KR20160052726A - 심장외막 세포 생성을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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앨릭 드레이크 위티
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Abstract

hPSC로부터 심혈관 계통 세포를 수득하기 위한 방법 및 생성물을 제공한다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로부터 심근세포 계통 또는 심장외막 계통 세포 집단을 수득하는 방법은 하기 단계 중 하나 이상의 단계를 포함한다: (a) BMP 성분으로 프라이밍된 hPSC를, hPSC가 심혈관 중배엽 세포 집단으로 분화되도록 유도하는 데 적합한 심혈관 중배엽 프로그래밍 칵테일과 프로그래밍 칵테일이 hPSC에 침투하기에 적합한 조건하에서 접촉시키고, 일정 기간 동안 접촉된 hPSC를 배양하여 KDR+ 및 PDGFR알파+ 심혈관 중배엽 세포 집단을 생성하는 단계; (b) 심혈관 중배엽 세포 집단을, NKX2-5+ 또는 WT1+ 심혈관 전구체 세포 집단을 특정화하는 데 적합한 심혈관 전구체 특정화 칵테일과 특정화 칵테일이 심혈관 중배엽 세포 집단에 침투하기에 적합한 조건하에서 접촉시키고, 일정 기간 동안 접촉된 심혈관 중배엽 세포 집단을 배양하여 NKX2-5+ 또는 WT1+ 심혈관 전구체 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (d) 심혈관 전구체 세포 집단을 성숙 칵테일과 성숙 칵테일이 심혈관 전구체 세포 집단에 침투하기에 적합한 조건하에서 접촉시키고, 일정 기간 동안 접촉된 심혈관 전구체 집단을 배양하여 심혈관 집단, 임의적으로, 심장 트로포닌 T (cTnT) 및/또는 SIRPA를 발현하는 심근세포 계통 세포, 및/또는 WT1을 발현하는 심장외막 계통 세포를 생산하는 단계.

Description

심장외막 세포 생성을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR GENERATING EPICARDIUM CELLS}
관련 출원
본 출원은 2013년 9월 13일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/877,618의 우선권에 기초하여 35 U.S.C. § 119의 이점을 주장하는 특허 협력 조약 출원이고, 상기 가특허 출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 hPSC를 비롯한 PSC로부터 심혈관 계통 세포를 생산하는 방법 및 조성물 뿐만 아니라, 심근세포 및 심장외막 계통 세포 집단을 생산하는 방법 및 조성물을 제공한다.
지난 5년간, 인간 배아 (hESC) 및 유도된 만능 줄기 세포 (hiPSC) (통틀어 인간 만능 줄기 세포; hPSC로 지칭된다)를 심혈관 계통의 것을 비롯한 특정 세포 유형으로의 분화를 지시할 수 있는 능력에 있어 진보가 이루어졌다1 , 2. 이러한 성공은 크게는 모델 유기체에서의 계통 발생 및 조직 형성에 대한 이해를 hPSC 분화 배양으로 해석한 것을 토대로 이루어진 것이다1. 심혈관계와 관련하여, 이러한 접근법을 통해 원시선 (PS)-유사 집단 형성, 심혈관 중배엽 유도, 및 상기 중배엽으로부터 심혈관 계통의 특정화를 포함하는, 중요한 발생 단계를 개괄하는 분화 프로토콜이 확립되었다3 , 4. 발생 생물학이 또한 본 발명자들에게 PS/중배엽 집단 생성을 위한 액티빈 A/노달 및 BMP4 신호전달 요구 및 중배엽을 심혈관 운명으로 특정화하기 위해 β-카테닌 의존성 Wnt 신호전달을 억제시켜야 할 필요를 비롯한 상기 발생 진행을 제어하는 중요한 조절 경로에 관한 정보를 제공하였다4. 최근 연구를 통해 심혈관 발생의 상이한 단계를 나타내는 세포 집단에 특이적인 표면 마커가 확인되었다. 상기 마커 세트로는 심혈관 중배엽에서 발현된 KDR 및 PDGFRα5, 및 심혈관 전구체 및 분화된 심근세포 상에 존재하는 SIRPA를 포함한다6. KDR+PDGFRα+ 집단의 출현을 모니터링한 결과, 상이한 hPSC 세포주는 최적의 중배엽 유도 및 심근세포 발생을 위해서는 상이한 농도의 액티빈 A 및 BMP4를 필요로 하는 것으로 밝혀졌다5.
심장외막 계통은 마우스에서 대략 배아 단계 (E) 9.5에서 심장에 인접하여 발생하는 전심장외막 기관 (PEO)으로 공지된 구조로부터 유래된다7. 전사 인자인 빌름스 종양 1 (WT1) 및 TBX18의 발현을 특징으로 하는 전심장외막 세포는 루핑 과정 동안 PEO로부터 초기 심관으로 이동하고, 빠르게 그를 감쌈으로써 심장외막으로 공지된 외부 상피층을 형성한다. 심장외막은 정상적인 심장 발생, 및 심실 세포의 빠른 증식 및 치밀층 심근 형성을 지원하는 기능에 필수적이다. 이는 또한 심장 섬유모세포, 관상 혈관 평활근 세포 및 보다 적게는 내피 세포를 포함하는 심장의 수개의 주요 세포 유형의 근원이다. 이러한 분화된 자손은 심장외막 유래 세포 (EPDC)로 지칭되며, 심장외막의 상피-중간엽 전이 (EMT)를 거쳐 유래된 것이다. 계통 추적 연구는 심장외막 또한 심근세포의 근원이라는 것을 제안한다8 , 9. 그러나, 추적 실험에 사용된 유전자의 심장외막 특이성이 불확실하다고 가정하였을 때, 상기 연구 해석에 대한 의문이 제기되었다10.
심장외막은 레티노산 (RA), 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 및 인슐린-유사 성장 인자 (IGF)를 비롯한 다수개의 인자를 생산하는데, 그중 수개의 인자는 치밀층 심근 형성에 필요한 심실 근세포 증식의 과도기에 필수적이다. 최근 연구 결과, IGF2는 심실 증식을 촉진시키는 중요한 심장외막 유래 인자이고11, RA는 간에서 에리트로포이에틴 (EPO)의 활성화를 통해 간접적으로 상기 기능을 매개하고, 궁극적으로는 심장외막에서 IGF2를 유도하는 것12으로 밝혀졌다. G-액틴 단량체 결합 단백질인 티모신 β4 (Tβ4)의 활성을 통해 심장외막의 심근 조절이 이루어진다는 증거가 또한 존재한다13. Tβ4는 발생 중인 심근에 의해 생산되고, 적절한 심장외막 발생 및 완전성에 필요하다.
정상적인 성인의 심장외막은 WT1, TBX18 또는 RALDH2를 발현하지 않지만14, 손상, 예컨대, 심근 경색은 상기 '태아' 유전자 프로그램의 상향조절 뿐만 아니라, 상기 집단 내의 세포 증식 및 EMT의 재활성화를 유도할 것이다. 경색 동안 Tβ4 주사는 아마도 활성화된 심장외막 세포로부터의 측분비 인자의 생산을 통해 상기 변화를 증진시키고, 심근 사멸을 막는다14 , 15. 성인에서의 계통 추적 연구는 상기 활성화된 심장외막이 새로운 심근세포를 생성할 수 있는 능력을 가지고 있고, 이러한 심장발생 잠재능은 경색전(pre-infarcted) 심장의 Tβ4에 의한 프라이밍에 의해서 증강된다는 것을 제안한다15. 그러나, 최근 연구를 통해서 Tβ4로 처리된 경색된 심장의 심근에 심장외막이 기여한다는 것이 입증되지 못하였는 바, 태아 연구에서와 같이 상기 개념은 논쟁의 여지가 있다14.
시험관내 연구 결과, 체외이식편 배양물 중 심장외막 세포에서는 EMT가 이루어질 것이고, 상기 세포는 Notch16, TGFβ17 -19 및 PDGFBB20 또는 Tβ415에 대한 반응으로 EPDC를 생기게 할 것이라고 밝혀졌다. Tβ4로 프라이밍된 경색증을 앓는 동물로부터의 심장외막 세포는 생체내에서 체외이식편 배양물 중에서 심근세포 마커를 발현하는 세포로 분화한다15.
비록 이러한 진보를 통해서 hPSC로부터 심근세포를 효율적으로 및 확장가능하게 유도할 수 있기는 하지만, 이러한 분화된 집단이 미성숙 세포를 함유하고, 그 안의 심근 및 심장외막을 비롯한 상이한 심장 계통 세포의 비율이 잘 정의되어 있지 않은 바, 상기 분화된 집단은 많은 적용에 최적인 것은 아니다. 심혈관 연구 및 치료학적 적용에서 hPSC의 잠재능을 실현시키기 위해서는 인간 심장을 더욱 정확하게 나타내는 조작된 조직 및 배양 시스템 개발이 필요할 것이다.
한 측면은 (a) BMP 성분으로 프라이밍된 hPSC를 hPSC가 심혈관 중배엽 세포 집단으로 분화되도록 유도하는 데 적합한 심혈관 중배엽 프로그래밍 칵테일과, 프로그래밍 칵테일이 hPSC에 침투하기에 적합한 조건하에서 접촉시키고, 일정 기간 동안 접촉된 hPSC를 배양하여 KDR+ 및 PDGFRα+ 심혈관 중배엽 세포 집단을 생성하는 단계; (b) 심혈관 중배엽 세포 집단을 NKX2-5+ 또는 WT1+ 심혈관 전구체 세포 집단을 특정화하는 데 적합한 심혈관 전구체 특정화 칵테일과, 특정화 칵테일이 심혈관 중배엽 세포 집단에 침투하기에 적합한 조건하에서 접촉시키고, 일정 기간 동안 접촉된 심혈관 중배엽 세포 집단을 배양하여 NKX2-5+ 또는 WT1+ 심혈관 전구체 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (d) 심혈관 전구체 세포 집단을 성숙 칵테일과, 성숙 칵테일이 심혈관 전구체 세포 집단에 침투하기에 적합한 조건하에서 접촉시키고, 일정 기간 동안 접촉된 심혈관 전구체 집단을 배양하여 심혈관 계통 집단, 임의적으로, 심장 트로포닌 T (cTnT) 및/또는 SIRPA를 발현하는 심근세포 계통 세포 집단, 및/또는 임의적으로, WT1을 발현하고/거나, 심장외막 유래 세포 (EPDC)를 포함하는 심장외막 계통 세포 집단을 생산하는 단계를 포함하는, 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로부터 심혈관 계통 세포 집단, 임의적으로, 심근세포 계통 세포 집단 또는 심장외막 계통 세포 집단을 수득하는 방법을 포함한다.
본 개시내용의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 구체적인 예는 본 개시내용의 바람직한 실시양태를 명시함과 동시에, 본 개시내용의 정신 및 범주 내의 다양한 변화 및 변형이 상기 상세한 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명하게 되는 바, 이는 단지 예시로 제공됨을 이해하여야 한다.
이제 본 개시내용의 실시양태를 하기 도면과 관련하여 기술할 것이다:
도 1. hESC로부터의 심근세포 특정화. 주요 발생 3단계: 1) 중배엽 유도, 2) 심혈관 특정화 및 3) 성숙을 강조한, hESC를 심근세포 계통으로 분화시키는 데 사용된 프로토콜에 대한 도해. 액티빈A/BMP4로 유도된 4일째 배상체 (EB)로부터의 세포를 젤라틴으로 코팅된 웰 상에 단일층으로서 플레이팅시킨다. BMP 경로를 VEGF (5 ng/ml), 액티빈/노달 (SB-431542 5.4 μM) 및 Wnt (DKK1 150 ng/ml) 억제제의 존재하에서 48시간의 기간 (D4-D6) 동안 조작한다. 특정화 이후, 배양물을 9일 동안 VEGF 중에 유지시킨 후, 유세포 측정법에 의해 cTnT+ 심근세포의 존재에 대하여 분석한다.
도 2. BMP4가 hESC 유래 중배엽으로부터의 심근세포의 특정화를 조절한다. ( a) 4일째 및 5일째 KDR+ 및 PDGFRα+ 집단의 존재, 및 비처리 (대조군), BMP4 (10 ng/ml) 또는 BMP4 억제제 노긴 (400 ng/ml) 처리 후 배양 15일째의 cTnT+ 발현을 보여주는 유세포 측정 분석. ( b) 상기와 같이 처리된 배양물 중 15일째의 웰당 세포 총 개수. 오차 막대는 3회 실험으로부터 얻은 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다.
도 3. BMP 신호전달은 hESC 유래 중배엽으로부터 심근세포를 용량 의존적으로 특정화한다. 명시된 양의 BMP4 또는 노긴으로 처리된 집단으로부터 생성된 15일째의 배양물 중 cTnT+ 세포의 비율(%)을 보여주는 유세포 측정 분석에 대하여 그래프로 나타낸 것이다. NT = 비처리. 막대는 3회의 독립 실험 (N=3)으로부터 얻은 값의 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다; 비처리와 비교하였을 때, *P≤0.05, **P≤0.01.
도 4. BMP 처리 이후의 심근 및 심장외막 마커의 qRT - PCR 발현. 비처리 (대조군), BMP4 처리된 세포 또는 노긴 (400 ng/ml) 처리된 세포로부터 생성된 집단 중 6, 8, 10, 12, 및 15일째의 배양물에서의 명시된 유전자의 qRT-PCR 기반 발현. 값은 하우스키핑 유전자 TBP에 대해 상대적인 값이다. 오차 막대는 3회의 독립 실험 (N=3)으로부터 얻은 값의 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다; 비처리와 비교하였을 때, *P≤0.05, **P≤0.01.
도 5. BMP4 유도된 세포가 심장외막 마커 WT1.B를 발현한다. 배양 15일째 비처리 (대조군), BMP4 (10 ng/ml) 처리된 세포 및 노긴 (400 ng/ml) 처리된 세포 중의 cTnT 및 WT1의 존재를 보여주는 형광성 면역염색 분석. DAPI 염색은 세포 핵을 나타낸다.
도 6. WT1 + 심장외막은 계대 이후에 상피판을 생성한다. ( a) 배양 15일째 BMP4 (10 ng/ml) 처리된 심장외막 세포의 형태 및 ZO1 및 WT1의 존재를 보여주는 위상차 현미경 검사 및 형광성 면역염색. DAPI 염색은 세포 핵을 나타낸다. 스케일 막대는 100 μM을 나타낸다. ( b) 계대 후 4일째 (15+4일째) BMP4 (10 ng/ml) 처리된 심장외막 세포의 형태 및 ZO1 및 WT1의 존재를 보여주는 위상차 현미경 검사 및 형광성 면역염색. DAPI 염색은 세포 핵을 나타낸다. 스케일 막대는 100 μM을 나타낸다.
도 7. 15일째 심근세포 , 15일째 심장외막 , 및 계대 후 심장외막에서의 세포 표면 마커의 발현에 대한 유세포 측정 분석. 15일째 심근세포, 15일째 심장외막 및 계대 후 4일째 (15+4일째) 심장외막 상의 명시된 마커에 대한 유세포 측정 분석. 회색 채움 히스토그램은 비염색된 형광 강도를 나타낸다.
