되어 있는 조직에 0.25 %의 trypsin을 37 ℃의 항온수조에서 3시간 동안 처리한 뒤, 3 %의 triton-X 및 0.05 %의 EDTA가 포함되어 있는 PBS를 첨가하여 30분간 교반시켜 수행될 수 있다. 이에, 도 4b를 참조하면, 섬유아세포와 세포외기질이 뒤섞여 불투명했던 결합 조직이 탈세포화 과정을 통하여, 섬유아세포가 분리되어 세포외 기질만 남아 부피가 줄어들고, 투명하게 변한 것으로 나타난다.
이상의 제 2 배양하는 단계를 통해, 심근세포는 심장 조직의 섬유아세포로부터 유래한 세포외 기질과 배양됨에 따라, 생체와 유사한 물리적 환경에서 심장 융합 조직으로 발달할 수 있는 효과가 있다.
(3) 심장 오가노이드 형성을 위한 제 3 배양 단계
먼저, 도 5a는, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법에서의 제 3 배양하는 단계의 절차를 도시한 것이다. 이하에서는 설명의 편의를 위해서 5b 내지 10c를 참조하여 설명한다.
도 5a를 참조하면, 제 3 배양하는 단계는, 융합 조직 형성을 위한 제 2 배양 단계 이후에 수행되며, 제 2 배양 단계로부터 형성된 융합 조직이 제 2 유지 배지에서 배양된다. 보다 구체적으로, 도 5b를 참조하면, 패치 형태의 융합 조직이 세절된 현미경 이미지가 도시된다. 배양에 앞서, 패치 형태의 융합 조직을 피펫 등을 이용하여 물리적으로 여러 조각으로 세절한다. 그 다음, 3 내지 10개의 세절된 조직을 플레이트에 옮긴 뒤, 2일에 한번씩 제 2 유지 배지를 교체해주며 부유 배양(floating culture 또는 suspension culture)한다.
이때, 본 명세서에서 사용되는 용어 "부유 배양"은, 스피너(spinner) 및 로테이셔널 챔버(rotational chamber) 등과 같은 교반기(stirrer)를 이용하여 세포를 끊임없이 움직여 바닥에 세포가 부착하지 못하도록 액상 내에 부유된 생태로 자라는 3차원 세포 배양 모델을 의미한다. 부유 배양은 세포가 배양액에 떠서 움직이다 보면 세포간 상호작용을 통해 보다 친화성이 높은 세포끼리 접착하고, 원래의 조직 구조를 반영한 구조를 만드는 특징이 있다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "제 2 유지 배지"는, 동물세포를 유지 및 성장시키기 위해 사용되는 인슐린을 포함하는 천연 또는 인공의 무혈청 배지를 의미한다. 보다 구체적으로, 제 2 유지 배지는 인슐린을 포함하여 포도당 및 아미노산의 흡수를 촉진시키고, 심장 오가노이드 형성 및 성장을 증진시킬 수 있다. 나아가, 제 2 유지 배지는 인슐린을 포함하는 최소 필수 배지(Minimal essential medium, MEM), 이글 최소 필수 배지(Eagle's MEM), 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM), Ham's F 12, SF 12 및 RPMI 1640 등과 같은 다양한 무혈청 배지 및 이들의 변이형을 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 인슐린을 포함하는 RPMI 1640일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
전술한 방법에 의하여 형성된 심장 오가노이드는 생체 심장의 발생학 과정과 유사한 과정을 통하여 형성될 수 있으며, 이에, 형태 및 기능이 생체 심장과 매우 유사한 생체 대응 모델을 형성할 수 있다.
예를 들어, 다시 도 5a를 참조하면, 심근 세포와 세포외 기질로부터 형성된 융합 조직은 제 3 배양하는 단계 동안 심근 및 혈관, 챔버(심실) 및 신경, 유출입관 및 밸브, 심 내막근을 형성하여 심장 오가노이드로 발달할 수 있으며, 지속적으로 성장 및 유지될 수 있다. 이때, 각 조직의 형성 기간은 제 3 배양하는 단계 시작일로부터 심근 및 혈관 0 내지 10일, 챔버 및 신경 10 내지 30일, 유출입관 및 밸브 30 내지 60일 및 심내막근 60 내지 90일인 것으로 나타난다. 그러나, 각 세포 및 조직의 형성 기간은 이에 제한되는 것은 아니며, 세절된 조직의 크기에 따라 세포의 발달 및 성장 속도에 따라 상이할 수 있다.
