KR20190040317A - 심근세포 성숙 - Google Patents

심근세포 성숙 Download PDF

Info

Publication number
KR20190040317A
KR20190040317A KR1020197008631A KR20197008631A KR20190040317A KR 20190040317 A KR20190040317 A KR 20190040317A KR 1020197008631 A KR1020197008631 A KR 1020197008631A KR 20197008631 A KR20197008631 A KR 20197008631A KR 20190040317 A KR20190040317 A KR 20190040317A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cardiac
hco
cell
medium
cells
Prior art date
Application number
KR1020197008631A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102634265B1 (ko
Inventor
엔조 포렐로
제임스 허드슨
드류 티트마시
리차드 밀스
Original Assignee
더 유니버서티 어브 퀸슬랜드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=61246715&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20190040317(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from AU2016903404A external-priority patent/AU2016903404A0/en
Application filed by 더 유니버서티 어브 퀸슬랜드 filed Critical 더 유니버서티 어브 퀸슬랜드
Publication of KR20190040317A publication Critical patent/KR20190040317A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102634265B1 publication Critical patent/KR102634265B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/16—Magnesium; Mg chelators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

심근세포 성숙 배지는 기초 배지, 하나 이상의 지방산, 예컨대, 팔미트산, 글루코스 및 알부민을 포함한다. 하나 이상의 지방산 및 글루코스는 이상적으로 약 1:10의 농도 비로 존재한다. 전형적으로, 상기 배지는 TGF 또는 인슐린을 포함하지 않거나, 최소한의 TGF 및/또는 인슐린을 포함한다. 발생하는 심장 근육의 힘 측정을 용이하게 하는 마주보는 장대(opposed poles)를 포함하는 세포 배양 용기가 제공된다.

