TW201940693A

TW201940693A - 細胞之培養方法

Info

Publication number: TW201940693A
Application number: TW107142689A
Authority: TW
Inventors: 池谷真; 豊岡生
Original assignee: 國立大學法人京都大學; 日商武田藥品工業股份有限公司
Priority date: 2017-11-30
Filing date: 2018-11-29
Publication date: 2019-10-16
Also published as: IL274746A; CA3083253A1; EP3719120A4; KR20200091885A; US11959100B2; US20210002608A1; JP2023093693A; WO2019107485A1; EP3719120A1; MX2020005668A; SG11202004964WA; EA202091354A1; JPWO2019107485A1; CO2020007772A2; AU2018376391A1; JP7330466B2; CN111492052A; BR112020010539A2

Abstract

提供一種神經脊細胞之製造方法，作為用以在不降低分化能力下使神經脊細胞增殖的技術，該方法包含
(1)得到神經脊細胞之步驟，與(2)於含有GSK3β抑制劑及鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)之培養基中將神經脊細胞懸浮培養之步驟，其中該培養基含有顯示與超過1μM且未達5μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度之GSK3β抑制劑。

Description

細胞之培養方法

本發明係關於神經脊細胞之製造方法及增殖方法、培養基、冷凍保存物，以及自神經脊細胞製造各種細胞之方法。更詳細而言，係關於神經脊細胞之製造方法及增殖方法與用於此等的培養基、包含神經脊細胞之冷凍保存物，以及可由神經脊細胞分化誘導的各種細胞之製造方法。

神經脊細胞(Neural Crest Cell：NCC)，係於發育初期由神經板形成神經管時由神經外胚葉與表皮外胚葉之間所產生的細胞，其係具有分化為神經細胞、神經膠細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞及色素細胞等之多種類細胞的多能性(multipotency)與自我增殖能力的細胞。如此之多能性(multipotency)及自我增殖能力，為顯示作為再生醫療用之細胞醫藥的神經脊細胞之有用性者，用以將神經脊細胞有效率地維持或增殖的技術係受到需求。

非專利文獻1中，記載由人類誘導性多能性細胞(iPSC)誘導神經脊細胞，且進一步由神經脊細胞誘導間葉系間質細胞等。非專利文獻1中，神經脊細胞之維持培養，係藉由使用添加了TGFβ抑制劑、上皮生長因子(EGF)及鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF(亦稱為FGF2))之培養基的接著培養來進行。

又，非專利文獻2中，記載由雞胚神經管誘導神經脊細胞，且進一步由神經脊細胞誘導神經膠細胞等。非專利文獻2中，神經脊細胞之維持培養，係藉由使用添加了雞胚萃取物、類胰島素生長因子(IGF)、bFGF及網膜酸(RA)之培養基的懸浮培養來進行。

非專利文獻3中，記載由人類胚胎幹細胞(ESC)或人類iPSC誘導神經脊細胞，且進一步由神經脊細胞誘導平滑肌細胞等。非專利文獻3中，神經脊細胞之維持培養，係藉由使用添加了GSK3β抑制劑及TGFβ抑制劑之培養基的接著培養來進行。

進一步，非專利文獻4中，記載由人類iPSC誘導神經脊細胞，且藉由使用添加了GSK3β抑制劑、TGFβ抑制劑、EGF及bFGF之培養基來進行接著培養或懸浮培養而維持。非專利文獻4，報告了於接著培養之維持培養下，在bFGF之濃度0pg/ml-10ng/ml的範圍，培養細胞集團中之神經脊細胞數目及比率，係濃度依賴性地減少(參照圖5A~C)。又，於懸浮培養之維持培養下，使用1µM之CHIR99021為GSK3β抑制劑進行7日培養，確認到Sox10陽性細胞的存在，但該細胞是否為具有多能性(
multipotency)者則未明朗。