한편, 심장은 심근 세포 내의 칼슘 이온 농도의 조절로 인하여 수축됨에 따라, 칼슘 트랜지언트(transient)의 확인을 통하여 심근 세포의 존재 및 자발적인 수축 운동의 여부를 확인할 수 있다.
이에, 심근의 형성 여부를 확인하기 위하여, 도 6a를 참조하면, 세포내 칼슘에 결합하는 염색 시약인 Fluo-4를 이용한 심근 발달 형태에 대한 형광염색 이미지가 도시된다. 심장 오가노이드의 외측(outside) 및 내강(inside)에 칼슘 트랜지언트(transient)가 형성된 것으로 나타나며, 이는, 심장 오가노이드에 칼슘이 형성된 심근 세포가 존재하며, 이를 통하여 외부의 전기자극 없이 자발적인 수축 운동을 할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
나아가, 내강에서의 심근 세포는 심장 오가노이드의 내측 방향으로 육주화(trabeculation)되어 형성된 것으로 나타난다. 이는, 심장의 발달 동안, 심근 세포가 심실 내강 내로 연장되어, 육주화된 심근 세포를 형성하여 심근을 비대하고 섬유화하는 과정과 유사한 것으로 나타난다. 보다 구체적으로, 도 6b를 참조하면, 배양이 진행될수록 심장 오가노이드의 심근이 육주화된 심근 세포로 인하여 비대해지는 것으로 나타난다. 이때, 심근 세포는 제 3 배양하는 단계 시작일로부터 0 내지 10일 동안 형성되는 것으로 나타나며, 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가, 심근의 형성과 동시에 심장 오가노이드에 혈관이 형성된다. 보다 구체적으로, 도 7을 참조하면, 심근 세포 확인 마커인 TNNT2(troponin T2) 및 혈관 내피 세포 확인 마커인 PECAM1(Platelet endothelial cell adhesion molecule 1)을 이용한 혈관 형성에 대한 면역 형광 염색 이미지가 도시된다. 이때, DAPI 염색을 이용하여 핵과 염색질(chromatin)을 대조적으로 확인하였다. 혈관 내피 세포는 심근 세포를 따라 심장 오가노이드의 외측 및 내강에 형성된 것으로 나타난다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통한 심장 오가노이드는 심장 발생 과정에서 나타나는 심근의 형성과 유사한 과정을 통하여 심장 오가노이드의 심근을 형성할 수 있으며, 심장 오가노이드의 심근 세포 내에 칼슘이 형성됨에 따라, 칼슘 이온 농도에 따른 수축 운동을 할 수 있다.
그 다음, 심장 오가노이드에서 생체 심장의 심실과 같은 기관인 챔버의 형성 여부를 확인하기 위하여, 도 8a를 참조하면, 심실 확인 마커인 MYL2(myosin regulatory light chain 2)를 이용한 심실 형성에 대한 면역 형광염색 이미지가 도시된다. 심실 확인 마커인 MYL2가 심장 오가노이드의 전체를 둘러싸며 발현된 것으로 나타나며, MYL2의 발현과 동시에 DAPI도 발현함에 따라, 형성된 심장 오가노이드의 세포 사멸(apoptosis)는 발생하지 않은 것으로 나타난다. 이때, 챔버는 제 3 배양하는 단계 시작일로부터 10 내지 30일 동안 형성되는 것으로 나타나며, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 생체의 심실은 단순한 근육 조직이 아닌 액체를 수용할 수 있는 챔버(chamber)가 형성된 조직을 의미할 수 있다. 이에, 도 8b를 참조하면, 챔버가 형성된 심장 오가노이드에 대한 현미경 이미지가 도시된다. 이때, 심장 오가노이드의 챔버 확인을 위하여, 바늘(needle) 및 집게(forcep)을 이용하였다. 제 3 배양하는 단계 시작일로부터 30일째의 심장 오가노이드를 집게를 이용하여 쥐어 짜낸 결과, 심장 오가노이드의 챔버 내에 수용되어 있던 액체가 분출되는 것으로 나타난다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통한 심장 오가노이드는 생체 심실과 형태학적으로 유사한 챔버를 형성할 수 있다.