도 8. 심근세포 및 심장외막 세포는 4일째 PDGFRα + 중배엽으로부터 유래된다. (a) PDGFR+ 및 PDGFR- 집단을 4일째 EB로부터 단리시키고, 심근세포 또는 WT1+ 세포 발생을 지원하는 조건하에 플레이팅시켰다. ( b) 심장발생촉진 조건하에 플레이팅된 15일째 배양물 중의 cTnT+ 세포를 보여주는 유세포 측정 분석. (c) 전심장외막 유도 조건 (BMP4)하에 플레이팅된 15일째 배양물 중의 WT1 양성 세포의 존재에 대한 형광성 면역염색. DAPI 염색은 세포 핵을 나타낸다. ( d) 전심장외막 조건하의 배양 후 D15일 때 분류된 집단 중 심장외막 마커인 WT1 및 TBX18의 qRT-PCR 기반 발현 분석. 값은 비분류 배양물에 대해 상대적인 변화 배수(fold change)이다. 오차 막대는 3회의 독립 실험 (N=3)으로부터 얻은 값의 평균의 표준 편차를 나타낸다; 비분류 배양물과 비교하였을 때, *P≤0.05, **P≤0.01.
도 9. BMP 및 Wnt 신호전달이 심근세포 및 심장외막 세포 특정화를 조정한다. ( a) 비처리된 세포 (대조군), 또는 명시된 양의 DKK1 또는 CHIR과 함께 조합하여 BMP4 (10 ng/ml) 또는 BMP 억제제 도소모르핀 (DM 4 μM)으로 처리된 세포로부터 생성된 15일째 배양물 중의 cTnT+ 세포 비율(%)을 보여주는 유세포 측정 분석에 대하여 그래프로 나타낸 것이다. 오차 막대는 3회의 독립 실험 (N=3)으로부터 얻은 값의 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다; BMP 경로의 명시된 조작과 관련하여 'Wnt 비처리' (NT) 대조군과 비교하였을 때, *P≤0.05, **P≤0.01. (b) 비처리된 세포 (대조군), 또는 명시된 양의 DKK 또는 CHIR과 함께 조합하여 BMP4 (10 ng/ml) 또는 DM (4 μM)으로 처리된 세포로부터 생성된 15일째 배양물 상의 WT1 발현에 대한 qRT-PCR 기반 분석. 값은 하우스키핑 유전자 TBP에 대해 상대적인 값이다. 오차 막대는 3회의 독립 실험 (N=3)으로부터 얻은 값의 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다; BMP 경로의 명시된 조작과 관련하여 'Wnt 비처리' (NT) 대조군과 비교하였을 때, *P≤0.05, **P≤0.01. ( c) 비처리된 세포 (대조군), 또는 명시된 양의 XAV939 (XAV)와 함께 조합하여 BMP4 (10 ng/ml) 또는 DM (4 μM)으로 처리된 세포로부터 생성된 15일째 배양물 중의 cTnT+ 세포 비율(%)을 보여주는 유세포 측정 분석 및 WT1 발현에 대한 qRT-PCR 분석. 오차 막대는 3회의 독립 실험 (N=3)으로부터 얻은 값의 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다; 특정 BMP 처리와 관련하여 Wnt 비처리 (도 9a 및 9b 참조)와 비교하였을 때, *P≤0.05, **P≤0.01. (d) 비처리된 세포 (대조군), 또는 명시된 양의 IWP2와 함께 조합하여 BMP4 (10 ng/ml) 또는 DM (4 μM)으로 처리된 세포로부터 생성된 15일째 배양물 중의 cTnT+ 세포 비율(%)을 보여주는 유세포 측정 분석 및 WT1 발현에 대한 qRT-PCR 분석. 오차 막대는 3회의 독립 실험 (N=3)으로부터 얻은 값의 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다; 특정 BMP 처리와 관련하여 Wnt 비처리 (도 9a 및 9b 참조)와 비교하였을 때, *P≤0.05, **P≤0.01.
도 10. 센다이 바이러스 유래 hiPSC 및 H7 hESC로부터의 WT1 + 심장외막 세포 생성. (a) hiPSC 유래 심장외막 배양물 중의 WT1 및 ZO1의 발현을 보여주는 형광성 면역염색. DAPI 염색은 세포 핵을 나타낸다. 도해는 조작 및 분석 시기를 나타낸 것이다. (b) H7 hESC 유래 심장외막 배양물 중의 WT1 및 ZO1의 발현을 보여주는 형광성 면역염색. DAPI 염색은 세포 핵을 나타낸다. 도해는 조작 및 분석 시기를 나타낸 것이다.
도 11. WT1 + 심장외막 세포는 TGFβ1 및 bFGF 처리에 대한 반응으로 EMT를 거친다. (a) EMT 유도를 위해 사용된 프로토콜의 도해. 15일째 WT1+ 배양물을 계대하고, 1일 동안 정착시킨 후, 이어서, 4일 동안 TGFβ1 (5 ng/ml)로 처리한 후, 비처리하거나 (TGFβ), 4일 동안 TGFβ1 (5 ng/ml)로 후속 처리한 후, 4일 동안 bFGF (10 ng/ml)로 처리하거나 (TGFβ+bFGF), 또는 8일 동안 bFGF (10 ng/ml) 처리한다 (bFGF). 배양물 비처리가 대조군으로서의 역할을 한다. ( b) EMT 개시 후 8일째 배양물을 세포 표면 중간엽 마커인 CD90에 대하여 유세포 측정 분석. 회색 채움 히스토그램은 대조군 배양물 형광 강도를 나타낸다. ( c) EMT 개시 후 2, 4, 6 및 8일째 심장외막 유전자인 WT1 및 EMT 유도된 유전자인 SNAI1 및 SNAI2의 qRT-PCR 기반 발현. 값은 실험 매칭된 계대 이전의 15일째 WT1+ 배양물에 대해 상대적인 변화 배수로서 표현된 것이다. 오차 막대는 3회의 독립 실험 (N=3)으로부터 얻은 값의 평균의 표준 편차를 나타낸다; 비처리 대조군과 비교하였을 때, *P≤0.05, **P≤0.01.
도 12. EMT에 대한 반응으로 WT1 및 ZO1 발현은 상실된다. 명시된 인자에 의한 EMT 개시 이후 8일째 심장외막 배양물에서의 세포 형태 및 ZO1 및 WT1 단백질의 발현을 보여주는 위상차 및 형광성 면역염색. DAPI 염색은 세포 핵을 나타낸다.
도 13. EPDC는 형광성 면역염색법에 의해 섬유모세포 및 혈관 평활근 세포 마커의 특징적인 발현을 나타낸다. 명시된 인자에 의한 EMT 개시 이후 8일째 배양물 중의 α-평활근 액틴 (SMA) 및 비멘틴 (VIM) 단백질을 보여주는 형광성 면역염색. DAPI 염색은 세포 핵을 나타낸다.
도 14. EPDC는 qRT - PCR에 의해 섬유모세포 및 혈관 평활근 세포 마커 의 특징적인 발현을 나타낸다. EMT 개시 이후 8일째 명시된 배양물 중의 평활근 유전자인 CCN1, MYH11, TAGLN 및 SMTN , 및 심장외막/심장 섬유모세포 유전자인 TCF21의 qRT-PCR 기반 발현 분석. 값은 실험 매칭된 계대 이전의 15일째 WT1+ 심장외막 배양물에 대해 상대적인 변화 배수로서 표현된 것이다. 오차 막대는 3회의 독립 실험 (N=3)으로부터 얻은 값의 평균의 표준 편차를 나타낸다; 비처리 대조군 배양물과 비교하였을 때, *P≤0.05, **P≤0.01.
도 15. hESC 심장외막 유래 평활근-유사 세포는 자극을 받았을 때 활동 전위를 생성한다.
(a) 명시된 처리에 대하여 EMT 유도된 배양물 중 활동적으로 사이클링하는 세포의 총 비율을 측정하였다. TGFβ+bFGF 처리가 효능제에 대한 반응으로 가장 큰 비율로 활동적으로 사이클링하는 세포를 포함하는 집단을 생성하였다. 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다; N=3/군; 터키 사후검정과 함께 일원 ANOVA에 의해 비교하였을 때, *P<0.05, **P<0.01.
(b) 기준선에서 및 NE 및 PE 첨가 이후에 명시된 바와 같은 조건하에서 활동적으로 사이클링하는 세포에서의 칼슘 사이클 빈도. 중첩 막대는 기준선 기록 동안 (평행선 음영 표시), 및 NE (흰색) 또는 PE (검은색) 처리 이후 칼슘 사이클링 빈도에의 기여를 나타내는 것이다.
(c) EMT 유도된 배양물에서의 NE 및 PE 첨가 이후의 칼슘 과도 상태의 진폭. 비처리 NE N=6 세포, PE N=4 세포; TGFβ NE N=6 세포, PE N=12 세포; TGFβ+bFGF NE N=13 세포, PE N=25 세포. 터키 사후검정과 함께 일원 ANOVA에 의해 비교하였을 때, *P<0.05.
(d) EMT 유도된 배양물에서의 NE 및 PE 첨가 이후의 칼슘 과도 상태의 지속 기간. 비처리 NE N=6 세포, PE N=4 세포; TGFβ NE N=6 세포, PE N=12 세포; TGFβ+bFGF NE N=13 세포, PE N=25 세포. 터키 사후검정과 함께 일원 ANOVA에 의해 비교하였을 때, **P<0.01.
도 16. hESC 심장외막 유래 섬유모세포-유사 세포가 3D 겔을 침습한다.
(a) EMT 유도 후 8일째 마트리겔 침습 검정의 XY면 (상면도) 및 3D 재구성 (측면도)을 나타낸 대표 시계.
(b) EMT 개시 후 D8일 때의 최대 마트리겔 침습 깊이. 막대는 3회의 독립 실험 (N=3)으로부터 얻은 값의 평균의 표준 오차를 나타낸다; 스튜던츠 T 검정에 의해 분석된 바, 비처리 대조군과 비교하였을 때, **P≤0.01.
도 17. WT1 + 심장외막 세포는 계대 후 ALDH1A2 발현을 상향조절하고, 알데히드 데히드로게나제 활성을 나타낸다. ( a) D15 WT+ 심장외막 배양물 및 계대 이후의 15+8일째 비처리된 심장외막 배양물 중의 ALDH1A1, ALDH1A2 및 ALDH1A3의 qRT-PCR 기반 발현 분석. 값은 하우스키핑 유전자 TBP에 대해 상대적인 값이다. 오차 막대는 3회의 독립 실험 (N=3)으로부터 얻은 값의 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다; ALDH1A2 발현 수준과 비교하였을 때, *P≤0.05, **P≤0.01. ( b) EMT 개시 후 2, 4, 6 및 8일째의 ALDH1A2의 qRT-PCR 기반 발현 분석. 값은 실험 매칭된 계대 이전의 15일째 WT1+ 심장외막 배양물에 대해 상대적인 변화 배수로서 표현된 것이다. 오차 막대는 3회의 독립 실험 (N=3)으로부터 얻은 값의 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다; 비처리 대조군 배양물과 비교하였을 때, *P≤0.05, **P≤0.01. (c) 4일째 내지 6일째 DM (비-심장, 비-심장외막), BMP4+XAV (심근세포) 또는 BMP4+CHIR (WT1+ 심장외막 세포)로 처리된 세포로부터 생성된 15일째 집단 상의 알데플루오르(Aldefluor)의 유세포 측정 분석. ( d) 명시된 처리에 의한 EMT 개시 이후 8일째 WT1+ 심장외막 유래 배양물 상의 알데플루오르의 유세포 측정 분석.
도 18. hPSC 유래 중배엽으로부터의 심근세포 , 심장외막 , 및 EPDC 발생을 보여주는 분화 도해이다.
I. 정의
본원에서 사용되는 바, "액티빈 성분"이라는 용어는 노달 신호 전달, 임의적으로, 액티빈 A 활성을 활성화시키는 분자, 예컨대, 액티빈 A 및/또는 노달을 포함하는 하나 이상의 성분, 또는 상기 성분(들)을 포함하는 조성물, 임의적으로, 배양 배지를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "액티빈" 또는 "ActA"라는 용어는 예를 들어, "액티빈 A" (예를 들어, 유전자 ID: 3624), 예를 들어, 인간 액티빈 A 뿐만 아니라, 예를 들어, 노달 신호 전달을 활성화시킬 수 있는, 임의적으로, 천연적으로 발생된 활성 접합체 및 단편을 비롯한, 그의 활성 접합체 및 단편 뿐만 아니라, 천연적으로 발생된 활성 접합체 및 단편을 비롯한 그의 활성 접합체 및 단편을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "액티빈/노달 억제제" 및/또는 "액티빈/노달/TGF-βR 억제제"라는 용어는 액티빈/노달 경로의 신호를 억제하는 임의의 분자, 및 특히, 수용체 ALK4, ALK7 및/또는 TGF-βRI를 억제하는 임의의 분자를 의미하며, SB431542 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich)) A83-01 (토크리스(Tocris), 2929), D 4476, GW 788388, LY 364947, RepSox, SB 505124, SB 525334 (시그마 알드리치), 및 SD 208을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "wnt 억제제"라는 용어는 wnt 신호 전달을 억제하는 임의의 화합물 및/또는 단백질을 비롯한 임의의 작용제를 의미하며, Wnt 리간드 그 자체 또는 Wnt 수용체에 결합하는 wnt 길항제, 예컨대, Dickkopf (Dkk) 단백질, Wnt 억제 인자-1 (WIF-1), 및 분비된 프리즐드-관련 단백질(sFRP: secreted Frizzled Related Proteins) 뿐만 아니라, wnt 역전 효능제 (예컨대, 효능제와 같은 수용체에 결합하지만, 효능제의 것과 반대되는 약리학적 반응을 유도하는 작용제)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. Wnt 억제제의 예로는 XAV939, wnt 프로세싱 억제제인 IWP 2, 및 β-카테닌-반응성 전사 (CRT)의 강력한 억제제인 iCRT14 (이들 둘 모두 토크리스 바이오사이언스(Tocris Bioscience)로부터 이용가능) 뿐만 아니라, 그의 조합을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "wnt 성분"이라는 용어는 심혈관 세포에서 wnt/베타-카테닌 수용체 신호전달을 활성화시키는 임의의 분자를 의미하고, 예를 들어, Wnt3a 및 뿐만 아니라, GSK3 선택성 억제제, 예컨대, CHIR99021 (스테몰레큘(Stemolecule)™ CHIR99021 스템젠트(Stemgent)), 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (바이오(BIO)) (케이만 케미칼(Cayman Chemical) (cat:13123)), 또는 스템젠트로부터의 스테몰레큘™ 바이오 (cat:04003)를 포함한다. CHIR99021은 GSK3의 선택성 억제제이다. 고려되는 GSK3 선택성 억제제는 예를 들어, Wnt 신호전달 경로에서 GSK-3α/β에 대한 선택성 억제제이다.
본원에서 사용되는 바, "FGF 성분"이라는 용어는 예를 들어, FGF를 비롯한 분자, 예컨대, 시토카인, 또는 FGF 신호전달 경로를 활성화시키는, 예컨대, FGF 수용체에 결합하고, 그를 활성화시키는 소형 분자를 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "FGF"라는 용어는 임의의 섬유모세포 성장 인자, 예를 들어, 인간 FGF1 (유전자 ID: 2246), FGF2 (이는 또한 bFGF로도 공지됨; 유전자 ID: 2247), FGF3 (유전자 ID: 2248) , FGF4 (유전자 ID: 2249), FGF5 (유전자 ID: 2250), FGF6 (유전자 ID: 2251), FGF7 (유전자 ID: 2252), FGF8 (유전자 ID: 2253), FGF9 (유전자 ID: 2254) 및 FGF10 (유전자 ID: 2255) (임의적으로, 천연적으로 발생된 활성 접합체 및 단편을 비롯한, 그의 활성 접합체 및 단편 포함)을 지칭한다. 특정 실시양태에서, FGF는 bFGF, FGF10, FGF4 및/또는 FGF2이다.