再者，非專利文獻1~4均未記載將神經脊細胞藉由使用添加了超過1µM之濃度的CHIR99021與bFGF之培養基來進行懸浮培養，而維持、增殖。

[先前技術文獻]
[非專利文獻]

[非專利文獻1] Fukuta M. et al., "Derivation of
mesenchymal stromal cells from pluripotent stem cells
through a neural crest lineage using small molecule
compounds with defined media.", PLoS One, 2014, 9(12)：
e112291.
[非專利文獻2] Kerosuo L. et al., "Crestospheres: Long-Term Maintenance of Multipotent, Premigratory Neural Crest Stem Cells.", Stem Cell Reports, 2015, 5(4):499-507.
[非專利文獻3] Menendez L. et al., "Wnt signaling and a Smad pathway blockade direct the differentiation of human pluripotent stem cells to multipotent neural crest cells.", Proc. Natl. Acad. Sci., 2011, 108(48):19240-5.
[非專利文獻4] Horikiri T. et al., "SOX10-Nano-
Lantern Reporter Human iPS Cells; A Versatile Tool for Neural Crest Research.", PLoS One, 2017, 12(1):e0170342.

[發明所欲解決之課題]

神經脊細胞，本來具備分化為神經細胞、神經膠細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞及色素細胞等之多種類細胞的多能性(multipotency)，但已知在培養下，多能性(multipotency)會漸漸降低，可分化之細胞種類會減少。

本發明之主要目的為提供用以將維持多能性(multipotency)之神經脊細胞持續長期間培養、增殖的技術。

[用以解決課題之手段]