그 다음, 신경 세포의 형성 여부를 확인하기 위하여, 도 9a를 참조하면, 자가 수축하는 심근 세포의 현미경 이미지가 도시된다. 보다 구체적으로, 심근 세포의 주변에 신경 섬유 다발(bundle of neuron fiber)이 형성된 것으로 나타난다. 이에, 신경 세포는 오가노이드가 형성되기 전, 심근 세포에서부터 형성된다는 것을 의미할 수 있다.
나아가, 도 9b를 참조하면, 신경 세포 확인 마커인 TUBB3(β-tubulin-III)를 이용한 신경 세포 형성에 대한 면역 형광염색 이미지가 도시된다. 신경 세포 확인 마커인 TUBB3가 오가노이드의 전체를 둘러싸며 발현된 것으로 나타난다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통한 심장 오가노이드는 신경 세포가 형성됨에 따라, 전기적인 방법으로 신호를 교류할 수 있다.
그 다음, 유출입관의 형성 여부를 확인하기 위하여, 도 10a를 참조하면, 심장 오가노이드의 유출입관에 대한 현미경 이미지가 도시된다. 보다 구체적으로, 심장 오가노이드는 챔버와 연결되어 챔버 내로 유체가 유입되는 제 1 관 및 챔버와 연결되어 챔버 내의 유체가 유출될 수 있는 제 2 관이 형성된 것으로 나타난다. 즉, 심장 오가노이드는 정맥 및 동맥과 연결되어 혈액이 순환되는 생체 심장과 유사한 구조를 형성할 수 있다.
나아가, 유체가 유입되는 제 1 관에는 유입관을 개폐시켜, 유체의 유입을 조절할 수 있는 밸브(valve)가 형성된 것으로 나타난다. 보다 구체적으로, 도 10b를 참조하면, 심장 오가노이드의 제 1 관에 형성된 밸브에 대한 형광염색 이미지가 도시된다. 심장 오가노이드의 제 1 관에 형성된 밸브는 심근으로부터 유래된 얇은 근육층이 제 1 관을 개폐시키는 것으로 나타난다.
더 나아가, 도 10c를 참조하면, 심장 오가노이드의 밸브가 유체 흐름에 따라 조절되는 것으로 나타난다. 즉, 심장 오가노이드는 혈액을 일정하게 흐르도록 도와주는 판막과 유사한 기능 및 구조를 형성할 수 있다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통한 심장 오가노이드는 제 1 관, 제 2 관 및 밸브를 통하여 심장 오가노이드 내부와 외부에 유체를 한 방향으로 일정하게 순환시킬 수 있다.
이상의 실시예 1을 통해, 본 발명의 다양한 실시예에 이용되는 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통한 심장 오가노이드는 생체 심장과 구조 및 기능적으로 유사하게 형성되어, 보다 생체 대응성이 높은 생체 유사 모델로 이용될 수 있다.
실시예 2. 심장 오가노이드의 기능성 검증 평가 확인
이하에서는 도 11a 및 11b를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드의 수축 운동에 대하여 구체적으로 설명한다.
도 11a 내지 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드의 자발적인 수축 운동에 대한 결과를 도시한 것이다.