본원에서 사용되는 바, "BMP 성분"이라는 용어는 예를 들어, BMP4 및 BMP2를 비롯한, BMP4에 대한 수용체를 활성화시키는 임의의 분자, 임의적으로, 임의의 BMP 또는 성장 및 분화 인자 (GDF)를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "BMP 억제제"라는 용어는 BMP 신호전달의 임의의 억제제를 의미하고, 예를 들어, 1형 BMP 수용체 억제제, BMP 리간드 및/또는 가용성 BMP 수용체를 포함한다. 도소모르핀 (DM), 노긴, 코르딘(Chordin), LDN-193189, 가용성 BMPR1a, 및/또는 가용성 BMPR1b로부터 임의적으로 선택된다.
본원에서 사용되는 바, "BMP4" (예를 들어, 유전자 ID: 652)라는 용어는 골 형태 형성 단백질 4, 예를 들어, 인간 BMP4 뿐만 아니라, 예를 들어, BMP4 수용체 신호전달을 활성화시킬 수 있는, 임의적으로, 천연적으로 발생된 활성 접합체 및 단편을 비롯한, 그의 활성 접합체 및 단편을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "BMP 성분으로 프라이밍된 hPSC"라는 용어는 12시간 이상, 바람직하게, 24시간 이상, 또는 더욱 바람직하게, 48시간 이상 동안 BMP 성분과 접촉된 hPSC를 의미한다. 전형적으로, 상기 세포는 배상체 또는 단일층 배양물 중에 존재한다.
"심혈관 계통 세포"라는 용어는 심혈관 중배엽, 심근세포 또는 심장외막 유전자 발현 패턴을 발현하는, 예를 들어, KDR, PDGFRα, NK2 호메오박스 5 (NKX2-5), 심장 트로포닌 T (cTnT), 신호 조절성 단백질 알파 (SIRPA) 또는 빌름스 종양 1 (WT1)을 발현하며, 프라이밍되어 본원에 기술된 바와 같은 심근세포 계통 세포 및/또는 심장외막 계통 세포 또는 심장외막 유래 세포 (EPDC), 예컨대, 혈관 평활근 유사 세포 또는 섬유모세포 유사 세포로 분화되거나, 또는 그와 같이 분화될 수 있는 능력을 가지는 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "심혈관 중배엽 프로그래밍 칵테일"이라는 용어는 BMP 성분 및 액티빈 성분, 및 임의적으로, FGF 성분을 포함하는 조합물이고, 심혈관 중배엽 프로그래밍 칵테일을 hPSC와 함께 약 3 내지 약 5일 동안 접촉시킨다.
본원에서 사용되는 바, "심혈관 전구체 특정화 칵테일"이라는 용어는 NKX2-5+ 또는 WT1+ 심혈관 전구체 세포 집단을 특정화시키기 위한 하나 이상의 성분, 상기 성분(들)을 포함하는 조성물, NKX2-5+ 심근세포 계통 전구체 세포 집단을 특정화시키기 위한 심근세포 촉진 성분, 또는 WT1+ 심장외막 계통 전구체 세포 집단을 특정화시키기 위한 심장외막 촉진 성분을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "심근세포 촉진 성분"이라는 용어는 1) Wnt 억제제, 임의적으로, DKK1, XAV939 및 IWP2로부터 선택되는 것, 및 BMP 성분, 임의적으로, 여기서, BMP 성분이 0.01 ng/mL 이상, 0.05 ng/mL 이상, 0.1 ng/mL 이상, 0.5 ng/mL 이상, 1.25 ng/mL 이상, 2.5 ng/mL 이상, 5 ng/mL 이상이되, 10 ng/ml 미만, 또는 15 ng/ml 미만, 또는 바람직하게, 약 0.5 ng/mL인 농도의 BMP4인 성분의 조합물; 또는 2) BMP 억제제, 예컨대, 노긴 또는 도소모르핀, 예를 들어, 200 ng/mL 미만, 150 ng/mL 미만, 100 ng/mL 미만, 50 ng/mL 미만, 또는 25 ng/mL 미만 및/또는 12.5 ng/mL 초과인 농도의 노긴; 3) 예를 들어, 생산된 내인성 BMP4가 충분히 존재하는 Wnt 억제제 및/또는 4) BMP 성분, 임의적으로, 예를 들어, BMP4가 0.63 ng/mL 미만, 0.5 ng/mL 미만, 0.4 ng/mL 미만, 또는 0.3 ng/mL 미만인 농도로 존재하는 BMP4로 이루어진 심근세포 계통 농축물을 포함하는 것인 하나 이상의 성분 또는 상기 성분(들)을 포함하는 조성물을 의미한다. 유효 농도 및/또는 조합은 NKX2-5 발현 및/또는 TNNT2/cTnT 발현을 모니터링하고, 최적화시킴으로써 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "심장외막 계통 촉진 성분"이라는 용어는 BMP 성분, 임의적으로, BMP4, 및 임의적으로, Wnt 성분으로 이루어진 심장외막 계통 촉진 농축물을 포함하는 것인 하나 이상의 성분 또는 상기 성분(들)을 포함하는 조성물을 의미한다. 임의적으로, BMP4는 1.25 ng/mL 이상, 2.5 ng/mL 이상, 5 ng/mL 이상, 또는 10 ng/mL 이상인 농도로 존재하고/거나, Wnt 성분은 CHIR99021이다. 유효 농도 및/또는 조합은 WT1 발현, 바소뉴클린 1 (BNC1) 발현, 아넥신 A8 (ANXA8) 발현 및/또는 T-box 18 (TBX18) 발현을 모니터링하고, 최적화시킴으로써 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "심근세포 계통 세포"라는 용어는 NKX2-5+이고, 예를 들어, 본원에 기술된 방법을 사용하여 심근세포로 분화될 수 있는 세포를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "심장외막 계통 세포"라는 용어는 WT1+이고, 예를 들어, 본원에 기술된 방법을 사용하여 심장외막 세포, 및/또는 심장외막 유래 세포 (EPDC)로 분화될 수 있는 세포를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "배양하는"이라는 용어는 단일층, 비드, 플라스크, 또는 3D 배양물을 비롯한, 세포 집단을 유지시키고/거나, 증식시키는 시험관내 방법으로서, 임의적으로는 주변 조건이 인큐베이터에서와 같이 제어되는 것인 방법을 포함하며, 임의적으로, 세포를 계대하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "상피-중간엽 전이 (EMT) 칵테일"이라는 용어는 EMT를 유도하기 위한, TGFβ 성분, 예컨대, TGFβ 또는 TGFβ 성분 및 FGF 성분, 예컨대, bFGF를 포함하는 조합물을 포함하는 것인 하나 이상의 성분 또는 상기 성분(들)을 포함하는 조성물을 의미한다.
또는 본원에서 사용되는 바, "TGFβ 성분"이라는 용어는 TGFβ 신호전달을 촉진시키는 성분 또는 상기 성분을 포함하는 조성물을 의미하며, 예를 들어, TGFβ1, TGFβ2 및/또는 TGFβ3을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "KDR+ 세포"라는 용어는 "키나제-인서트 도메인-함유 수용체" (KDR) 세포 표면 발현을 보이는 세포를 의미하며, "KDR+ 세포 집단"이란 세포 중 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 또는 그 초과의 세포가 KDR 세포 표면 발현을 보이는 세포 집단을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "PDGFRα+ 세포"라는 용어는 "혈소판 유래 성장 인자 수용체 α" 세포 표면 발현을 보이는 세포를 의미하며, PDGFRα+ 세포 집단이란 세포 중 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 또는 그 초과의 세포가 PDGFRα 세포 표면 발현을 보이는 세포 집단을 의미한다.
"농도"라는 용어는 세포 배양 배지 중에 희석된 농도를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 본원에서 사용되는 세포 집단과 관련하여 "정제된 집단"이라는 용어는 세포 및/또는 다른 성분으로 이루어진 혼합된 또는 불균질 집단, 예컨대, 배양 배지로부터 제거되고, 분리된 (예컨대, 단리된) 세포 집단을 의미한다. 일부 실시양태에서, 정제된 집단은 세포 단리 또는 강화 기점이 된 불균질 집단과 비교하여 실질적으로 순수한 세포 집단이다.
특정 세포 집단과 관련하여 "실질적으로 순수한"이라는 용어는 전체 세포 집단을 구성하는 세포에 대해 상대적으로 약 65% 이상, 바람직하게, 약 75% 이상, 약 85% 이상, 더욱 바람직하게, 약 90% 이상, 및 가장 바람직하게, 약 95% 이상 순수한 세포 집단을 의미한다. 유사하게, "실질적으로 순수한"이라는 것과 관련하여, 예를 들어, WT1+ 세포 집단은 WT1+이 아닌 세포를 약 30% 미만, 약 20% 미만, 더욱 바람직하게, 약 15%, 10%, 8%, 7% 미만, 가장 바람직하게, 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만, 또는 1% 미만으로 함유하는 세포 집단을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "대상체"라는 용어는 포유동물을 비롯한, 동물계의 모든 구성원을 포함하고, 적합하게는 인간을 지칭한다.
세포에 적용될 때, "처리하다," "처리하는," "처리"라는 용어 등은 세포를 임의의 종류의 프로세스 또는 조건에 적용하거나, 또는 임의의 종류의 조작 또는 절차를 세포에 대해 수행하는 것을 포함한다. 대상체에게 적용될 때, 본 용어는 의학적 또는 외과적 치료, 돌봄 또는 관리를 개체에게 제공하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 대상체에게 적용될 때, "치료"라는 용어는 임상적 결과를 비롯한, 유익한 또는 원하는 결과를 얻고자 하는 접근법을 의미하며, 암 치료를 위한 예를 들어, 제약적 개입, 수술, 방사선 요법 및 자연 요법적 개입 뿐만 아니라, 검사 치료를 비롯한 의학적 시술 및 적용을 포함한다. 유익한 또는 원하는 임상적 결과로는 검출가능한지 또는 검출불가능한지 여부와는 상관없이, 하나 이상의 증상 또는 병태의 경감 또는 호전, 질환 정도의 감소, 질환 상태 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질환 확산 예방, 질환 진행 속도 지연 또는 저속화, 질환 상태 호전 또는 일시적 완화, 및 (부분적인지 또는 전체적인지 상관없이) 관해를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. "치료"는 또한 치료받지 않은 경우에 예상되는 생존 기간과 비교하여 생존 기간을 연장시키는 것을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "투여하는," "도입하는" 및 "이식하는"이라는 용어는 도입되는 세포를 요구되는 부위에 적어도 부분적으로 국재화하는 방법 또는 경로에 의해 세포를 대상체 내로 도입하는 측면에서 상호교환가능하게 사용된다.
"접촉시키는"이라는 용어는 성분(들) 및 세포를 함께 시험관내에서 인큐베이션시키는 것 (예컨대, 화합물을 배양물 중 세포에 첨가하는 것)을 포함하는 것으로 하며, 접촉시키는 단계는 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포는 부착 배양으로, 또는 현탁 배양으로, 또는 3D 배양으로 처리될 수 있거나, 또는 세포가 비드 상에서 배양되는 경우, 칵테일 성분은 시간상 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 (예컨대, 제1 성분 첨가로부터 1시간 이내에) 첨가될 수 있다. 세포는 또한 세포를 안정화하거나, 또는 세포를 추가로 분화시키기 위해 또 다른 작용제, 예컨대, 성장 인자 또는 다른 분화제 또는 환경과 접촉될 수 있고, 예를 들어, 실시예에서 추가로 기술되는 바와 같이, 예를 들어, 만능성 (및/또는 분화된) 집단의 배양을 위해 관련 기술분야에 공지된 조건하에서 세포를 배양하는 것을 포함한다.
본원에서 지칭되는 바, "세포 배양 배지" (이는 또한 본원에서 "배양 배지" 또는 "배지"로도 지칭된다)라는 용어는 세포 생존가능성을 유지시키고, 증식 및 임의적으로, 분화를 지지하는 영양소를 함유하는, 세포를 배양하기 위한 배지이다. 세포 배양 배지는 하기의 것 중 임의의 것을 적절한 조합으로 함유할 수 있다: 염(들), 완충제(들), 아미노산, 글루코스 또는 다른 당(들), 항생제, 혈청 또는 혈청 대체물, 및 다른 성분, 예컨대, 펩티드 성장 인자, 비타민 등. 통상적으로 특정 세포 유형에 사용되는 세포 배양 배지는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 바, "만능 줄기 세포"라는 용어는 상이한 조건하에서 1개 초과의 분화된 세포 유형으로 분화될 수 있는 능력, 및 예를 들어, 3개의 배세포 층의 특징을 나타내는 세포 유형으로 분화될 수 있는 능력을 가진 세포를 의미하고, 배아 줄기 세포 및 유도된 만능 줄기 세포를 포함한다. 만능성 세포는 예를 들어, 누드 마우스 기형종 검정법을 사용하여 1개 초과의 세포 유형으로 분화될 수 있는 그의 능력에 의해 특징화된다. 만능성은 또한 배아 줄기 (ES) 세포 마커의 발현에 의해 입증된다. 본원에서 사용되는 바, 만능성 줄기로는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC) 및 배아 줄기 세포 (ESC)를 비롯한 세포주를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포가 아니다.
본원에서 사용되는 바, "iPSC" 및 "유도된 만능 줄기 세포"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 이는 예를 들어, (제한 없이, SOX2 (유전자 ID; 6657), KLF4 (유전자 ID; 9314), cMYC (유전자 ID; 4609), NANOG (유전자 ID; 79923), LIN28/ LIN28A (유전자 ID; 79727)와 함께 조합된 POU4F1/OCT4 (유전자 ID; 5460)을 비롯한) 하나 이상의 유전자의 발현을 유도함으로써 비-만능 세포, 전형적으로, 성체 체세포로부터 인공적으로 유래된 (예컨대, 유도된, 또는 완전한 역전에 의한) 만능 줄기 세포를 의미한다.
"배아 줄기 세포"라는 용어는 배아 배반포의 내부 세포 매스의 만능 줄기 세포를 의미하는 것으로 사용된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,843,780, 6,200,806 참조). 상기 세포는 또한 체세포 핵 전달로부터 유래된 배반포의 내부 세포 매스로부터 수득할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,945,577, 5,994,619, 6,235,970 참조). 배아 줄기 세포의 독특한 특징이 배아 줄기 세포 표현형을 정의한다. 따라서, 세포가 다른 세포와 구별될 수 있도록 하는 배아 줄기 세포의 하나 이상의 특유한 특징을 가진다면, 세포는 배아 줄기 세포의 표현형을 가진다. 예시적인 독특한 배아 줄기 세포 특징으로는 제한 없이, 유전자 발현 프로파일, 증식 능력, 분화 능력, 핵형, 특정 배양 조건에 대한 반응성 등을 포함한다.
"발현"이라는 용어는 적용가능한 경우, 제한하는 것은 아니지만, 예를 들어, 전사, 번역, 폴딩, 변형 및 프로세싱을 포함하는, RNA 및 단백질, 및 적절한 경우, 분비 단백질의 생산에 관여하는 세포 과정, 및 세포 표면 발현을 의미한다. "발현 생성물"로는 유전자로부터 전사된 RNA 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득되는 폴리펩티드를 포함한다.