為了解決上述課題，本發明提供以下之[1]~ [21b]。
[1]一種神經脊細胞之製造方法，其包含以下步驟：
(1)得到神經脊細胞之步驟、
(2)於含有GSK3β抑制劑及鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)之培養基中懸浮培養神經脊細胞之步驟，其中該培養基含有顯示與超過1μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度之GSK3β抑制劑。
[1a]如[1]之製造方法，其中前述GSK3β抑制劑之濃度，為顯示與超過1μM且未達5μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度。
[1b]如[1]之製造方法，其中前述效果，係基於GSK3β抑制劑之GSK3β抑制活性來評估，
GSK3β抑制劑之GSK3β抑制活性，係藉由以下之流程決定：
(i)將於GSK3β之控制下抑制了報導基因表現的細胞，於GSK3β抑制劑之存在下及非存在下培養的流程、
(ii)測定在GSK3β抑制劑之存在下及非存在下的報導基因之表現量的流程，及
(iii)基於在GSK3β抑制劑之存在下的報導基因之表現量相對於在GSK3β抑制劑之非存在下的報導基因之表現量的增加量，來決定GSK3β抑制劑之GSK3β抑制活性的流程。
[2]如[1]之製造方法，其中前述培養基進一步含有TGFβ抑制劑。
[3]如[1]之製造方法，其中前述培養基為CDM培養基。
[4]如[1]之製造方法，其中前述培養基進一步含有上皮生長因子(EGF)。
[5]如[1]之製造方法，其中前述GSK3β抑制劑為選自由CHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、
kenpaullone、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、
TWS-119及SB415286所成群組的至少一者。
[6]如[5]之製造方法，其中前述GSK3β抑制劑為CHIR99021。
[6a]如[6]之製造方法，其中CHIR99021之濃度為超過1μM且未達5μM。
[6b]如[6a]之製造方法，其中CHIR99021之濃度為2μM以上且4.5μM以下。
[6c]如[5]之製造方法，其中前述GSK3β抑制劑為CP21R7。
[6d]如[6c]之製造方法，其中CP21R7之濃度為0.5μM以上且1μM以下。
[7]如[2]之製造方法，其中前述TGFβ抑制劑為選自由SB431542、A83-01、LDN193189、Wnt3a/BIO、BMP4、
GW788388、SM16、IN-1130、GW6604及SB505124所成群組的至少一者。
[7a]如[1]-[7]中任一項之製造方法，其中前述bFGF之濃度為20-40ng/ml。
[8]如[1]之製造方法，其中前述步驟(2)中，神經脊細胞係於播種後每5~8日繼代。
[9]如[1]之製造方法，其中前述步驟(1)，為由幹細胞分化誘導神經脊細胞之步驟。
[10]一種神經脊細胞之增殖方法，其包含以下步驟：
(I)於含有GSK3β抑制劑及鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)之培養基中懸浮培養神經脊細胞之步驟，其中該培養基含有顯示與超過1μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度之GSK3β抑制劑。
[10a]如[10]之增殖方法，其中前述GSK3β抑制劑之濃度，為顯示與超過1μM且未達5μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度。
[10b]如[10]之增殖方法，其中前述培養基進一步含有TGFβ抑制劑。
[10c]如[10]之增殖方法，其中前述培養基為CDM培養基。
[10d]如[10]之增殖方法，其中前述培養基進一步含有上皮生長因子(EGF)。
[10e]如[10]之增殖方法，其中前述GSK3β抑制劑為選自由CHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、
kenpaullone、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及SB415286所成群組的至少一者。
[10f]如[10e]之增殖方法，其中前述GSK3β抑制劑為CHIR99021。
[10g]如[10f]之製造方法，其中CHIR99021之濃度為超過1μM且未達5μM。
[10h]如[10g]之製造方法，其中CHIR99021之濃度為2μM以上且4.5μM以下。
[10i]如[10e]之製造方法，其中前述GSK3β抑制劑為CP21R7。
[10j]如[10i]之製造方法，其中CP21R7之濃度為0.5μM以上且1μM以下。
[10k]如[10b]之增殖方法，其中前述TGFβ抑制劑為選自由SB431542、A83-01、LDN193189、Wnt3a/BIO、
BMP4、GW788388、SM16、IN-1130、GW6604及
SB505124所成群組的至少一者。
[10l]如[10]之增殖方法，其中前述步驟(I)中，神經脊細胞係於播種後每5~8日繼代。
[11]一種培養基，其係含有GSK3β抑制劑、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)及神經脊細胞之培養基，且其含有顯示與超過1μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度之GSK3β抑制劑。
[11a]如[11]之培養基，其中前述GSK3β抑制劑之濃度，為顯示與超過1μM且未達5μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度。
[12]如[11]之培養基，其中進一步含有TGFβ抑制劑。
[13]如[11]之培養基，其中前述培養基為CDM培養基。
[14]如[11]之培養基，其中進一步含有上皮生長因子(EGF)。
[15]如[11]之培養基，其中前述GSK3β抑制劑為選自由CHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、
kenpaullone、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及SB415286所成群組的至少一者。
[16]如[15]之培養基，其中前述GSK3β抑制劑為CHIR99021。