도 11a의 (a)를 참조하면, 심장 오가노이드는 수축 운동에 대한 영상 이미지가 도시된다. 심장 오가노이드는 일부분이 아닌 전체적인 면적이 수축 시에 줄어들고, 이완 시에는 확장되는 것으로 나타난다. 보다 구체적으로 11a의 (b)를 참조하면, 도 11a의 (a)의 영상 이미지 정보를 pixels/sec로 나타낸 결과가 도시된다. 심장 오가노이드의 자발적인 수축 운동은 초당 1회 정도 발생하는 것으로 나타난다. 이는, 심장 오가노이드가 인간의 정상적인 심장 박동수인 분당 60 내지 100회와 유사한 박동수를 갖는 것을 의미할 수 있다. 이때, 심장 오가노이드의 수축 운동은 초당 1회 정도 발생하는 것으로 나타나지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 심장 오가노이드의 크기 및 배양 시기에 따라 상이할 수 있다.
나아가, 도 11b를 참조하면, 심장 오가노이드의 수축 운동 시의 심근에 대한 이미지가 도시된다. 심장 오가노이드가 이완되어 유체가 유입될 경우, 심근의 두께는 188 내지 250 μm인 것으로 나타나며, 심장 오가노이드가 수축되어 유체가 유출될 경우, 심근의 두께는 310 μm인 것으로 나타난다. 이때, 심장 오가노이드의 심근의 두께는 이완될 경우 188 내지 250 μm이며, 수축될 경우 310μm인 것으로 나타나지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 심장 오가노이드의 크기 및 배양 시기에 따라 상이할 수 있다.
이상의 실시예 2를 통해, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드는, 생체 심장과 유사한 수준의 자발적인 수축 운동 즉, 박동수를 가짐에 따라, 신약의 독성 및 유효성 평가에 있어 생체 심장에 대한 기능 모사 모델로 사용될 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드는 오가노이드 내부에서 발생하는 수축 운동에 따른 심근의 변화 및 유체의 유입까지 모니터링할 수 있다.
실시예 3. 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가
이하에서는 도 12 내지 13d를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가에 대하여 구체적으로 설명한다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가 방법의 절차를 도시한 것이다. 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가 방법은 심장 오가노이드와 약물을 반응시키는 단계(S110), 약물 반응이 끝난 심장 오가노이드를 세척하는 단계(S120), 세척된 심장 오가노이드를 배양하는 단계(S130), 반응, 세척 및 배양하는 단계를 영상으로 촬영하는 단계(S140), 촬영된 영상을 수득하는 단계(S150) 및 수득된 영상을 분석하는 단계(S160)를 포함할 수 있다.
이때, 심장 오가노이드는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법에 의하여 생성된 심장 오가노이드를 의미할 수 있으며, 육주화된 심근세포가 챔버의 내관을 향하여 형성됨에 따라, 심장의 발생 과정에서 나타나는 심근의 형성과 유사한 과정을 통하여 심근을 형성할 수 있다.
나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드는 유체가 저장되는 챔버, 챔버와 연결되어 유체가 유입되는 제 1 관, 챔버와 연결되어 유체가 유출되는 제 2관 및 제 1 관에 형성되어 자발적으로 유입관을 개폐시키는 밸브를 포함할 수 있다.
더 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드는 신경 세포의 확인 마커인 TUBB3, 심근 세포의 확인 마커인 TNNT2, 혈관 내피세포의 확인 마커인 PECAM1 및 심실 확인 마커인 MYL2를 발현할 수 있으며, 칼슘 트랜지언트가 형성할 수 있다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드는 체내 심장과 유사한 구조를 가지고, 외부의 전기 자극 없이 자발적인 수축 운동을 할 수 있으며, 외내부의 액체를 순환시킬 수 있다. 따라서, 심장 오가노이드는 약물에 대한 부작용, 독성 및 유효성 평가에 있어 인체 모사 모델로 이용될 수 있다.