본 개시내용의 범주를 이해할 때, 본원에서 사용되는 바, "~을 포함하는(comprising)"이라는 용어 및 그의 파생어는 언급된 특징, 요소, 성분, 군, 정수, 및/또는 단계가 존재한다는 것을 명시하지만, 언급되지 않은 다른 특징, 요소, 성분, 군, 정수, 및/또는 단계의 존재도 배제시키지는 않는 것인 개방형 용어인 것으로 한다. 상기 용어는 또한 유사한 의미를 가지는 단어들, 예컨대, "~을 포함하는(including)," "가지는"이라는 용어 및 그의 파생어에도 적용된다. 마지막으로, 본원에서 사용되는 바, 정도를 나타내는 용어, 예컨대, "실질적으로," "약" 및 "대략"이라는 용어는 최종 결과에는 유의적인 변화가 없도록 하는 수식된 용어의 합리적인 편차량을 의미한다. 이러한 정도를 나타내는 용어는 상기와 같은 편차가 수식되는 단어의 의미를 무효화하지 않는다면, 수식되는 용어의 ±5% 이상의 편차를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 개시내용의 범주를 이해할 때, 본원에서 사용되는 바, "~으로 이루어진"이라는 용어 및 그의 파생어는 언급된 특징, 요소, 성분, 군, 정수, 및/또는 단계가 존재한다는 것을 명시하고, 이는 또한 언급되지 않은 다른 특징, 요소, 성분, 군, 정수, 및/또는 단계의 존재는 또한 배제시키는 것인 폐쇄형 용어인 것으로 한다.
본원에서 종점으로 수치 범위를 언급한 것은 그 범위 내에 포함된 모든 수치 및 분수값을 포함한다 (예컨대, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.90, 4, 및 5를 포함한다). 모든 수치 및 그의 분수값은 "약"이라는 용어로 수식되는 것으로 추정된다는 것도 이해하여야 한다. 추가로, "하나(a, an)," 및 "그"라는 것은 문맥상 달리 명백하게 명시되지 않는 한, 복수 개의 지시 대상을 포함한다는 것을 이해하여야 한다. "약"이라는 용어는 언급된 수치의 ± 0.1 내지 50%, 5-50%, 또는 10-40%, 바람직하게, 10-20%, 더욱 바람직하게, 10% 또는 15%를 의미한다.
추가로, 특정 섹션에서 기술된 정의 및 실시양태는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 적합한 것으로 기술된 본원의 다른 실시양태에도 적용가능한 것으로 한다. 예를 들어, 하기 구절에서 본 발명의 상이한 측면이 더욱 상세하게 정의된다. 그렇게 정의된 각 측면은 명백하게 반대로 명시되지 않는 한, 임의의 다른 측면 또는 측면들과 함께 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나, 또는 이로운 것으로 명시된 임의의 특징은 바람직하거나, 또는 이로운 것으로 명시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 함께 조합될 수 있다.
II. 방법 및 생성물
본원에서는 심근세포 계통 세포, 심장외막 계통 세포 및 심장외막 유래 세포를 포함하는 심혈관 계통 세포를 생산하는 방법을 기술한다. 이러한 세포 유형을 특정화하기 위한 성분 및 조건 뿐만 아니라, 이러한 세포 유형의 출현을 모니터링하기 위한 마커를 기술한다.
따라서, 한 측면은 (a) BMP 성분으로 프라이밍된 hPSC를 hPSC가 심혈관 중배엽 세포 집단으로 분화되도록 유도하는 데 적합한 심혈관 중배엽 프로그래밍 칵테일과, 프로그래밍 칵테일이 hPSC에 침투하기에 적합한 조건하에서 접촉시키고, 일정 기간 동안 접촉된 hPSC를 배양하여 KDR+ 및 PDGFRα+ 심혈관 중배엽 세포 집단을 생성하는 단계; (b) 심혈관 중배엽 세포 집단을 NKX2-5+ 또는 WT1+ 심혈관 전구체 세포 집단을 특정화하는 데 적합한 심혈관 전구체 특정화 칵테일과, 특정화 칵테일이 심혈관 중배엽 세포 집단에 침투하기에 적합한 조건하에서 접촉시키고, 일정 기간 동안 접촉된 심혈관 중배엽 세포 집단을 배양하여 NKX2-5+ 또는 WT1+ 심혈관 전구체 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (c) 심혈관 전구체 세포 집단을 성숙 칵테일과, 성숙 칵테일이 심혈관 전구체 세포 집단에 침투하기에 적합한 조건하에서 접촉시키고, 일정 기간 동안 접촉된 심혈관 전구체 집단을 배양하여 심혈관 계통 집단, 임의적으로, 심장 트로포닌 T (cTnT) 및/또는 SIRPA를 발현하는 심근세포 계통 세포 집단, 및/또는 임의적으로, WT1을 발현하고/거나, EPDC를 포함하는 심장외막 계통 세포 집단을 생산하는 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포 (PSC), 임의적으로, 인간 PSC (hPSC)로부터 심혈관 계통 세포 집단, 임의적으로, 심근세포 계통 세포 집단 또는 심장외막 계통 세포 집단을 수득하는 방법을 포함한다.
KDR 및 PDGFRα는 심혈관 중배엽 세포 집단의 발생을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. KDR의 발현은 KDR에 특이적인 항체를 사용하여 모니터링될 수 있고/거나, PDGFRα의 발현은 PDGFRα에 특이적인 항체를 사용하여 모니터링될 수 있다. 상기 둘 모두 세포 표면에서 발현되는 바, KDR 및 PDGFRα 발현은 세포 표면 발현을 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 예를 들어, KDR 및 PDGFRα의 발현은 유세포 측정법을 사용하여 모니터링될 수 있다.
한 실시양태에서, BMP 성분으로 프라이밍된 hPSC는 hPSC를 BMP 성분과 약 1 내지 약 2일 동안 접촉시킴으로써 제조되고, 임의적으로, 여기서, BMP 성분은 BMP4 및/또는 BMP2이다.
한 실시양태에서, 심혈관 중배엽 프로그래밍 칵테일은 BMP 성분 및 액티빈 성분, 및 임의적으로, FGF 성분을 포함하고, 심혈관 중배엽 프로그래밍 칵테일을 hPSC와 약 3 내지 약 5일 동안 접촉시킨다.
한 실시양태에서, FGF 성분은 bFGF를 포함한다.
한 실시양태에서, BMP 성분은 BMP4 및/또는 BMP2를 포함한다.
한 실시양태에서, 액티빈 성분은 액티빈 A를 포함한다.
액티빈 성분 및 BMP 성분의 농도는 기술된 바와 같이 최적화될 수 있다5.
한 실시양태에서, PSC는 배상체에 포함되어 있다.
예를 들어, 상기 단계 a) 및 b)를 사용하여 NKX2-5+ 또는 WT1+ 심혈관 전구체 세포 집단을 수득할 수 있다는 것이 본원에서 입증된다.
따라서, 추가의 측면은 (a) 임의적으로, 상기 기술된 바와 같이, hPSC로부터 KDR+ 및 PDGFRα+ 심혈관 중배엽 세포 집단을 수득하는 단계; (b) KDR+ 및 PDGFRα+ 심혈관 중배엽 세포 집단을 심혈관 전구체 특정화 칵테일과, 특정화 칵테일이 심혈관 중배엽 세포 집단에 침투하기에 적합한 조건하에서 접촉시키고, NKX2-5+ 또는 WT1+ 심혈관 전구체 세포 집단을 생성하는 데 충분한 기간 동안 접촉된 심혈관 중배엽 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하는, PSC, 임의적으로, hPSC로부터 NKX2-5+ 또는 WT1+ 심혈관 전구체 세포 집단을 수득하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, KDR+ 및 PDGFRα+ 심혈관 중배엽 세포 집단은 심혈관 전구체 특정화 칵테일과의 접촉 이전에 해리된다.
일부 실시양태에서, KDR+ PDGFRα+ 발현 세포는 심혈관 전구체 특정화 칵테일과의 접촉 이전에 정제된다.
또 다른 실시양태에서, 심혈관 중배엽 세포 집단을 적어도 12시간 내지 약 48시간 동안, 또는 12 내지 48시간 사이의 임의의 시간량의 기간 동안 심혈관 전구체 특정화 칵테일과 접촉시킨다.
한 실시양태에서, 심혈관 전구체 특정화 칵테일은 심근세포 계통 촉진 성분을 포함하며, 여기서, 심근세포 촉진 성분은 심근세포 발생을 촉진시키는 데 적합한 농도로 존재하고, NKX2-5+ 심혈관 전구체 집단을 특정화시킨다.
한 실시양태에서, 심근세포 촉진 성분은 예를 들어, 심근세포 특정화를 억제하는 수준으로 BMP를 내재적으로 발현하는 심혈관 중배엽 세포 집단과 함께 사용하기 위한 BMP 억제제를 포함한다.
한 실시양태에서, 심근세포 촉진 성분은 200 ng/mL 미만, 150 ng/mL 미만, 100 ng/mL 미만, 50 ng/mL 미만, 또는 25 ng/mL 미만 및/또는 12.5 ng/mL 초과인 농도로 노긴을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 심근세포 촉진 성분은 1 μM 미만, 0.5 μM 미만, 0.25 μM 미만, 또는 0.1 μM 미만인 농도의 도소모르핀이다.
또 다른 실시양태에서, 심근세포 촉진 성분은 0.63 ng/mL 미만, 0.5 ng/mL 미만, 0.4 ng/mL 미만, 또는 0.3 ng/mL 미만인 농도의 BMP4이다.
또 다른 실시양태에서, 심혈관 전구체 특정화 칵테일은 1) Wnt 억제제, 임의적으로, DKK1, XAV939 및 IWP2로부터 선택되는 것, 및 BMP 성분, 임의적으로, 여기서, BMP 성분이 0.01 ng/mL 이상, 0.05 ng/mL 이상, 0.1 ng/mL 이상, 0.5 ng/mL 이상, 1.25 ng/mL 이상, 2.5 ng/mL 이상, 5 ng/mL 이상이되, 10 ng/ml 미만, 또는 15 ng/ml 미만, 또는 바람직하게, 약 0.5 ng/mL인 농도의 BMP4인 성분의 조합물; 또는 2) BMP 억제제, 예컨대, 노긴 또는 도소모르핀, 예를 들어, 200 ng/mL 미만, 150 ng/mL 미만, 100 ng/mL 미만, 50 ng/mL 미만, 25 ng/mL 미만 또는 12.5 ng/mL 초과인 농도의 노긴; 3) 예를 들어, 생산된 내인성 BMP4가 충분히 생산되는 Wnt 억제제; 및/또는 4) BMP 성분, 임의적으로, 예를 들어, BMP4가 0.63 ng/mL 미만, 0.5 ng/mL 미만, 0.4 ng/mL 미만, 또는 0.3 ng/mL 미만인 농도로 존재하는 BMP4로 이루어진 심근세포 계통 농축물을 포함한다. 유효 농도 및/또는 조합은 NKX2-5 발현 및/또는 TNNT2/cTnT 발현을 모니터링하고, 최적화시킴으로써 결정될 수 있다.
예를 들어, 중배엽 세포 집단이 충분한 내인성 BMP 성분을 생산할 때, Wnt 억제제는 심근세포 특정화를 유도하는 데 BMP 없이도 사용될 수 있다.
예를 들어, 중배엽 세포 집단이 내인성 BMP 성분을 불충분하게 생산할 때, BMP 성분은 심근세포 특정화를 촉진시키는 농도로 사용될 수 있다.
분비되는 내인성 성분, 예컨대, BMP4 또는 BMP2 의 수준은 ELISA, 또는 다른 정량적 면역검정법 또는 정량적 RT-PCR에 의해 측정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, KDR+PDGFRα+ 심혈관 중배엽 집단 및/또는 NKX2-5+ 심혈관 전구체 집단은 정제/단리된다.
또 다른 실시양태에서, NKX2-5+ 심혈관 전구체 세포 집단을 임의적으로, VEGF 성분을 포함하는 성숙 칵테일과 추가로 접촉시킨다. 성숙 칵테일은 세포 유형에 적합한 배양 배지일 수 있고/거나, 추가의 성분을 포함할 수 있다.
추가의 측면은 (a) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에 따라 NKX2-5+ 심혈관 전구체 집단을 수득하는 단계; (b) 심혈관 전구체 세포 집단을, VEGF 성분을 포함하는 성숙 칵테일과 성숙 칵테일이 심혈관 전구체 세포 집단에 침투하기에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계; 및 (b) 심장 트로포닌 T (cTnT)를 발현하는 심근세포를 생산하는 데 충분한 기간 동안 접촉된 심혈관 전구체 집단을 배양하는 단계를 포함하는, 심장 트로포닌 T+ (cTnT) 심근세포 계통 세포 집단을 생산하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, NKX2-5+ 심혈관 전구체 집단을 성숙 칵테일과 4일 이상, 예를 들어, 적어도 약 4일, 임의적으로, 약 5일, 약 9일, 약 15일 또는 약 20일, 임의적으로, 성숙 수축성 심근세포가 생산될 때까지 접촉시킨다. 원하는 세포 집단이 수득될 때까지 세포를 배양물 중에 유지시킬 수 있다.
추가의 측면은 (a) 임의적으로, 상기 정의된 바와 같이, hPSC로부터 KDR+ 및 PDGFRα+ 심혈관 중배엽 세포 집단을 수득하는 단계; (b) 심혈관 중배엽 세포 집단을, 심장외막 계통 촉진 성분을 포함하는 심혈관 전구체 특정화 칵테일과 특정화 칵테일이 심혈관 중배엽 세포 집단에 침투하기에 적합한 조건하에서 접촉시키고, WT1+ 심혈관 전구체 세포 집단을 생성하는 데 충분한 기간 동안 접촉된 심혈관 중배엽 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하는, WT1+ 심장외막 계통 세포 집단을 생산하는 방법이다.
한 실시양태에서, 심혈관 전구체 특정화 칵테일은 심장외막 세포 촉진 성분을 포함하고, 임의적으로, 여기서, 심장외막 세포 촉진 성분은 심장외막 세포 발생을 촉진시키는 데 적합한 농도로 BMP4를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 심장외막 세포-촉진 성분은 1.25 ng/mL 이상, 2.5 ng/mL 이상, 5 ng/mL 이상 또는 10 ng/mL 이상인 농도로 BMP4를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 심장외막 세포 촉진 성분은 Wnt 성분, 임의적으로, CHIR99021을 추가로 포함한다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 심장외막 세포 촉진 성분은 BMP4 및 Wnt 성분, 임의적으로, CHIR 99021을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, WT1+ 심혈관 전구체 세포 집단을, VEGF 성분을 포함하는 성숙 칵테일과 접촉시킨다.
또 다른 실시양태에서, WT1+ 심혈관 전구체 집단을 성숙 칵테일과 약 4일 이상, 임의적으로, 약 5일, 약 9일, 약 15일 또는 약 20일 동안 접촉시켜 성숙 칵테일과 접촉된 WT1+ 심장외막 계통 세포 집단을 생산한다.
또 다른 실시양태에서, 성숙 칵테일과 접촉된 WT1+ 심장외막 계통 세포 집단을 집단은 정제/단리된다.
또 다른 실시양태에서, 성숙 칵테일과 접촉된 WT1+ 심장외막 계통 세포 집단을 배양하여 오클루딘대 1(ZO1: zona occludin 1)+ WT1+ 심장외막 계통 세포 집단을 수득하고, 임의적으로, 여기서, ZO1+WT1+ 심장외막 계통 세포 집단은 정제/단리된다.