Description

심근세포 성숙
본 발명은 심근세포에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 시험관내에서 심근세포 성숙을 촉진하는 배양 배지, 시스템 및 방법에 관한 것이다.
심근세포의 성숙은 출생 후 초기 동안 일어나고 증식 능력 및 생식력의 상실(2, 3)과 동시에 일어나는, 전기생리학적 변화, 구조적 변화 및 대사적 변화(1)를 포함하는 다수의 적응을 부과한다. 심근세포 성숙 및 세포 주기 정지의 핵심 업스트림 유도제의 발견은 심장 생물학에 있어서 가장 중요한 해결되지 않은 질문들 중 하나로 남아 있다. 이 유도제의 발견은 약물 발견을 위해 시험관내에서 심근세포 성숙을 촉진하고 재생 의학을 위해 생체내에서 성숙 심근세포를 탈분화시키기 위한 현재의 시도들을 용이하게 할 것이다.
출생 후 초기 동안 대사 기질 제공에 있어서 상당한 변화가 있다. 포유동물 심장은 고농도의 탄수화물 및 자궁 내의 인슐린의 존재에 의존하나, 나중에 모유에 존재하는 지방산 풍부 기질로 전환시키고 인슐린 수준은 출생 후 낮아진다(4). 이러한 기질 변화에 적응하기 위해, 심근세포는 출생 후 지방산 산화를 위해 요구된 유전자를 상향조절한다(5). 심근세포 성숙을 위한 이 대사적 적응의 중요성은 생체내에서의 지방산 산화 성분의 유전적 파괴가 건강에 광범위하게 부정적으로 영향을 미칠 수 있기 때문에 연구하기 어렵다(6). 따라서, 성숙 과정에 대한 심근세포 대사의 영향을 연구하기 위한 대안적 방법을 개발할 필요성이 있다.
hPSC는 심근세포를 비롯한 규정된 인간 체세포 유형의 생성을 위해 현재 널리 사용된다. hPSC-CM은 발생 연구, 약물 스크리닝, 질환 모델링 및 심장 회복을 위해 광범위하게 사용되고 있다. 그러나, 성숙의 결여 및 약리학적 물질에 대한 부적절한 반응이 2D 또는 배상체 기반 분화 전략의 한계로서 확인되었다(7). 심장 근육 구조 및 기능을 더 잘 시뮬레이션하기 위한 시도로, 3D 조작된 심장 근육을 형성하기 위한 심장 조직 조작이 이용되고 있다(8-12). 인간 심장 조직 조작에 있어서 이 최근 진보는 hPSC-CM의 구조적 및 기능적 성숙을 크게 향상시켰다. 그러나, 대사적, 전사적 및 증식적 성숙은 아직 달성되지 않았다.
본 발명은 넓게는 심근세포 성숙을 촉진하거나 향상시키는 규정된 성분을 가진 배지에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 넓게는 상기 언급된 배지에서 심근세포 및/또는 심근세포를 포함하는 심장 오가노이드(organoid)의 형성을 용이하게 하는 하나 또는 복수의 웰을 포함하는 배양 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 제1 양태는 기초 배지, 하나 이상의 지방산, 글루코스 및 알부민을 포함하는 심장 세포 성숙 배지를 제공한다.
적합하게는, 심장 세포 성숙 배지는 심근세포의 성숙에 적합하다.
심장 세포 성숙 배지는 하나 이상의 세포외 매트릭스(ECM) 분자 또는 이의 성분을 포함하는 겔화 배지를 추가로 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 세포외 매트릭스(ECM) 분자 또는 성분은 매트리겔(Matrigel)™일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 하나 이상의 세포외 매트릭스(ECM) 분자 또는 성분은 콜라겐을 포함한다.
바람직하게는, 하나 이상의 지방산과 글루코스는 약 1:10의 농도 비로 존재한다
바람직하게는, 하나 이상의 지방산은 팔미트산이거나 이를 포함한다.
적합하게는, 심장 세포 성숙 배지는 TGF 또는 인슐린을 포함하지 않거나, 최소한의 TGF 또는 인슐린을 포함한다.
전형적으로, 심장 세포 성숙 배지는 무혈청 배지이다.
본 발명의 제2 양태는 웰의 기저 표면으로부터 실질적으로 수직으로 뻗어 있는 마주보는 장대를 각각 포함하는 복수의 웰들을 포함하는 심장 세포 배양 용기를 제공한다.
본 발명의 제3 양태는
(i) 제1 양태의 심장 세포 성숙 배지; 및
(ii) 제2 양태의 심장 세포 배양 용기
를 포함하는 심장 세포 성숙 시스템을 제공한다.
특정 실시양태에서, 심장 세포 배양 시스템은 심장 동력계일 수 있거나, 심장 동력계의 구성요소이다.
본 발명의 제4 양태는 하나 또는 복수의 심근세포의 성숙을 유도하거나 촉진하기에 충분한 시간 동안 적합한 조건 하에서 하나 이상의 심근세포를 제1 양태의 심장 세포 성숙 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 심장 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 심근세포는 하나 이상의 전구세포로부터 분화되었다. 전구세포는 인간 배아 줄기 세포 또는 유도 다능성(induced pluripotent) 줄기 세포일 수 있거나 이러한 줄기 세포를 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 부분적으로 제3 양태의 심장 세포 성숙 시스템을 이용함으로써 수행된다.
이 양태의 방법에 의해 생성된 심장 세포, 오가노이드 또는 조작된 심장 조직도 제공된다.
본 발명의 제5 양태는 제2 양태의 심장 세포 성숙 시스템에서 하나 이상의 심근세포를 하나 이상의 후보 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 심장 세포 성숙을 조절하는 하나 이상의 분자를 확인하는 방법으로서, 하나 또는 복수의 심근세포의 성숙의 변형은 후보 분자가 심장 세포 성숙의 조절제라는 것을 표시하는 것인 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 조절제는 심근세포 성숙을 적어도 부분적으로 억제하거나 저해한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 조절제는 심근세포 성숙을 적어도 부분적으로 향상시키거나 촉진한다.
본 발명의 제6 양태는 제3 양태의 방법에 따라 생성된 심장 세포, 오가노이드 또는 조작된 심장 조직을 하나 이상이 분자와 접촉시키는 단계 및 심장 세포, 오가노이드 또는 조작된 심장 조직에 대한 상기 하나 이상의 분자의 효과를 측정하거나, 평가하거나 모니터링하는 단계를 포함하는, 심장 세포, 조직 또는 오가노이드에 대한 하나 이상의 분자의 효과를 측정하거나, 평가하거나 모니터링하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 상기 하나 이상의 분자의 치료 효능, 안전성 또는 독성을 측정하거나, 평가하거나 모니터링한다.
도 1: 심장 동력계 미세조직 플랫폼은 인간 심장 오가노이드의 자동화된 형성, 기계적 적재 및 분석을 용이하게 한다.
a) 96웰 플레이트 심장 동력계의 개략도. 각각의 웰은 2개의 탄성중합체성 장대를 함유하는 타원형 시딩 웰을 함유하는 배양 삽입체를 가진다.
b) 심장 동력계 내에서의 자동화 조직 형성. hPSC-CM 및 섬유모세포를 ECM 내에 시딩하고 37℃에서 30분 동안 겔화시킨다. 그 후, 세포는 2개의 탄성중합체성 장대 주변에 밀집되어, hCO의 자동화된 형성을 야기한다.
c) 장대 추적을 이용하여 수축력을 대략적으로 측정할 수 있다. 좌측: 힘 근사법 공식을 이용한 장대 편향 개략도(SI 부록 방법 참조). 본 발명자들의 시스템의 파라미터에 기반을 둘 때, 장대 편향의 ㎛당 14 μN과 동등한 힘을 야기한다. 우측: 심장 미세조직의 위상차 영상; 좌측 장대의 십자기호는 자동화된 수축 분석 소프트웨어에 의해 선택된 추적 점을 표시한다.
d) 수축성을 수득하기 위해 각각의 hCO에 대한 일괄(batch) 비디오 분석을 수행할 수 있다. 좌측: 대표적인 힘 추적기록 곡선. 우측: 배양 배지에서 7일 동안 배양된 n = 31개 조직들로부터의 전체 수축 파라미터 ± 표준 편차. Ta: 50% 활성화부터 피크까지의 시간. Tr: 피크부터 50% 이완까지의 시간.
e) 스크리닝을 위한 hCO 마커 발현을 평가하기 위해 전조직-표본고정(whole-mount) 면역염색을 이용할 수 있다. MLC2V, Ki-67 및 α-액티닌(actinin) 면역염색의 공초점 근접촬영을 이용한 대표적인 영상.
f) 스크리닝은 hCO 수축력을 위한 최적 글루코스 및 팔미테이트 농도를 확인시켜준다. 완전-요인 글루코스(0, 0.5, 1 및 5.5 mM) 및 팔미테이트(0, 1, 10 및 100 μM) 스크린에 반응한 힘 히트-맵(heat-map). CTRL 배지에서 2일 동안 hCO를 형성한 다음 5일 동안 무혈청 배양한 후 힘을 평가하였다. n = 3회 실험으로부터 7-13, HES3 유래의 hCO. CTRL = CTRL 배지 및 후속 패널(SI 부록 방법 참조).
g) 팔미테이트는 MLC2V 발현을 유도한다. 완전-요인 글루코스(0, 0.5, 1 및 5.5 mM) 및 팔미테이트(0, 1, 10 및 100 μM) 스크린에 반응한 MLC2v 힘 히트-맵. CTRL 배지에서 2일 동안 hCO를 형성한 다음 5일 동안 무혈청 배양한 후 MLC2V 발현을 평가하였다. n = 3회 실험으로부터 7-13, HES3 유래의 hCO. MLC2V 발현은 대조군 무혈청 조건(5.5 mM 글루코스, 팔미테이트 부재)에 비해 상대적 발현이다.
h) KI67 발현을 인슐린으로 유도한다. CTRL 배지에서 5일 동안 hCO를 형성한 다음 11일 동안 무혈청 배양한 후 조직을 평가하였다. n = 2회 실험으로부터 6-7, HES3 유래의 hCO. Ki-67 발현은 CTRL에 비해 상대적인 발현이다.
i) 스크리닝은 인슐린의 부재 하에서 최적 글루코스 및 팔미테이트 수준을 확인시켜준다. 인슐린의 존재 없이 완전-요인 글루코스(0, 0.5, 1 및 5.5 mM) 및 팔미테이트(0, 1, 10 및 100 μM) 스크린에 반응한 힘 히트-맵. CTRL 배지에서 5일 동안 hCO를 형성한 다음 11일 동안 무혈청 배양한 후 힘을 평가하였다. n = 3회 실험으로부터 6-15, HES3 유래의 hCO.
j) 팔미테이트는 MLC2V 발현을 유도한다. 인슐린의 부재 하에서 완전-요인 글루코스(0, 0.5, 1 및 5.5 mM) 및 팔미테이트(0, 1, 10 및 100 μM) 스크린에 반응한 MLC2v 히트-맵. CTRL 배지에서 5일 동안 hCO를 형성한 다음 11일 동안 무혈청 배양한 후 MLC2V 발현을 평가하였다. n = 3회 실험으로부터 6-9, HES3 유래의 hCO. MLC2V 발현은 대조군 무혈청 조건(5.5 mM 글루코스, 팔미테이트 부재)에 비해 상대적인 발현이다.
k) 인슐린 없이 1 mM 글루코스 및 100 μM 팔미테이트를 함유하는 무혈청 배지(지금부터 성숙 배지(MM)로서 지칭됨)에서 KI67 발현이 감소된다. CTRL 배지에서 5일 동안 hCO를 형성한 다음 11일 동안 무혈청 배양한 후 조직을 평가하였다. KI67 발현은 CTRL 배지에 비해 상대적인 발현이다. n = 2회 실험으로부터 6-8, HES3 유래의 hCO.
l) hCO의 배양은 CTRL 배지에서 5일 동안 hCO를 형성한 다음 11일 동안 배양한 후 CTRL 배지 또는 MM에서 높은 조직 생존율을 유지한다. n = 각각 733개 및 717개의 조직을 사용한 16회 실험, HES3 유래의 hCO.
m) CTRL 배지 또는 MM 배지에서 hPSC 증폭, 심장 분화, 및 hCO 형성 및 배양의 시기 및 지속을 표시하는, 완성된 심장 성숙 프로토콜의 배양 개략도.
데이터는 히트-맵(f,g,i,j)에 대한 평균 ± 표준오차이다. 터키 사후 검정(h), 5.5 mM 글루코스 및 팔미테이트 부재에 대한 던넷 사후 검정(f,g,i,j), 또는 t-검정(k)과 함께 일원 ANOVA를 이용하였을 때, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. #는 5.5 mM 글루코스 및 팔미테이트 부재에 대한 던넷 사후 검정과 함께 일원 ANOVA를 이용하였을 때(j), p = 0.07임을 표시한다.
도 2: 심장 동력계의 개발, 최적화 및 특징규명.
a) 96웰 플레이트에서 hCO를 가진 심장 동력계 배양 삽입체의 광학 현미경사진.
b) 수축력의 공지된 억제제/활성화제에 대한 수축 반응의 힘. n = 5.
c) 전구-부정맥유발성 화합물은 예상된 바와 같이 hCO에서 연장된 이완 시간을 야기한다. n = 5.
d) 전조직-표본고정 면역염색을 이용한 Ki-67 마커 활성화의 검증. n = 2회 실험으로부터 5-7. hCO를 0.05% DMSO 및 5 ㎛ CHIR로 처리하였다.
e) 인슐린의 존재 하에서 완전-요인 글루코스(0, 0.5, 1 및 5.5 mM) 및 팔미테이트(0, 1, 10 및 100 μM) 스크린에 반응한 락테이트 데하이드로게나제(dehydrogenase)(LDH) 수준. CTRL 배지에서 2일 동안 hCO를 형성한 다음 5일 동안 무혈청 배양한 후 LDH 수준을 평가하였다. n = 3회 실험으로부터 8-9, HES3 유래의 hCO. +VE- 양성 대조군, -VE- 음성 대조군.
f) 무혈청 조건에 대한 심장 트로포닌(CTNI) 수준. CTRL 배지에서 2일 동안 hCO를 형성한 다음 5일 동안 무혈청 배양한 후 CTNI 수준을 평가하였다. n = 1회 실험으로부터 2-3, HES3 ESC 세포주. +VE- 양성 대조군, -VE- 음성 대조군.
g) CTRL 배지에서 2일 동안 hCO를 형성한 다음 5일 동안 무혈청 배양한 후 깨진 '팔'(상부) 및 목(하부) 조직으로부터 대사적으로 망가진, α-액티닌에 의해 염색된 hCO의 전조직-표본고정 영상. 축적 막대 = 200 ㎛.
h) 완전-요인 글루코스(0, 0.5, 1 및 5.5 mM) 및 팔미테이트(0, 1, 10 및 100 μM) 스크린에 반응한 힘 히트-맵. CTRL 배지에서 2일 동안 hCO를 형성한 다음 5일 동안 무혈청 배양한 후 힘을 평가하였다. n = 3회 실험으로부터 8-12개 조직, H9 유래의 hCO.
i) 완전-요인 글루코스(0, 0.5, 1 및 5.5 mM) 및 팔미테이트(0, 1, 10 및 100 μM) 스크린에 반응한 전조직-표본고정 MLC2V 발현. CTRL 배지에서 2일 동안 hCO를 형성한 다음 5일 동안 무혈청 배양한 후 MLC2V 발현을 평가하였다. n = 3회 실험으로부터 8-12, H9 유래의 hCO. MLC2V 발현은 대조군 무혈청 조건(5.5 mM 글루코스, 팔미테이트 부재)에 비해 상대적인 발현이다.
j) TGF-β1은 hCO 기능에 유해하다. TGF-β1 농도(0, 1, 3 및 10 ng/㎖) 및 지속기간(2-5일, 2-7일, 및 2-9일)에 반응한 힘 히트-맵. CTRL 배지에서 2일 동안 hCO를 형성한 다음 10일 동안 무혈청 배양한 후 힘을 평가하였다. n = 3회 실험으로부터 13-16, H9 유래의 hCO.
k) 증가된 콜라겐 I 및 매트리겔은 조직 생존율을 개선한다. CTRL 배지에서 2일 동안 hCO를 형성한 다음 10일 동안 무혈청 배양한 후 조직 생존율을 평가하였다. n = 3회 실험으로부터 18, H9 유래의 hCO. 낮은 콜라겐 = 1.6 mg/㎖ 콜라겐 매트릭스, 높은 콜라겐 = 3.2 mg/㎖ 콜라겐 매트릭스, 높은 콜라겐 + MG = 2.6 mg/㎖ 콜라겐과 9%(v/v) 매트리겔 매트릭스. CTRL = 대조군 배지, SF = 무혈청 배지(1 mM 글루코스, 10 μM 팔미테이트, 인슐린의 존재).
l) hCO의 힘에 대한 세포외 매트릭스의 양 및 조성의 영향. CTRL 배지에서 2일 동안 hCO를 형성한 다음 10일 동안 무혈청 배양한 후 조직 생존율을 평가하였다. n = 3회 실험으로부터 6-15, H9 유래의 hCO. 낮은 콜라겐 = 1.6 mg/㎖ 콜라겐 매트릭스, 높은 콜라겐 = 3.2 mg/㎖ 콜라겐 매트릭스, 높은 콜라겐 + MG- 2.6 mg/㎖ 콜라겐과 9%(v/v) 매트리겔 매트릭스. CTRL - 대조군 배지, SF - 무혈청 배지(1 mM 글루코스, 10 μM 팔미테이트, 인슐린의 존재).
데이터는 평균 ± 표준오차이다. 기준 또는 0.2 mM Ca2+에 대한 일원 ANOVA 및 던넷 사후 검정을 이용하였을 때(b,c), TGF-β1의 부재에 대한 던넷 사후 검정(j)과 함께 t-검정을 이용하였을 때(d), 또는 터키 사후 검정으로 CTRL 배지 또는 SF 군과만 비교하는 ANOVA를 이용하였을 때(l), *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 3: MM에서의 hCO의 배양은 세포 조성을 변경시키지 않는다.
a) hCO에서의 DNA 강도는 MM에서 더 적은 세포를 표시한다. n = 14회 실험으로부터 70-74.
b) hCO로부터 해리된 단일 hPSC-CM(막대 = 10 ㎛).
c) hCO로부터 해리된 hPSC-CM(α-액티닌)의 유세포분석 프로파일링은 CTRL 배지 및 MM 둘 다에서 유사한 순도를 보여준다(유의미하지 않음).
d) hCO로부터 해리된 기질 세포(CD90+)의 유세포분석 프로파일링은 CTRL 배지에 비해 MM에서 배양된 hCO에서 CD90+ 세포의 그다지 크지 않은 감소를 보여준다(p < 0.05). n =5.
e) CTRL 배지 hCO는 hPSC-CM(MLC2v)을 통해 존재하는 내피 관상 구조물(CD31) 및 기질 세포(CD90)를 가진다. hCO의 외부 표면에 존재하는 심외막 세포(WT-1)도 있다. 전체 hCO의 저배율 영상은 각각의 염색에 대해 좌측에 표시되어 있고(막대 = 200 ㎛) 고배율 영상은 우측에 표시되어 있다(막대 = 20 ㎛).
f) MM hCO는 hPSC-CM(MLC2v)을 통해 존재하는 내피 관상 구조물(CD31) 및 기질 세포(CD90)를 가진다. hCO의 외부 표면에 존재하는 심외막 세포(WT-1)도 있다. 전체 hCO의 저배율 영상은 각각의 염색에 대해 좌측에 표시되어 있고(막대 = 200 ㎛) 고배율 영상은 우측에 표시되어 있다(막대 = 20 ㎛).
데이터는 평균 ± 표준오차로서 제공된다. t-검정을 이용하였을 때(a) ***P<0.001, t-검정을 이용함으로써 분석된 통계자료(c,d).
도 4: 전기생리학적 성질 및 수축성의 성숙은 조직-조작된 환경에 의해 결정된다.
a) CTRL 배지 또는 MM에서 hCO의 대표적인 개별 수축 곡선 및 수축 파라미터.
b) 이소프레날린(isoprenaline) 자극은 hCO에서 증가된 수축률을 유도한다. n = 5-6.
c) 이소프레날린은 MM에서 배양된 hCO에서 수축력을 증가시킨다. n = 2회 실험으로부터 5-7.
d) MM에서 배양된 hCO는 감소된 칼슘 민감성을 가진다. 이소프레날린 자극 실험을 배양 배지(Ca2+ = 1.8 mM)에서 수행하였을 때, 이소프레날린의 효과는 보다 낮은 칼슘 농도에서 더 현저할 수 있다. n = 2회 실험으로부터 4-7.
e) 이소프레날린은 칼슘 EC50 농도(CTRL = 0.3 mM, MM = 1.0 mM)에서 보행 조건(1 Hz) 하에서 수축력을 증가시키고 수축 지속시간을 감소시킨다. n = 7.
f) 37℃에서 1 Hz의 보행 조건 하에서 CTRL 배지 또는 MM에서 배양된 hCO로부터 해리된 개별 hPSC-CM로부터의 대표적인 개별 칼슘 표시제(Fluo-4) 기록 및 파라미터.
g) 37℃에서 1 Hz의 보행 조건 하에서 CTRL 배지 또는 MM에서 배양된 hCO로부터 해리된 개별 hPSC-CM로부터의 대표적인 개별 활동 전위 기록 및 파라미터. APD - 활동 전위 지속시간, RMP - 휴면 막 전위, CMP - 조여진 막 전위.
데이터는 평균 ± 표준오차이다. t-검정(a,e), 기준에 대한 차이를 표시하는 이원 ANOVA(b,c), 터키 사후 검정과 함께 ANOVA(f,g)를 이용하였을 때, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. CTRL 배지 및 MM에서 hCO의 칼슘에 대한 반응 곡선은 이원 ANOVA를 이용하였을 때 통계학적으로 유의미하다(p<0.05)(d).
도 5: 도 4에서 제공된 기능적 분석에 대한 뒷받침 데이터.
a) H9 유래의 hCO 및 iPSC 유래의 hCO는 MM에서 배양된 HES3 hCO와 유사한 수축성을 가진다. CTRL 배지 또는 MM에서 H9 또는 IPSC 유래의 hCO의 대표적인 수축 곡선 및 파라미터.
b) 37℃에서 1 Hz 보행 시 Fluo-4 AM을 가진 CTRL 배지 및 MM에서 배양된 2D 배양물 및 hCO로부터 단리된 hPSC-CM으로부터 기록된 대표적인 칼슘 추적기록의 미가공된 데이터 및 가공된 데이터.
c) 패치-클램프(patch-clamp)를 이용한 hPSC-CM 서브타입의 특징규명(보다 더 상세한 내용에 대해서는 재료 및 방법을 참조한다).
d) 꽂는 전극을 이용한 전기생리학적 기록. AP - 활동 전위, APD - 활동 전위 지속시간, RMP - 휴면 막 전위.
데이터는 평균 ± 표준오차이다. t-검정을 이용하였을 때(d), *P<0.05.
도 6: MM에서의 배양은 hCO에서 전사적 성숙 및 단백질체학 성숙을 유도한다.
a) 성숙을 프로파일링하기 위해 문헌(Delaughter et al.)(27)에 의해 확인된 유전자들(표 S6(27)으로부터의 유전자들)의 서브세트를 사용한 RNA-seq 데이터의 주성분 분석. 20일(n = 3), 1년(n = 3), 인간 태아 심실(n = 2) 및 성인 심장(n = 2)에서 2D hPSC-CM을 함유하는, (GSE62913)(25)로부터의 RNA-seq 데이터와 조합된, CTRL 배지 또는 MM에서 배양된 hCO(n = 4회 실험, 각각 20개의 모아진 hCO) 및 본 발명자들의 성인 심장 샘플(n = 1, 3개의 모아진 심장)로부터 유래한 RNA-seq 데이터. 모든 유전자들은 적어도 1개 샘플에 대해 백 만당 10 카운트를 초과하였다. 상부에 있는 막대는 성숙과 상관관계를 가진 성분인 PC1의 투영이다.
b) 피어슨(Pearson) 상관계수는 MM에서 배양된 hCO가 성인 심장 조직과 유의미한 상관관계를 가진다는 것을 표시한다. 그래프는 성인 심장(n = 1, 3개의 모아진 심장)의 log2(CPM) 또는 MM에서 배양된 hCO(n = 4)의 평균 유전자 발현을 보여준다.
c) 피어슨 상관계수는 MM에서 배양된 hCO가 인간 성숙 심장 조직과 유의미한 상관관계를 가진다는 것을 표시한다. 그래프는 성인 심장(n = 1) 또는 MM에서 배양된 모아진 hCO(n = 3, 각각 9개의 모아진 hCO)의 log2(iBAQ)를 보여준다.
d) CTRL 배지에서 배양된 hCO와 MM에서 배양된 hCO 사이에 조절된 유전자(FDR < 0.05)의 밀집된 히트-맵.
e) CTRL에서 배양된 hCO와 MM에서 배양된 hCO 사이에 조절된 단백질(q-값 < 0.05)의 밀집된 히트-맵.
f) RNA-seq의 GO-항(term) 분석은 다수의 과정들이 CTRL 배지에서 배양된 hCO에 비해 MM에서 배양된 hCO에서 감소되거나 증가된다는 것을 보여준다. 이들은 출생 후 심장 성숙 동안 일어나는 과정과 일치한다(5). 막대 안의 숫자는 그 특정 과정에서 확인된 유전자의 수를 표시한다.
g) 단백질체학의 GO-항 분석은 다수의 과정들이 CTRL 배지에서 배양된 hCO에 비해 MM에서 배양된 hCO에서 감소되거나 증가된다는 것을 보여준다. 이들은 출생 후 심장 성숙 동안 일어나는 과정과 일치한다(5). 막대 안의 숫자는 그 특정 과정에서 확인된 유전자의 수를 표시한다.
h) 성숙의 RNA-seq 마커: 단백질체학 데이터에서도 상향조절되는 "심장 발생" GO-항 내의 유전자.
i) 성숙의 단백질체학 마커: 단백질체학 데이터에서도 상향조절되는 "심장 발생" GO-항 내의 유전자.
데이터는 평균 ± 표준오차이다. *P<0.05, *P<0.01, ***P<0.001, 통계학적 분석을 위한 FDR(h) 또는 q-값(i)에 대해서는 재료 및 방법을 참조한다.
도 7: CTRL 배지 또는 MM에서 배양된 hCO는 생체내 유사 구조를 나타낸다.
a) 조망도(축적 막대 = 2 ㎛) 및 근절에의 보다 높은 초점(축적 막대 = 1 ㎛)을 위한 CTRL 배지 및 MM hCO의 투과 전자 현미경사진. 각각 Z, I - Z 및 I 밴드.
b) MLC2v 및 α-액티닌의 전조직-표본고정 면역염색은 CTRL 배지 및 MM 둘 다에서 hCO 내의 잘 발생된 근절의 존재를 보여준다(막대 = 20 ㎛). 5배 삽도 및 강도 프로파일을 주목해야 하는데, 이때 MLC2v/α-액티닌 공-염색은 Z-밴드에서 α-액티닌을 보여주고 나머지 근절에서만 MLC2V를 보여준다.
c) 티틴(titin) 및 α-액티닌의 전조직-표본고정 면역염색은 Z-밴드에서 α-액티닌 및 I-밴드에서 티틴의 명확한 윤곽을 보여준다(축적 막대 = 20 ㎛). 5배 삽도 및 강도 프로파일을 주목해야 하는데, 이때 티틴/α-액티닌 공-염색은 Z-밴드에서 α-액티닌을 보여주고 I-밴드에서만 티틴을 보여준다.
d) α-액티닌 염색을 이용한 근절 길이의 정량. n = 2회 실험으로부터 20개 세포. 데이터는 평균 ± 표준오차이다. NS - t-검정의 이용 시 유의미하지 않음(P<0.05).
e) CTRL 배지 및 MM hCO에서 미토콘드리아(M)의 투과 전자 현미경사진. M - 미토콘드리아(축적 막대 = 0.5 ㎛).
f) CTRL 배지 및 MM hCO에서 t-튜불(T)의 투과 전자 현미경사진(축적 막대 = 0.5 ㎛).
g) CAV3의 전조직-표본고정 면역염색은 CTRL 배지 및 MM에서 hCO 내의 t-튜불 구조를 확인시켜준다(축적 막대 = 10 ㎛).
h) CTRL 배지 및 MM hCO에서 개재판(ID)의 투과 전자 현미경사진(축적 막대 = 0.5 ㎛).
i) 범-캐드헤린(pan-cadherin)의 전조직-표본고정 면역염색은 CTRL 배지 및 MM에서 hCO 내의 개재판의 존재를 확인시켜준다(축적 막대 = 10 ㎛).
j) 코넥신(connexin) 43의 전조직-표본고정 면역염색은 CTRL 배지 및 MM에서 hCO 내의 개재판의 존재를 확인시켜준다(축적 막대 = 10 ㎛).
도 8: 도 6에서 제시된 hCO의 RNA-seq 및 단백질체학 발현 분석에 대한 뒷받침 데이터.
a) 잠재적으로 오염시키는 세포 유형에 대한 마커의 RNA-seq 발현. n = 4회 실험.
b) 상이한 심장 세포 집단에서 발현된 마커의 RNA-seq 발현. n = 4회 실험.
c) 20일(n = 3), 1년(n = 3), 인간 태아 심실(n = 2) 및 성인 심장(n = 2)에서 hPSC 유래의 2D hPSC-CM을 함유하는, (GSE62913)(25)로부터의 RNA-seq 데이터와 조합된 본 발명자들의 RNA-seq 데이터의 주성분 분석. 모든 유전자들은 적어도 1개 샘플에 대해 백 만당 10 카운트를 초과하였다.
d) 성인 심장에 더 풍부한, MM 내의 hCO와 성인 심장 사이에 가장 높은 차등적 발현을 가진 1000개의 유전자들에 대한 상위 25개 GO 항.