예를 들어, 항암 치료에 필수적인 항암제들은 종종 심독성을 유발하여 환자의 예후에 영향을 미치며, 항암제의 심독성으로 인한 심장 부작용으로 심실 기능 부전(LV dysfunction), 허혈, 고혈압 및 부정맥 등이 발생할 수 있다. 보다 구체적으로, 독소루비신(Doxorubicin), 다우노루비신(Daunorubicin), 아이다루비신(Idarubicin), 에피리부신(Epirubicin) 등의 안트라사이클린계(Anthracyclines) 약물들은 심근 세포에 손상을 일으킨다. 이에, 심근 세포의 확인 마커인 TNNT2의 발현으로 심근 세포가 확인된 본 발명의 심장 오가노이드를 통하여, 안트라사이클린계 같은 심근 세포 손상 약물을 평가할 수 있다. 나아가, 혈관 내피세포의 확인 마커인 PECAM1의 발현으로 혈관 내피 세포가 확인된 본 발명의 심장 오가노이드를 통하여, 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 카페시타빈(Capecitabine) 및 5-플루오로유라실(Fluorouracil) 등과 같이 혈관 내피 세포를 손상시키는 약물을 평가할 수 있다. 더 나아가, 심실 확인 마커인 MYL2의 발현으로 심실이 확인된 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 통하여, 미토산트론(Mitoxantrone), 이포스파미드(Ifosfamide) 및 수니티닙(Sunitinib) 등과 같이 심실 기능 부전을 일으키는 약물을 평가할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드는 심장의 기능 및 구조적 요소를 모두 포함함에 따라, 다양한 약물에 대한 독성 및 유효성을 평가할 수 있다.
먼저, 심장 오가노이드와 약물을 반응시키는 단계(S110)에서는, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 약물과 함께 플레이트에서 15 내지 60 분동안 반응시킨다.
이때, 본 명세서에서 사용되는 용어 "약물"은, 생물의 이익을 위해 생리적 시스템 또는 질병 상태를 변화시키거나 검토하기 위해서 사용되는 모든 물질을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 비타민제, 호르몬제, 금속염류, 백신, 항혈청제, 항생제, 화학요법제제, 강심제, 혈압조절제, 항히스타민제, 스테로이드제, 해독제 및 조영제로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
그 다음, 약물 반응이 끝난 심장 오가노이드를 세척하고(S120), 세척된 심장 오가노이드를 배양한다(S130). 이때, 배양 환경 조건에서 온도는 36 ℃내지 38 ℃바람직하게는 36.5 ℃내지 37.5 ℃이며, 공급 산소(O2)는 1 % 내지 25 %이며, 공급 이산화탄소(CO2)는 1 % 내지 15 %일 수 있으며, 배양 시간은 30 내지 90 분일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
그 다음, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가는 전술한 반응, 세척 및 배양하는 단계를 영상으로 촬영하는 단계(S140), 촬영된 영상을 수득하는 단계(S150) 및 수득된 영상을 분석하는 단계(S160)를 포함할 수 있다.
이때, 반응, 세척 및 배양하는 단계를 영상으로 촬영하는 단계(S140), 촬영된 영상을 수득하는 단계(S150) 및 수득된 영상을 분석하는 단계(S160)에서는 Cellogy pulse analysis가 사용었으며, 촬영된 영상을 통하여 분석하는 방법은 연속적으로 촬영된 영상에서 세포 영역과 배경 영역 간의 픽셀(pixel)값의 변화량 차이를 측정하는 방법을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가는, 촬영된 영상을 통하여 분석하는 방법뿐만 아니라, 심장 오가노이드의 온도, 신경 활동, 전도도, 압력 및 이온 등을 측정할 수 있는 다양한 전기 장치를 통하여 약물에 의한 심장 오가노이드의 변화도를 측정하고 평가할 수 있다.
한편, 전술한 방법에 의하여, 다양한 약물에 대한 심장 독성 및 유효성에 대하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 도 13a 내지 13d를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 및 유효성 평가에 대한 결과가 도시된다.
도 13a를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드의 칼슘 길항제(calcium antagonist) 약물 처리에 따른 이미지 및 박동 속도에 대한 히트맵이 도시된다. 심장 오가노이드는 니페디핀(nifedipine) 및 베라파밀(verapamil)에 의하여 칼슘 채널이 차단되어, 박동 속도가 감소되고, 세척 및 1시간 배양 이후에는 박동 속도가 다시 증가하는 것으로 나타난다.