또 다른 실시양태에서, 성숙 칵테일과 접촉된 WT1+ 심장외막 계통 세포 집단 및/또는 ZO1+ WT1+ 심장외막 계통 세포 집단을 상피-중간엽 전이 (EMT) 칵테일과 접촉시키고, 일정 기간 동안 배양한다.
또 다른 실시양태에서, EMT 칵테일은 1) TGFβ 성분; 2) TGFβ 성분 및 FGF 성분 (임의적으로, 여기서, TGFβ 성분 및 FGF 성분은 순차적으로 투여된다); 또는 3) FGF 성분을 포함한다.
한 실시양태에서, TGFb 성분은 TGFb-1이다. 한 실시양태에서, FGF 성분은 bFGF이다.
실시예 2에 제시된 바와 같이, TGFb를 포함하는 WT1+ 세포 EMT 칵테일로 처리하면, 기능성 평활근 세포가 생성되고, TGFb 및 bFGF를 포함하는 EMT 칵테일로 WT1+ 세포를 처리하면, 더 높은 비율의 평활근 세포가 생성된다.
한 실시양태에서, WT1+ 세포를 EMT 칵테일과 약 1일 내지 최대 3주, 예를 들어, 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 약 10일 또는 약 1주, 2주 또는 수주 동안 접촉시킨다. 예를 들어, EMT 칵테일이 순차적으로 투여되는 성분을 포함하는 경우, 각 성분은 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 약 10일, 또는 약 1주, 약 2주 또는 약 3주 동안 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, TGFb 성분은 TGFβ-1이고, 농도는 약 0.25 ng/ml 내지 약 10 ng/ml, 또는 0.25 ng/ml 내지 10 ng/ml 사이의 0.1 ng/ml씩 증분된 임의의 한 농도이다. TGFb 신호전달 경로 활성화를 일으키는, 유사 농도의 다른 TGFb 성분이 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, FGF 성분은 bFGF이고, 농도는 약 1 ng/ml 내지 약 50 ng/ml, 또는 1 ng/ml 내지 50 ng/ml 사이의 1 ng/ml씩 증분된 임의의 농도이다. FGF 신호전달 경로 활성화를 일으키는, 유사 농도의 다른 FGF 성분이 사용될 수 있다.
추가의 또 다른 실시양태에서, EMT 칵테일을 하기 스케줄에 따라 WT1+ 세포 집단과 접촉시킨다: 1) TGFβ-1 (예를 들어, 약 0.25 내지 약 10 ng/ml)을 4일 동안 접촉시킨 후, 이어서, 추가 인자 없이 4일 동안 접촉 (TGFβ), 2) TGFβ-1 (예를 들어, 약 0.25 내지 약 10 ng/ml)을 4일 동안 접촉시킨 후, 이어서, bFGF (예를 들어, 약 1 내지 약 50 ng/ml)와 함께 약 4일 동안 접촉 (TGFβ+bFGF), 또는 3) bFGF (예를 들어, 약 1 내지 약 50 ng/ml)를 약 8일 동안 접촉 (bFGF).
또 다른 실시양태에서, EMT 칵테일은 1) TGFβ 성분; 또는 2) TGFβ 성분 및 FGF 성분을 포함하고; 세포 집단을 일정 기간 동안 배양하여 임의적으로, 유세포 측정법에 의해 측정되는, EMT 마커, 예컨대, SNAI1 및/또는 SNAI2 (예를 들어, SNAI1 및/또는 SNAI2 전사체 발현 수준을 측정함으로써 검출가능), 중간엽 마커, 예컨대, 비멘틴 및/또는 CD90 및/또는 평활근 마커, 예컨대, SMA를 발현시키거나, 또는 평활근 유전자, 임의적으로, CNN1, MYH11, TAGLN 및 SMTN을 발현시킨다.
실시예 2에서 입증된 바와 같이, EMT 이후 생성된 평활근-유사 세포는 NE 및 PE 유도된 칼슘 과도 상태를 보였다. 칼슘 과도 상태를 보인 세포의 비율은 TGFβ+bFGF에 의해 유도된 집단에서 가장 높았으며 (70%), 이는 신호전달 경로의 이러한 조합이 수축가능한 평활근 세포의 발생을 효율적으로 촉진시켰다는 것을 시사한다 (도 16a). 한 실시양태에서, NE 또는 PE 자극시에 집단 중 50% 이상, 60% 이상, 또는 70% 이상의 세포가 칼슘 과도 상태를 보이는 세포 집단을 생산하는 데 충분한 기간 동안 세포 집단을 배양한다.
또 다른 실시양태에서, 세포 집단이 평활근 마커 또는 전사체를 발현할 때까지, 임의적으로, 세포 집단이 중간엽 마커, 임의적으로, 비멘틴 및/또는 CD90을 증가된 수준으로 발현할 때까지 세포 집단을 배양하여 혈관 평활근 계통 세포 집단을 수득한다.
또 다른 실시양태에서, EMT 칵테일은 FGF 성분을 포함하고, 세포 집단을 배양하여, 임의적으로, qRT-PCR에 의해 측정되는 심장외막 유래 섬유모세포 마커, 임의적으로, TCF21을 발현하는 섬유모세포 계통 세포 집단을 생산한다.
EMT 유도된 hPSC 유래 에피 세포가 침습성을 획득할 수 있다는 것이 실시예 2에서 추가로 입증된다. 예를 들어, EMT 유도 후 8일째에 침습이 모니터링되었고, bFGF 단독으로 그에 의해 유도된 세포는 이동성이 가장 컸고, 가장 깊게 마트리겔을 침습하였다. bFGF 처리 또한 관심 영역 (ROI; 예컨대, 기록되는 영역) 내의 세포 총 개수를 증가시켰다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 집단 중 일정 비율의 세포가 침습성을 획득한 세포 집단을 생산하는 데 충분한 기간 동안 세포 집단을 배양한다. 침습성은 예를 들어, 실시예 2에 기술된 바와 같은 마트리겔 검정법에서 100 ㎛, 150 ㎛, 200 ㎛, 250 ㎛, 300 ㎛, 400 ㎛, 500 ㎛ 또는 600 ㎛ 이상 이동할 수 있는 세포를 포함한다.
한 실시양태에서, 세포 집단은 임의적으로, 형광 활성화된 세포 분류 (FACS), 자기 분리, 친화성 크로마토그래피, 면역염색법 및/또는 세포독성제에 대한 저항을 포함하는, 유세포 측정법을 사용하여 정제/단리된다. 다른 실시양태에서, 정제/단리는 비-표면 발현 마커 검출에 기반하며, 이는 예를 들어, 정량적 RT 또는 다른 PCR 및 면역 기반 검정법, 예컨대, 웨스턴 블롯에 의해 분취량을 모니터링함으로써 달성될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, TCF21을 발현하도록 세포 집단을 배양함으로써 섬유모세포 계통 세포 집단을 수득한다.
또 다른 실시양태에서, 성숙 칵테일과 접촉된 WT1+ 심장외막 계통 세포 집단 및/또는 WT1+ ZO1+ 심장외막 계통 세포 집단을 일정 기간 동안 배양하여 레티놀 데히드로게나제를 발현하는 심장외막 계통 세포 집단을 수득하고, 임의적으로, 여기서, 레티놀 데히드로게나제를 발현하는 심장외막 계통 세포 집단은 ALDH1A2를 발현하거나, 또는 알데플루오르 양성 염색인 것이고, 임의적으로, 여기서, 세포 집단은 50% 이상 알데플루오르 양성이다.
또 다른 실시양태에서, 혈관 평활근 계통 세포 집단, 섬유모세포 계통 세포 집단 및/또는 레티놀 데히드로게나제를 발현하는 심장외막 계통 세포 집단은 정제/단리된다.
또 다른 실시양태에서, 심혈관 전구체 특정화 칵테일은 액티빈/노달 억제제, 임의적으로, SB431542를 추가로 포함한다. 예를 들어, 심혈관 특정화 단계 동안 첨가된 SB431542는 심근세포 및 심장외막 특정화, 둘 모두를 촉진시킬 수 있다.
또 다른 실시양태에서, PSC는 인간 PSC이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, PSC는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC) 세포주, 임의적으로, 인간 iPSC 및/또는 배아 줄기 세포 (ESC) 세포주, 임의적으로, 인간 ESC (hESC)이다. 한 실시양태에서, iPSC는 섬유모세포 유래 iPSC 세포주이다.
추가의 측면은 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 심혈관 계통 세포 또는 세포 집단의 정제된 집단 및/또는 그로부터 분화된 세포 또는 세포 집단을 포함한다. 예를 들어, 심근세포 또는 심장외막 계통 세포는 오염성 세포 유형과 함께 특정화될 수 있다는 것이 본원에서 입증된다. 한 실시양태에서, 정제된 집단은 겔, 임의적으로, 마트리겔 중에 포함되어 있다. 따라서, 원하는 집단은 최소의 개입으로 정제될 수 있다.
한 실시양태에서, 세포는 고체 지지체, 예컨대, 디쉬 또는 플라스크에 부착된다.
또 다른 측면은 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 정제된/단리된 심혈관 계통 세포 또는 세포 집단 및/또는 그로부터 분화된 세포 또는 세포 집단; 및 적합한 희석제를 포함하는 조성물을 포함한다.
적합한 희석제로는 예를 들어, 적합한 배양 배지, 또는 예를 들어, 혈청, 혈청 대용물 또는 혈청 보충물 및/또는 적합한 동결보호제, 예컨대, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 글리세롤 메틸셀룰로스 또는 폴리비닐 피롤리돈을 함유하는 냉동 배지를 포함한다.
또 다른 측면은 임의적으로, 심근세포를 특정화하기 위한 농도로 BMP 성분을 포함하거나, 또는 심장외막 특정화를 위한 Wnt 성분 및 BMP 성분을 포함하는 심혈관 전구체 특정화 칵테일을 포함하는 배양 배지 보충물을 포함한다. 성분은 액체 형태, 또는 재구성용의 분말 형태의 것일 수 있다.
성분은 기초 배지, 예컨대, 라이프 테크놀로지스 스템프로-34(Life Technologies StemPro-34)에 첨가되는 단일 보충물 중에 포함될 수 있다. 보충물 중 성분의 양은 예를 들어, 배양 배지 중에 희석되었을 때 (예컨대, 450 mL 기초 배지 중에 희석되었을 때) 본원에 기술된 농도가 형성되는 양일 수 있다.
또 다른 측면은 임의적으로, 심근세포를 특정화하기 위한 농도로 BMP 성분을 포함하거나, 또는 심장외막 특정화를 위한 Wnt 성분 및 BMP 성분을 포함하는 특정화 칵테일을 포함하는 배양 배지를 포함한다. 예컨대, 전형적인 배양 배지 성분 또한 포함될 수 있다.
또 다른 측면에서는 또한 1) 마커가 KDR, PDGFRα, NKX2-5+, WT1, ZO1, EMT 마커, 예컨대, SNAI1 및/또는 SNAI2, 중간엽 마커, 예컨대, 비멘틴 및/또는 CD90 및/또는 평활근 마커, 예컨대, SMA, 평활근 유전자, 임의적으로, CNN1 , MYH11 , TAGLN 및 SMTN, TCF21, 레티놀 데히드로게나제, 및/또는 알데플루오르 활성으로부터 선택되는 것인, 심혈관 계통 세포 또는 그로부터 분화된 세포 상에서 발현된 마커의 발현을 측정하기 위한 작용제; 및/또는 2) 성분이 임의적으로, 심근세포를 특정화하기 위한 농도의 BMP 성분을 포함하거나, 또는 심장외막 특정화를 위한 Wnt 성분 및 BMP 성분을 포함하는 칵테일로부터 선택되는 것인, 심혈관 계통 세포 집단의 분화를 유도하기 위한 성분 또는 조성물, 예컨대, 상기 성분을 포함하는 배양 배지를 포함하는 키트 또한 포함한다.
작용제는 예를 들어, 면역검정법 및 유동 기반 방법을 위한 항체 또는 그의 단편, 특정 전사체를 검출하기 위한 프라이머 및/또는 프로브 기반 방법, 예컨대, RT-PCR, qRT-PCR, 계내 하이브리드화 및 밀리포어 스마트플레어(Millipore SmartFlare)에 의해 발현을 검출하기 위한 프로브일 수 있다.
조성물 및 키트 성분은 본원 다른 곳에 기술된 성분들 중 임의의 것, 및 임의적으로, 사용 설명서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 키트는 본원에 기술된 하나 이상의 단계 또는 계통의 분화를 유도하는 성분 등 (예컨대, 실시예에 기술된 성분 포함)을 포함하는 보충물을 포함한다. 한 실시양태에서, 키트는 기초 배양 배지, 임의적으로, 본원에 기술된 기초 배양 배지 및 본원에 기술된 배양 배지 보충물을 포함한다.
본원에 기술된 방법에 따라 생산된 세포는 심혈관 계통 세포 분화를 촉진 및/또는 억제시키는 작용제를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 추가의 측면은 (a) 본원에 기술된 방법의 한 단계에서 시험 세포 집단을 시험 작용제와 접촉시키는 단계; (b) 시험 세포 집단 및 대조군에서 KDR, PDGFR알파, NKX2-5+, WT1, ZO1, 중간엽 마커, 예컨대, 비멘틴 및/또는 CD90 및/또는 평활근 마커, 예컨대, SMA, 평활근 유전자, 임의적으로, CNN1 , MYH11 , TAGLN 및 SMTN, TCF21, 레티놀 데히드로게나제, 및/또는 알데플루오르 활성 수준으로부터 선택되는 마커의 발현에 대하여 모니터링하는 단계; 및 (c) 시험 작용제가 심혈관 마커의 발현을 유도하고/거나, 증가시키고/거나, 심근세포, 심장외막 또는 EPDC의 특정화를 유도하였을 때, 시험 작용제를 심혈관 세포 분화 촉진제로서 확인하는 것인 단계를 포함하는, 심혈관 세포 분화 촉진제를 확인하는 방법을 포함한다.
예를 들어, hPSC 유래 심장외막 및 심근세포를 혼합하고, 응집체 또는 단일체 포맷으로 플레이팅할 수 있는 공동 배양 검정법을 수행할 수 있다. 미리 결정된 시간량만큼 경과한 후, qRT-PCR, 유세포 측정법, 면역 기반 방법에 의해 유전자 및 단백질 발현 변화에 대하여 배양물을 검정할 수 있다. 예를 들어, 알파 액티닌, 심방 나트륨 이뇨성 인자 (ANF), 및/또는 뇌 나트륨 이뇨성 펩티드 (BNP)에 대해 염색함으로써 근절 형태에 대하여; 예를 들어, 유세포 측정법 및/또는 면역학적 방법을 사용하여 평가될 수 있는 미토콘드리아 성숙에 대하여; 주로 성인의 심방 근육에서 발현된 미오신 조절성 경쇄 7 (MYL7)에 대하여 및/또는 WT1 하향조절 (예컨대, 심장외막 성숙을 나타내는 것)에 대하여 배양물을 평가할 수 있다. 유세포 측정법 및 면역학적 방법의 예는 실시예에 제공되어 있다.