[16a]如[16]之培養基，其中CHIR99021之濃度為超過1μM且未達5μM。
[16b]如[16a]之培養基，其中CHIR99021之濃度為2μM以上且4.5μM以下。
[16c]如[15]之培養基，其中前述GSK3β抑制劑為CP21R7。
[16d]如[16c]之製造方法，其中CP21R7之濃度為0.5μM以上且1μM以下。
[17]如[12]之培養基，其中前述TGFβ抑制劑為選自由SB431542、A83-01、LDN193189、Wnt3a/BIO、BMP4、
GW788388、SM16、IN-1130、GW6604及SB505124所成群組的至少一者。
[18]一種冷凍保存物，其含有以[1]之製造方法所得到之神經脊細胞。
[18a]如[18]之冷凍保存物，其係藉由
將[1]之步驟所得到之神經脊細胞分離之步驟，與
使經分離之神經脊細胞懸浮於細胞保存液，並冷凍之步驟而得到。
[19]一種神經細胞、神經膠細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞或色素細胞之製造方法，其包含以下步驟：
(i)於含有GSK3β抑制劑及鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)之培養基中懸浮培養神經脊細胞之步驟，其中該培養基含有顯示與超過1μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度之GSK3β抑制劑，及
(ii)使步驟(i)所得到之神經脊細胞，分化為選自由神經細胞、神經膠細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞及色素細胞所成群組的至少一種細胞之步驟。
[19a]如[19]之製造方法，其中前述GSK3β抑制劑之濃度，為顯示與超過1μM且未達5μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度。
[19b]如[19]之製造方法，其中前述培養基進一步含有TGFβ抑制劑。
[19c]如[19]之製造方法，其中前述培養基為CDM培養基。
[19d]如[19]之製造方法，其中前述培養基進一步含有上皮生長因子(EGF)。
[19e]如[19]之製造方法，其中前述GSK3β抑制劑為選自由CHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、
kenpaullone、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及SB415286所成群組的至少一者。
[19f]如[19e]之製造方法，其中前述GSK3β抑制劑為CHIR99021。
[19g]如[19f]之培養基，其中CHIR99021之濃度為超過1μM且未達5μM。
[19h]如[19g]之培養基，其中CHIR99021之濃度為2μM以上且4.5μM以下。
[19i]如[19e]之培養基，其中前述GSK3β抑制劑為CP21R7。
[19j]如[19i]之製造方法，其中CP21R7之濃度為0.5μM以上且1μM以下。
[19k]如[19b]之製造方法，其中前述TGFβ抑制劑為選自由SB431542、A83-01、LDN193189、Wnt3a/BIO、
BMP4、GW788388、SM16、IN-1130、GW6604及
SB505124所成群組的至少一者。
[19l]如[19]之製造方法，其中前述步驟(i)中，神經脊細胞係於播種後每5~8日繼代。
[20]一種將具有多能性之神經脊細胞長期間培養之方法，其包含以下步驟：
(1)得到神經脊細胞之步驟、
(2)於含有GSK3β抑制劑及鹼性纖維母細胞生長因子之培養基中將神經脊細胞懸浮培養之步驟，其中該培養基含有顯示與超過1μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度之GSK3β抑制劑。
[20a]如[20]之培養方法，其中前述GSK3β抑制劑之濃度，為顯示與超過1μM且未達5μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度。
[20b]如[20]之培養方法，其中前述培養基進一步含有TGFβ抑制劑。
[20c]如[20]之增殖方法，其中前述培養基為CDM培養基。
[20d]如[20]之增殖方法，其中前述培養基進一步含有上皮生長因子(EGF)。
[20e]如[20]之增殖方法，其中前述GSK3β抑制劑為選自由CHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、
kenpaullone、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及SB415286所成群組的至少一者。
[20f]如[20e]之增殖方法，其中前述GSK3β抑制劑為CHIR99021。
[20g]如[20f]之製造方法，其中CHIR99021之濃度為超過1μM且未達5μM。
[20h]如[20g]之製造方法，其中CHIR99021之濃度為2μM以上且4.5μM以下。
[20i]如[20e]之製造方法，其中前述GSK3β抑制劑為CP21R7。
[20j]如[20i]之製造方法，其中CP21R7之濃度為0.5μM以上且1μM以下。
[20k]如[20b]之增殖方法，其中前述TGFβ抑制劑為選自由SB431542、A83-01、LDN193189、Wnt3a/BIO、
BMP4、GW788388、SM16、IN-1130、GW6604及
SB505124所成群組的至少一者。
[20l]如[20]之增殖方法，其中前述步驟(I)中，神經脊細胞係於播種後每5~8日繼代。
[21]一種使用，其係將含有鹼性纖維母細胞生長因子，與顯示與超過1μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度之GSK3β抑制劑的培養基，用於長期間培養具有多能性之神經脊細胞。
[21a]一種使用，其係將鹼性纖維母細胞生長因子，與顯示與超過1μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度之GSK3β抑制劑，用於神經脊細胞之培養。
[21b]一種使用，其係將鹼性纖維母細胞生長因子，與顯示與超過1μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度之GSK3β抑制劑，用於神經脊細胞培養基之製造。