이는, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드가 고혈압 및 부정맥의 치료를 위한 칼슘 길항제의 효과를 생체 심장과 마찬가지로 동일한 반응으로 나타낼 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
나아가, 도 13b를 참조하면, 니페디핀의 처리량에 따른 심장 오가노이드의 전도 변위, 박동 속도 및 심박 변이를 나타내는 결과가 도시된다. 이때, 전도 변위(conduction displacement)는 심장의 전기적 신호의 이상을 평가할 수 있으며, 이에 따른 심장의 변화는 박동 속도(velocity)의 변화로 나타낼 수 있다. 나아가, 심박 변이(beat rate variation)는 심장이 예기치 못한 자극에 적응하는 능력을 의미할 수 있으며, 심장의 건강상태 및 심장 활동을 조절하는 자율 신경계의 상태를 평가할 수 있다.
먼저, 니페디핀 처리 전의 전도 변위는 100 nM 그룹이 가장 높은 것으로 나타나며, 니페디핀의 처리 후의 전도 변위도 100 nM 그룹이 가장 높은 것으로 나타난다. 그러나, 세척 후의 전도 변위는 세 그룹이 모두 비슷한 것으로 나타난다. 나아가, 이에 따른 니페디핀 처리 전의 속도 또한, 100 nM 그룹이 가장 높은 것으로 나타나며, 니페디핀 처리 후의 속도도 100 nM 그룹이 가장 높은 것으로 나타나며, 세척 후의 속도는 세 그룹이 모두 비슷한 것으로 나타난다. 이는, 각 그룹에 따른 수축력의 차이로 기인한 차이일 수 있다.
그러나, 니페디핀 처리 전의 심박 변이는 세 그룹 모두 비슷한 것으로 나타나나, 니페디핀 처리 후의 심박 변이는 10 μM 처리 군이 가장 높으며, 100 nM 처리 군이 가장 낮은 것으로 나타나며, 니페디핀의 처리량이 증가할수록 비례적으로 심박 변이가 높아지는 것으로 나타난다. 이는, 니페디핀의 약물 처리량이 증가할수록, 심장오가노이드가 생체 심장의 부정맥과 같은 비정상적으로 빠른 수축 운동을 하는 것을 의미할 수 있다. 이에, 니페디핀은 10 μM 이상일 경우, 생체 내 심장에서 부작용을 야기할 수 있다는 것을 유추할 수 있다. 나아가, 심장 오가노이드는 생체 심장에서 나타나는 전기적 장애를 모사할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
또한, 도 13c를 참조하면, 베라파밀의 처리량에 따른 심장 오가노이드의 전도 변위, 박동 속도 및 심박 변이를 나타내는 결과가 도시된다.
먼저, 베라파밀 처리 전의 전도 변위는 세 그룹이 모두 비슷한 것으로 나타나며, 처리 후의 전도 변위는 1 μM 그룹이 가장 높은 것으로 나타난다. 나아가, 세척 후의 전도 변위 또한, 1 μM 그룹이 가장 높은 것으로 나타난다. 더 나아가, 이에 따른 니페디핀 처리 전의 속도는 10 μM 그룹이 가장 높은 것으로 나타나며, 처리 후 및 세척 후의 속도는 세 그룹이 모두 비슷한 것으로 나타난다.
그러나, 베라파밀 처리 전의 심박 변이는 세 그룹 모두 비슷한 것으로 나타나나, 베라파밀 처리 후의 심박 변이는 10 μM 및 100 nM 두 그룹이 비슷한 수준으로 1 μM 그룹에 비하여 높은 것으로 나타나며, 세척 후의 심박 변이는 10 μM 그룹이 가장 높은 것으로 나타난다. 이는, 베라파밀의 경우, 적은 약물 처리량에서도 심장오가노이드가 심장에서의 부정맥과 같은 비정상적으로 빠른 수축 운동을 하는 것을 의미할 수 있다. 이에, 베라파밀은 100 nM 이상일 경우, 생체 내 심장에서 부작용을 야기할 수 있다는 것을 유추할 수 있으며, 전술한 니페디핀보다 심장에 대한 약물 독성이 더 높은 것을 의미할 수 있다.