한 실시양태에서, 본 방법은 예를 들어, 심장 및/또는 혈관 리모델링을 촉진 및/또는 방해하기 위한 심혈관 약물의 약물 스크리닝에 사용된다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법을 사용하여 생산된 HPSC 유래 심근세포 및 심장외막 계통 세포 및/또는 조직을 1) 임의적으로, 내피 세포와 함께 조합하여 공동 배양하고; 2) 시험 작용제와 접촉시키고; 및 3) 대조군과 비교하여 i) 세포 사멸 또는 ii) 임의적으로, 내피 세포 개수의 증식 증가; 및/또는 iii) 조직의 조직화 변경에 대하여 평가하고, 여기서, 대조군과 비교하여 세포 사멸이 감소, 세포 계통 중 하나 이상의 것의 증식이 증가 및/또는 세포 조직화가 I) 감소 또는 II) 증가되었다면, 이는 시험 작용제가 추정의 심혈관 약물임을 나타내는 것이다. 내피 세포 개수는 예를 들어, CD31에 대해 염색함으로써 평가될 수 있고; 세포 사멸 및/또는 증식은 예를 들어, 유세포 측정법, 세포 계수 방법 및/또는 유세포 측정법에 의해 평가될 수 있고; 세포 조직화는 시각적으로 평가될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 방법은 심장외막 분화, 흉터 조직의 대치, 허혈성 영역의 재혈관화 등을 촉진시키는 것으로 추정되는 작용제를 확인하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법을 사용하여 생산된 HPSC 유래 심근세포 및 심장외막 계통 세포 및/또는 조직을 1) 임의적으로, 내피 세포와 함께 조합하여 공동 배양하고; 2) 저산소 또는 다른 심장독성 조건하에서 시험 작용제와 접촉시키고; 및 3) 대조군과 비교하여 저산소 조건하에서의 i) 세포 사멸 또는 ii) 임의적으로, 내피 세포 개수의 증식 증가; 및/또는 iii) 조직의 조직화 변경에 대하여 평가하고, 여기서, 대조군과 비교하여 세포 사멸이 감소, 세포 계통 중 하나 이상의 것의 증식이 증가 및/또는 세포 조직화가 I) 감소 또는 II) 증가되었다면, 이는 시험 작용제가 심장외막 분화, 흉터 조직의 대치, 허혈성 영역의 재혈관화를 촉진시키는 것으로 추정되는 작용제임을 나타내는 것이다. 내피 세포 개수는 예를 들어, CD31에 대해 염색함으로써 평가될 수 있고; 세포 사멸 및/또는 증식은 예를 들어, 유세포 측정법, 세포 계수 방법 및/또는 유세포 측정법에 의해 평가될 수 있고; 세포 조직화는 시각적으로 평가될 수 있다.
심근 경색 또한 다양한 모델 유기체에서 유도될 수 있고, hPSC 유래 심장외막 세포는 심장의 외층에 이식될 수 있다. 심장 기능 회복, 근세포 증식/생존, 및 EPDC의 기여에 대해 검정할 수 있다.
따라서, 추가의 측면은 본원에 기술된 방법에 따라 심혈관 세포 집단을 생산하는 단계, 세포 집단을 정제하는 단계, 및 상기 세포 집단을 필요로 하는 대상체 내로 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 세포 집단을 필요로 하는 대상체 내로 상기 세포 집단을 도입하는 방법을 포함한다.
세포 집단은 임의적으로, 대상체에게 투여하는 데 적합한 등장성 조성물 중에 포함되어 있다.
추가의 측면은 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 세포 집단, 임의적으로, 정제된 세포 집단을 이식시키는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 대상체는 일과성 허혈 발작을 앓았거나, 또는 앓고 있는 대상체이다. 한 실시양태에서, 대상체는 허혈성 심장 질환을 앓는 대상체이다.
한 실시양태에서, 대상체는 hPSC로부터 생산된 집단을 투여받으며, 여기서, hPSC는 자가 iPSC이다.
다수의 유전자 및 유전자 생성물이 본원에 기술되어 있다. TNNT2 -NM_001276345.1, NKX2 -5 - NM_004387.3, WT1 - NM_024426.4, TBX18 - NM_001080508.2, GATA4 - NM_002052.3, GATA5 - NM_080473.4, ISL1 - NM_002202.2, TBX5 - NM_000192.3, BNC1 - NM_001717.3, ANXA8 - NM_001271702.1, SNAI1 - NM_005985.3, SNAI2 - NM_003068.4, CCN1 - NM_001299.4, MYH11 - NM_001040113.1, TAGLN - NM_001001522.1, SMTN - NM_001207017.1, TCF21 - NM_198392.2, ALDH1A1 - NM_000689.4, ALDH1A2 - NM_003888.3, 및 ALDH1A3 - NM_000693.2를 비롯한, 상기로 언급되는 유전자 및 유전자 생성물에 대한 모든 참조 수탁 번호, 그와 관련된 서열은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
상기 개시내용은 일반적으로 본 출원을 기술한다. 하기의 구체적인 실시예를 참조함으로써 더욱 완전하게 이해될 수 있다. 본 실시예는 단지 예시를 목적으로 기술된 것이며, 본 출원의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다. 환경으로 인해 방편이 제안되거나, 제공될 수 있는 바, 형태상의 변화 및 등가물의 치환이 고려된다. 비록 본원에서 특정 용어가 사용되기는 하지만, 상기 용어는 설명하기 위한 의미로 의도되는 것이지, 제한하기 위한 것이 아니다.
하기의 비제한적인 실시예는 본 개시내용을 예시하는 것이다:
실시예
실시예 1
10 ng/ml 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 1 mM 아스코르브산, 및 4 3 10_4 M 모노티오글리세롤 (MTG) (시그마(Sigma))로 보충된 스템프로-34 (라이프 테크놀로지스)로 이루어진 배지. 인간-BMP4, 인간-bFGF, 인간-액티빈 A, 인간-DKK1, 및 인간-VEGF (R&D 시스템즈(R&D Systems))를 명시된 시점과 농도로 첨가하였다. 각각 SB-431542 (토크리스: 미국 미주리주 엘리스빌) 및 도소모르핀 (시그마)을 이용하여 액티빈/노달/TGF-b 및 BMP 억제 실험을 수행하였다. Wnt 신호전달을 수반하는 실험을 위해, CHIR-99021 (스템젠트), XAV-939 (R&D), 또는 IWP2(R&D)를 명시된 농도로 사용하였다. 배양물을 처음 10-12일 동안 5% CO2, 5% O2, 90% N2 환경에서 유지시킨 후, 이어서, 남은 배양 기간 동안 5% CO2 대기 환경으로 옮겨 놓았다. 명시된 시점에, 세포를 수거하고, 유세포 측정법에 의해 분석하거나, 세포를 분류하였다.
결과
심근세포 특정화. hPSC로부터의 심혈관 계통의 발생은, 적어도 구별되는 3개 단계인 KDR+PDGFR+ 심혈관 중배엽 유도, 및 상기 중배엽의, NKX2-5+ 심혈관 전구체를 발생하는 심혈관 운명으로의 특정화, 및 이어서, 수축성 심근세포로의 성숙을 통해 진행된다 (도 1). 액티빈 A 및 BMP4가 제1 단계의 중요한 조절인자인 한편5, 심장 특정화를 제어하는 경로는 잘 이해되고 있지 않으며, 이는 유도 단계와는 다를 가능성이 있다. 특정화 단계를 조사하기 위하여, 본 발명자들이 상기 발생 단계 동안 신호전달 경로를 쉽게 조작할 수 있었던 모델을 확립하였다 (도 1). 이러한 접근법에 의해, 심혈관 중배엽은 기술된 바와 같이 최적 농도의 액티빈 및 BMP4로 EB에서 유도된다5. 중배엽 유도 4일째, EB를 해리시키고, 세포를 마이크로타이터 웰에 (웰 당 1x105) 단일층으로 플레이팅하고, 24-48시간 동안 상이한 경로 효능제 및 길항제로 처리한다. 상기 특정화 단계 이후, 배양물을 VEGF의 존재하에 유지시키고, 15일째 심장 트로포닌 T (cTnT) 및/또는 SIRPA를 발현하는 수축성 세포의 존재에 대하여 분석한다. 초기 연구 결과, 심근세포는 상용적으로 Wnt 억제제 DKK1 및 액티빈/노달/TGFβ 억제제 SB431542의 존재하에서 발생되는 것으로 나타났으며, 이는 상기 경로가 특정화에 요구되지 않는다는 것을 시사한다. 한편, 고수준의 BMP4 또는 억제제 노긴 또는 도소모르핀 첨가 결과, 심근세포 발생이 완전하게 차단되었는 바 (도 2a), BMP 신호전달은 상기 단계에 지대한 영향을 미쳤다. 비록 노긴이 KDR 수준을 어느 정도까지 감소시키기는 했지만, 어느 조작도 중배엽 발생에 극적 영향을 미치지는 못했다. 처리 후 48시간 경과하였을 때, 각 군의 세포 개수는 유의적으로 다르지 않았는 바, 심근세포 발생 억제는 극적 세포 사멸에 기인하는 것은 아니었다 (도 2b).
C.2. 심장외막 세포 생성. 상기 특정화 단계 동안 효능제 및 길항제를 적정한 결과, 심근세포 발생은 (분화 세포에 의해 생산된) 내인성 수준에 의해, 또는 낮은 수준의 노긴 (12.5-200 ng/ml) 또는 낮은 수준의 BMP4 (0.31 ng/ml)의 첨가를 통해 달성되는 낮은 수준의 BMP 신호전달을 필요로 한다는 것이 밝혀졌다 (도 3). 고농도의 노긴 뿐만 아니라, 0.63 ng/ml 이상인 농도의 BMP4 첨가는 심근세포 특정화를 억제시켰다. 모든 군에서 세포 개수는 동등하였는 바 (도 2b), 이러한 관찰 결과는 신호전달의 부재하에서 또는 보다 높은 수준의 신호전달의 존재하에서 다른 계통이 생성된다는 것을 제안한다. 상기 세포를 확인하는 제1 접근법으로서, 본 발명자들은 상기 세포를 6-15일간의 시간 경과에 걸쳐 심근 및 심장외막 유전자 패널의 발현에 대해 분석하였다. 예상대로, TNNT2 및 NKX2 -5를 비롯한, 심근세포 발생을 나타내는 유전자는 오직 대조군 배양물에서만 발현되었다 (도 4). 흥미롭게도, 두 심장외막 마커, WT1 및 TBX18은 BMP4로 처리된 중배엽으로부터 생성된 세포에서 배타적으로 (WT1) 또는 지배적으로 (TBX18) 발현되었고, 이는 이들이 발생 중인 심장외막 계통을 대표한다는 가능성을 제기한다. 최근 확인된 심장외막 마커인 BNC1 및 ANXA8 22 또한 BMP4로 처리된 세포에서 고도로 발현되었다. GATA4, GATA5, ISL1, 및 TBX5를 비롯한 다른 심장 계통 마커의 발현이 대조군 및 BMP4로 처리된 배양물, 둘 모두에서 어느 정도까지는 나타났다. 노긴으로 처리된 배양물은 상기 유전자 중 어느 것도 유의적인 수준으로 발현하지 못하였다. 면역염색법 결과, WT1 (핵)은 오직 BMP4로 유도된 세포에서만 검출된 반면, cTnT는 오직 비처리군 세포에만 존재하는 것으로 나타났고 (도 5), 이는 RT-qPCR 분석을 확증하였다 (도 4). 생체내에서, 심장외막 세포는 발생 중인 심장을 둘러싸는 상피 층을 형성한다18. 그의 구별되는 형태 이외에도, 배양물 중의 상피 세포는 오클루딘대 1 (ZO1) 단백질의 존재에 의해 모니터링될 수 있는 밀착 연접을 형성할 수 있는 그의 능력에 의해 특징화된다. 배양 D15에, WT1 발현 배양물은 전형적인 상피 형태를 보이지 않았고, ZO1 발현은 관찰되지 않았다 (도 6a). 그러나, (96웰에서 6웰 플레이트로) 좀 더 큰 포맷으로 계대하고, 4일 동안 배양한 후, WT1+ 세포는 확장되어 상피 형태를 가지는 컨플루언트 단일층을 생성하였다 (도 6b). 종합해보면, 이러한 관찰 결과는 BMP4로 처리된 세포가 hPSC 유래 심장외막 (에피) 세포를 나타낸다는 것을 강력하게 제안한다. 제브라피시에서, BMP 경로는 PEO의 발생에 필수적인 것으로 관찰되었다23.
WT1+ 에피 세포에 관한 추가의 특징 규명을 위하여, 15일째 집단 및 계대된 집단, 둘 모두를 유세포 측정법에 의해 다양한 표면 항원의 발현에 대하여 분석하였다. 이들 집단의 발현 패턴을 15일째의 심근세포와 비교하였다 (도 7). 심근세포, 및 두 WT1 발현 에피 집단 모두, 발생 중인 마우스 심근세포 상에서 및 성체 마우스 심장외막 상에서 발견되고, 세포 이동과 관련이 있는 것으로 간주되는 막횡단 당단백질인 포도플라닌 (PDPN)에 대해 양성으로 염색되었다22 , 24. 흥미롭게도, 두 에피 집단 모두, 앞서 hPSC 유래 및 태아 심근세포 상에서 발현되는 것으로 밝혀진 수용체인 SIRPα에 대해서도 또한 양성이었다6. 비록 수준이 계대함에 따라 하향조절되기는 하였지만, WT1+ 에피 집단은 중간엽/섬유모세포 마커인 CD90을 발현하였다. 본 발명자들의 이전 관찰 결과와 일관되게, 심근세포는 CD90을 발현하지 못하였다6. 마우스의 배아 심장외막 상에서 발현된 PDGFRβ는 두 에피 집단 모두에서 낮은 수준으로 검출되었다25. 그에 반해, 중배엽 전구체 마커인 PDGFRα는 어느 집단에서도 발현되지 않았으며, 이는 상기 마커가 계통 특정화에 따라 하향조절됨을 나타내는 것이다. 범(pan)-상피 마커인 EPCAM은 심근세포 상에는 존재하였지만, 에피 집단 중 어느 것에도 존재하지 않았다. EPCAM 발현은 심장외막에서 발현되는 것으로 보고되지 않고 있는데, 이는 그의 단순한 편평한 형태가 이유일 가능성이 가장 크다26 , 27. 어느 집단도 CD31, VE-카드헤린 또는 cKIT를 발현하지 않았으며, 이는 오염성 내피 및 조혈 세포 유형이 없다는 것을 나타내는 것이다. 종합해보면, 상기 유세포 측정 분석으로부터 얻은 관찰 결과는 BMP로의 중배엽 처리로부터 생성된 에피 세포는 표현형이 마우스의 심장외막과 유사하다는 것을 제안한다.
추정 에피 세포가 중배엽 기원임을 입증하기 위하여, 4일째 집단으로부터 PDGFRα+ (중배엽) 및 PDGFRα- (비-중배엽) 분획을 단리시키고, 분석하였다. 도 8에 제시되어 있는 바와 같이, 심근세포 (도 7b) 및 WT1+ TBX18 + 에피 세포 (도 7c,d)는 오직 양성 집단으로부터만 생성되었으며, 이는 상기 세포가 중배엽 기원임을 나타내는 것이다. 이러한 관찰 결과는 인간 만능 줄기 세포로부터 심장외막 세포가 생성될 수 있다는 것을 1차로 입증한다.