本說明書中，「多能性(pluripotency)」，意指可分化為具備各種不同形態或功能之組織或細胞，且係3胚葉之不管何種系統之細胞均可分化的能力。「多能性(pluripotency)」，就無法分化為胚盤，因此並無形成個體之能力的點上，係與可分化為包含胚盤之生體的一切組織之「全能性(totipotency)」有所區別。

「多能性(multipotency)」，意指可分化為複數個限定數量之系統的細胞之能力。例如，間葉系幹細胞、造血幹細胞、神經幹細胞為multipotent，但非pluripotent。神經脊細胞，具有分化為神經細胞、神經膠細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞及色素細胞等之細胞之多能性(multipotency)。

本說明書中，「培養」，係指將細胞於體外(in vitro)環境維持，使其增殖(生長)，且/或分化。「進行培養」意指於組織外或體外，例如將細胞於細胞培養皿或燒瓶中維持，使其增殖(生長)，且/或分化。

「接著培養」，意指於使細胞附著於容器之狀態，例如於適當之培養基存在下使細胞附著於滅菌塑膠(或經塗覆的塑膠)之細胞培養皿或燒瓶之狀態下進行培養。
又，「懸浮培養」，意指於使細胞不附著於容器地，於適當之培養基中作為由單一細胞或2個以上之細胞所成的細胞團(cell sphere)而分散的狀態下進行培養。

「擴大培養」，意指以使所期望之細胞增殖為目的來進行培養。

「GSK3β抑制劑」，係指具有對GSK3β(肝糖合成酶激酶3β)之抑制活性的物質。GSK3(肝糖合成酶激酶3)，為絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶之一種，其與肝糖之產生或細胞凋亡、幹細胞之維持等的許多訊息路徑相關。GSK3係存在有α與β之2種同功型(isoform)。本發明中所用之「GSK3β抑制劑」，只要具有GSK3β抑制活性則無特殊限定，亦可為一併具有GSK3β抑制活性與GSK3α抑制活性之物質。

「TGFβ抑制劑」，係指具有對TGFβ(轉化生長因子β)之抑制活性的物質。TGFβ係結合於2種之絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶型受體的細胞激素，係透過以Smad(R-Smad)活化為主的訊息傳導來控制細胞增殖、細胞分化、細胞死亡等。具有TGFβ抑制活性之物質，可列舉阻礙TGFβ與其受體之結合的物質，或阻礙TGFβ與受體結合後之下游訊息的物質。該下游訊息例示有TGFβII型受體所致之TGFβI型受體之磷酸化、磷酸化TGFβI型受體所致之Smad之磷酸化等。本發明所用之「TGFβ抑制劑」只要具有TGFβ抑制活性則無特殊限定。

本說明書中，「標記」意指「標記蛋白質」或「標記基因」，且係於特定細胞型中在細胞表面、細胞質內及/或核內等特異表現的蛋白質或其基因。標記可為陽性選擇標記或陰性選擇標記。標記較佳為細胞表面標記，特別是若以細胞表面陽性選擇標記，可實施生存細胞之濃縮、單離，及/或檢測。
標記蛋白質之檢測，可利用使用對該標記蛋白質之特異性抗體的免疫學分析，例如ELISA、免疫染色、流式細胞儀分析等來進行。對標記蛋白質之特異性抗體，可使用結合於與標記蛋白質中之特定胺基酸序列或標記蛋白質結合的特定糖鏈等之抗體。又，於細胞內表現，且不出現在細胞表面之標記蛋白質(例如轉錄因子或其次單元等)的情況時，可使報導蛋白質與該標記蛋白質一起表現，並藉由檢測該報導蛋白質，來檢測作為對象之標記蛋白質(例如非專利文獻4)。該方法當於找不到適當的細胞表面標記時可較佳地使用。標記基因之檢測，可利用該領域中公知之核酸放大方法及/或核酸檢測方法，例如RT-PCR、微陣列、生物晶片及RNAseq等來進行。