또한, 도 13d를 참조하면, 니페디핀 10 μM 처리에 따른 심장 오가노이드의 수축 운동에 대한 결과가 도시된다. 보다 구체적으로, 니페디핀 처리 전의 심장 오가노이드는 수축기에 50 내지 60 pixels 및 이완기에 30 내지 40 pixels의 크기로, 25 frames에 한번씩 박동(beating velocity)하는 것으로 나타나며, 수축 크기(contraction magnitude)는 25 frames에 한번씩 2 내지 3 pixels의 크기를 갖는 것으로 나타난다. 그러나, 니페디핀 처리 후의 심장 오가노이드는 수축기에 50 내지 100 pixels 및 이완기에 40 내지 80 pixels의 크기로, 25 frames에 여러번 박동(beating velocity)하는 것으로 나타나며, 수축 크기(contraction magnitude)는 50 frames에 한번씩 5 내지 7.5 pixels의 크기를 갖는 것으로 나타난다.
즉, 니페디핀 처리 전의 심장 오가노이드는 일률적인 수축 및 이완 운동을 하는 것으로 나타나나, 니페디핀 처리 후의 심장 오가노이드는 산발적인 수축 및 이완 운동을 하는 것으로 나타난다. 이는, 니페디핀이 정상적인 심장에서 심박수가 산발적인 부정맥과 같은 부작용을 일으킬 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
이상의 실시예 3을 통해, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가는 약물에 대한 부작용, 독성 및 유효성을 평가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가는 환자에 따른 약물에 대한 용량 및 적응력을 예측할 수 있으며, 신약 개발에 있어 약물이 유효량을 판달할 수 있다. 이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시 예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (17)

  1. 만능 줄기세포(pluripotent stem cells, PSCs)를 심근세포(cardiomyocytes, CM)로 분화되도록 제 1 배양하는 단계;
    융합 조직을 형성하도록 상기 심근세포와 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)을 제 1 유지 배지(maintenance media)에서 제 2 배양하는 단계, 및
    심장 오가노이드를 형성하도록 상기 융합 조직을 제 2 유지 배지에서 제 3 배양하는 단계를 포함하고,
    상기 세포외 기질은,
    섬유아세포(fibroblast)로부터 획득되고,
    상기 제 1 유지 배지는,
    인슐린을 포함하지 않는 무혈청 배지이고,
    상기 제 2 유지 배지는,
    인슐린을 포함하는 무혈청 배지인, 심장 오가노이드 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 배양 단계는,
    만능 줄기세포를 접종하는 단계;
    접종된 상기 만능 줄기세포를 상기 제 1 유지 배지에서 유지하는 단계;
    상기 만능 줄기세포가 중배엽 세포 단계를 거쳐 심장 전구세포로 유도되도록 만능 줄기세포를 유도 배지(induction medium)에서 배양하는 단계, 및
    상기 심장 전구세포가 성숙 심근세포로 분화되도록, 상기 중배엽 세포를 제 1 유지 배지에서 배양하는 단계를 포함하고,
    상기 유도 배지는,
    IWR-1 endo, XAV-939, JW74, SEN461, ICG-001, LGK-974, IWP-2, IWP-4, Wnt-C59 및 WIKI4로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함하는, 심장 오가노이드 제조 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 3항에 있어서,
    상기 만능 줄기세포를 유도 배지에서 배양하는 단계는,
    5 내지 7일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양하는, 심장 오가노이드 제조 방법.
  7. 제 3항에 있어서,
    상기 심장 전구세포를 제 1 유지 배지에서 배양하는 단계는,
    10 내지 21일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양하는, 심장 오가노이드 제조 방법.
  8. 삭제
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 제 2 배양 단계는,
    28 내지 32일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양하는, 심장 오가노이드 제조 방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 제 3 배양 단계는,
    상기 융합조직을 세절하는 단계, 및
    세절된 상기 융합조직을 부유배양하는 단계를 포함하는, 심장 오가노이드 제조 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
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