e) RNA-seq 데이터의 차등적 분석을 보여주는 화산도(Volcano plot). n = 4회 실험.
f) 단백질체학 데이터의 차등적 분석을 보여주는 화산도. n = 3개의 샘플.
g) 성숙함에 따라 전환되거나/증가하는 것으로 공지된 근절 유전자의 qPCR(TTN N2B, MYH7/6, TNNI3/1 및 MYL2/7). n = 4회 실험.
데이터는 평균(a,b) 또는 평균 ± 표준오차(f)이다. 만-휘트니(Mann-Whitney)를 이용하였을 때(f), *P<0.05.
도 9: 도 4에서 제시된 데이터를 뒷받침하는, 대사 유전자에 대한 RNA-seq 및 단백질체학 데이터의 히트-맵.
a) GO 항 "해당작용"에 대한 RNA-seq 또는 단백질체학 데이터에서 유의미하게 조절된 표적(CTRL 배지 대 MM)으로부터의 히트 맵 데이터.
b) GO 항 "산화 환원"에 대한 RNA-seq 또는 단백질체학 데이터에서 유의미하게 조절된 표적(CTRL 배지 대 MM)으로부터의 히트 맵 데이터.
c) GO 항 "지방산 산화"에 대한 RNA-seq 또는 단백질체학 데이터에서 유의미하게 조절된 표적(CTRL 배지 대 MM)으로부터의 히트 맵 데이터.
데이터는 모든 조건들에 대한 평균에 비해 log2 발현으로서 제공된다. n = RNA-seq를 위해 4회 실험, 및 n = 단백질체학을 위해 3회 실험.
도 10: MM에서 배양된 hCO에서 대사는 해당작용으로부터 지방산 산화로 전환된다.
a) 해마 미토콘드리아 스트레스 시험. A - 올리고마이신, B - FCCP, C - 에트목시르(etmoxir), D - 안티마이신(antimycin) A/로테논(rotenone). 9일 동안 CTRL 배지 또는 MM에서 배양된 hCO로부터의 기록당 n = 8개의 모아진 hCO로부터의 n = 6회 독립적인 기록을 이용하여 해마 스트레스 시험을 실시하였다(패널 b-d).
b) 최대 OCR은 MM에서 배양된 hCO에서 더 높다.
c) 비축 대사 능력은 MM에서 배양된 hCO에서 더 높다.
d) 지방산 산화는 MM에서 배양된 hCO에서 더 높다.
e) mtDNA는 MM에서 배양된 hCO에서 더 높다(내생성 게놈 대조군으로서 ND1 및 RNA18S5를 사용한 qPCR). n = 4회 실험.
f) 탄소 대사물질의 측정(n = 2, 각각 12개 내지 14개의 모아진 hCO)은 MM에서 배양된 hCO에서의 대사가 해당작용으로부터 지방산 산화로 전환된다는 것을 확인시켜준다. 가로 안의 적색 값은 MM에 비해 CTRL 배지에서 더 높은 배수를 표시한다. 대사체학 값은 CTRL 배지에 비해 MM에서 배양된 hCO의 DNA 강도로 표준화된다.
데이터는 평균 ± 표준오차이다. *P<0.05, **P<0.01, t-검정(b-d) 또는 비 대응 t-검정(e).
도 11: hPSC-CM 증식 및 WNT-β-카테닌 신호전달은 MM에서 배양된 hCO에서 억제된다.
a) MM에서의 hCO의 배양(총 11일)은 hPSC-CM(α-액티닌) 증식을 감소시킨다(Ki-67). n = 3회 또는 4회 실험으로부터 11개 내지 14개의 hCO. 4,396개의 hPSC-CM을 수동으로 카운팅하였다. 축적 막대 = 20 ㎛.
b) MM에서의 hCO의 배양(총 11일)은 hPSC-CM(α-액티닌) 유사분열을 감소시킨다(pH3). n = 5회 실험으로부터 10. 7,838개의 hPSC-CM들을 수동으로 카운팅하였다.
c) 48시간 후 상이한 대사 조건에서 배양된 hCO의 활성화된 β-카테닌 강도는 인슐린의 결여가 활성화된 β-카테닌의 감소의 원인이라는 것을 보여준다. n = 3회 실험으로부터 6-13.
d) 인슐린을 갖거나 갖지 않은 MM 내의 hCO에서 활성화된 β-카테닌의 대표적인 면역염색. 축적 막대 = 200 ㎛. 채색된 영상 위의 삽도는 백색으로 채색된 활성화된 β-카테닌 단독이다.
e) 48시간 후 상이한 대사 조건에서 배양된 hCO의 Ki-67 강도는 인슐린의 결여가 세포 주기 활성의 초기 감소의 원인이라는 것을 보여준다. n = 3회 실험으로부터 6-13. 축적 막대 = 20 ㎛.
f) 세포 주기 활성(Ki-67)과 활성화된 β-카테닌은 상이한 대사 조건 하에서 배양된 hCO에서 높은 상관관계를 가졌다. n = 3회 실험으로부터 146.
g) 보다 긴 기간 배양(MM에서 9일) 후 48시간 동안 인슐린의 재도입은 hPSC-CM(α-액티닌)의 증식(Ki-67)을 회복시킬 수 없었다(대표적인 면역염색).
h) 보다 긴 기간 배양(MM에서 9일) 후 48시간 동안 인슐린의 재도입 후 hCO의 Ki-67 강도는 증식을 회복시킬 수 없었다. n = 2회 실험으로부터 10-11개 hCO.
i) 증식하는 (Ki-67) hPSC-CM(α-액티닌)의 정량은 보다 긴 기간 배양(MM에서 9일) 후 48시간 동안 인슐린의 재도입 후 증식을 회복시킬 수 없다는 것을 보여준다. n = 2회 실험으로부터 3-4개 hCO. 2,441개의 hPSC-CM을 수동으로 카운팅하였다.
축적 막대 = 20 ㎛. 데이터는 평균 ± 표준오차이고, t-검정을 이용하였을 때(a), **P<0.01. t-검정(b,h,i) 피어슨 상관관계(r) 및 p-값(f)을 이용하였을 때 계산된 P-값. P<0.0001, 이원 ANOVA를 이용하였을 때 INS+와 통계학적으로 상이한 INS-(c,e).
도 12: 도 5에 제시된 데이터를 뒷받침하여 상이한 세포주로부터 유래한 hCO의 Ki-67 강도 및 상이한 대사 조건 하에서의 수축력.
a) H9 유래의 hCO의 Ki-67 강도. n = 10.
b) hIPSC 유래의 hCO의 Ki-67 강도. n = 4.
c) 48시간 후 상이한 대사 조건에서 배양된 HES3 유래의 hCO의 수축력. n = 3회 실험으로부터 11-15.
데이터는 평균 ± 표준오차이다. t-검정을 이용하였을 때(a,b), **P<0.01.
도 13: MM에서의 hCO 배양은 DDR을 유도한다.
a) GO 항 "DNA 손상 자극에 대한 세포 반응"에 대한 단백질체학 데이터로부터 유래한, CTRL 배지 대 MM에서 유의미하게 조절된 단백질을 보여주는 히트 맵. 데이터는 모든 조건들에 대한 평균에 비해 상대적인 log2 발현으로서 제시된다. n = 3회 실험.
b) MM에서 배양된 hPSC-CM(MLC2v)에서 증가를 보이는 DNA 8-옥소-7,8-디하이드로구아닌(8-OxoG)의 산화적 염기 변형에 대한 핵 강도. n = 120개 내지 180개의 hPSC-CM 핵. 삽도는 백색으로 채색된 8-OxoG 단독이다.
c) MM에서 배양된 hPSC-CM(MLC2v)에서 증가를 보이는 인산화된(Ser1987) ATM(pATM)에 대한 핵 강도. n = 120개 내지 240개의 hPSC-CM 핵. 삽도는 백색으로 채색된 pATM 단독이다.
축적 막대 = 20 ㎛. 데이터는 평균 ± 표준오차이다. t-검정을 이용하였을 때(b,c), ****P<0.0001.
도 14. 심장 동력계 장치의 웰의 바람직한 실시양태.
도 15. 수축력을 측정하는 시스템의 계략적 묘사.
도 18. 성숙 배지에서 성숙된 심장 오가노이드의 비-증식 상태.
a) 5 μM CHIR99021 및 0.05 % DMSO(대조군)에 반응하여, 2D 젤라틴으로 코팅된 플레이트 내의 CTRL 배지에서 배양된 증식하는(Ki-67) hPSC-CM(α-액티닌)의 정량. 데이터는 4회 독립적인 실험이다. 3160개의 심근세포를 이 실험들에서 수동으로 카운팅하였다.
b) 증식하는(Ki-67) hPSC-CM(α-액티닌)의 정량은 MM에서 배양된 hCO가 CHIR99021(24시간 처리)에 대한 무딘 증식 반응을 가진다는 것을 확인시켜준다. n = 2회 실험으로부터 7-8. 10,609개의 hPSC-CM을 수동으로 카운팅하였다.
축적 막대 = 20 ㎛. 데이터는 평균 ± 표준오차이다. 던넷(a) 또는 터키 사후 검정(b)과 함께 ANOVA를 이용하였을 때, *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001.
도 17: 성숙 hCO를 사용한 독성학 스크리닝.
a) 인간 심근세포들은 수축을 위한 모든 주요 이온 채널들, 칼슘 취급 단백질들 및 근절 단백질들을 발현하기 때문에, 독성학 스크리닝을 위한 우수한 모델이 된다(RNA-seq로부터의 데이터, 도 6).
b) 부정맥 효과의 고위험을 가진 공지된 분자에 대한 성숙 hCO의 50% 이완 시간(Tr)에 대한 농도-반응 곡선.
c) 부정맥 효과의 중간 위험을 가진 공지된 분자에 대한 성숙 hCO의 50% 이완 시간(Tr)에 대한 농도-반응 곡선.
d) 부정맥 효과의 저위험을 가진 공지된 분자에 대한 성숙 hCO의 50% 이완 시간(Tr)에 대한 농도-반응 곡선.
데이터는 평균 ± 표준오차로서 제시된다. n = 시험된 분자당 4개 내지 6개의 hCO. hAH - 성인 심장.
도 18: 당뇨병성 상태는 심장 기능에 있어서 보존된 박출률을 가진 심부전(HFpEF) 유사 변경을 촉진한다.
a) 변경된 글루코스/인슐린 제공 시 수축력.
b) 변경된 글루코스/인슐린 제공 시 이완 시간(확장 기능).
n = 8, 터키 사후 검정과 함께 ANOVA를 이용하였을 때, 기준 성숙 배지(1 mM 글루코스, 인슐린 부재)로부터의 **p<0.01.
도 19: 성숙 배지(MM)는 2D 심근세포 배양물에서 세포 주기 활성도 감소시킨다.
상이한 배지 조성물에서 3일 동안 배양한 후 증식하는(Ki-67+) 심근세포(α-액티닌+)의 정량. n = 8개 내지 12개의 웰. 데이터는 평균 ± 표준오차로서 제시된다. 터키 사후 검정과 함께 ANOVA를 이용하였을 때, **P<0.01, ****P<0.0001.
본 발명은 심장 성숙에 대한 대사의 효과에 대해 스크리닝하는 것을 목적으로 하는 작업으로부터 비롯되었다. 이 작업의 한 양태는 생물조작된 인간 심장 조직에서 고속대량 스크리닝을 하기 위한 96웰 장치의 개발이었다. 심장 동력계(또는 "심장-Dyno")는 조직 크기 및 상기 장치의 기하학적 구조를 제한함으로써 조밀한 근육 다발을 형성하여, 임의의 조직 취급 없이 자동화된 조직 형성, 배양 및 수축력 분석을 가능하게 하도록 디자인되었다. 심장 동력계를 이용할 때, hPSC 유래의 심근세포 및 심장 오가노이드의 구조적 성숙, 전기생리학적 성숙, 대사적 성숙 및 증식적 성숙을 촉진하는 완전한 무혈청 3D 배양 조건이 규정되었다. 따라서, 본 발명은 예컨대, 심장 오가노이드 형태의 줄기 세포 유래의 심장 조직의 구조적 성숙, 전기생리학적 성숙, 대사적 성숙 및/또는 증식적 성숙을 용이하게 하는 방법, 배양 배지 및/또는 시스템에 관한 것이다.
달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 방법 및 재료와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 요구하는 경우를 제외하고, 용어 "포함한다" 및 이 용어의 어미변화, 예컨대, "포함하는", "포함하고" 및 "포함된"은 추가 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하기 위한 것이 아니다.
부정 관사는 단일 부정 관사로서, 또는 부정 관사가 지칭하는 하나 초과의 단일 객체를 달리 배제하는 것으로서 읽혀지지 않아야 한다는 것이 인식될 것이다. 예를 들면, 세포는 하나의 세포, 하나 이상의 세포 및 복수의 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 언급된 값보다 높거나 낮은 값의 범위를 포괄할 수 있는 자격을 언급된 값에 부여하다. 바람직하게는, 이와 관련하여, 범위는 언급된 값보다 2%, 5% 또는 10% 높을 수 있거나 낮을 수 있다. 예를 들면, "약 100 μM"은 90 내지 110 μM, 95 내지 105 μM 또는 98 내지 102 μM일 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, "단리된"은 그의 천연 상태로부터 제거되었거나 인간에 의해 다른 방식으로 조작된 물질을 의미한다. 단리된 물질(예를 들면, 세포)은 그의 천연 상태에서 정상적으로 그와 함께 존재하는 성분을 실질적으로 또는 본질적으로 갖지 않을 수 있거나, 그의 천연 상태에서 정상적으로 그와 함께 존재하는 성분과 함께 인공 상태로 존재하도록 조작될 수 있다.
"농후한" 또는 "정제된"은 농후화 또는 정제 전 이전 성태에 비해 특정 상태(예를 들면, 농후한 또는 정제된 상태)에서 더 높은 발생률, 표시 또는 빈도를 가진다는 것을 의미한다.
일부 양태에서, 본 발명은 넓게는 전구세포, 예컨대, 인간 배아 줄기 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포로부터 심장 세포, 예컨대, 심근세포를 분화시키기에 적합한 세포 배양 배지, 시스템 및/또는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 양태는 기초 배지, 하나 이상의 지방산, 글루코스 및 알부민을 포함하는 심장 세포 성숙 배지를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는
(i) 제1 양태의 심장 세포 성숙 배지; 및
(ii) 웰의 기저 바닥으로부터 실질적으로 수직으로 뻗어 있는 마주보는 장대를 각각 포함하는 복수의 웰들을 포함하는 심장 세포 배양 용기
를 포함하는 심장 세포 배양 시스템을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 전구세포들 중 하나 또는 복수의 전구세포들이 심근세포로 성숙하도록 유도하거나 촉진하기에 충분한 시간 동안 적합한 조건 하에서 하나 이상의 전구세포를 제1 양태의 심장 세포 성숙 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 심장 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
"전구세포"는 자가-재생하거나 자가-재생하지 않으면서 하나 또는 복수의 발생 경로를 따라 분화할 수 있는 세포이다. 전형적으로, 전구세포는 단분화능 또는 다분화능 세포이고 적어도 제한된 자가-재생을 할 수 있다.
용어 "인간 배아 줄기 세포", "hES 세포" 및 "hESC"는 성숙 동물에 존재하는 모든 세포 유형들을 생성하는 능력을 가진, 자가-재생 다능성 또는 전능성(toti-potent) 인간 배아 또는 배반포로부터 유도되거나, 수득될 수 있거나 유래한 세포를 지칭한다. 인간 배아 줄기 세포(hESC)는 예를 들면, 인간 생체내 착상 전 배아, 시험관내 수정된 배아, 또는 배반포 단계로 증폭된 1-세포 인간 배아로부터 수득된 인간 배반포로부터 단리될 수 있다.
용어 "유도 다능성 줄기 세포" 및 "iPSC"는 외생성 유전자, 예컨대, OCT4, SOX 1, 2, 3, 15 및 18, KLF4, LIN28, Glis 1 및 c- MYC를 포함하나 이들로 한정되지 않는 전사 인자의 발현을 통해 다능성 상태로 재프로그래밍된 임의의 유형의 인간 성숙 체세포로부터 유도될 수 있거나, 수득될 수 있거나 유래한 세포를 지칭한다.
용어 "분화한다", "분화하는" 및 "분화된"은 세포가 발생 경로의 초기 또는 최초 단계로부터 발생 경로의 후기 또는 더 성숙한 단계로 진행하거나 성숙하는 것을 의미한다. 이와 관련하여 "분화된"은 세포가 완전히 분화되고 다능력(pluropotentiality), 또는 그 발생 경로 또는 다른 발생 경로를 따라 더 진행하는 능력을 상실한다는 것을 의미하거나 내포하지 않는다는 것이 인식될 것이다. 분화는 세포 분열에 동반될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "심근세포"는 심장 근육, 예컨대, 심장의 심방 및 심실에서 발견되는 근육을 구성하는, 근심장세포 또는 심장 근세포로서도 공지되어 있는 심장 근육 세포이다. 각각의 근심장세포는 심장 근육 세포의 기본 수축 유닛인 근원섬유를 함유한다. 심근세포는 전형적으로 근육 수축을 위한 아데노신 트리포스페이트(ATP)의 생성을 용이하게 하기 위해 4개만큼 많은 상대적으로 높은 미토콘드리아 밀도를 가질 수 있지만 1개 또는 2개의 핵을 함유한다. 심근 경색은 심근세포의 사멸을 야기한다. 성인에서, 이들 상실된 심근세포를 재생시키는 심장의 제한된 능력은 손상된 심장 기능 및 높은 이환율 및 사망률로 이어진다.
당분야에서 잘 이해될 바와 같이, 세포의 분화의 단계 또는 상태는 복수의 마커들 중 한 마커의 발현 및/또는 비-발현을 특징으로 할 수 있다. 이와 관련하여, "마커"는 발생 전체에 걸쳐 변화된 발현 또는 발현 패턴을 가진, 세포, 세포 집단, 계통, 구획 또는 서브세트의 게놈에 의해 코딩된 핵산 또는 단백질을 의미한다. 핵산 마커 발현은 핵산 서열 증폭(예를 들면, 중합효소 연쇄 반응) 및 핵산 혼성화(예를 들면, 마이크로어레이, 노던 혼성화, 제자리 혼성화)를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 당분야에서 공지되어 있는 임의의 기법에 의해 검출될 수 있거나 측정될 수 있다. 단백질 마커 발현은 유세포분석, 면역조직화학, 면역블롯팅, 단백질 어레이, 단백질 프로파일링(예를 들면, 2D 겔 전기영동)을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 당분야에서 공지되어 있는 임의의 기법에 의해 검출될 수 있거나 측정될 수 있다. 바람직하게는, 단백질 마커는 단백질 마커에 결합하는 항체 또는 항체 단편(다중클론 또는 단일클론일 수 있음)에 의해 검출된다. 적합하게는, 항체는 예컨대, 방사성 표지, 형광단(예를 들면, 알렉사(Alexa) 염료), 디곡소게닌(digoxogenin) 또는 효소(예를 들면, 알칼리성 포스파타제, 호스라디쉬 퍼록시다제)(그러나, 이들로 한정되지 않음)로 표지된다. 표 1 및 2는 본 발명에 따른 마커 검출에 유용한 마커, 항체 및 형광단의 구체적인 비-한정적 예를 제공한다. 대안적으로, 마커는 분화 또는 발생의 결과로서 세포 변화를 동반하는 대사 과정의 생성물인 "대사물질"일 수 있다.
본원에서 일반적으로 사용된 바와 같이, 용어 "혈청"은 동물로부터 수득되었거나 수득될 수 있는 실질적으로 세포 무함유 단백질성 혈액 분획(예를 들면, 태아 소 혈청)을 지칭하고 정제된 또는 재조합 합성 혈청 성분, 예컨대, 알부민을 포함하지 않는다. 이와 관련하여, 무혈청 배지로서 "무혈청"은 혈청의 완전한 부재를 의미하거나, 약 1%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1%(v/v) 이하의 혈청을 지칭할 수 있다.
본원에 개시된 심장 세포 배양 배지의 구체적인 특징은 심근세포의 성숙, 및 조작된 심장 조직(EHT) 및 심장 오가노이드의 형성을 최적화하는 성분 또는 구성요소의 선택이다.
방법의 초기 단계는 전구세포, 예컨대, hESC 또는 iPSC를 심장 중배엽으로 분화시킨 후 심근세포로 분화시킨다. 초기에, 전구세포는 인슐린의 부재 하에서 약 2%(v/v)의 바람직한 농도로 보충제, 예컨대, B27과 함께 무혈청 기초 배지, 예컨대, RPMI를 포함하는 배양 배지에서 심장 중배엽으로 분화된다. 상기 배양 배지는 아스코르브산 2 포스페이트, BMP-4, 액티빈 A, FGF-2 및 GSK-3 억제제, 예컨대, CHIR99021을 추가로 포함할 수 있다. 그 후, 세포는 Wnt 억제제, 예컨대, IWP-4의 존재 하에서 심근세포로 분화되고, 그 후 약 15일째 날에 콜라겐분해효소로 분해할 때까지 인슐린 및 아스코르브산 2 포스페이트를 보충된 배지(예를 들면, RPMI + 2% B27)에 첨가한다.
그 다음, 콜라겐분해효소에 의해 분해된 심근세포를 심장 세포 성숙 배지에서 배양할 수 있다. 적합하게는, 심장 성숙 배지는 임의의 무혈청 배지, 예컨대, αMEM, DMEM, 이스코브(Iscove) 배지 또는 RPMI1640일 수 있는 "기초 배지"를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기초 배지는 α-MEM GlutaMAX이다. 적합하게는, 심장 세포 성숙 배지는 무혈청 배지이다. 심장 세포 성숙 배지는 보충제, 예컨대, B27(그러나, 이것으로 한정되지 않음)을 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 심장 세포 성숙 배지는 알부민, 예컨대, 정제된 또는 재조합 소 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민을 포함한다. 알부민은 보충제, 예컨대, B27에 존재할 수 있거나, 배지의 별도의 성분으로서 포함될 수 있다. 적합하게는, 알부민의 농도는 바람직하게는 자그마치 약 2 mg/㎖, 1 mg/㎖ 미만, 0.5 mg/㎖ 미만, 0.2 mg/㎖ 미만 또는 0.1 또는 0.05 mg/㎖만큼 낮은 농도이다. 심장 세포 성숙 배지는 L-아스코르브산 2 포스페이트를 추가로 포함할 수 있다.
심장 세포 성숙 배지는 도 20에 나타낸 바와 같이 심장 세포 현탁액, 단층 또는 2차원 "2D" 배양물을 생성하는 데 적합할 수 있다.
상기 언급된 심장 세포 성숙 배지에서 배양하기 전에 3차원 "3D" 심장 조직 또는 오가노이드가 생성되어야 하는 다른 실시양태에서, 전술된 바와 같은 무혈청 기초 배지 및 보충제, 예컨대, B27(알부민을 포함하나 인슐린을 포함하지 않음) 및 세포외 매트릭스(ECM) 또는 이의 성분을 포함하는 겔화 배지에서 세포를 배양한다. 본원에서 광범위하게 사용된 바와 같이, "ECM"은 세포-세포 소통, 세포 신호전달, 세포 부착, 간격, 위치 및/또는 배향(그러나, 이들로 한정되지 않음)을 조절하는 세포 밖 또는 외부에 위치한 분자의 매트릭스 또는 웹을 지칭한다. ECM의 분자 성분은 프로테오글리칸, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라틴, 콜라겐(예를 들면, I형 내지 XIV형), 엘라스틴, 라미닌 및 피브로넥틴을 포함할 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, ECM은 매트리겔™의 형태로 존재할 수 있다. 매트리겔™의 농도는 겔화 배지의 약 2% 내지 20%(v/v), 바람직하게는 약 5% 내지 15%(v/v), 보다 바람직하게는 약 7% 내지 12%(v/v) 또는 8% 내지 10%(v/v) 또는 유리하게는 약 9%(v/v)일 수 있다. 적합하게는, 콜라겐도 겔화 배지의 약 2 mg/㎖ 또는 유리하게는 약 2.6 mg/㎖의 과량의 농도로 존재한다. 이것은 대략 약 0.23 mg/1.5 x 106개 세포이다. 적합하게는, 심근세포는 전형적으로 약 30분 동안 약 37℃에서 매트리겔™ 및 콜라겐을 포함하는 겔화 배지에서 겔화된다. 특히 보다 높은 농도, 예컨대, 9%의 매트리겔™의 존재는 심장 조직 덩어리가 심장 동력계의 마주보는 장대로부터 떨어져 나가는 "네킹(necking)"을 야기하는 세포 장력에 의해 손상될 수 있는, 심장 동력계에서 생성된 3D 심장 조직의 장기간 구조적 완전성에 유리하다.
겔화 후, 심근세포는 하나 이상의 지방산, 알부민 및 글루코스를 포함하는 심장 성숙 배지에서 성숙된다. 유사하게, "2D" 단층으로서 배양된 심근세포는 하나 이상의 지방산, 알부민 및 글루코스를 포함하는 심장 성숙 배지에서 성숙된다. 하나 이상의 지방산 및 글루코스는 약 1:5 내지 약 1:60, 약 1:7 내지 1:20의 농도 비로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 지방산 및 글루코스는 약 1:10의 농도 비로 존재한다. 지방산은 포유동물 세포에서 산화적 지방산 대사를 위한 기질로서 작용할 수 있는 포화 지방족 쇄 또는 단일불포화 또는 다중불포화 지방족 쇄를 가진 임의의 카복실산일 수 있다. 바람직하게는, 지방산은 열두(12)개 내지 이십(20)개의 탄소 원자를 포함하는 지방족 쇄를 가진다(즉, C12-C20 지방산). 바람직하게는, 지방산은 열여섯(16)개 또는 열여덟(18)개의 탄소 원자를 포함하는 지방족 쇄를 가진다(즉, C16 또는 C18 지방산). 지방산은 리놀렌산, 팔미트산, 리놀레산 또는 올레산일 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 지방산은 팔미트산이거나 팔미트산을 포함한다. 지방산, 예컨대, 팔미트산은 1 내지 1000 μM, 5 내지 500 μM, 10 내지 200 μM 또는 50 내지 150 μM 범위 내의 농도로 존재할 수 있다. 지방산, 예컨대, 팔미트산의 바람직한 농도는 약 100 μM이다.
글루코스의 바람직한 농도는 약 0.5 내지 5.5 mM, 또는 유리하게는 약 1 mM이다.
글루코스는 D-글루코스, 및 포유동물 세포에서 해당작용을 위한 기질로서 작용할 수 있는, D-글루코스의 임의의 개방된 쇄, 키랄 및/또는 환형 이성질체를 포함한다는 것도 이해될 것이다.
전형적으로, 심장 세포 성숙 배지는 인슐린을 포함하지 않거나 최소 농도의 인슐린을 포함한다. 적합하게는, 인슐린의 최소 농도는 인슐린의 완전한 부재 하에서 관찰된 수준보다 5% 내지 10% 이하만큼 더 높은 수준으로 심근세포 증식(예컨대, KI67 발현에 의해 측정됨) 및/또는 Wnt/β-카테닌 활성화를 자극하는 농도이다.
이론에 불필요하게 구속되고자 하지는 않지만, 심장은 발생의 초기 단계에서 우세한 해당작용 대사인 대사를 성숙 시 거의 전적으로 산화 대사인 대사로 전환시킨다는 것이 제안되어 있다. 따라서, 순환 수준의 기질은 태아 심장에서 맞닥뜨리는 해당작용 대사를 확립하는 데 있어서 중요한 역할을 하는데, 이는 발생의 이 단계가 혈액에서의 낮은 수준의 지방산 및 높은 수준의 락테이트로 특징져지기 때문이다. 출생 전 대사는 탄수화물의 우세한 사용을 특징으로 하고, 지방산 산화는 총 에너지 생성의 약 15%만을 기여한다. 성인 심근세포 대사는 거의 전적으로 산화 대사이다(총 에너지 생성의 약 90%). 실시예에서 제공된 데이터는 심장 세포 성숙 배지가 에너지 대사를 인슐린 및 글루코스 의존적 해당작용 대사로부터 지방산 대사로 전환시키고, 이것이 Wnt/β-카테닌 신호전달 및 세포 주기 진행의 억제와 상관관계를 가진다는 것을 암시한다. 이들 조건은 심근세포 성숙에 유리한 듯하다. 그러나, 글루코스의 완전한 부재는 바람직하지 않고, 이 경우 앞에 기재된 바와 같이 특정 지방산:글루코스 비가 바람직하다.
적합하게는, 심장 세포 성숙 배지는 TGF-β1을 포함하지 않거나 최소 농도 또는 양의 TGF-β1을 포함한다. 적합하게는, TGF-β의 최소 농도는 약 2 ng/㎖ 미만, 또는 바람직하게는 약 1 ng/㎖ 이하이다. 적합하게는, 존재하는 경우, 최소 농도의 TGF-β1은 배양의 오(5)일, 바람직하게는 배양의 초기 오(5)일 미만 동안 존재한다. 실시예에 더 상세히 기재될 바와 같이, 성숙 배지 내에서의 TGF-β1의 연장된 존재는 상당한 세포 사멸을 야기하였고 EHT의 수축 기능을 손상시켰다.