BMP4가 Wnt 및 액티빈/노달 억제제의 존재하에서 심근세포 및 WT1+ 심장외막-유사 계통을 특정화할 수 있다는 관찰 결과는 상기 경로가 심혈관 발생 중 이 단계에서는 중요한 역할을 하지 않는다는 것을 제안한다. 그러나, 이러한 해석은, 야생형 한배 새끼와 비교하였을 때 Dkk1 -/- Dkk2 -/- 널(null) 마우스의 심장의 심장외막 두께가 증가되어 있고, 심근 크기는 감소되어 있다는 관찰 결과와 일맥상통하지는 않으며, 이는 실제로 Wnt 신호전달이 상기 계통의 발생에서 어느 정도 중요한 역할을 한다는 것을 제안한다28. 이러한 차이를 조정하기 위하여, 구체적으로는 BMP4, 소형 분자 BMP 억제제인 도소모르핀29 (DM, 노긴 대신)의 존재하에서, 또는 BMP 경로 조절인자 대조군의 부재하에서 (비처리) DKK1 또는 소형 분자 길항제 XAV939 또는 IWP2의 적정에 의해 경로의 억제에 초점을 맞추면서 단계 2 동안 Wnt 신호전달을 추가로 조작하였다. 도 9a에 제시된 바와 같이, DKK1 양 증가가 BMP4로 처리된 배양물의 운명을 변경시켰고, WT1+ 에피 집단보다는 심근세포의 발생을 촉진시켰다. XAV939 또는 IWP2 첨가는 고농도의 DKK1의 것과 유사한 영향을 미쳤다 (도 9c 및 d). DM으로 처리된 배양물 및 비-BMP 배양물의 심근세포 잠재성은 대개 이러한 조작에 의해서는 영향을 받지 않았다 (도 9a, c 및 d). 예상대로, DM으로 처리된 배양물은 CHIR 첨가에 의해 영향을 받지 않은 반면, 소형 분자 Wnt 효능제 CHIR99021 (CHIR)의 첨가에 의한 Wnt 경로 활성화가 내인성 BMP 대조군에서 심근세포 발생을 억제시켰다 (도 9a).
발현 분석 결과, 보다 높은 고농도의 DKK1 또는 소형 분자 길항제 XAV939 및 IWP2 첨가가 BMP4로 처리된 세포에서 WT1 발현을 감소시킨 것으로 나타났고, 이는 심장외막 집단의 손실 및 대신, 심근세포 계통의 특정화를 나타낸다 (도 9b-d). CHIR에 의한 Wnt 경로의 활성화가 BMP4로 처리된 세포에서 WT1 발현에 영향을 미치지 않았지만, 내인성 BMP 집단에서는 수준을 증가시킨 반면, DM으로 처리된 배양물은 WT1 발현에 있어 어떤 변화도 보이지 않았다 (도 9b). 종합해 보면, 이러한 관찰 결과는 Wnt 신호전달이 심장외막 계통의 특정화를 위해서는 필요하다는 것을 입증한다.
남은 모든 연구를 위해, BMP4 및 XAV939를 D4 중배엽에 첨가하여 심근세포를 생성한 반면, BMP4 및 CHIR의 조합물은 WT1+ 심장외막 계통을 유도하는 데 사용되었다. BMP 억제제 DM으로 처리된 세포를 비-심근세포, 비-심장외막 대조군 집단으로서 사용하였다. 본 프로토콜을 사용하여 인간 섬유모세포 유래 iPSC 세포주 (센다이(Sendai) hiPSC) 및 hESC 세포주 H7을 비롯한 다른 hPSC 세포주로부터 WT1+ 심장외막-유사 세포를 생성할 수 있었다 (도 10a 및 b).
hESC 유래 WT1+ 심장외막-유사 세포에서 EMT가 이루어질 수 있는지 여부를 측정하기 위해, D15 심장외막 세포를 계대하고, 회수에 1일을 허용한 후, 총 8일 동안 4개의 처리 요법 중 하나로 처리하는 검정법을 디자인하였다. 본 요법은 1) TGFβ-1로 4일 동안 처리한 후, 이어서, 추가 인자 없이 4일 동안 처리 (TGFβ), 2) TGFβ-1로 4일 동안 처리한 후, 이어서, bFGF와 함께 4일 동안 처리 (TGFβ+bFGF), 3) bFGF로 8일 동안 처리 (bFGF), 또는 4) 추가 인자 없이 8일 동안 처리로 이루어졌다 (도 11a). 상이한 조건하에서 배양한 후, 세포를 수거하고, qRT-PCR 및 유세포 측정법에 의해 분석하였다.
WT1의 발현 수준은 계대 후 즉시 하향조절된 후, 이어서, 8일간의 배양 기간 동안에 걸쳐 점진적으로 상향조절되었다 (도 11c). TGFβ 또는 TGFβ+bFGF로 처리된 세포는 시간 경과에 따른 WT1 발현의 꾸준한 감소를 보였으며, 이는 심장외막 정체성의 손실을 나타내는 것이다 (도 11c). 그에 반해, WT1 발현 수준은 bFGF로 처리된 세포에서 대조군의 것 아래로 감소하지는 않았다. 비록 수준이 시토카인 조합에 의존하여 달라지기는 하였지만, 처리된 집단에서는 EMT 마커인 SNAI1 및 SNAI2의 발현 또한 증가되었다. TGFβ, TGFβ+bFGF 및 bFGF, 모두 SNAI2 발현을 증가시킨 반면, 오직 bFGF만이 SNAI1의 발현을 유도하였다 (도 11c). 면역염색 분석 결과는 ZO1 발현이 TGFβ 또는 bFGF 처리 이후에 내재화되었거나, 또는 손실되었다는 것을 보여주었다 (도 12). 면역염색법에 의한 WT1의 발현은 qRT-PCR에 의해 측정된 전사체 발현과 일치하였다. 비록 오직 TGFβ만으로 처리된 것과 형태상 구별이 어렵기는 하였지만, TGFβ+bFGF로 처리된 세포에서 WT1 및 ZO1 발현의 가장 유의적인 손실이 관찰되었다. 유세포 측정 분석 결과, 비처리 대조군과 비교하였을 때, 모든 처리군에서의 세포가 중간엽 마커인 CD90을 상향조절한 것으로 나타났고 (도 11b), 이는 TGFβ 및 bFGF가 EMT를 개시시켰다는 해석을 지지하는 것이다. 종합해 보면, 이러한 관찰 결과는 WT1+ 세포가 TGFβ 및 bFGF 경로의 활성화 이후에 EMT를 거칠 수 있다는 것을 나타내며, 이로써, 이는 발생 중인 심장외막의 시험관내 등가물을 나타낸다는 추가 증거를 제공한다.
EMT 유도 동안 특정화된 세포 유형을 확인하기 위하여 파생 집단을 면역염색법에 의해 중간엽 마커인 비멘틴 (VIM) 및 평활근 마커인 α-평활근 액틴 (SMA)의 발현에 대하여, 및 qRT-PCR에 의해 평활근 유전자인 CNN1 , MYH11 , TAGLN 및 SMTN 30 , 및 심장외막 유래 섬유모세포 마커인 TCF21 31의 전사체에 대하여 분석하였다. VIM은 어느 정도까지는 모든 집단에서 발현되었고, 동시에 bFGF 단독으로 처리된 세포에서보다 TGFβ 및 TGFβ+bFGF로 처리된 세포에서 실질적으로 더 밝은 염색이 관찰되었다 (도 13). SMA는 또한 bFGF와 함께, 또는 인자들의 부재하에서 배양된 것과 비교하였을 때, TGFβ 및 TGFβ+bFGF로 처리된 세포에서 더 높은 수준으로 검출되었다. 이러한 패턴은 TGFβ 또는 TGFβ+bFGF 중 어느 것으로 처리된 세포는 혈관 평활근 계통을 따라 진행되고 있음을 제안하는 것이다. TGFβ 또는 TGFβ+bFGF 중 어느 것으로 처리된 세포가 CNN1 , MYH11 , TAGLN 및 SMTN의 발현은 상향조절하였지만, TCF21은 그렇지 않았다는 관찰 결과가 이를 지지한다 (도 14). 그에 반해, bFGF 유도된 집단은 CNN1, TAGLN 및 SMTN 이외에 TCF21도 발현하였다 (도 14). 그러나, 상기 세포는 MYH11은 발현하지 못하였다. 종합해 보면, 이러한 관찰 결과는 TGFβ가 hESC 유래 WT1+ 심장외막 세포를 평활근-유사 운명으로 특정화하는 반면, bFGF는 섬유모세포-유사 세포의 발생을 촉진시킨다는 것을 나타낸다. TGFβ 이후에 bFGF로 처리하였을 때, 상기 세포에서 CNN1 , MYH11 , TAGLN 및 SMTN의 발현이 증가된 것으로 관찰된 바, 평활근-유사 운명을 증진시키는 것으로 나타났다.
TGFβ 및 TGFβ+bFGF로 유도된 EMT 이후에 생성된 평활근-유사 세포의 수축 기능을 시험하기 위하여, 앞서 기술된 방법32을 사용하여 노르에피네프린 (NE) 및 페닐에프린 (PE)로 자극시킨 이후에 칼슘 과도 상태를 측정하였다. 칼슘 과도 상태를 보인 세포의 비율은 TGFβ+bFGF에 의해 유도된 집단에서 가장 높았고 (70%), 이는 신호전달 경로의 이와 같은 조합인 수축가능한 평활근 세포의 발생을 효율적으로 촉진시켰다는 것을 나타내는 것이다 (도 15a). 칼슘 과도 상태를 보인 세포 중 TGFβ 및 TGFβ+bFGF 유도된 세포에서 PE 자극 이후에 사이클링 속도는 유사한 것으로 관찰되었다. 상기 두 집단으로부터의 세포가 비유도된 대조군 배양물 중의 것보다 더 빠른 칼슘 사이클링 속도를 보였다 (도 15b). 칼슘 반응의 진폭은 대조군 배양물과 비교하였을 때, PE 처리된 TGFβ 세포에서 가장 컸다 (도 15c). 마지막으로, PE 자극 이후에 칼슘 과도 상태의 지속 기간은 TGFβ로 처리된 것 또는 대조군 집단 중의 것보다 TGFβ+bFGF 유도된 세포에서 유의적으로 더 길었다 (도15d). 종합해 보면, 이러한 관찰 결과는 TGFβ+bFGF의 조합 (또는 보다 적게는 TGFb)으로 에피 세포를 유도하는 것이 효능제에 대해 반응할 수 있는 평활근 세포의 발생을 촉진시키고, 이로써, 칼슘 조종이 증가됨에 따라 평활근 활동 전위 및 수축성은 쉽게 이루어질 수 있다는 것을 입증한다.
심장 발생 동안, EPDC 및 특히, 심장 섬유모세포는 심근층을 침습한다는 것은 널리 확립되어 있다33. hPSC 유래 에피 세포의 이러한 잠재능을 평가하기 위해, 상이한 인자에 의한 EMT 유도 이후 마트리겔의 3D 층을 침습할 수 있는 그의 능력에 대해 측정하였다. 본 발명자들이 세포의 이동을 쉽게 추적할 수 있도록 하기 위해, GFP를 발현하는 hESC로부터 에피 집단을 생성하였다48. EMT 유도 후 8일 경과하였을 때에 공초점 현미경 검사법에 의해 마트리겔 침습을 모니터링하고, 3D 영상 재구성을 사용하여 평가하였다 (도 16a). bFGF 단독으로 유도된 세포는 이동성이 가장 컸고, 가장 깊게 마트리겔을 침습하였으며 (도 16b), 이는 성질상 섬유모세포성을 띤다는 해석을 지지한다. bFGF 처리 또한 침습과 함께, 관심 영역 (ROI) 내의 세포 총 개수를 증가시켰다. 다른 군들은 그 어느 것도 이와 같은 확장을 보이지 않았다 (비처리, ROI당 73.8±6.1개의 세포; TGFβ, ROI당 56.8±9.5개의 세포; bFGF, ROI당 379.7±40.5개의 세포, p=0.0017; TGFβ+bFGF, ROI당 80.3±17.1개의 세포). 특히, TGFβ 단독으로 유도된 집단은 마트리겔을 침습할 수 있는 능력을 거의 보이지 않았는데, 그 능력은 섬유모세포 계통 (흰색 화살촉 표시)으로의 자발적 EMT를 거친 일부 세포를 함유할 수 있는 비처리된 대조군보다도 훨씬 더 적었다. TGFβ+bFGF의 조합으로 유도된 세포는 대조군 집단과 유사하게 반응을 보였고, BFGF 단독으로 유도된 것보다 현저히 더 적은 침습성을 띠었다. 침습 정도를 추가로 정량화하기 위해, 각 집단 중의, 다른 깊이까지 이동한 세포의 비율을 계산하였다. 비유도된 집단, TGFβ 유도된 집단 및 TGFβ+bFGF 유도된 집단 중의 사실상 모든 세포는 겔의 처음 200 ㎛ 이내에서 검출되었다. 그에 반해, bFGF 유도된 집단 중 거의 절반의 세포는 상기 범위를 초과하는 깊이까지 이동하였고, 일부는 600 ㎛ 정도까지 이동하였다. 종합해 보면, 이러한 관찰 결과는 bFGF 유도된 집단이 생체내에서 EPDC에 대해 예측되는 것과 일관되는 이동 거동을 보인다는 것을 입증한다. 평활근 특징을 가지는 세포는 이러한 잠재능을 보이지 않는다는 관찰 결과는 상기 계통의 성숙이 조직 내로의 이동 이후에 발생할 가능성이 있다는 것을 제안한다.
심장외막은 발생 동안 및 심장 손상 이후에 레티놀 데히드로게나제 ALDH1A2의 상향조절을 통해 레티노산을 생산한다는 것이 널리 받아들여지고 있다. 분화 D15에서, WT1+ 심장외막 세포는 ALDH1A2를 발현하지도 않았고 (도 15a), 유세포 측정법에 의해 알데히드 데히드로게나제 활성의 마커인 알데플루오르에 대해서도 양성으로 염색되지 않았다 (도 15c). 그러나, 계대 후, 상기 집단은 ALDH1A2 발현의 꾸준한 증가를 보였다 (도 15a 및 b). 심장외막과는 관련이 없지만, 레티노산 합성에도 또한 관여하는 레티놀 데히드로게나제인 ALDH1A1 및 ALDH1A3은 오직 낮은 수준으로만 발현되었다 (도 15a). 계대 후 8일째, 심장외막-유사 집단은 알데플루오르 염색법에 의해 78% 초과의 세포가 양성인 것으로 측정된 바 (도 15d), 알데히드 데히드로게나제 활성을 실질적으로 상향조절하였다. EMT가 TGFβ, bFGF 또는 TGFβ+bFGF로 유도된 것인 배양물은 현저히 더 낮은 수준의 ALDH1A2 발현 및 알데플루오르 염색을 보였는데, 이는 더 이상 심장외막 세포가 존재하지 않는다는 해석과 일관되는 것이다 (도 15b).
종합해 보면, 본 연구 결과, 계대된 WT1+ 심장외막 세포는 TGFβ 및 bFGF 신호전달에 대한 반응으로 평활근-유사 세포 및 섬유모세포-유사 세포로의 EMT가 이루어질 수 있는 능력을 가지는 것으로 밝혀졌다. EMT 유도성 신호의 부재하에서 WT+ 세포는 ALDH1A2의 상향조절을 통해 상피-유사 형태 및 알데히드 데히드로게나제 활성을 획득하는데, 이는 RA를 합성할 수 있는 그의 능력을 나타내는 것이다 (도 18).
본 출원은 현재 바람직한 예로 간주되는 것을 참조로 하여 기술되었지만, 본 출원은 개시된 예로 한정되는 것은 아님을 이해하여야 한다. 그와 반대로, 본 출원은 첨부된 청구범위의 정신 및 범주 내에 포함되는 다양한 변형 및 등가의 배열도 포함하는 것으로 한다.