本說明書中，「表現(expression)」，係定義為藉由細胞內之啟動子(promoter)所驅動的特定核苷酸序列之轉錄及/或轉譯。

本說明書中，「包含(含有)~(comprise(s)或comprising)」，意指表示包含其語句之後的要素，但不限定於此。因此，雖其係表示包含其語句之後的要素，但不意味著除外其他的任意要素。

本說明書中，「約」或「大約」，係表示對基準值變動至正或負各30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之值。較佳為，「約」或「大約」之用語，表示對基準值正或負各15%、10%、5%，或1%之範圍。

[發明之效果]

藉由本發明，提供用以將維持多能性(
multipotency)之神經脊細胞予以持續長期間培養並增殖的技術。

以下，說明用以實施本發明的適宜形態。再者，以下所說明的實施形態，為顯示本發明之代表性的實施形態之一例者，並非藉此狹義解釋本發明之範圍。

[神經脊細胞之製造方法及增殖方法]
本發明之神經脊細胞之製造方法包含以下步驟。特別是其中之步驟(2)，係本發明之神經脊細胞之增殖方法。
(1)得到神經脊細胞之步驟、
(2)於含有GSK3β抑制劑及鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)之培養基中懸浮培養神經脊細胞之步驟，其中該培養基含有顯示與超過1μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度之GSK3β抑制劑。

[得到神經脊細胞之步驟(1)]
得到神經脊細胞之步驟(1)，為得到用於步驟(2)之神經脊細胞之步驟。步驟(1)之得到神經脊細胞之方法並無特殊限定，例如，可列舉由幹細胞分化誘導神經脊細胞之方法、購入市售之神經脊細胞之方法，及採取天然存在的神經脊細胞之方法等。

本發明之一實施形態中，為了得到用於步驟(2)之神經脊細胞，可由幹細胞分化誘導神經脊細胞。

本發明中可使用的「幹細胞(stem cell)」，例如可列舉多能性幹細胞(pluripotent stem cell)。本發明中可使用的「多能性幹細胞(pluripotent stem cell)」，係指可分化為具備生體之各種不同的形態或功能之組織或細胞，且係具有不管3胚葉(內胚葉、中胚葉、外胚葉)之何種系統的細胞均可分化之能力的幹細胞。其並無特殊限定，例如可列舉胚胎幹細胞(ESC)、源自由核移植所得之複製胚胎的胚胎幹細胞、精子幹細胞、胚胎生殖細胞、人工多能性幹細胞(本說明書中亦有稱為「iPSC」者)等。又，本發明中可使用的「多能性幹細胞(multipotent stem cell)」，係指具有可分化為複數個限定數量之系統的細胞之能力的幹細胞。本發明中可使用的「多能性幹細胞(multipotent stem cell)」，例如可列舉牙髓幹細胞、口腔黏膜來源之幹細胞、毛囊幹細胞、培養纖維母細胞或骨髓幹細胞來源之體性幹細胞等。較佳的多能性幹細胞(pluripotent stem cell)為ESC及iPSC。

作為「ESC」，若為小鼠ESC，則可利用inGenious targeting laboratory公司、理研(理化學研究所)等所建立的各種小鼠ESC株，若為人類ESC，則可利用威斯康辛大學、NIH、理研、京都大學、國立成育醫療研究中心及Cellartis公司等所建立的各種人類ESC株。例如，人類ESC株，可利用ESI Bio公司所分讓的CHB-1~CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1~HUES28株等、WiCell Research所分讓的H1株、H9株等、理研所分讓的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。