적합하게는, 심장 세포 성숙 배지는 섬유모세포 성장 인자(FGF), 예컨대, FGF2를 포함하지 않거나, 최소 농도 또는 양의 FGF2를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 웰의 기저 표면으로부터 실질적으로 수직으로 뻗어 있는 마주보는 장대를 각각 포함하는 복수의 웰을 포함하는 심장 세포 배양 용기를 포함하는 심장 세포 성숙 시스템을 제공한다. 적합하게는, 상기 웰 및 마주보는 장대는 마주보는 장대와 맞물리고 이 장대를 둘러싸는 조밀한 근육 다발을 포함하는 심장 오가노이드의 형성을 최대화하는 치수, 모양 및 배향을 가진다. 도 15를 참조하면서 실시예에 더 상세히 기재되어 있는 바와 같이, 근육 다발에 의해 야기된 마주보는 장대의 변위는 수축력 측정을 용이하게 한다.
전형적으로, 웰, 또는 적어도 웰의 상부 둘레는 모양이 실질적으로 타원형이다. 적합하게는, 웰은 웰의 장축을 따라 간격을 두고 떨어져 있는 마주보는 장대를 포함한다. 적합하게는, 상기 장대는 장축을 따라 대칭으로 간격을 두고 있다. 상기 장대는 웰의 상부 둘레보다 더 돌출되지 않으면서 웰의 기부에 실질적으로 수직할 수 있다. 구체적으로, 웰의 비-한정적 치수는 3 mm 장축 및 2 mm 단축을 포함한다. 마주보는 장대는 정사각형 또는 직사각형 횡단면을 가진 블록 모양의 장대일 수 있다. 특정 형태에서, 마주보는 장대는 횡단면이 0.2 mm X 0.5 mm의 치수를 가진 직사각형일 수 있다. 특정 형태에서, 마주보는 장대는 장축을 따라 장대의 중심부터 약 1.0 mm의 간격을 두고 대칭으로 존재한다. 웰의 구체적인 예는 도 14 및 도 1에 표시되어 있다. 심장 성숙 용기는 예컨대, 24, 48, 96, 384 또는 당분야에서 공지되어 있는 다른 다중웰 포맷으로 본원에 개시된 복수의 웰들을 포함할 수 있다.
심장 성숙 용기는 자동화된 심장 조직 형성, 배양 및 수축력 분석을 위해 조밀한 근육 세포 다발을 형성하는 심장 동력계(또는 "심장-Dyno") 장치일 수 있거나 이 장치의 구성요소일 수 있다. 심장 동력계 장치의 장점은 형성, 배양 및 수축력 분석 동안 조직 취급을 최소화하거나 심지어 제거한다는 점이다. 실시예로부터 이해될 바와 같이, "심장 동력계" 장치는 전술된 세포 배양 배지를 개발하는 데 특히 유리한 수축력 측정을 제공하였다. 수축력 측정을 수행하는 것의 상세한 설명은 이하 실시예에 기재되어 있고, 개략적 요약은 도 15에 제시되어 있다. 추가로, 예컨대, (예를 들면, Ki67 발현으로) 심근세포 증식 및 (예를 들면, 심실 미오신 경쇄 2의 발현으로) 성숙을 평가하기 위해 심근세포의 면역조직화학을 용이하게 수행할 수 있다.
본 발명의 관련 양태는 본원에 개시된 심장 세포 배양 시스템 내의 하나 이상의 심근세포를 하나 이상의 후보 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 심장 세포 성숙을 조절하는 하나 이상의 분자를 확인하는 방법을 제공하는데, 이때 하나 또는 복수의 심근세포의 성숙의 변형은 후보 분자가 심장 세포 성숙의 조절제라는 것을 표시한다.
한 실시양태에서, 조절제는 심장 세포 성숙을 적어도 부분적으로 향상시키거나 촉진한다. 상기 설명으로부터 인식될 바와 같이, 이러한 조절제는 특히 특정 비로 존재할 때 글루코스 및 지방산, 예컨대, 팔미테이트를 포함한다. 심장 세포 성숙을 적어도 부분적으로 향상시키거나 촉진하는 다른 조절제는 이 방법에 따라 확인될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
또 다른 실시양태에서, 조절제는 심장 세포 성숙을 적어도 부분적으로 억제하거나 저해한다. 상기 설명으로부터 인식될 바와 같이, 이러한 조절제는 연장된 기간 동안 인슐린 및 상대적으로 높은 농도의 TGF-β1을 포함한다. 심장 세포 성숙을 적어도 부분적으로 억제하거나 저해하는 다른 조절제는 이 방법에 따라 확인될 수 있다는 것이 인식될 것이다. "심장 세포 성숙을 적어도 부분적으로 억제하거나 저해하는"은 심근세포에 대한 독성을 나타내고/내거나 세포 사멸을 유발하는 조절제(예를 들면, 심근세포 아폽토시스의 유도제)를 포함한다는 것이 이해될 것이다.
일부 실시양태에서, 심근세포는 전구세포로부터 분화되었다. 전구세포는 인간 배아 줄기 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포일 수 있거나, 이러한 줄기 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 이 양태는 심근세포 성숙을 조절할 수 있는 후보 분자를 확인하거나, 분석하거나 스크리닝하는 방법 또는 시스템을 제공한다는 것이 인식될 것이다. 후보 분자는 조합 라이브러리, 천연 생성물 라이브러리, 합성 화학적 라이브러리, 파지 디스플레이 라이브러리, 선두 화합물 라이브러리, 및 스크리닝에 적합한 분자의 임의의 다른 라이브러리 또는 집합체에 존재할 수 있다.
본 발명의 추가 양태는 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 하나 이상의 심근세포, 또는 이를 포함하는 심장 조직 또는 오가노이드를 제공한다.
앞에 기재된 바와 같이, 심장 세포 성숙 배지, 성숙 시스템 및 방법은 심장 세포 현탁액, 단층 또는 "2D 배양물"을 생성하는 데 적합할 수 있다.
다른 특정 실시양태에서, 심장 세포 성숙 배지, 성숙 시스템 및 방법은 3차원(3D) 구조물, 예컨대, EHT 또는 심장 "오가노이드"로 심장 근육 조직을 생성하는 데 적합할 수 있다. 오가노이드는 조작된 또는 인공 심장 조직을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 심장 오가노이드는 스카폴드, 예컨대, 세포가 제거된 인간 심장, 폴리에스테르 플리스(fleece) 또는 생분해성 중합체 스카폴드 내에 포함됨으로써, 심장 3D 구조물을 생성할 수 있다. "바이오프린팅된" 3D 심장 구조물도 예상된다.
예를 들면, 하이드로겔 스카폴드를 이용하여 인간 세포를 원하는 배향으로 배치함으로써 인간 장기를 재생성하는 장기 프린팅 기계가 개발되었다.
본원에 기재된 심근세포 및/또는 심장 오가노이드는 심장의 세포 요법을 위한 정제되고 분화된 심근세포의 잠재적 공급원을 제공할 수 있다는 것도 인식될 것이다. 특정 실시양태에서, 유전적 심장 결함 또는 질환을 가진 환자로부터 유도되거나, 수득되거나 유래한 iPSC 세포주는 시험관내에서 유전적 돌연변이(들)의 복구를 위해 사용될 수 있다. 이러한 심장 세포, EHT 또는 오가노이드는 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있었고 그 다음 자가 세포 요법을 위해 환자에게 투여될 수 있었다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 생성된 심장 세포, EHT 또는 오가노이드는 조직 패치, 매트, 플러그 또는 볼루스의 형태, 또는 다른 이식 가능한 형태로 심장에 직접 투여될 수 있다.
본원에 기재된 심근세포 및/또는 심장 오가노이드는 심장 질환 모델링을 위한 정제되고 분화된 심근세포의 잠재적 공급원을 제공할 수 있다는 것도 인식될 것이다. 예를 들면, 유전적 결함을 가진 심근세포를 포함하는 심장 오가노이드의 수축성을 측정함으로써 심장 기능에 대한 유전적 결함의 효과를 연구할 수 있다. 추가 실시양태에서, 유전적 결함을 치료하거나 바로잡는 데 있어서 약물 또는 다른 분자의 효능을 본원에 기재된 심근세포 및/또는 심장 오가노이드로 평가할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 심근세포 및/또는 심장 오가노이드는 환자 특이적 심장 질환 모델링 및 심장 생물학, 예컨대, 유전자 발현 조절(예를 들면, 유전자 "넉아웃", "넉다운" 또는 과다발현) 효과의 모델링, 연구 또는 예측과 같은 적용에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 특정 양태는 본원에 개시된 방법에 따라 생성된 심장 세포, 오가노이드 또는 조작된 심장 조직을 하나 이상의 분자와 접촉시키는 단계 및 심장 세포, 오가노이드 또는 조작된 심장 조직에 대한 하나 이상의 분자의 효과를 측정하거나, 평가하거나 모니터링하는 단계를 포함하는, 심장 세포, 조직 또는 오가노이드에 대한 하나 이상의 분자의 효과를 측정하거나, 평가하거나 모니터링하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이 양태는 심장 세포, 조직 또는 오가노이드에 대한 하나 이상의 분자의 효과를 측정하거나, 평가하거나 모니터링하는 방법을 제공한다는 것이 인식될 것이다. 효과는 심장 질환 또는 장애를 치료하는 데 있어서 치료 효능, 약물 용량 결정, 독성 및/또는 안전성(예를 들면, 약물의 부작용 평가) 및 심장 세포, 조직 또는 오가노이드의 수축성(그러나, 이들로 한정되지 않음)일 수 있거나 이들과 관련될 수 있다.
하나 이상의 분자는 공지된 또는 기존 약물일 수 있거나, 조합 라이브러리, 천연 생성물 라이브러리, 합성 화학적 라이브러리, 파지 디스플레이 라이브러리, 선두 화합물 라이브러리, 및 상기 방법에 적합한 분자의 임의의 다른 라이브러리 또는 집합체에 존재할 수 있다.
상기 방법의 특정 실시양태에서, 심근세포 및/또는 심장 오가노이드는 독성 스크리닝 또는 시험관내 약물 안전성 시험에 유용할 수 있다. 심장독성을 나타내는, 특히 심장 부정맥, 심근병증 및/또는 급성 관상 증후군을 야기하는 여러 약물들 및 다른 분자들이 존재한다. 이들은 시사프라이드(cisapride), Ca2+, K+ 및 Na+ 채널 차단제, β 차단제 및 화학요법제, 예컨대, 안쓰라사이클린(anthracycline)을 포함한다. 심근세포 및/또는 심장 오가노이드에 대해 약물을 스크리닝하여, 일반적인 심장독성을 확인할 수 있거나, 특정 개체의 전구세포로부터 수득된 심근세포 또는 오가노이드가 잠재적 심장독성 약물 또는 다른 분자 또는 화합물에 대한 민감성을 나타내는 지 아니면 나타내지 않는 지를 확인할 수 있다.
앞에 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 심장 세포, 조직 또는 오가노이드는 하나 이상의 특정 유전적 결함을 가진 개체의 전구세포로부터 수득될 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 상이한 유전적 배경을 가진, 본원에 개시된 심근세포 및/또는 심장 오가노이드에 대해 후보 약물 또는 다른 분자를 시험하여, 특정 유전적 배경과 상관관계를 가진 차등 약물 효능 및/또는 부작용이 있는 지를 확인하는 "유전적 배경 시험"을 고려한다. 이것은 특정 유전적 배경을 가진 환자를 위한 적절한 약물 요법의 선택을 가능하게 할 수 있다.
본 발명을 용이하게 이해하고 실시할 수 있기 위해, 하기 비-한정적 실시예를 참고한다.
실시예
도입
포유동물 심장은 성체의 증가된 기능적 요구를 충족시키기 위해 출생 후 수명 동안 성숙을 겪는다. 그러나, 이 과정의 핵심 유도제는 잘 규명되어 있지 않은 상태로 남아 있다. 본 발명자들은 현재 인간 다능성 줄기 세포 유래의 심근세포(hPSC-CM)에서 출생 후 성숙을 재현할 수 없는데, 이것이 재생 치료제를 발견하기 위한 모델 시스템으로서의 그의 잠재력을 제한한다. 여기서, 본 발명자들은 인간 다능성 줄기 세포 유래의 심장 오가노이드(hCO)에서의 기능적 스크리닝을 위해 96웰 장치를 개발한 본 발명자들의 연구의 요약을 제공한다. 10,000개 초과의 오가노이드의 조사를 통해, 본 발명자들은 심장 조직 생존율, 기능 및 성숙을 향상시키는 세포외 매트릭스, 대사 기질 및 성장 인자 조건을 비롯한 파라미터를 체계적으로 최적화한다. 최적화된 성숙 조건 하에서, 기능적 및 분자적 특징규명은 지방산 대사로의 전환이 심장 성숙의 중추적 유도제라는 것을 보여주었다. 이 조건 하에서, hPSC-CM은 유사분열촉진 자극에 대한 불응성을 나타내었고, 본 발명자들은 β-카테닌 및 YAP1을 비롯한 핵심 증식 경로가 억제되었다는 것을 확인하였다.
방법
인간 다능성 줄기 세포
인간 배아 줄기 세포(hESC)의 사용을 위한 윤리적 승인을 퀸즈랜드 대학의 의학연구 윤리위원회(2014000801)로부터 얻었고 호주 국립 건강 및 의학 연구 심의회(NHMRC) 규정에 따라 수행하였다. mTeSR-1(Stem Cell Technologies)/매트리겔(Millipore)을 사용하여 HES3(여성) 및 H9(여성) hESC(WiCell) 또는 hiPSC(여성, 센다이-바이러스 재프로그래밍된 CD34+ 세포 ATCC-BXS0116, ATCC)를 TypLE(ThermoFisher Scientific) 계대배양된 배양물로서 유지하였다. 핵형분석 및 DNA 핑거프린팅을 품질 조절(quality control)로서 수행하였다.
인간 RNA 샘플
성인 심장 샘플을 클론텍(Clontech)으로부터 입수하였다. 외상으로 인해 사망한 30세 내지 39세 백인 남성의 3개 심장으로부터 성인 샘플을 모았다.
인간 단백질체학 샘플
건강한 49세 여성으로부터 성인 심장 샘플을 수득하였고 시드니 대학으로부터의 윤리적 승인(2012/2814) 하에서 급속 냉동시켰고 호주 국립 건강 및 의학 연구 심의회(NHMRC) 규정에 따라 수행하였다.
신생아 래트 심실 심근세포
이전에 기재된 바와 같이(60), 심근세포는 P1 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 신생아 래트로부터 유래하였다. 심근세포 단리를 위해 1일령 또는 2일령 신생아 래트(스프라그 돌리)를 사용하였고 퀸즈랜드 대학 윤리위원회로부터의 윤리적 승인 하에서 과학적 목적을 위한 동물의 보호 및 사용에 대한 호주 관리 규정에 따라 취급하였다. 요약하건대, 신생아 래트를 희생시켰고, 심장을 절제하고 ADS 완충제로 세척하였고, 심방을 제거하였다. 콜라겐분해효소 II를 사용하여 근세포를 단리하고 퍼콜(Percoll) 구배로 분리하였다. 15 ㎖ 팔콘(Falcon) 튜브에서 1:0.5 퍼콜:ADS 층 위에 1:1.2 퍼콜:ADS 층을 쌓아 올림으로써 퍼콜 구배를 구축하였다. 단리된 근세포를 젤라틴으로 코팅된 유리 커버슬립 위의 CTRL 배지(하기 참조)에 1 x 105개 세포/cm2로 플레이팅하고 실험 전에 하룻밤 동안 회수하였다.
심장 동력계 제작
표준 SU-8 포토리쏘그래피(photolithography) 및 PDMS 성형 관행(16)을 이용하여 심장 동력계 배양 삽입체를 제작하였다. 미세제작된 캔틸레버(cantilever) 어레이 디자인을 DraftSight(Dassault Systems)로 작성하고 다수의 상이한 디자인들을 실현가능성에 대해 먼저 시험하였다. 그 다음, MIVA 포토플롯터(photoplotter)로 디자인의 포토마스크를 7-인치 HY2 유리 플레이트(Konica Minolta) 위에 작도하였다. 6-인치 규소 웨이퍼 기판에 대한 SU-8 포토리쏘그래피(photolithography)는 약 700 ㎛의 깊이까지 구조물을 형성하였다. 요약하건대, 규소 웨이퍼를 아세톤, 이소프로판올 및 N2로 세정한 후, 30분 동안 150℃에서 탈기하였다. SU-8 2150 포토레지스트(Microchem)를 스핀 코팅하고 4회 소프트 베이킹하여 요구된 두께까지 SU-8을 구축하였다. 그 다음, 총 선량 1082 mJ/cm2를 위해 웨이퍼를 포토마스크 하에서 UV 광에 노출시켰다. 그 다음, 노출된 웨이퍼를 노출 후 베이킹하고(65℃에서 5분; 95℃에서 40분; 65℃에서 4분), 초음파분쇄기 전해조(sonicator bath)에서 45분 동안 프로필렌 글리콜 모노메틸 에테르 아세테이트로 현상하였다. 최종 특징 높이를 광학 표면 프로파일러(Veeco)로 측정하였다. 35분 동안 65℃에서 경화하면서 폴리(디메틸실록산)(PDMS; Sylgard 184, Dow Corning; 10:1의 단량체:촉매 비로 혼합됨)을 사용한 소프트 리쏘그래피로 심장 동력계를 성형하였다. 6 mm 홀 펀치를 이용하여 금형을 절단하고 96웰 플레이트 내에 넣은 후, 70% 에탄올 및 UV 광으로 멸균하고 PBS로 세척하고 3% BSA (Sigma)로 코팅하여 세포가 웰의 바닥에 부착되지 않게 하였다.
심장 분화
최근에 개발된 프로토콜(13, 56, 58)을 이용하여 심장 세포를 생성하였다. hPSC를 매트리겔로 코팅된 플라스크 내에 2X104개 세포/cm2로 시딩하였고, mTeSR-1을 이용하여 4일 동안 배양하였다. 그 다음, 3일 동안 매일 배지를 교체하면서, 5 ng/㎖ BMP-4(RnD Systems), 9 ng/㎖ 액티빈 A(RnD Systems), 5 ng/㎖ FGF-2(RnD Systems) 및 1 μM CHIR99021(Stem Cell Technologies)을 함유하는 RPMI B27- 배지(RPMI1640 GlutaMAX + 인슐린을 갖지 않은 2% B27 보충제, 200 μM L-아스코르브산 2 포스페이트 세스퀴마그네슘 염 수화물(Sigma) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(달리 표시되어 있지 않은 한, 모두 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific) 제품))를 사용하여 hPSC를 심장 중배엽으로 분화시켰다. 그 후, 2일 내지 3일마다 배지를 교체하면서, 5 μM IWP-4(Stem Cell Technologies)를 함유하는 RPMI B27-을 사용한 후 RPMI B27+(RPMI1640 GlutaMAX + 인슐린을 가진 2% B27 보충제, 200 μM L-아스코르브산 2 포스페이트 세스퀴마그네슘 염 수화물 및 1% 페니실린/스트렙토마이신)을 7일 동안 사용하여 hPSC를 hPSC-CM/기질 세포 혼합물로 특정하였다. 그 다음, 37℃에서 60분 동안 PBS(Ca2+ 및 Mg2+을 가짐) 중의 20% 태아 소 혈청(FBS) 중의 0.2% 콜라겐분해효소 I형(Sigma)을 사용한 후 10분 동안 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 15일째 날에 분해할 때까지, 분화된 세포를 RPMI B27+에서 배양하였다. 100 ㎛ 메시 세포 여과기(BD Biosciences)를 이용하여 세포를 여과하고 3분 동안 300 x g에서 원심분리하고 요구된 밀도로 CTRL 배지에 재현탁하였다: α-MEM GlutaMAX, 10% FBS, 200 μM L-아스코르브산 2 포스페이트 세스퀴마그네슘 염 수화물 및 1% 페니실린/스트렙토마이신. 유세포분석에 기반을 둘 때, 조직 조작을 위해 생성되고 사용된 세포는 약 70% α-액티닌+/CTNT+ hPSC-CM이었고, 이때 나머지는 주로 CD90+ 기질 세포이었다(13).
hCO 제작
CTRL 배지: α-MEM GlutaMAX(ThermoFisher Scientific), 10% 태아 소 혈청(FBS)(ThermoFisher Scientific), 200 μM L-아스코르브산 2 포스페이트 세스퀴마그네슘 염 수화물(Sigma) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(ThermoFisher Scientific). 각각의 hCO를 위해, CTRL 배지 중의 5 x 104개 심장 세포를 콜라겐 I과 혼합하여, 2.6 mg/㎖ 콜라겐 I 및 9% 매트리겔을 함유하는 3.5 ㎕의 최종 용액을 제조하였다. 소 산-가용화된 콜라겐 I(Devro)의 염 균형을 먼저 달성하였고, 매트리겔 및 세포와 혼합하기 전에 각각 10X DMEM 및 0.1 M NaOH을 사용하여 pH를 중화시켰다. 혼합물을 얼음 위에서 제조하고 심장 동력계 내로 피펫팅하였다. 그 다음, 심장 동력계를 10초 동안 100 x g로 원심분리하여, hCO가 장대의 중간까지 올라간 곳에서 형성되게 하였다. 그 다음, CTRL 배지를 첨가하기 전, 혼합물을 30분 동안 37℃에서 겔화하여 조직을 덮었다(150 ㎕/hCO). 심장 동력계 디자인은 내장된 PDMS 운동 장대(약 0.07 ㎛/μN을 변형시키도록 디자인됨) 주변에서 조직의 자가 형성을 용이하게 한다. 2일 내지 3일마다 배지를 교체하였다(150 ㎕/hCO).
hCO를 형성용 CTRL 배지에서 배양한 후, 실험을 위해 표시된 바와 같이 무혈청 배지로 교체하였다. 모든 스크리닝 실험을 위해, hCO 형성 후, 글루코스, 글루타민 및 페놀 레드를 갖지 않고 4% B27(인슐린을 갖거나 갖지 않음)(ThermoFisher Scientific), 1% GlutaMAX(ThermoFisher Scientific), 200 μM L-아스코르브산 2 포스페이트 세스퀴마그네슘 염 수화물 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(ThermoFisher Scientific)으로 보충된 DMEM(ThermoFisher Scientific)을 포함하는 무혈청 조건에서 hCO를 배양하였다. 배지에의 첨가제는 글루코스, 팔미트산(37℃에서 2시간 동안 항온처리함으로써 B27 내의 소 혈청 알부민과 접합됨, Sigma) 또는 TGFβ-1(Peprotech)을 포함하였다. 완성된 hCO 제작, 배양 및 성숙 프로토콜의 시각표는 도 1m에서 확인될 수 있다.
심장 동력계에서의 hCO의 힘 분석
장대 편향을 이용하여 수축력을 대략적으로 측정하였다. Leica DMi8 도립 고성능 영상화기를 이용하여, 37℃에서 각각의 hCO 수축의 10초 저속 촬영을 실시간으로 포착하였다. 주문제작 일괄 프로세싱 파일을 Matlab R2013a(Mathworks)로 작성하여 적층된 TIFF 파일을 AVI로 전환시켰고, 장대 이동을 추적하였고(vision.PointTracker 이용), 수축 파라미터를 측정하였고, 힘-시간 도면을 생성하였고 일괄 데이터를 엑셀(Microsoft) 스프레드시트로 내보냈다.
주문제작 일괄 프로세싱 파일을 Matlab R2013a(Mathworks)로 작성하여 적층된 TIFF 파일을 AVI로 전환시켰고, 장대 이동을 추적하였고(vision.PointTracker 이용), 수축 파라미터를 측정하였고, 힘-시간 도면을 생성하였고 일괄 데이터를 엑셀(Microsoft) 스프레드시트로 내보냈다. 하기 식을 이용하여 각각의 시점에서 수축력을 측정하였다.
특정된 거리에서 적용된 힘으로 한 말단에 고정된 직사각형 캔틸레버의 말단에서의 최대 편향:
Figure pct00001
Figure pct00002
식 1과 식 2의 조합:
Figure pct00003
상기 식에서, F = 힘, I = 관성 모멘트, E = 영률, b = 장대의 길이, h = 장대의 폭(굽힘 방향), L = 장대의 높이, x = z-방향으로 장대에서의 조직의 위치, 및 δ = 장대 편향.
본 발명자들의 시스템의 파라미터에 기반을 둘 때: E = 1500 kPa, b = 0.5 mm, h = 0.2 mm, L = 0.7 mm, 및 x = 0.35 mm(장대의 중간까지 올라간 곳에서 hCO), k = 14 μN/㎛.
Figure pct00004
본 발명자들은 고감도 등거리 힘 변환기(ADInstruments)를 이용하여 이 파라미터들을 검증하였고 k = 14.2 ± 2.4 μN/㎛(n = 10)를 측정하였다.
전조직-표본고정 면역염색
hCO를 실온에서 1% 파라포름알데하이드(Sigma)로 60분 동안 고정시키고 PBS로 3회 세척한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 PBS에서 차단 완충제, 5% FBS 및 0.2% 트리톤-X-100(Sigma)에서 일차 항체(표 1)와 함께 항온처리하였다. 그 다음, 세포를 2시간 동안 차단 완충제로 2회 세척한 다음, 4℃에서 하룻밤 동안 이차 항체(표 1) 및 Hoescht(1:1000)와 함께 항온처리하였다. 상기 세포를 2시간 동안 차단 완충제로 2회 세척하였고, 제자리에서 영상화하였거나 플루오로마운트(Fluoromount)-G(Southern Biotech)를 사용하여 현미경 슬라이드 위에 탑재하였다.
면역염색 분석
스크리닝을 위해, 제자리 영상화용 Leica DMi8 고성능 영상화 현미경을 이용하여 hCO를 영상화하였다. 주문제작 일괄 프로세싱 파일을 Matlab R2013a(Mathworks)로 작성하여 배경을 제거하였고, 영상 강도를 계산하였고, 일괄 데이터를 엑셀(Microsoft) 스프레드시트로 내보내었다.
보다 더 상세한 영상을 위해, 탑재된 영상화용 올림푸스(Olympus) IX81 공초점 현미경 또는 니콘 디스코버리 스피닝 디스크(Nikon Diskovery Spinning Disk) 공초점 현미경을 이용하였다. 세포 주기 분석 실험을 위해, 3개의 무작위 시야를 영상화하였고 증식에 대해 수동으로 정량하였다. 이들을 함께 더하여, 각각의 hCO에서 hPSC-CM 증식의 백분율을 계산하였다.
유세포분석
유세포분석을 위해 세포를 단일 세포로 해리하였다. 먼저 hCO를 37℃에서 관류 완충제(130 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5 mM KCl, 0.5 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES, 10 mM 타우린, 10 mM 글루코스, 10 μM 2,3-부탄디온 모녹심, pH 7.4)로 2회 세척하였다. hCO를 5분 동안 37℃에서 EDTA 완충제(130 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.5 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES, 10 mM 타우린, 10 mM 글루코스, 5 mM EDTA, 10 μM 2,3-부탄디온 모녹심, pH 7.4)에서 항온처리하였다. hCO를 관류 완충제로 2회 세척한 후, 750 rpm의 진탕기 위에서 37℃에서 30분 동안 1 mg/㎖ 콜라겐분해효소 B(Roche)를 함유하는 관류 완충제에서 항온처리하였다. 그 다음, hCO를 3분 동안 1000 x g에서 원심분리하였고, 콜라겐분해효소를 제거하였고, 37℃에서 진탕기 위에서 750 rpm으로 15분 동안 0.25% 트립신-EDTA에서 항온처리하였다. 그 다음, 5% FBS를 함유하는 관류 완충제를 첨가하였고, 3분 동안 1000xg에서 원심분리하여 단일 세포를 펠렛화하였다. 이어서, 생존 세포의 세포 생존율을 유지하기 위해 PBS를 관류 완충제로 대체한 점을 제외하고 공개된 프로토콜을 이용하여 유세포분석을 위해 세포를 염색하였다. 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) LSR 포르테사(Fortessa) X-20 세포분석기에서 유세포분석을 수행하였고 사이플로직(Cyflogic) 1.2.1(Cyflo Ltd)을 이용하여 분석하였다.