모든 공개 문헌, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 공개 문헌, 특허 또는 특허 출원은 그 전문이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 명시된 것과 같은 정도로 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 구체적으로, 예를 들어, 표 또는 그 밖에 다른 곳에서 제공된 수탁 번호 및/또는 바이오마커 서열 (예컨대, 단백질 및/또는 핵산)을 비롯한, 본원에서 제공된 각 수탁 번호와 관련된 서열은 그 전문이 참조로 포함된다.
명세서에서 참조된 참고 문헌에 대한 인용
Figure pct00001
Figure pct00002

Claims (43)

  1. (a) BMP 성분으로 프라이밍된 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)를 hPSC가 심혈관 중배엽 세포 집단으로 분화되도록 유도하는 데 적합한 심혈관 중배엽 프로그래밍 칵테일과, 프로그래밍 칵테일이 hPSC에 침투하기에 적합한 조건하에서 접촉시키고, 일정 기간 동안 접촉된 hPSC를 배양하여 KDR+ 및 PDGFR알파+ 심혈관 중배엽 세포 집단을 생성하는 단계; (b) 심혈관 중배엽 세포 집단을 NKX2-5+ 또는 WT1+ 심혈관 전구체 세포 집단을 특정화하는 데 적합한 심혈관 전구체 특정화 칵테일과, 특정화 칵테일이 심혈관 중배엽 세포 집단에 침투하기에 적합한 조건하에서 접촉시키고, 일정 기간 동안 접촉된 심혈관 중배엽 세포 집단을 배양하여 NKX2-5+ 또는 WT1+ 심혈관 전구체 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (d) 심혈관 전구체 세포 집단을 성숙 칵테일과, 성숙 칵테일이 심혈관 전구체 세포 집단에 침투하기에 적합한 조건하에서 접촉시키고, 일정 기간 동안 접촉된 심혈관 전구체 집단을 배양하여 심혈관 집단, 임의적으로 심장 트로포닌 T (cTnT) 및/또는 SIRPA를 발현하는 심근세포 계통 세포, 및/또는 WT1을 발현하는 심장외막 계통 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로부터 심근세포 계통 또는 심장외막 계통 세포 집단을 수득하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, BMP 성분으로 프라이밍된 hPSC는 hPSC를 BMP 성분과 약 1 내지 약 2일 동안 접촉시킴으로써 제조되고, 임의적으로, 여기서, BMP 성분은 BMP4 및/또는 BMP2인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 심혈관 중배엽 프로그래밍 칵테일이 BMP 성분 및 액티빈 성분, 및 임의적으로, FGF 성분을 포함하고, 심혈관 중배엽 프로그래밍 칵테일은 hPSC와 약 3 내지 약 5일 동안 접촉시키는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, FGF 성분이 bFGF인 방법.
  5. 제3항에 있어서, BMP 성분이 BMP4인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 액티빈 성분이 액티빈 A인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, hPSC가 배상체에 포함되는 것인 방법.
  8. (a) hPSC로부터 KDR+ 및 PDGFR알파+ 심혈관 중배엽 세포 집단을 임의적으로 제1항의 단계 a에 정의된 바와 같이 수득하는 단계; (b) KDR+ 및 PDGFR알파+ 심혈관 중배엽 세포 집단을 심혈관 전구체 특정화 칵테일과 특정화 칵테일이 심혈관 중배엽 세포 집단에 침투하기에 적합한 조건하에서 접촉시키고, NKX2-5+ 또는 WT1+ 심혈관 전구체 세포 집단을 생성하는 데 충분한 기간 동안 접촉된 심혈관 중배엽 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하는, hPSC로부터 NKX2-5+ 또는 WT1+ 심혈관 전구체 세포 집단을 수득하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, KDR+ 및 PDGFR알파+ 심혈관 중배엽 세포 집단이 심혈관 전구체 특정화 칵테일과의 접촉 이전에 해리되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 심혈관 중배엽 세포 집단을 심혈관 전구체 특정화 칵테일과 적어도 12시간 내지 약 48시간 동안 접촉시키는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 심혈관 전구체 특정화 칵테일이 심근세포 계통 촉진 성분을 포함하고, 여기서, 심근세포 촉진 성분이 심근세포 발생을 촉진시키는 데 적합한 농도로 존재하고, 이는 NKX2-5+ 심혈관 전구체 집단을 특정화시키는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 심근세포 촉진 성분이 200 ng/mL 미만, 150 ng/mL 미만, 100 ng/mL 미만, 50 ng/mL 미만, 또는 25 ng/mL 미만 및/또는 12.5 ng/mL 초과인 농도의 노긴인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 심근세포 촉진 성분이 1 μM 미만, 0.5 μM 미만, 0.25 μM 미만, 또는 0.1 μM 미만의 도소모르핀인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 심근세포 촉진 성분이 0.63 미만, 0.5 ng/mL 미만, 0.4 ng/mL 미만, 또는 0.3 ng/mL 미만인 농도의 BMP4인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 심혈관 전구체 특정화 칵테일이 1) Wnt 억제제, 임의적으로 DKK1, XAV939 및 IWP2로부터 선택된 것, 및 BMP 성분, 임의적으로 여기서, BMP 성분이 0.01 ng/mL 이상, 0.05 ng/mL 이상, 0.1 ng/mL 이상, 0.5 ng/mL 이상, 1.25 ng/mL 이상, 2.5 ng/mL 이상, 5 ng/mL 이상이되, 10 ng/ml 미만, 또는 15 ng/ml 미만, 또는 바람직하게, 약 0.5 ng/mL인 농도의 BMP4인 성분의 조합물; 또는 2) BMP 억제제, 예컨대, 노긴 또는 도소모르핀, 임의적으로, 200 ng/mL 미만, 150 ng/mL 미만, 100 ng/mL 미만, 50 ng/mL 미만, 또는 25 ng/mL 미만 및/또는 12.5 ng/mL 초과인 농도의 노긴; 3) Wnt 억제제, 및/또는 4) BMP 성분, 임의적으로, 예를 들어, 여기서, BMP4가 0.63 ng/mL 미만, 0.5 ng/mL 미만, 0.4 ng/mL 미만, 또는 0.3 ng/mL 미만인 농도로 존재하는 BMP4의 심근세포 계통 농축물을 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, KDR+PDGFRα+ 심혈관 중배엽 집단 및/또는 NKX2-5+ 심혈관 전구체 집단을 단리시키는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, NKX2-5+ 심혈관 전구체 세포 집단을 VEGF 성분을 포함하는 성숙 칵테일과 추가로 접촉시키는 것인 방법.
  18. (a) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에 따라 NKX2-5+ 심혈관 전구체 집단을 수득하는 단계; (b) 심혈관 전구체 세포 집단을, VEGF 성분을 포함하는 성숙 칵테일과 성숙 칵테일이 심혈관 전구체 세포 집단에 침투하기에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계; 및 (b) 심장 트로포닌 T (cTnT)를 발현하는 심근세포를 생산하는 데 충분한 기간 동안 접촉된 심혈관 전구체 집단을 배양하는 단계를 포함하는, 심장 트로포닌 T+ (cTnT) 심근세포 계통 세포 집단을 생산하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, NKX2-5+ 심혈관 전구체 집단을 성숙 칵테일과 약 4일 이상, 임의적으로, 약 4일, 약 5일, 약 9일, 약 15일 또는 약 20일, 임의적으로, 성숙 수축성 심근세포가 생산될 때까지 접촉시키는 것인 방법.
  20. (a) hPSC로부터 KDR+ 및 PDGFR알파+ 심혈관 중배엽 세포 집단을 임의적으로 제1항의 단계 a에 정의된 바와 같이 수득하는 단계; (b) 심혈관 중배엽 세포 집단을, 심장외막 계통 촉진 성분을 포함하는 심혈관 전구체 특정화 칵테일과 특정화 칵테일이 심혈관 중배엽 세포 집단에 침투하기에 적합한 조건하에서 접촉시키고, WT1+ 심혈관 전구체 세포 집단을 생성하는 데 충분한 기간 동안 접촉된 심혈관 중배엽 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하는, WT1+ 심장외막 계통 세포 집단을 생산하는 방법.
  21. 제1항 내지 제10항 또는 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 심혈관 전구체 특정화 칵테일이 심장외막 세포 촉진 성분을 포함하고, 임의적으로, 여기서, 심장외막 세포 촉진 성분이 심장외막 세포 발생을 촉진시키는 데 적합한 농도로 BMP4를 포함하는 것인 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 심장외막 세포 촉진 성분이 1.25 ng/mL 이상, 2.5 ng/mL 이상, 5 ng/mL 이상, 또는 10 ng/mL 이상인 농도의 BMP4를 포함하는 것인 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 심장외막 세포 촉진 성분이 Wnt 성분, 임의적으로 CHIR99021을 추가로 포함하는 것인 방법.
  24. 제20항에 있어서, 심장외막 세포 촉진 성분이 BMP4 및 Wnt 성분, 임의적으로 CHIR 99021을 포함하는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제10항, 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, WT1+ 심혈관 전구체 세포 집단을 VEGF 성분을 포함하는 성숙 칵테일과 접촉시키는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, WT1+ 심혈관 전구체 집단을 성숙 칵테일과 4일 이상, 임의적으로 약 4일, 약 5일, 약 9일, 약 15일 또는 약 20일 동안 접촉시켜 성숙 칵테일과 접촉된 WT1+ 심장외막 계통 세포 집단을 생산하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 성숙 칵테일과 접촉된 WT1+ 심장외막 계통 세포 집단을 단리시키는 것인 방법.
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서, 성숙 칵테일과 접촉된 WT1+ 심장외막 계통 세포 집단을 배양하여 오클루딘대 1(ZO1: zona occludin 1)+ WT1+ 심장외막 계통 세포 집단을 수득하고, 임의적으로 여기서, ZO1+WT1+ 심장외막 계통 세포 집단은 단리시키는 것인 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 성숙 칵테일과 접촉된 WT1+ 심장외막 계통 세포 집단 및/또는 ZO1+ WT1+ 심장외막 계통 세포 집단을 상피-중간엽 전이 (EMT) 칵테일과 접촉시키고, 일정 기간 동안 배양하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, EMT 칵테일이 1) TGFβ 성분을 포함하거나; 2) TGFβ 성분 및 FGF 성분을 포함하되, 임의적으로, 여기서, TGFβ 성분 및 FGF 성분이 순차적으로 투여되거나; 또는 3) FGF 성분을 포함하는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, EMT 칵테일을 하기 스케줄: 1) TGFβ-1을 약 4일 동안 접촉시킨 후, 이어서, 추가 인자 없이 약 4일 동안 접촉시키거나 (TGFβ), 2) TGFβ-1을 약 4일 동안 접촉시킨 후, bFGF와 약 4일 동안 접촉시키거나 (TGFβ+bFGF), 또는 3) bFGF를 약 8일 동안 접촉시키는 (bFGF) 스케줄에 따라 WT1+ 세포 집단과 접촉시키는 것인 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, EMT 칵테일이 1) TGFβ 성분; 또는 2) TGFβ 성분 및 FGF 성분을 포함하고; 세포 집단을 일정 기간 동안 배양하여 임의적으로, 유세포 측정법에 의해 측정되는, EMT 마커, 예컨대, SNAI1 또는 SNAI2, 중간엽 마커, 예컨대, 비멘틴 및/또는 CD90, 및/또는 평활근 마커, 예컨대, SMA를 발현시키거나, 또는 평활근 유전자, 임의적으로, CNN1 , MYH11 , TAGLN 및 SMTN을 발현시키는 것인 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 평활근 마커 또는 전사체를 발현할 때까지, 임의적으로, 세포 집단이 중간엽 마커, 임의적으로, 비멘틴 및/또는 CD90을 증가된 수준으로 발현할 때까지, 또는 자극시 일정 비율의 세포가 칼슘 과도 상태를 보일 때까지 세포 집단을 배양하여 혈관 평활근 계통 세포 집단을 수득하는 것인 방법.
  34. 제29항 또는 제30항에 있어서, EMT 칵테일이 FGF 성분을 포함하고, 세포 집단을 일정 기간 동안 배양하여, 임의적으로, qRT-PCR에 의해 측정되는 심장외막 유래 섬유모세포 마커, 임의적으로, TCF21을 발현하는 섬유모세포 계통 세포 집단을 생산하는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 세포 집단을 배양하여 TCF21을 발현하고/거나, 침습성을 획득하도록 하여 섬유모세포 계통 세포 집단을 수득하는 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제10항, 및 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 성숙 칵테일과 접촉된 WT1+ 심장외막 계통 세포 집단 및/또는 WT1+ ZO1+ 심장외막 계통 세포 집단을 일정 기간 동안 배양하여 레티놀 데히드로게나제를 발현하는 심장외막 계통 세포 집단을 수득하고, 임의적으로, 여기서, 레티놀 데히드로게나제를 발현하는 심장외막 계통 세포 집단은 ALDH1A2를 발현하거나, 또는 알데플루오르 양성 염색인 것이고, 임의적으로, 여기서, 세포 집단은 50% 이상 알데플루오르™ 양성인 것인 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관 평활근 계통 세포 집단, 섬유모세포 계통 세포 집단 및/또는 레티놀 데히드로게나제를 발현하는 심장외막 계통 세포 집단을 단리시키는 것인 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 심혈관 전구체 특정화 칵테일이 액티빈/노달 억제제, 임의적으로, SB431542를 추가로 포함하는 것인 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, hPSC가 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC) 세포주 및/또는 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 세포주인 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, iPSC가 섬유모세포 유래 iPSC 세포주인 것인 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 심혈관 계통 세포 및/또는 세포 심장외막 유래 세포 (EPDC) 집단.
  42. 1) 마커가 KDR, PDGFR알파, NKX2-5+, WT1, ZO1, EMT 마커, 예컨대, SNAI1 및/또는 SNAI2, 중간엽 마커, 예컨대, 비멘틴 및/또는 CD90, 및/또는 평활근 마커, 예컨대, SMA, 평활근 유전자, 임의적으로, CNN1 , MYH11 , TAGLN 및 SMTN, TCF21, 레티놀 데히드로게나제, 및/또는 알데플루오르 활성으로부터 선택되는 것인, 심혈관 계통 세포 또는 EPDC 상에서 발현된 마커의 발현을 측정하기 위한 작용제; 및/또는 2) 성분이 심근세포를 특정화하기 위한 농도의 BMP 성분, 또는 심장외막 특정화를 위한 Wnt 성분 및 BMP 성분을 포함하는 것으로부터 선택되는 것인, 심혈관 계통 세포 집단의 분화를 유도하기 위한 성분을 포함하는 키트.
  43. (a) 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 한 단계에서 시험 세포 집단을 시험 작용제와 접촉시키는 단계; (b) 시험 세포 집단 및 대조군에서 KDR, PDGFR알파, NKX2-5+, WT1, ZO1, 중간엽 마커, 예컨대, 비멘틴 및/또는 CD90, 및/또는 평활근 마커, 예컨대, SMA, 평활근 유전자, 임의적으로, CNN1 , MYH11 , TAGLN 및 SMTN, TCF21, 레티놀 데히드로게나제, 및/또는 알데플루오르 활성 수준으로부터 선택되는 마커의 발현에 대하여 모니터링하는 단계; 및 (c) 시험 작용제가 심혈관 마커의 발현을 유도하고/거나, 증가시켰을 때, 시험 작용제를 심혈관 세포 분화 촉진제로서 확인하는 단계를 포함하는, 심혈관 세포 분화 촉진제를 확인하는 방법.
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