「人工多能性幹細胞」，係指藉由於哺乳動物體細胞或未分化幹細胞，導入特定因子(核初始化因子)並進行重編程(reprogramming)所得到的細胞。目前，「人工多能性幹細胞」係有各種者，除了由山中等人藉由於小鼠纖維母細胞導入Oct3/4･Sox2･Klf4･c-Myc之4個因子所建立的iPSC(Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126： 663-676)以外，亦可使用將同樣之4個因子導入人類纖維母細胞所建立的人類細胞來源的iPSC(Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.)、於導入上述4個因子後，以Nanog的表現為指標來篩選所建立之Nanog-iPSC(Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.)、以不含c-Myc之方法所製作的iPSC(Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature
Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106)、以無病毒(virus-free)法導入6個因子所建立的iPSC(Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.)等。又，亦可使用由Thomson等人所製作之導入OCT3/4･SOX2･NANOG･LIN28之4個因子所建立的人工多能性幹細胞(Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.)、由Daley等人所製作之人工多能性幹細胞(Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146)、櫻田等人所製作之人工多能性幹細胞(日本特開
2008-307007號)等。
此外，已公開之所有論文(例如Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574;、Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650;Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797)，或專利(例如日本特開2008-307007號、日本特開2008-283972號、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、
WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、
WO2009-007852)所記載之於該領域公知的人工多能性幹細胞均可使用。
人工多能性幹細胞株，可利用NIH、理研、京都大學等所建立的各種iPSC株。例如，若為人類iPSC株，可列舉理研之HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株等；京都大學之253G1株、253G4株、1201C1株、1205D1株、1210B2株、1383D2株、1383D6株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、1231A3株、FfI-01s04株等，較佳為1231A3株。

由幹細胞對神經脊細胞之分化誘導，可遵照文獻公知(例如非專利文獻1)之方法進行。例如，使用人類iPSC時，可藉由將iPSC播種於培養皿等進行接著培養後，以含有TGFβ抑制劑及GSK3β抑制劑之培養基進行接著培養，而分化為神經脊細胞。

此時，所使用之培養基並無特殊限定，例如適合使用TeSR1培養基及Chemically Defined Medium (CDM)培養基。其他，亦可使用BME培養基、BGJb培養基、CMRL 1066培養基、Glasgow MEM培養基、Improved MEM(IMEM)培養基、Improved MDM(IMDM)培養基、Medium 199培養基、Eagle MEM培養基、αMEM培養基、DMEM培養基(High glucose、Low glucose)、DMEM/F12培養基、Ham培養基、RPMI 1640培養基、Fischer's培養基，及此等之混合培養基等。

CDM培養基並無特殊限定，例如，可使用由Iscove’s modified Dulbecco’s medium(GE Healthcare公司製)所配製的培養基。更具體的例子，係使用非專利文獻1記載之CDM培養基。CDM培養基中，可含有原運鐵蛋白、單硫甘油、牛血清白蛋白(BSA)、胰島素及/或抗生素。

添加TGFβ抑制劑及GSK3β抑制劑之前的培養期間，只要係可得到目標細胞數的期間即可，並無特殊限定，例如為2~6日。

TGFβ抑制劑，可列舉SB431542(4-(5-苯[1,3]二氧呃-5-基-4-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲醯胺, 4-[4-(1,3-苯并二氧呃-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲醯胺, 4-[4-(3,4-亞甲基二氧基苯基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲醯胺)、A83-01(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1-苯基硫代胺甲醯基-4-喹啉-4-基吡唑)、LDN193189(4-[6-[4-(1-Piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]-quioline
)、Wnt3a/BIO(Wnt Family Member 3A/(2'Z,3'E)-6-溴靛紅-3'-肟)、BMP4(Bone morphogenetic protein 4)、GW788388 (4-[4-[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]-吡啶-2-基]-N-(四氫-2H-吡喃-4-基)苯甲醯胺)、SM16(4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-bicyclo
[2.2.2]octane-1-carboxamide)、IN-1130(3-[[5-(6-Methyl-2-
pyridinyl)-4-(6-quinoxalinyl)-1H-imidazol-2-yl]methyl]-
benzamide)、GW6604(2-Phenyl-4-[3-(pyridin-2-yl)-1H-
pyrazol-4-yl]pyridine)及SB505124(2-(5-苯并[1,3]二氧呃-5-基-2-tert-丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶)等。此等亦可組合2種以上來使用。