단일 세포 전기생리학 및 칼슘 영상화를 위한 hPSC-CM 해리
hCO 제작을 위한 프로토콜과 동일한 프로토콜을 이용하여 2D hPSC-CM에 대해 hPSC-CM을 해리하였고 CTRL 배지 내의 젤라틴-코팅된 커버슬립에 시딩하였다. 다음날 세포를 분석하였다.
MM으로 전환시킨 지 9일 후, 10 μM 2,3-부탄디온 모녹심을 가진 칼슘 무함유 티로드(Tyrode) 완충제(120 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5.4 mM KCl, 22.6 mM NaHCO3, 0.42 mM NaH2PO4, 5.5 mM 글루코스, pH 7.4)(해리 완충제)로 3회 세척함으로써 hPSC-CM을 hCO로부터 해리시켰다. 37℃에서 30분 내지 60분 동안 1 mg/㎖ 콜라겐분해효소 Bin 해리 완충제를 사용하여 세포를 해리시켰다. 해리된 세포를 해리 완충제로 세척하고 3분 동안 100 x g에서 원심분리하였다. 상기 세포를 해리 완충제에 재현탁하였고, 10 μM 2,3-부탄디온 모녹심을 가진 CTRL 배지 또는 MM을 사용하여 칼슘 농도를 10, 50, 250 및 마지막으로 1250 μM까지 점차적으로 증가시켰다. 상기 세포를 3분 동안 100 x g에서 원심분리하였고 10 μM 2,3-부탄디온 모녹심을 가진 CTRL 배지 또는 MM에 재현탁하였고 성장 인자-감소된 매트리겔 또는 라미닌(Sigma)-코팅된 커버슬립 위에 플레이팅하였다. 4시간의 부착 후, 배지를 10 μM 2,3-부탄디온 모녹심을 갖지 않은 CTRL 배지 또는 MM으로 교체하였고, 다음날 세포를 분석하였다.
전기생리학
올림푸스 IX-51 도립 현미경의 재물대 위에 탑재된 TC-124A 온도 제어기(Warner Instruments)를 이용하여 37℃에서 전기생리학적 기록을 수득하였다. Axoclamp 200B 증폭기(Axon Instruments)에 연결된 16-비트 AD/DA 계면(Digidata 1322A, Axon Instruments)을 통해 pClamp 9 소프트웨어(Axon Instruments)로 데이터를 획득하였다. 기록을 10 kHz에서 샘플링하였고, 5 kHz에서 저역 베셀(Bessel)-여과하였고 클램프피트(Clampfit) 10 및 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 6으로 오프라인 평가하였다. P-87 수평 풀러(puller)(Sutter Instruments) 위의 표준 벽 보로실리케이트 유리 모세관(BF 120-69-10, Sutter Instruments)으로부터 피펫을 준비하였다.
용액(140 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 5 mM 글루코스, pH = 7.4)에 잠긴 해리된 세포로부터 hCO 단일 hPSC-CM 활동 전위(AP)를 기록하였다. 전류-클램프 모드로 전체 세포 패치-클램프 측정보다 먼저 피펫 전위 오프셋 및 전기용량 중성화를 수행하였다. 패치 피펫은 내부 용액(10 mM NaCl, 140 mM KCl, 2 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 0.1 mM Na-GTP, 5 mM Mg-ATP, 10 mM HEPES, pH = 7.2)으로 다시 충전되었을 때 1 내지 3 MΩ의 저항을 가졌다. hPSC-CM을 연속적인 전류 주입으로 -80 mV의 막 전위까지 '클램핑'하였다. 125% 역치 수준에서 4 ms 직사각형 전류 펄스를 적용함으로써 1 Hz에서 AP를 이끌어내었다. hPSC-CM을 하기 기준에 따라 심실, 심방 및 결절 유사 AP로 분류하였다: 심실 유사 AP는 분명한 안정기(막 전위에서 20 mV 미만의 감소를 가진 적어도 50 ms 지속의 연장된 시기), 빠른 상승운동(> 50V/s), 큰 AP 진폭(> 85mV), 및 90% 재분극화에서의 AP 지속 대 50% 재분극화에서의 AP 지속의 작은 비(APD90/APD50 < 2.3)를 가졌다. 심방 유사 AP는 분명한 안정기를 나타내지 않았으나 모든 다른 심실 유사 기준을 공유하였다. 마지막으로, 결절 유사 AP는 안정기를 결여하였고 보다 느린 재분극화기(APD90/APD50 > 2.3)를 특징으로 하였다.
수축을 억제하기 위해 7 μM 블레비스타틴(blebbistatin)을 가진 CTRL 배지 또는 MM에 잠긴 온전한 hCO로부터 막 전위 및 자연발생적 전기 신호를 기록하였다. 조직에 꽂기 전에 피펫 전위 오프셋 및 전기용량을 중성화시켰다. 날카로운 전극은 3 M KCl로 재충전될 때 30 내지 50 MΩ의 직렬 저항을 가졌다. 팁 전위 및 액간 전위는 수 mV에 달하였고 보정되지 않았다.
칼슘 영상화
세포를 37℃에서 30분 동안 배양 배지에 직접적으로 첨가된 2.5 μM Fluo-4 AM(ThermoFisher Scientific)과 함께 적재하였다. 배지를 교체하였고(CTRL 또는 MM) 기록 전에 37℃에서 30분 동안 방치하였다. 기록을 위해, 37℃에서 라인 스캐닝(약 10초 동안 라인당 약 1 ms)을 이용하여 올림푸스 IX81 공초점 현미경에서 세포를 1 Hz로 자극하였다(판랩(Panlab)/하바드 어패러터스(Harvard Apparatus) 디지털 자극기를 이용함). 미가공 데이터를 가공하였고, 피크를 확인하였고, 기록에서 일시적인 각각의 칼슘에 대해 파라미터를 계산하였고 그 특정 세포에 대해 평균을 산출하였다. 정확성을 개선하고 편견을 없애기 위해 Matlab R2013a(Mathworks)의 주문제작 작성 프로프램을 이용하여 이를 수행하였다.
RNA 추출
트리졸(Trizol)(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 RNA를 추출하였고 DNAse(Qiagen)로 처리하였고 RNeasy 미니일루트 클린업(Minielute Cleanup) 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
RNA-seq
hCO 및 성인 심장 샘플의 경우, 리보 제로 골드(Ribo Zero Gold)로 리보좀 RNA를 고갈시켰고, 수퍼스크립트(SuperScript) II 역전사효소(ThermoFisher Scientific)로 cDNA를 생성하였다. RNA-seq 라이브러리를 TruSeq 가닥 총 RNA 키트(Illumina)로 생성하였고 HiSeq 2500 시퀀서에서 HiSeq SR 클러스터 v4 키트(Illumina)로 판독하였다. 샘플 판독 품질을 FASTQC로 확인하였고, 트리모매틱(Trimmomatic)(61)을 사용하여 좋지 않은 품질의 서열(<25 phred 점수) 및 어댑터 서열을 잘라내었다. 각각의 샘플을 STAR(62)로 hg38에 맵핑하였다. 그 다음, 맵핑된 판독결과를 통합 모드로 htseq-카운트로 카운팅하였고, EdgeR(v3.2.4)로 차등적 발현 분석을 수행하였다.
단백질체학 샘플 준비
CTRL 배지 또는 MM 조건으로부터 반복실험당 9개의 hCO를 모아 PBS로 2회 세척하였다. 조직을 6 M 구안디늄 클로라이드, 100 mM 트리스(pH 8.0), 10 mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀 및 40 mM 2-클로로아세트아마이드에서 팁-프로브 초음파분쇄로 용해시키고 5분 동안 95℃까지 가열하였다. 샘플을 4℃까지 냉각시키고 10분 동안 20,000 x g에서 원심분리하였다. 상청액을 물로 1:1 희석한 후, 4배 부피의 아세톤으로 단백질을 침전시켰다. 단백질 펠렛을 80% 아세톤으로 세척하고 10% 트리플루오로에탄올 및 100 mM 트리스(pH 8.0)에 재현탁하였다. 단백질을 BCA로 정량하였고 50 ㎍을 37℃에서 2시간 동안 1 ㎍ LysC(Wako Chemicals)로 분해한 후, 37℃에서 16시간 동안 1 ㎍ 트립신(Sigma)으로 분해하였다. 분해물을 4배 부피의 0.5% 트리플루오로아세트산(TFA)으로 희석하고 POROS 올리고 R2/R3 역상 입자(20 ㎛, ThermoFisher Scientific)로 팩킹된 C18 마이크로컬럼으로 탈염시켰다. 펩타이드를 50% 아세토니트릴 및 0.1% TFA로 용출하고 진공 원심분리로 건조하였다. 펩타이드를 쿠비트(Qubit) 형광으로 정량하였고 LC-MS/MS에 의한 직접적인 분석을 위해 1 ㎍ 분취물을 회수하였다. 각각의 hCO 샘플(총 30 ㎍)로부터 펩타이드의 제2 분취물을 회수하였고 분획화를 위해 모았다. 아질런트(Agilent) 1200 HPLC를 이용하여 모아진 hCO 및 심근 조직으로부터의 펩타이드를 320 ㎛ x 30 cm 내부 팩킹된 C18 μHPLC(3 ㎛ BEH, Waters)에서 분획화하였다. 구배는 수집된 후 LC-MS/MS에 의한 분석을 위해 12개의 분획으로 연쇄적으로 이어지는 2분 분획들을 사용하는 60분에 걸친 0-40% 완충제 B이었다(완충제 A = 10 mM 중탄산암모늄 pH 7.9, 완충제 B = 90% 아세토니트릴).
LC-MS/MS 및 데이터 분석
툰(Tune) v2.4.1824를 갖춘 Q-이그잭티브 플러스(Exactive Plus)에 커플링된 디오넥스(Dionex) 3500RS에서 양성 극성 모드로 펩타이드를 분석하였다. 55℃에서 250 nl/분의 속도로 120분에 걸쳐 0.1% FA를 함유하는 2-30% 아세토니트릴의 구배와 함께 내부 팩킹된 75 ㎛ x 50 cm 풀링된 컬럼(1.9 ㎛ 입자 크기, C18AQ; Dr Maisch)을 이용하여 펩타이드를 분리하였다. 300-1500 m/z(70,000 해상도, 3e6 AGC, 100 ms 주입 시간)로부터 MS1 스캔을 획득한 후, HCD(17,500 해상도, 1e5 AGC, 60 ms 주입 시간, 27 NCE, 1.2 m/z 단리 폭)로 가장 강한 20개 이온의 MS/MS 데이터 의존적 획득을 달성하였다. 펩타이드 분광 일치 및 1%로 설정된 단백질 거짓 발견율(FDR)과 함께 모든 디폴트 설정을 이용하여 맥스쿠안트(MaxQuant) v1.5.3.30(64)의 안드로메다(Andromeda)(63)로 인간 유니프롯(UniProt) 데이터베이스(2016년 1월)에 대해 미가공 데이터를 검색하였다. hCO의 단일-샷 반복시료(replicate)들이 모아진 분획화된 샘플에 일치되는 "실행들 사이의 일치" 옵션을 포함하는 표지 부재 정량(65)을 가능하게 하였다. 통계학적 분석은 퍼시우스(Perseus)(66)에서 수행되었고 벤자미니-호크베르그(Benjamini-Hochberg ) FDR을 이용한 다중 검정을 위해 보정된 2-샘플 t-검정을 포함하였다. 모든 생물학적 반복시료들에서 정량된 단백질만이 최종 분석에 포함되었고 q<0.05를 기준으로 유의성을 계산하였다.
생물정보학
EdgeR(v3.2.4)(67)로부터 출력된, 표준화된 log2 변환된 백 만당 카운트 데이터를 사용하는 Matlab R2013a(Mathworks)를 이용하여 주성분 분석(PCA)을 수행하였다. PCA는 1년 또는 20일 동안 배양된 hPSC-CM, 및 성인 및 태아 인간 심장 조직의 RNA-seq를 포함하였다(25). 유전자 발현 옴니버스(GSE62913)로부터 이 100개 염기쌍 페어링-말단 판독 데이터를 수득하였고, 페어링-말단 시퀀싱 설정을 이용하여 트리모매틱(61) 및 STAR(62)를 실행하였다는 점을 제외하고 전술된 바와 같이 분석하였다. DAVID(68) 및 히트-맵을 이용하여 유전자 존재론적 분석을 수행하였고, GENE-E(Broad Institute)를 이용하여 계층 클러스터링을 수행하였다.
qPCR
수퍼스크립트(Superscript) III(무작위 프라이머)를 사용하여 cDNA를 역전사하였고, 어플라이드 바이오시스템스 스텝 온 플러스(Applied Biosystems Step One Plus)에서 SYBR 마스터믹스(Mastermix)(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 qPCR을 수행하였다. 18S를 내생성 대조군으로서 사용하여 유전자 발현 변화를 확인하기 위해 2-ΔΔCt 방법을 이용하였다. 프라이머 서열은 표 2에 나열되어 있고 200 nM로 사용되었다.
투과 전자 현미경관찰
종래 기재된 바와 같이(69) 전자 현미경관찰을 위해 샘플을 프로세싱하였다. Jeol1011 투과 전자 현미경에서 박편을 염색되지 않은 상태로 분석하였다.
대사물질 추출
세포 대사물질을 추출하기 위해, (9일 동안) CTRL 배지 또는 MM에서 배양된 hCO에 대해 hCO를 각각 n = 12 또는 14로 모았다. hCO를 3 ㎖의 빙냉 0.9% NaCl로 3회 세척하였고, 10분에 걸쳐 다회 볼텍싱하면서 1 ㎖의 빙냉 50% 수성 아세토니트릴을 사용하여 대사물질을 추출하였다(70). 샘플을 프로세싱 및 분석까지 -80℃에서 급속 냉동시켰다. 추출 용액은 HPLC-MS/MS 분석을 위해 추출 효율을 모니터링하기 위한 내부 표준물로서 샘플당 50 nM 아지도타이미딘을 함유하였다.
중심 탄소 대사물질 분석
다음과 같이 변형된, 문헌(71)에 기재된 방법에 따라 중심 탄소 대사(CCM)의 중간체를 분석하였다: 존재도가 낮은 대사물질을 검출할 확률을 향상시키고 매우 풍부한 대사물질을 범위 내로 희석하기 위해 샘플 추출물을 2개의 농도에서 분석하였다. 따라서, V-AQ 프로그램을 이용하여 가열하지 않으면서(즉, 실온에서) 약 60분 동안 진공 원심분리기(Eppendorf Concentrator Plus, Eppendorf)에서 200 ㎕의 샘플 추출물을 건조하였다. 샘플을 50 ㎕의 95:5 물:아세토니트릴에 재현탁하여 4배 농축된 샘플을 제공하였고, 5 ㎕의 이 샘플을 새로운 바이알로 옮기고 95 ㎕의 95:5 물:아세토니트릴로 희석하여 원래의 추출물의 효과적인 5배 희석을 제공하였다. 샘플을 종래 기재된 바와 같이(71) HPLC-MS/MS 시스템에 주입함으로써 CCM 분석용 HPLC 바이알로 옮겼다.
해마 대사 프로파일링
해마 XF24 세포외 유동 생물분석기(Seahorse Bioscience)에서 세포 생물에너지[산소 소비율(OCR) 및 세포외 산성화율(ECAR]을 포함함]를 측정하였다. 요약하건대, hCO를 글루코스(5.5 mM, Sigma), 피루브산나트륨(1.0 mM, ThermoFisher Scientific) 및 GlutaMAX(2.0 mM, ThermoFisher Scientific)로 보충된 비완충된 어세이 배지(pH=7.4, Seahorse Bioscience)로 세척하였다. 2회 세척 후, 6개 내지 8개의 hCO를 24웰 XF24 세포 배양 마이크로플레이트(Seahorse Bioscience) 내에 시딩하였다(어세이 배지). 비완충된 어세이 배지만을 함유하는 8개의 웰을 배경 대조군으로서 사용하였다. 종래 기재된 바와 같이(72), 올리고마이신(2 μM), FCCP(1.5 μM), 에토목시르(4 μM) 및 로테논(rotenone)/안티마이신(antimycin) A(2 μM)의 연속 투여를 이용하여 미토콘드리아 스트레스 시험 동안 미토콘드리아 및 해당작용 생물에너지의 구체적인 양태를 분석하였다.
미토겐 스크리닝
신생아 래트 심근세포를 위해, 소분자/성장 인자를 CTRL 배지에 첨가하고 24시간 또는 48시간 동안 세포에게 제공하였다: DMSO(Sigma), CHIR99021 및 NRG-1(RnD Systems). 형질감염 실험을 위해, 500 ㎕/24웰 OptiMEM 중의 리포펙타민(Lipofectamine) RNAiMax(3 ㎕/24웰)를 사용하여 8시간 동안 세포를 형질감염시킨 후, 배지를 CTRL 배지로 교체하였다. 스크램블(scramble) miR 대조군(모두 스타스(Stars) 음성 대조군, Qiagen), miR 모방물질 hsa-miR-199a-3p(Qiagen) 또는 miR 모방물질 hsa-miR-590-3p(Qiagen)를 50 nM로 사용하여 세포를 형질감염시켰다. 항시적 활성 Yap1의 과다발현을 위해, 뮤린 Yap1의 돌연변이된 버전을 함유하는 아데노바이러스인 CMV-YAP(S112A)를 사용하여 CTRL 배지에서 세포를 10의 MOI로 감염시켰다.
hCO를 처리 전에 CTRL 배지 내의 심장 동력계에 시딩한 후 6일 동안 배양하였다. 소분자를 첨가하였고 48시간 동안 세포에게 제공하였다: DMSO, CHIR99021 및 NRG-1. 형질감염 실험을 위해, 150 ㎕/hCO OptiMEM 중의 리포펙타민 RNAiMax(3 ㎕/hCO)를 사용하여 세포를 4시간 동안 형질감염시킨 후, 배지를 CTRL 배지로 교체하였다. 스크램블 miR 대조군, miR 모방물질 hsa-miR-199a-3p 또는 miR 모방물질 hsa-miR-590-3p를 50 nM로 사용하여 세포를 형질감염시켰다. 항시적 활성 YAP1의 과다발현을 위해, 인간 YAP1의 돌연변이된 버전을 함유하는 AAV6인 CMV-YAP(S127A) (Vector Biolabs)를 1.25-2.5 x 1010 vg/hCO로 사용하여 hCO를 감염시켰다. 항시적 활성 β-카테닌의 과다발현을 위해, 아미노산 2-90을 갖지 않은 인간 CTNNB1의 돌연변이된 버전을 함유하는 AAV6인 AAV6-ΔN90βCAT(Vector Biolabs)를 1.25-2.5 x 1010 vg/hCO로 사용하여 hCO를 감염시켰다. 대조군 AAV6-MCS 또는 AAV6-GFP(Vector Biolabs) 대조군을 이 실험들에서 동일한 역가로 사용하였다.
정량 및 통계학적 분석
재현성을 보장하기 위해 다수의 실험에서 조건당 다수의 hCO를 사용하여 모든 핵심 hCO 실험들을 수행하였다. 다수의 군들이 분석되는 스크리닝 또는 실험의 경우, 결과가 상이한 실험들에 걸쳐 조건 비교의 인공물이 아니라는 것을 보장하기 위해 대조군을 비롯한 모든 군들이 각각의 실험에 존재하였다.
달리 언급되어 있지 않은 한, 데이터는 평균 ± 표준오차로서 제공된다. 마이크로소프트 엑셀(Microsoft) 또는 그래프패드 프리즘 6(Graphpad Software Inc)을 이용하여 통계자료를 분석하였다. 샘플 수, 실험 반복 횟수, 통계학적 분석 및 p-값이 각각의 도면 범례에 보고되어 있다.
데이터-세트 입수가능성
RNA-seq 데이터는 GSE93841로서 GEO에 기탁되었고, CTRL 배지 대 MM hCO 단백질체학 데이터는 PXD005736 하에서 PRIDE에 기탁되었다.
결과
심장 동력계: 소형화된 96웰 인간 심장 오가노이드 스크리닝 플랫폼
조밀한 근육 다발을 포함하는 심장 오가노이드의 자동화된 형성 및 분석을 용이하게 하기 위해, 본 발명자들은 SU-8 포토리쏘그래피 및 폴리디메틸실록산(PDMS) 주조를 이용하여, 배양 삽입체를 함유하는 96웰 플레이트를 제작하였다(도 1a). 본 발명자들은 50,000개의 심장 세포를 함유하는 3.5 ㎕ 부피가 2일에 걸쳐 2개의 탄성 장대 주위에 자동적으로 농축되어, 길이가 1 mm인 hCO를 형성하도록 타원형 기하학적 구조를 디자인하였다(도 1b, 도 2a). hPSC 유래의 심장 세포는 약 70% α-액티닌+/CTNT+ hPSC-CM으로 구성되고, 나머지는 주로 CD90+ 기질 세포이다(13). hPSC-CM 대 기질 세포의 이 비는 기능성 hCO를 형성하는 데 필수적이고 최적이다(13, 14). 상기 탄성 장대는 기능을 향상시키는 데 요구되는, hCO의 수축에 대한 기계적 저항성을 제공한다(15). 이 디자인은 상기 장대의 이동을 추적함으로써 수축력도 대략적으로 측정될 수 있게 하고(도 1c), 본 발명자들은 힘 변환기를 이용하여 이를 검증하였다. 추가로, 고속(초당 50 프레임)으로 각각의 웰로부터 각각의 hCO의 10초 비디오를 포착하도록 주문제작-디자인된 고성능 영상화 시스템을 개발하였다. 그 후, 주문제작-작성된 Matlab 프로그램을 이용하여 비디오 파일을 일괄 분석함으로써, 각각의 hCO에 대한 힘 추적기록 및 수축 데이터를 생성하였다(도 1d). 본 발명자들은 수축력을 변경시키고(도 2b) 이완 시간을 연장시키는(도 2c) 자극에 대한 hCO 반응을 평가함으로써 본 발명자들의 3D 조직 배양 및 수축 분석 파이프라인도 검증하였다. 중요하게는, 심장 동력계는 병원에 입고되었으나 나중에 부정맥유발성 부작용으로 인해 회수된, hERG 독성을 가진 화합물(시사프라이드)을 비롯한 공지된 약리학적 물질에 대한 생리학적 반응을 예측할 수 있었다(도 2c).
수축력의 반자동화된 분석 이외에, 본 발명자들은 고성능 영상 분석과 조합된 전조직-표본고정 면역염색을 이용하여 상이한 마커의 발현에 대한 hCO의 후-분석 프로토콜도 개발하였다(도 1e). 본 발명자들은 CHIR99021(16)을 사용한 GSK3 억제의 전구증식 효과를 검출하기 위해 α-액티닌 및 Ki-67 염색을 이용하여 이 방법을 검증하였다(도 2d). 이 초기 연구는 만성 자극을 용이하게 하는 고속대량 고성능 스크리닝 플랫폼으로서 뿐만 아니라 수축성 및 마커 발현의 분석으로서 심장 동력계를 검증하였다.
hCO 성숙을 위한 최적 대사 기질에 대한 스크리닝
다음으로, 본 발명자들은 대사를 해당작용으로부터 지방산 산화로 전환시키는 것이 hCO 성숙을 유도할 수 있는 지를 확인하였다. 본 발명자들은 무혈청 배지에서 심장 성숙에 대한 글루코스와 팔미테이트 사이의 완전 요인 상호작용을 스크리닝하였다. 본 발명자들은 팔미테이트가 모든 장쇄 유리 지방산들의 36%를 차지하는, 신생아 기간 동안 순환하는 가장 풍부한 지방산들 중 하나이기 때문에 지방산 기질로서 팔미테이트를 사용하는 것을 선택하였다(17). 3종의 주요 판독결과를 통해 심장 성숙을 평가하였다: 심장 기능(수축력에 의해 평가됨), 미성숙의 마커로서 hPSC-CM 증식(Ki-67 발현에 의해 평가됨) 및 성숙 마커로서 심실 미오신 경쇄 2(MLC2v)의 발현(18).
hCO 수축력은 무혈청 조건 하에서 10 μM 및 100 μM 팔미테이트를 첨가함에 따라 증가하는 경향을 보였다(각각의 팔미테이트 농도에 대해 모든 글루코스 농도를 모음, 0 μM 팔미테이트에 비해 각각 p=0.007 및 p=0.07). 가장 큰 힘은 1 mM 글루코스 및 10 μM 또는 100 μM 팔미테이트를 함유하는 배지 내에서 생성되었다(도 1f). 동시에, MLC2v 발현도 팔미테이트를 첨가함에 따라 증가하였다(도 1g). 10 μM 팔미테이트를 가진 1 mM 글루코스에서 배양된 hCO 이외에 100 μM 팔미테이트에서 배양된 모든 hCO들이 무혈청 대조군(팔미테이트를 갖지 않은 5.5 mM 글루코스)에 비해 증가된 MLC2v 발현을 가졌다. 이 무혈청 조건이 세포 생존율에 대한 임의의 유해한 효과를 갖는 지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 락테이트 탈수소화효소 및 심장 트로포닌 I에 대한 ELISA를 수행하였고 이들의 수준이 팔미테이트의 첨가에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 발견하였는데, 이 결과는 hCO에서 본 발명자들의 무혈청 배양 조건이 세포 사멸을 명백히 야기하지 않았다는 것을 시사한다(도 2e,f). 생존 및 기능을 개선하기 위해 대다수의 무혈청 배지 보충제들에서 통상적으로 사용되는 인슐린의 존재 하에서 초기 글루코스-팔미테이트 스크리닝을 수행하였다. 그러나, 인슐린이 해당작용을 유도하고 PI3K/GSK3 신호전달에 대한 그의 작용을 통해 증식을 잠재적으로 촉진할 수 있기 때문에(19), 인슐린은 심근세포 성숙도 방해할 수 있다. 본 발명자들은 인슐린이 무혈청 조건(1 mM 글루코스 및 10 μM 팔미테이트) 하에서 hPSC-CM 증식을 유도한다는 것을 발견하였다(도 1h). 인슐린의 제거가 세포 주기 활성을 감소시켰을지라도, 이 조건은 1 mM 글루코스 및 10 μM 팔미테이트를 사용하는 무혈청 조건 하에서 세포 대사에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있었다. 따라서, 다음으로 본 발명자들은 인슐린의 부재 하에서 글루코스와 팔미테이트 사이의 완전-요인 상호작용을 스크리닝하였다. 본 발명자들은 팔미테이트의 존재 하에서 힘의 증가도 관찰하였는데, 이때 유의미하게 더 큰 힘은 다양한 농도의 글루코스(0.5, 1 및 5.5 mM 글루코스; 도 1i)의 존재 하에서 조차도 100 μM 팔미테이트에서 배양된 조직 내에서 생성되었다. 팔미테이트는 MLC2v 발현을 증가시키는 경향을 다시 한 번 촉진하였다(도 1j). 무혈청 배지(100 μM 팔미테이트를 가진 1 mM 글루코스, 및 인슐린 부재)에서의 hCO의 배양도 CTRL 배지에서 수득된 결과에 비해 세포 주기 활성을 4배 감소시켰다(도 1k). 이 조건들은 다수의 hPSC 세포주들로부터 유래한 hCO의 강력한 생성 및 배양을 가능하게 하였고, 이때 생존 가능하고 온전한 기능성 조직이 90% 초과의 생존율로 생성되었다(도 1l). 그 후, 본 발명자들은 이 배지를 '성숙 배지'(MM)로서 지칭하였고 이 성숙 프로토콜을 이용하여 hCO의 광범위한 표현형 분석을 수행하였다(도 1m).
MM은 hCO에서 세포 조성을 변경시키지 않는다.
Ki-67의 감소와 일치하여, 본 발명자들은 MM에서 배양된 hCO가 DNA 강도 분석에 기반을 둘 때 CTRL 배지에 비해 감소된 수의 세포를 가진다는 것을 발견하였다(도 3a). hCO를 해리시킨 후, 본 발명자들은 CTRL 배지 및 MM 조건 둘 다 하에서 유사한 백분율의 hPSC-CM(α-액티닌)이 존재한다는 것을 확인하였다(도 3b,c). 본 발명자들은 MM에서 배양된 CD90+ 세포의 작지만 유의미한 감소도 발견하였다(13% CTRL 대 10% MM, p < 0.05)(도 3d). 추가로, 본 발명자들은 전조직 표본고정 면역염색을 이용하여 hCO 내에서 다수의 심장 세포 집단들을 조사하였고, hPSC-CM(α-액티닌 또는 MLC2v), 기질 세포(CD90), 튜브로 조립된 내피 세포(CD31) 및 심외막 세포(WT-1)가 CTRL 배지 또는 MM에서 배양된 조직에 모두 존재한다는 것을 발견하였다(도 3e,f). 더 큰 조직 포맷, 예컨대, 본 발명자들의 최근 공개문헌(13)과 대조적으로, 이것은 내피 구조물이 본 발명자들의 조밀한 소형화된 hCO 포맷에서 더 잘 지지된다는 것을 암시한다.
MM은 hCO에서 hPSC-CM 기능을 더 향상시키지 않는다.
본 발명자들은 CTRL 배지 및 MM 둘 다에서 배양된 hCO의 수축성을 상세히 분석하였다. 본 발명자들은 MM에서 배양된 hCO가 CTRL 배지에서 배양된 hCO에 비해 유사한 수축력을 갖되, 감소된 활성화 시간(Ta) 및 감소된 이완 시간(Tr)을 가진다는 것을 확인하였는데(도 4a), 이것은 인간 심근세포 발생 동안 기능적 성숙 동안 일어나는 변화를 반영한다(20). 이 발견을 확인하기 위해, 본 발명자들은 2종의 추가 세포주인 hESC 세포주 H9 및 상업적으로 입수될 수 있는 인간 유도 다능성 줄기 세포주(hiPSC)로부터 유래한 hCO의 수축 동력학도 프로파일링하였다. HES3 유래의 hCO 및 hiPSC 유래의 hCO 둘 다가 CTRL 배지에 비해 MM에서 증가된 수축률 및 감소된 Ta를 나타내었다. 그러나, H9 유래의 hCO는 CTRL 배지에 비해 MM에서 증가된 수축률 또는 Ta를 갖지 않았다(도 5a). 이것은 Ta의 변화가 속도 의존적이라는 것을 표시한다. 대조적으로, 시험된 모든 세포주들은 속도와 관계없이 CTRL 배지에서 배양된 세포주에 비해 MM에서 감소된 Tr을 가졌다(도 4a, 도 5a). ECM 생성이 심장 질환을 가진 환자에서 증가된 이완 시간과도 상관관계를 갖기 때문에(21), 이것은 내생성 ECM 합성의 감소에 기인할 수 있다(도 6f,g).
본 발명자들은 CTRL 배지 및 MM 둘 다에서 배양된 hCO에서 이소프레날린에 대한 변시성 및 변력성 반응도 평가하였다. 이소프레날린은 두 배지들에서 수축률을 증가시켰다(도 4b). 그러나, 이소프레날린만이 MM에서 배양된 hCO에서 수축력의 증가를 유도하였는데(도 4c), 이 결과는 시험된 배양 조건 하에서 큰 수축성 비축을 시사한다. 본 발명자들은 MM에서 배양된 hCO가 수축력을 위해 CTRL 배지에서 배양된 hCO(0.3 mM Ca2+)보다 더 높은 칼슘 EC50(1.0 mM Ca2+)을 가진다는 것을 확인하였다(도 4d). 이소프레날린 반응은 수축성 비축에 의존하기 때문에(22), 낮은 칼슘 EC50은 1.8 mM Ca2+을 함유하는 본 발명자들의 hCO 배양 조건 하에서 무딘 이소프레날린-유도된 변력성 반응을 야기할 수 있다. 이를 조사하기 위해, 본 발명자들은 CTRL 배지(0.3 mM) 및 MM(1.0 mM) hCO에 대한 칼슘 EC50에서 고도로 조절된 보행 조건(1 Hz) 하에서 이소프레날린의 효과를 평가하였다. 이 조건들 하에서, CTRL 배지 및 MM 둘 다가 유사한 수축력 증가 및 감소된 50% 수축 시간을 가졌다(도 4e). MM에서 배양된 hCO에서 증가된 칼슘 EC50은 성인 심장 근육을 향한 성숙을 표시한다(EC50 = 성인에서 2.6 - 6.0 mM(23)).
1 Hz 보행(37℃) 시 hCO로부터 해리된 단일 세포에 대한 Fluo-4 AM 칼슘 영상화를 이용하여 수축 동안 칼슘 동력학도 평가하였다. 기준물인 SP hPSC-CM, 및 CTRL 배지 및 MM 내의 hCO로부터 해리된 hPSC-CM으로부터 단일 세포 칼슘 기록을 수득하였다(도 5b). 이 실험들은 SP에 비해 hCO에서 증가된 피크 진폭, 상승하는 기울기 및 붕괴가 있다는 것을 보여주었는데; 이것은 더 성숙한 칼슘 취급 시스템을 표시하나, 상이한 배지에서 배양된 hCO들 사이의 차이는 관찰되지 않았다(도 4f). CTRL hCO와 MM hCO 사이의 칼슘 취급 동력학의 차이의 결여(도 4f)도 MM에서 배양된 hCO에서의 감소된 수축 Tr이 hPSC-CM 칼슘 취급 성질의 변화보다는 오히려 감소된 ECM 생성에 기인한다는 개념을 뒷받침한다.
다음으로, 본 발명자들은 CTRL 배지 또는 MM에서 배양된 hCO, 및 기준물인 SP hPSC-CM으로부터 해리된 단일 세포로부터의 전체 세포 패치-클램프 기록을 이용하여 hPSC-CM의 전기생리학적 성질을 확인하였다. 본 발명자들은 CTRL 배지 및 MM 둘 다에서 hCO로부터의 hPSC-CM의 활동 전위 프로파일이 성인 심실 심근세포의 활동 전위 프로파일과 유사한다는 것을 발견하였다(도 4g, 도 5c에서 정량된 심실 hPSC-CM). 그러나, 본 발명자들은 CTRL 배지 또는 MM hCO로부터 유래한 hPSC-CM들 사이의 차이가 없음을 발견하였다(도 4g). hCO로부터 해리된 hPSC-CM의 휴면 막 전위가 상대적으로 탈분극화되었기 때문에(도 4g), 본 발명자들은 꽂는 전극을 이용하여 제자리에서 hCO의 전기생리학적 파라미터도 기록하였다(도 5d). 이 방법을 이용하여, 본 발명자들은 제자리에서 hPSC-CM이 대략 -60 mV의 휴면 막 전위를 가진다는 것을 확인하였다(도 5d). 효소에 의해 해리된 hPSC-CM에 대해 수행된 초기 패치-클램프 실험에서 탈분극화된 막 전위(도 4g)는 아마도 해리 과정에 의해 야기되었을 것이다. 중요하게는, 제자리에서 꽂는 전극을 이용한 활동 전위 기록도 CTRL 배지 및 MM 둘 다에서 hCO 내의 hPSC-CM이 성인 유사 심실 활동 전위를 가진다는 것을 확인시켜주었다(도 5d). 종합하건대, 이 결과들은 종래 보고된 바와 같이(10, 14) 조직-조작된 배양 환경이 생체내 유사 기능적 성숙의 발생을 뒷받침한다는 것을 암시한다.
MM은 hCO 배양에 의해 뒷받침된 구조적 조직화를 더 향상시키지 않는다.
MM의 다른 근절 관련 변화가 있는 지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 hCO 내의 hPSC-CM의 구조적 조직화를 프로파일링하였다. 투과 전자 현미경관찰(TEM)을 이용하여 CTRL 및 MM 둘 다에서 hCO 내의 분명한 Z-밴드 및 I-밴드의 존재를 확인하였다(도 7a). 이것은 고도로 조직화된 발현 패턴을 보여주는 MLC2V 및 α-액티닌 염색을 이용함으로써 확인되었고, 이때 CTRL 배지 또는 MM에서 배양된 hCO에서 α-액티닌은 Z-밴드에 위치하였고, MLC2V는 I-밴드 및 A-밴드에 위치하였다(도 7b). 티틴 및 α-액티닌 염색도 Z-밴드에서의 α-액티닌 발현, 및 I-밴드 및 A-밴드에서의 티틴 발현의 명확한 윤곽을 보여주었다(도 7c). 근절 길이는 상기 두 배지에서 약 2.3 ㎛이었는데(도 7d), 이 결과는 미성숙 심근세포보다 오히려 성숙 심근세포와 일치한다(24). 본 발명자들은 TEM을 이용하여 근절에 인접한 잘 발생된 미토콘드리아(도 7e) 및 t-튜불(도 7f)도 관찰하였다. 본 발명자들은 카베올린(caveolin)-3 면역염색을 이용하여 t-튜불의 존재를 확인하였다(도 7g).
본 발명자들은 TEM을 이용하여 고도로 조직화된 개재판(도 7h)도 존재한다는 것을 발견하였고, 본 발명자들은 범-캐드헤린(도 7i) 및 코넥신 43 염색(도 7j)을 이용하여 세포-세포 연접의 형성을 확인하였다. 종합하건대, 이 결과들도 종래 보고된 바와 같이(10, 14) 조직-조작된 배양 환경이 생체내 유사 구조물의 발생을 뒷받침한다는 것을 암시한다.
MM은 심장 발생 인자, 대사 및 세포 주기의 향상된 성숙을 유도한다.
hCO에 대한 MM의 효과의 더 넓은 시야를 얻기 위해, 본 발명자들은 다음으로 CTRL 배지 또는 MM에서 배양된 hCO, 및 상업적으로 입수될 수 있는 성인 심장 샘플(3명의 모아진 남성 심장, 30세 내지 39세)에 대한 RNA-seq를 수행하였다. 다른 계통으로부터의 오염 세포 유형은 hCO에 거의 존재하지 않았는데, 이때 잠재적 오염 계통에 대한 대다수의 마커들은 hCO 및 성인 심장 조직에서 유사한 수준으로 발현되었다(도 8a). 본 발명자들이 심장에서 가장 두드러진 세포 유형의 마커를 조사하였을 때, 본 발명자들은 본 발명자들의 프로토콜이 hPSC-CM, 심외막 세포 및 섬유모세포성 세포를 생성한다는 것을 발견하였는데, 이때 이 계통들에 대한 유사한 존재도의 전사체가 hCO 및 성인 심장 조직에 존재하였다(도 8b). 내피 전사체도 존재하였으나, 보다 낮은 존재도로 존재하였고, 백혈구 전사체는 성인 심장 조직에 비해 hCO에서 낮았거나 부재하였다(도 8b). 이 결과들은 본 발명자들의 유세포분석 및 면역염색(도 3)과 일치한다.
주성분 분석(PCA)을 수행하여 본 발명자들의 샘플들 사이의 차이를 확인하였다. 이 분석을 위해, 본 발명자들은 20일령 hPSC-CM 및 1년령 hPSC-CM, 인간 태아 심실 및 성인 심장을 포함하는 추가 공개적으로 입수될 수 있는 기준 데이터(GSE62913)도 포함시켰다. 본 발명자들이 모든 전사체들(> 백 만당 10 카운트)을 사용하였을 때, 본 발명자들은 hCO가 다른 샘플들과 상이하게 밀집된다는 것을 발견하였는데, 이 결과는 실험들 사이의 우수한 재현 가능성을 시사한다(도 8c). 그러나, 상이한 세포 집단들의 영향에 기인할 가능성이 가장 높은, 함께 밀집된 2개의 조건들은 각각의 상이한 샘플에 존재하지 않는다(즉, 문헌(Kuppusamy et al.)(25)으로부터의 hPSC-CM 샘플은 순수한 반면, 본 발명자들의 hCO 샘플 및 심장 조직은 다수의 세포 유형을 함유한다). 실제로, hCO는 보다 더 적은 내피 세포를 갖고 천연 심장 조직에 풍부한 백혈구를 결여한다(도 8b)(26). 이 개념을 뒷받침하여, MM에서 배양된 hCO에 비해 성인 심장 조직에서 더 많이 발현된 상위 1000개의 유전자들에 대한 상위 25 유전자 존재론(GO)-항은 주로 면역 과정과 관련되어 있었다(도 8d). 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 심근세포에서 발현된 전사체에 대한 PCA를 수행함으로써 본 발명자들의 hCO의 발생 단계를 프로파일링하기 위해 문헌(Delaughter et al.)(27)의 방법과 유사한 방법을 이용하였다(문헌(27)의 표 S6, 795개의 전사체 > 백 만당 10 카운트). 본 발명자들은 이 방법을 이용하여 CTRL 배지 및 MM 조건 둘 다로부터의 hCO, 1년령 hPSC-CM 및 인간 태아 심실이 PC1에 밀집되었고 20일령 hPSC-CM보다 더 성숙하다는 것을 발견하였는데(도 6a), 이 발견은 문헌(Delaughter et al.)(27)에서 제공된 성숙 프로파일링과 일치하였다. PCA에 의해 강조된 이 차이에도 불구하고, 본 발명자들은 RNA-seq 데이터를 기반으로 MM에서 배양된 hCO가 성인 심장 조직과 높은 상관관계를 가진다는 것을 확인하였다(도 6b). 본 발명자들은 CTRL 배지 또는 MM에서 배양된 hCO 및 성인 심장 조직에 대한 단백질체학도 수행하였고, 단백질체학 데이터를 기반으로 MM에서 배양된 hCO도 성인 심장 조직과 매우 유사하다는 것을 발견하였다(도 6c).
본 발명자들은 CTRL 배지 또는 MM에서 hCO들 사이에 차등적으로 조절된 3856개의 전사체들 및 855개의 단백질들을 확인하였다(각각 FDR < 0.05 및 q-값 < 0.05; 도 8e,f). 본 발명자들은 차등적으로 발현된 유전자(도 6d) 또는 단백질(도 6e)을 사용하여 RNA-seq(도 6f) 및 단백질체학 데이터 세트(도 6g)에 대해 독립적으로 GO-항 분석을 수행하였다. 두 경우에서, 해당작용, 세포외 매트릭스 조직화 및 액틴 세포골격 조직화의 감소가 MM에서 배양된 hCO에서 확인되었다(도 6f,g). 2개의 데이터 세트들 사이에 일관되게 향상된 과정은 RNA 프로세싱/RNA 대사 과정의 조절 및 전사/염색체 조직화의 조절을 포함하였다(도 6f,g). 흥미롭게도, "산화-환원", "지방산 산화" 및 "DNA 손상 자극에 대한 세포 반응"만이 단백질체학 데이터 세트에서 상향조절되었다(도 6f,g). 이 생물학적 과정들은 생체내 심근세포의 포유동물 출생 후 성숙을 잘 표시하는데(5, 28, 29), 이것은 전사체학 이외에 단백질체학 분석 수행의 중요성을 추가로 강조한다. 출생 후 성숙과 일치하여, GO-항 "세포 주기 조절"은 특히 RNA-seq 데이터 세트에서 MM에 의해 감소되었는데, 이것은 아마도 CTRL 배지에서 조차도 세포 주기에 관여하는 낮은 존재도의 단백질에 기인하였을 것이다(도 6f,g). GO-항 "심장 발생"도 RNA-seq 데이터 세트에서 MM에서 배양된 hCO에서 상향조절되었고(도 6f), 이 GO-항에서 심장 성숙에 관여하는 핵심 인자들(MYH7, IRX4 및 MYBPC3)도 단백질체학 분석에서 상향조절되었다(도 6h,i). MYH7은 인간 심장 성숙 동안 증가하는 것으로 공지되어 있고(30), IRX4 핵 전위는 출생 후 심장 성숙 동안 증가하고(31) 심장 기능을 유지하는 데 매우 중요하고(32), 심근세포는 MYBPC3 넉아웃 마우스에서 출생 후 세포 주기 정지 전에 추가 라운드의 분열을 겪는다(33). 본 발명자들은 qPCR을 이용하여 성숙 동안 전환/증가하는 것으로 공지된 근절 이소폼(isoform)(24), 예컨대, TTN N2B, MYH7/6 및 TNNI3/1이 MM에서 배양된 hCO에서 증가하였다는 것도 입증하였다(도 8g). 종합하건대, 이 결과들은 MM에서 배양된 hCO가 심장 발생 인자의 유도, 대사 전환, DNA 손상 및 세포 주기 활성의 감소를 포함하는 다수의 출생 후 성숙 과정들을 겪는다는 것을 입증한다. 그러나, 본 발명자들의 발견은 MM에서의 hCO 배양이 특히 이 과정들을 성숙시키는 반면, 성숙과 관련된 다른 구조적 및 기능적 성질이 MM에서의 배양에 의해 더 향상되지 않는다는 것도 강조한다(도 4, 5, 6 및 7에서 확인된 바와 같음).
MM은 해당작용으로부터 지방산 산화로의 대사 전환을 유도한다.
본 발명자들의 RNA-seq 및 단백질체학 분석(도 6)은 MM에서의 hCO 배양이 많은 해당작용 성분들을 억제하고 hCO에서 많은 지방산 산화 성분들을 활성화시킨다는 것을 보여주었다(도 9). 다음으로, 본 발명자들은 에토목시르를 사용하여 내생성 지방산 산화를 측정하기 위해 추가 단계를 가진 해마 XF 생물분석기 미토콘드리아 스트레스 시험을 이용하여 hCO의 대사를 프로파일링하였다(도 10a). 지방산 산화로의 전환을 뒷받침하여, MM으로부터의 hCO는 해마 시험 조건 하에서 보다 높은 최대 OCR(도 10b), OCR 비축(도 10c) 및 증가된 지방산 산화(도 10d)를 가졌다. 산화 능력의 이 변화는 미토콘드리아 함량(mtDNA)의 증가와 관련되어 있었다(도 10e). 카보닐 시아나이드-4(트리플루오로메톡시)페닐하이드라존(FCCP)을 사용한 ATP 언커플링이 글루코스의 부재 하에서 조차도 성숙 심근세포에서 세포외 산성화율(ECAR)의 큰 증가를 유발할 수 있기 때문에(34), 본 발명자들은 CTRL 배지 및 MM 조건 하에서 hCO에서의 해당작용 및 분지화 경로 대사 유동을 더 프로파일링하기 위해 대사체학을 이용하기로 선택하였다. 해당작용 경로뿐만 아니라, 헥소사민, 펜토스 포스페이트 및 글리코겐 경로를 포함하는, 해당작용 경로로부터 분지된 경로들의 대사물질은 CTRL 배지에 비해 MM에서 모두 감소되었다(도 10f). 종합하건대, 본 발명자들의 RNA-seq, 단백질체학, 해마 데이터 및 대사체학은 해당작용으로부터 지방산 산화로의 대사 전환을 확인시켜준다.
MM은 세포 주기를 억제하고 β-카테닌의 억제 및 DNA 손상 반응(DDR)의 유도와 관련되어 있다.
본 발명자들은 먼저 MM이 다수의 hPSC 세포주들에서 Ki-67 강도의 감소를 유도한다는 것을 확인하였다(H9 및 hiPSC, 도 12a,b). 추가로, 본 발명자들은 고해상 공초점 현미경관찰 염색 및 hPSC-CM 세포 주기 활성의 정량을 이용하여 본 발명자들의 초기 전조직-표본고정 형광 강도 스크리닝 데이터(도 1k)를 확인하였다. 본 발명자들은 MM에서의 hCO 배양이 일반적인 세포 주기 마커인 Ki-67(도 11a), 및 유사분열 특이적 마커인 pH3(도 11b)을 사용하여 세포 주기에서 hPSC-CM의 백분율의 감소를 야기하였다는 것을 발견하였다. hPSC-CM 증식은 출생 후 인간 심장(35)과 유사한 매우 낮은 hPSC-CM 유사분열률(약 0.2% pH3+ hPSC-CM)을 가지면서 MM에서 배양된 hCO에서 현저히 감소되었다.
다음으로, 본 발명자들은 대사 기질이 얼마나 심장 세포 주기에 영향을 미치는 지를 평가하고자 하였다. 본 발명자들은 hCO 형성기 후 글루코스, 인슐린 및 팔미테이트를 사용하여 요인 실험을 수행하였다. 중요하게는, 모든 조건들은 처음 48시간의 배양 동안 유사한 수축력을 가졌는데(도 12c), 이것은 hCO가 글루코스 및 팔미테이트의 부재 하에서 조차도 이 초기 단계에서 유사한 기능적 성질 및 생존율을 가진다는 것을 시사한다(장기간 배양과 대조됨, 도 1i). 이 연구들에서, 본 발명자들은 인간 심근세포 증식의 가장 강력한 활성화제들 중 하나로서 CHIR99021 (16)을 이미 확인하였고 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로가 출생 후 성숙 동안 전사적으로 억제된다는 것도 발견하였기 때문에(5) 이 경로를 구체적으로 조사하였다. 본 발명자들의 스크린에서 β-카테닌 활성의 판독결과로서, 본 발명자들은 핵에 위치하는 활성화된 β-카테닌에만 결합하는 항체를 사용하여 활성화된 β-카테닌의 정량을 수행하였다(36). 활성화된 β-카테닌은 증식과 마찬가지로(도 11e) 글루코스 또는 팔미테이트의 존재와 관계없이 인슐린에 매우 의존하였고(도 11c,d), 활성화된 β-카테닌과 Ki-67 강도 사이에 매우 유의미한 상관관계가 있었다(모든 조건들에서 모든 hCO들에 비해 도 11f). MM에서 배양한 지 2일 후, 증식을 위한 인슐린 신호전달에의 이 의존성에도 불구하고, 11일 후 MM에의 인슐린의 첨가는 hPSC-CM 증식을 재활성화시키기에 충분하지 않았다(도 11g,h,i). 이것은 MM에서의 장기간 배양이 인슐린의 증식 작용에 대한 hPSC-CM의 탈감작을 유도한다는 것을 시사한다.
생체내 심근세포의 고도 산화적 출생 후 환경은 심근세포 말기 분화를 유도하는 중추 기작으로서 제안된 DDR을 유도한다(29). 생체내에서의 이 발견과 일치하여, 본 발명자들은 MM에서 배양된 hCO에서 DDR 단백질의 증가된 발현이 있었다는 것도 발견하였다(도 6g, 도 13a). DNA 8-옥소-7,8-디하이드로구아닌(8-OxoG)의 산화적 염기 변형(도 13b) 및 증가된 Ser1987 인산화된 ATM(pATM)의 마커의 증가된 발현(도 13c)을 비롯한, MM에서 배양된 hCO에서의 DDR의 유도에 대한 증거가 존재하였다. 따라서, 생체내 출생 후 성숙과 일치하여, DDR은 MM에서 배양된 hCO에서의 증식 정지와도 관련되어 있다.
성숙 심근세포 및 오가노이드의 추가 사용
본 발명에 따라 생성된 오가노이드는 심장 생물학, 질환 모델링 및 독성학에 대한 보다 더 신뢰할 만한 이해를 가능하게 할 것이다.
성숙 배지(MM)에서 생성된 hCO 내의 심근세포는 다른 2D 및 3D 심근세포에 비해 감소된 수준의 증식을 나타낸다(도 16a,b). 추가로, MM에서 배양된 hCO 내의 심근세포는 미토겐 자극에 대한 불응성을 나타내는데, 이 경우 예는 CHIR99021(GSK3 억제제)이다(도 16a,b). 이것은 성인 심근세포가 미토겐 자극에 반응하여 세포 주기 내로 더 이상 들어가지 않는 생체내 출생 후 심장 성숙과 일치한다.
MM에서 생성된 hCO는 수축 주기를 위해 중요한 이온 채널, 칼슘 취급 단백질 및 수축 단백질을 발현하기 때문에 약물 독성학을 모델링하는 데 사용될 수 있다(도 17a). MM에서 생성된 hCO는 이완 시간 연장을 기반으로 인간 에테르-어-고-고(ether-a-go-go) 채널(hERG)과 상호작용하는 고위험, 중간 위험 또는 저위험 화합물을 정확히 예측하였다(도 17b,c,d).
MM에서 생성된 hCO의 대사 성숙은 대사 질환이 hCO에서 모델링될 수 있게 한다. 당뇨병의 조건(낮은 인슐린, 높은 글루코스)에서 배양된 hCO는 일관된 수축력을 나타내되, 증가된 이완 시간을 나타낸다(도 18a,b). 이 "확장 기능장애"는 보존된 박출률을 가진 심부전(HFpEF) 환자에서 일어나는 기능적 변화와 일치한다. 따라서, MM에서 생성된 hCO는 심장 기능에 대한 대사 장애의 영향을 모델링하는 데 매우 중요할 수 있고, 당뇨병을 가진 환자는 심근병증 및 HFpEF를 발생시킬 보다 큰 위험을 갖는 것으로 공지되어 있다.
일부 유전적 질환들은 2D 배양에서 모델링될 수 있으나, 성숙 근절 이소폼 또는 ECM과 관련된 임의의 유전적 질환은 3D 오가노이드를 요구한다. ALPK3 결핍 성숙 심근세포는 정상 심근세포에 비해 감소된 수축력을 보이면서 심근병증을 초래할 수 있다. 유사하게, 감소된 수축력은 NKX2-5 결핍 심근세포에서 측정될 수 있다. 돌연변이체 유전자, 예컨대, 이들의 효과의 분석은 본원에 개시된 성숙 배지를 사용함으로써 생성된 성숙 심근세포 및/또는 오가노이드에서 착수될 것이다.
성숙 배지의 추가 사용
많은 적용이 hCO에서의 배양보다는 2D 심근세포의 배양을 요구할 수 있다. MM이 2D에서도 작용할 수 있는 지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 상이한 배지 조성물들 및 세포 주기 활성을 감소시키는 이들의 능력을 비교하였다(도 19). 본 발명자들은 동일한 MM, 또는 인간 혈청 알부민으로 대체된 B27을 가진 MM이 심지어 짧은 기간에 걸쳐 2D 배양에서도 세포 주기 활성을 감소시키기에 충분하다는 것을 발견하였다.
논의
hPSC-CM은 인간 심장 생물학, 발생 및 생리학을 연구하는 데 널리 사용되어 왔다. 그러나, hPSC-CM은 전형적으로 미성숙하고, 이 성질은 성인 심장 생물학을 정확히 모델링하는 그의 능력을 제한한다. 조작된 심장 근육이 구조 및 기능 면에서 hPSC-CM 성숙을 개선할 수 있지만(10, 14), 대사 성숙 및 세포 주기 정지의 핵심 업스트림 유도제는 거의 알려져 있지 않다.
hPSC-CM 성숙 및 세포 주기 탈출의 중추적 조절제를 확인하기 위해, 본 발명자들은 소형화된 반자동화된 심장 오가노이드 배양 플랫폼(심장 동력계)을 개발하여 스크리닝을 용이하게 하였다. 본 발명자들은 체계적 및 반복적 스크리닝을 통해 성숙 과정의 상이한 생리학적 특징이 상이한 신호들에 의해 유도된다는 것을 입증할 수 있었다. 예를 들면, 본 발명자들은 많은 파라미터들, 예컨대, 구조적, 전기생리학적, 칼슘 취급뿐만 아니라, 아드레날린성 자극에 대한 반응의 성숙이 3D 조작된 심장 조직 환경에 의해 뒷받침된다는 것을 발견하였다. 본 발명자들의 hCO에서의 이 파라미터들은 다른 심장 조직 조작 플랫폼을 사용함으로써 보고된 파라미터와 유사하였다(8-12). 그러나, 본 발명자들은 지방산 산화로의 대사 전환이 대사 유전자의 발현, 미토콘드리아 생물발생 및 지방산 산화를 변동시키기 위한 핵심 유도제일 뿐만 아니라, 성인 근절 단백질 이소폼의 증가된 발현 및 세포 주기 탈출을 위한 핵심 유도제이기도 하다는 것을 확인하였다. 따라서, 성인 심근세포 표현형의 상이한 양태는 성숙 hPSC-CM의 생성을 위해 조심스럽게 조절될 필요가 있는 상이한 신호들에 의해 좌우된다.
생체내에서 출생 후 첫 주의 기간 동안 지방산 산화로의 대사 전환 및 세포 주기 탈출이 심장에서 일어나는데, 이것은 혈청 조성이 해당작용 기질로부터 지방산으로 변화한다는 것과 일치한다(4). 이 연구에서, 본 발명자들은 대사 기질 제공의 이 변화를 모방하는 것이 대사 성숙뿐만 아니라, 인간 심근세포에서의 전사 및 세포 주기 성숙의 주요 유도제라는 것을 발견하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 통상적으로 사용되는 고인슐린 탄수화물 기반 배지를 저탄수화물 및 저인슐린 팔미테이트 기반 배지로 교체하는 것이 hCO의 성숙을 향상시킨다는 것을 발견하였다. 이 성숙 조건들은 일반적으로 글루코스, 인슐린 및 혈청을 포함하는 전형적인 세포 생장 환경과 대조되고, 세포 증식을 증가시키도록 디자인된다. 대사 환경의 변경은 hCO에서 성숙을 촉진하는 데 매우 중요하였고, 다른 세포 유형의 분화 및 기능적 성숙을 촉진하는 실행 가능한 방법을 대표할 수도 있다.
최근의 연구는 산소 분압이 심근세포 증식과 연관되어 있다는 것을 암시하였고(28, 29, 49), 높은 산소 환경이 출생 후 심근세포 세포 주기 탈출을 위한 핵심 유발제라는 것을 보여주었다(29). 그러나, 대기 산소(약 21% O2)에서 hPSC-CM의 시험관내 배양은 세포 주기 탈출을 유도하기에 충분하지 않다(16, 50). 본 발명자들의 연구는 높은 산소 환경에서 대사 기질 사용의 변경을 통한 지방산 산화로의 전환이 hPSC-CM 세포 주기 정지의 유도제라는 것을 입증한다. 이것은 높은 산소 환경이 심근세포 세포 주기 정지를 좌우하기 위해 출생 후 대사 기질 이용 가능성의 변화와 협력하여 작용한다는 것을 암시한다. 이것은 해당작용으로의 대사 전환과 관련되어 있는, 감소된 산소 농도와 성인 심장에서의 심근세포 증식 및 심장 재생의 재활성화 사이의 연관성을 입증하는 최근의 연구에 의해 생체내에서도 뒷받침된다(28). 종합하건대, 이 연구는 출생 후 대사 적응, 산소 분압 및 심근세포 증식 사이의 인과관계를 확립한다.
본 발명자들의 발견은 지방산 산화로의 hPSC-CM 대사의 전환이 β-카테닌 및 YAP1 신호전달의 오래 지속되는 변화를 유도할 뿐만 아니라, hPSC-CM 세포 주기 철수를 야기하는 DDR도 유도한다는 것을 보여준다. β-카테닌과 YAP 신호전달 사이의 협력은 배아 심장에서 보고되었고, 배아 심장에서 이들은 심장 발생 동안 심근세포 증식을 조절하도록 상호작용한다(41). 더욱이, Hippo/Yap 신호전달은 신생아 기간에서 심장 재생 능력의 중추적 조절제로서 등장하였다(51, 52). 본 발명자들의 연구는 심근세포 대사의 출생 후 변경이 출생 후 β-카테닌 및 YAP 신호전달의 억제를 통한 심근세포 세포 주기 폐쇄를 유발하는 핵심 스위치로서 작동할 수 있다는 것을 암시한다. 유사하게, 대사의 변경은 다른 세포 유형에서 β-카테닌 및 YAP 활성에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다(53, 54). 따라서, 이 발견은 β-카테닌, YAP1, 대사 및 DDR이 긴밀히 연관되어 있고 협력하여 심장 세포 주기 및 성숙을 조절하는 모델을 뒷받침한다.
인간 오가노이드의 생성은 지난 수년에 걸쳐 신속히 진행되었다. 고속대량 스크리닝 플랫폼, 예컨대, 심장 동력계와 커플링된 오가노이드 실험은 인간 생물학의 본 발명자들의 지식을 신속히 확장하고 잠재적으로 많은 질환들에 대한 신규 치료 전략을 열어 보일을 잠재력을 가진다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 본 발명을 어느 한 실시양태 또는 특징들의 특정 집합으로 한정하지 않으면서 본 발명의 바람직한 실시양태를 기술하는 것이 목적이다. 따라서, 본 개시에 비추어 볼 때, 당분야에서 숙련된 자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 예시된 특정 실시양태를 다양하게 변형시키고 변화시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본원에서 언급된 모든 컴퓨터 프로그램, 알고리즘, 특허 및 과학 문헌은 본원에 참고로 도입된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
참고문헌
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010

Claims (33)

  1. 기초 배지, 하나 이상의 지방산, 글루코스 및 알부민을 포함하는 심장 세포 성숙 배지.
  2. 청구항 1에 있어서,
    심근세포의 성숙에 적합한 심장 세포 성숙 배지.
  3. 청구항 1에 있어서,
    겔화 배지를 포함하는 심장 세포 성숙 배지.
  4. 청구항 3에 있어서,
    하나 이상의 세포외 매트릭스(ECM) 분자 또는 이의 성분을 포함하는 심장 세포 성숙 배지.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 ECM 분자 또는 이의 성분은 콜라겐 I 및 매트리겔(Matrigel)™을 포함하는 심장 세포 성숙 배지.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 지방산 및 글루코스는 약 1:10의 농도 비로 존재하는 심장 세포 성숙 배지.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 글루코스는 약 1 mM의 농도로 존재하는 심장 세포 성숙 배지.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 지방산은 약 100 μM의 농도로 존재하는 심장 세포 성숙 배지.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 지방산은 C12-C20 포화 지방산이거나 이를 포함하는 심장 세포 성숙 배지.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 하나 이상의 지방산은 팔미트산이거나 이를 포함하는 심장 세포 성숙 배지.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    TGF 또는 인슐린을 포함하지 않거나, 최소한의 TGF 및/또는 인슐린을 포함하는 심장 세포 성숙 배지.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    무혈청 배지인 심장 세포 성숙 배지.
  13. 웰의 기저 표면으로부터 실질적으로 수직으로 뻗어 있는 마주보는 장대(pole)를 각각 포함하는 복수의 웰들을 포함하는 심장 세포 배양 용기.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 웰에서 근육 다발에 의해 야기된 마주보는 장대의 변위가 수축력 측정을 용이하게 하는 심장 세포 배양 용기.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 마주보는 장대는 직사각형 횡단면을 갖는 심장 세포 배양 용기.
  16. 청구항 13 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 웰은 타원 모양을 갖는 심장 세포 배양 용기.
  17. 청구항 13 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
    약 3 mm 장축 및 약 2 mm 단축을 갖는 웰; 각각 약 0.2 mm × 약 0.5 mm의 치수를 갖는 직사각형 횡단면의 마주보는 장대; 및/또는 웰의 장축을 따라 각각의 장대의 중심으로부터 대칭적으로 약 1.0 mm의 간격을 두고 떨어져 있는 마주보는 장대;를 포함하는 적어도 하나의 차원을 포함하는 심장 세포 배양 용기.
  18. (i) 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항의 심장 세포 성숙 배지; 및
    (ii) 청구항 13 내지 청구항 17 중 어느 한 항의 심장 세포 배양 용기;를 포함하는 심장 세포 배양 시스템.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 심장 세포 배양 용기는 웰의 기저 표면으로부터 실질적으로 수직으로 뻗어 있는 마주보는 장대를 각각 포함하는 복수의 웰들을 포함하는 심장 세포 배양 시스템.
  20. 청구항 19에 있어서,
    심장 동력계이거나 심장 동력계의 구성요소인 심장 세포 배양 시스템.
  21. 하나 또는 복수의 심근세포의 성숙을 유도하거나 촉진하기에 충분한 시간 동안 적합한 조건 하에서 청구항 13 내지 청구항 17 중 어느 한 항의 세포 배양 용기 또는 청구항 18 내지 청구항 21 중 어느 한 항의 세포 배양 시스템에서 하나 이상의 심근세포를 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항의 심장 세포 성숙 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는 심장 세포를 배양하는 방법.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 하나 이상의 심근세포는 ECM 성분 또는 분자 및 알부민의 존재 하에서 초기에 겔화되는 방법.
  23. 청구항 22에 있어서,
    글루코스 및 하나 이상의 지방산이 인슐린의 부재 하에서 상기 겔화된 심근세포에 후속적으로 첨가되는 방법.
  24. 청구항 21 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 심근세포는 하나 이상의 전구세포로부터 분화된 방법.
  25. 청구항 24에 있어서,
    상기 전구세포는 인간 배아 줄기 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포이거나 이를 포함하는 방법.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 전구세포는 아스코르브산 2 포스페이트, BMP-4, 액티빈(Activin) A, FGF-2 및 GSK-3 억제제, 예컨대, CHIR99021 중 하나 이상을 사용하여 배양되는 방법.
  27. 청구항 21 내지 청구항 26 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 심장 세포, 오가노이드(organoid) 또는 조작된 심장 조직.
  28. 청구항 13 내지 청구항 17 중 어느 한 항의 세포 배양 용기 또는 청구항 18 내지 청구항 20 중 어느 한 항의 세포 배양 시스템에서 하나 이상의 심근세포를 하나 이상의 후보 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 심장 세포 성숙을 조절하는 하나 이상의 분자를 확인하는 방법으로서, 하나 또는 복수의 심근세포의 성숙의 변형은 상기 후보 분자가 심장 세포 성숙의 조절제임을 나타내는 방법.
  29. 청구항 28에 있어서,
    상기 조절제는 심장 세포 성숙을 적어도 부분적으로 억제하거나 저해하는 방법.
  30. 청구항 28에 있어서,
    상기 조절제는 심장 세포 성숙을 적어도 부분적으로 향상시키거나 촉진하는 것인 방법.
  31. 청구항 21 내지 청구항 26 중 어느 한 항의 방법에 따라 심장 세포, 오가노이드 또는 조작된 심장 조직을 생성하고, 상기 심장 세포, 오가노이드 또는 조작된 심장 조직을 하나 이상의 분자와 접촉시키는 단계; 또는 청구항 27의 심장 세포, 오가노이드 또는 조작된 심장 조직을 하나 이상의 분자와 접촉시키는 단계; 및 상기 심장 세포, 오가노이드 또는 조작된 심장 조직에 대한 상기 하나 이상의 분자의 효과를 측정, 평가, 또는 모니터링하는 단계;를 포함하는 심장 세포, 조직 또는 오가노이드에 대한 하나 이상의 분자의 효과를 측정, 평가, 또는 모니터링하는 방법.
  32. 청구항 31에 있어서,
    상기 하나 이상의 분자의 독성 또는 안전성을 측정하는 방법.
  33. 청구항 31에 있어서,
    상기 하나 이상의 분자의 치료 효능을 측정하는 방법.
KR1020197008631A 2016-08-26 2017-08-25 심근세포 성숙 KR102634265B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2016903404 2016-08-26
AU2016903404A AU2016903404A0 (en) 2016-08-26 Cardiomyocyte maturation
PCT/AU2017/050905 WO2018035574A1 (en) 2016-08-26 2017-08-25 Cardiomyocyte maturation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190040317A true KR20190040317A (ko) 2019-04-17
KR102634265B1 KR102634265B1 (ko) 2024-02-08

Family

ID=61246715

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197008631A KR102634265B1 (ko) 2016-08-26 2017-08-25 심근세포 성숙

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11920158B2 (ko)
EP (1) EP3504321A4 (ko)
JP (2) JP7262385B2 (ko)
KR (1) KR102634265B1 (ko)
AU (1) AU2017314870B2 (ko)
WO (1) WO2018035574A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102291271B1 (ko) * 2020-03-19 2021-08-18 연세대학교 산학협력단 심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9719068B2 (en) 2010-05-06 2017-08-01 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation
US10174289B2 (en) 2014-05-28 2019-01-08 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into gastric tissues through directed differentiation
WO2016061464A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Children's Hospital Center, D/B/A Cincinnati Children's Hospital Medical Center In vivo model of human small intetine using pluripotent stem cells and methods of making and using same
US11066650B2 (en) 2016-05-05 2021-07-20 Children's Hospital Medical Center Methods for the in vitro manufacture of gastric fundus tissue and compositions related to same
AU2017373767B2 (en) 2016-12-05 2021-09-16 Children's Hospital Medical Center Colonic organoids and methods of making and using same
EP3540046A1 (en) * 2018-03-13 2019-09-18 Medizinische Hochschule Hannover Process for producing cardiac organoids
JP2021518113A (ja) * 2018-03-16 2021-08-02 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 心筋細胞を生成及び増殖させるためのｗｎｔアゴニスト、並びに生理活性脂質を用いた試薬及び方法
WO2019189554A1 (ja) * 2018-03-30 2019-10-03 国立大学法人京都大学 心筋細胞成熟促進剤
WO2020028957A1 (en) * 2018-08-09 2020-02-13 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Skeletal muscle cell maturation
EP3927814A1 (en) 2019-02-21 2021-12-29 Stembiosys, Inc. Methods for the maturation of cardiomyocytes on amniotic fluid cell-derived ecm, cellular constructs, and uses for cardiotoxicity and proarrhythmic screening of drug compounds
WO2021100718A1 (ja) * 2019-11-21 2021-05-27 日本毛織株式会社 細胞集合体、その製造方法、その作製キット、及びそれを用いた化合物の評価方法
CN113106004A (zh) * 2020-01-09 2021-07-13 再心生物科技有限公司 用于细胞行为的调节剂的微制造装置和高通量测定
AU2021216134A1 (en) * 2020-02-09 2022-09-22 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Methods of increasing maturation of heart, pancreatic beta-cells, and neurons
CN115210362A (zh) * 2020-02-14 2022-10-18 赛拉尔研究有限公司 用于心脏类器官培养和移植的脱细胞心脏组织衍生支架及其制备方法
CN111718895B (zh) * 2020-07-01 2022-03-08 湖北大学 一种人工心肌组织纤维化模型、制备方法、制备装置及其应用
WO2023042858A1 (ja) * 2021-09-15 2023-03-23 株式会社幹細胞＆デバイス研究所 細胞群の運動特性を評価するためのシステム、方法、これらに用いられる装置、及びプログラム、並びに薬剤有効性評価方法
JPWO2023042859A1 (ko) * 2021-09-15 2023-03-23
WO2024010020A1 (ja) * 2022-07-08 2024-01-11 王子ホールディングス株式会社 培養細胞シートおよびその製造方法、化合物または薬物の評価方法、並びに培養細胞シートの品質評価方法
WO2024016058A1 (en) * 2022-07-21 2024-01-25 Murdoch Children's Research Institute Engineered human cardiac tissue
WO2024020067A1 (en) * 2022-07-22 2024-01-25 Board Of Trustees Of Michigan State University Maturation medium compositions and methods for human heart organoid maturation
WO2024090312A1 (ja) * 2022-10-27 2024-05-02 慶應義塾 人工臓器及びその製造方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015004539A2 (en) * 2013-07-02 2015-01-15 National University Of Singapore Differentiation of pluripotent stem cells and cardiac progenitor cells into striated cardiomyocyte fibers using laminins ln-511, ln-521 and ln-221
WO2015187023A1 (en) * 2014-06-06 2015-12-10 Pluriomics B.V. Cardiomyocyte maturation

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4999376A (en) * 1986-09-22 1991-03-12 Yaguang Liu Pharmaceutical composition for treating and preventing cardiovasular disease
JP2014521337A (ja) * 2011-07-29 2014-08-28 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド 幹細胞由来の組織細胞中の代謝成熟
WO2013056019A1 (en) * 2011-10-12 2013-04-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania In vitro microphysiological system for high throughput 3d tissue organization and biological function
CA2893971C (en) * 2012-12-07 2019-12-31 The Governing Council Of The University Of Toronto Cardiac tissue constructs and methods of fabrication thereof
EP3008172B1 (en) * 2013-06-11 2020-05-06 Ncardia B.V. Culture medium compositions for maturating cardiomyocytes derived from pluripotent mammalian stem cells
EP2840132B1 (en) * 2013-08-22 2016-11-30 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts Universitätsmedizin Method for producing Engineered Heart Muscle (EHM)

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015004539A2 (en) * 2013-07-02 2015-01-15 National University Of Singapore Differentiation of pluripotent stem cells and cardiac progenitor cells into striated cardiomyocyte fibers using laminins ln-511, ln-521 and ln-221
WO2015187023A1 (en) * 2014-06-06 2015-12-10 Pluriomics B.V. Cardiomyocyte maturation

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102291271B1 (ko) * 2020-03-19 2021-08-18 연세대학교 산학협력단 심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법
KR102291265B1 (ko) * 2020-03-19 2021-08-18 연세대학교 산학협력단 심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법
WO2021187758A1 (ko) * 2020-03-19 2021-09-23 연세대학교 산학협력단 심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017314870A1 (en) 2019-03-14
JP7262385B2 (ja) 2023-04-21
US20190203179A1 (en) 2019-07-04
JP2023024473A (ja) 2023-02-16
EP3504321A1 (en) 2019-07-03
WO2018035574A1 (en) 2018-03-01
US11920158B2 (en) 2024-03-05
KR102634265B1 (ko) 2024-02-08
JP2019526255A (ja) 2019-09-19
EP3504321A4 (en) 2020-03-11
AU2017314870B2 (en) 2023-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20190040317A (ko) 심근세포 성숙
Vidarsson et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes for in vitro and in vivo applications
Rupert et al. IGF1 and NRG1 enhance proliferation, metabolic maturity, and the force‐frequency response in hESC‐derived engineered cardiac tissues
Le et al. Enhanced telomere rejuvenation in pluripotent cells reprogrammed via nuclear transfer relative to induced pluripotent stem cells
KR102202160B1 (ko) 조직 구조체 및 그 제작 방법
CN110709092B (zh) 用于产生人少突胶质细胞和研究体外髓鞘形成的个性化3d神经培养系统
Lu et al. Engineering a functional three-dimensional human cardiac tissue model for drug toxicity screening
CN110573609A (zh) 双分化或多分化类器官
KR20160052726A (ko) 심장외막 세포 생성을 위한 방법 및 조성물
Lee et al. Generation of human iPSCs derived heart organoids structurally and functionally similar to heart
EP3985104A1 (en) Method for producing renal interstitial cell
US20190185816A1 (en) Cardiac microtissue and uses thereof
Goldenthal et al. Stem cells and cardiac disorders: an appraisal
JP7250154B2 (ja) 羊水細胞由来のｅｃｍ上での心筋細胞の成熟化のための方法、細胞構築物、ならびに薬物化合物の心毒性および催不整脈スクリーニングのための使用
Shahriyari et al. Human engineered skeletal muscle of hypaxial origin from pluripotent stem cells with advanced function and regenerative capacity
EP3712253A1 (en) Method of in vitro cellular assay, cell circuit board, and method of manufacturing cell circuit board
Liao et al. Maturation of stem cell-derived cardiomyocytes: foe in translation medicine
EP4249585A1 (en) Heart tissue models, method of producing heart tissue models and uses of heart tissue models
US20180044640A1 (en) Contractile cellular construct for cell culture
Dunn Maturation of Stem Cell-Derived Cardiomyocytes via Coculture for Cellular Manufacturing
Bueno et al. Non-proliferative adult neurogenesis in neural crest-derived stem cells isolated from human periodontal ligament
Meier Advanced hiPSC-based platforms for in vitro modeling of cardiac development, disease, and therapy
Luecker Changes in Growth Factor Responsiveness during In Vitro Maturation of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes
Birket et al. Expansion and developmental patterning of human PSC-derived cardiovascular progenitors
Rao The effect of biomimetic tissue engineering constructs on the phenotype of immature cardiomyocytes

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)