本步驟中之TGFβ抑制劑之添加濃度，係依所添加之TGFβ抑制劑的種類而適當調整，例如為1~40µM、較佳為5~20µM。
使用SB431542(4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-
pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide)時，添加濃度特別可為10µM。

GSK3β抑制劑，可列舉CHIR98014(2-[[2-[(5-硝基-6-胺基吡啶-2-基)胺基]乙基]胺基]-4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-1-基)嘧啶)、CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]胺基]乙基]胺基]菸鹼甲腈)、CP21R7(3-(3-胺基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)、LY2090314(3-[9-Fluoro-1,2,3,4-
tetrahydro-2-(1-piperidinylcarbonyl)pyrrolo[3,2,1-jk][1,4]
benzodiazepin-7-yl]-4-imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl-1h-
pyrrole-2,5-dione)、TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、TWS-119(3-[6-(3-胺基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧基]酚)、kenpaullone (Kenpaullone)、1-氮雜kenpaullone(Azakenpaullone)、
SB415286(3-[(3-氯-4-羥基苯基)胺基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)及AR-AO144-18(1-[(4-methoxyphenyl)
methyl]-3-(5-nitro-1,3-thiazol-2-yl)urea)、CT99021、
CT20026、BIO((2'Z,3'E)-6-溴靛紅-3'-肟)、BIO-丙酮肟、吡啶并咔唑-環戊二烯基釕複合體、OTDZT、α-4-二溴苯乙酮、鋰等。此等亦可組合2種以上來使用。
GSK3β抑制劑不限定於此等，亦可使用對GSK3β之mRNA的反義寡核苷酸或siRNA、結合於GSK3β之抗體、顯性負(dominant negative)GSK3β變異體等，作為GSK3β抑制劑，此等可於商業上獲得，或可遵照公知方法合成。

本步驟中之GSK3β抑制劑的添加濃度，係依所添加之GSK3β抑制劑的種類而適當調整，例如為0.01~20µM、較佳為0.1~10µM。
使用CHIR99021時，添加濃度並無特殊限定，例如為0.1~1µM、較佳為0.5~1µM、特別可為1µM。

添加TGFβ抑制劑及GSK3β抑制劑之後的培養期間，只要係可得到目標細胞數之期間即可，並無特殊限定，例如為6~14日、8~12日、9~11日或10日。

接著培養係使用培養皿、燒瓶、微培養盤、OptiCell(製品名)(Nunc公司)等之細胞培養片等之培養容器。培養容器較佳為經用以提高與細胞的接著性(親水性)之表面處理，或經膠原蛋白、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、層連結蛋白、纖維接合素、Matrigel(例：BDMatrigel(日本Becton Dickinson公司))、玻連蛋白(vitronectin)等之細胞接著用基質被覆。
再者，「Matrigel」，係由含有豐富細胞外基質蛋白質之Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤所萃取的可溶性基底膜配製品，被覆有Matrigel的培養容器可由商業上獲得。Matrigel之主成分，係層連結蛋白、膠原蛋白IV、硫酸乙醯肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan)，及內功素(entactin)/巢蛋白(nidogen)1,2。Matrigel，於此等主成分以外，係含有TGFβ、上皮細胞生長因子、類胰島素生長因子、纖維母細胞生長因子、組織胞漿素原活化因子3,4，及EHS腫瘤所自然產生之其他生長因子。
培養溫度並無特殊限定，係於30~40℃(例如37℃)進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度例如為5%左右。

本發明之一實施形態中，為了得到用於步驟(2)之神經脊細胞，亦可購入市售之神經脊細胞。市售之神經脊細胞，例如，可列舉人類毛囊外毛根鞘細胞(COSMO BIO 公司製)、O9-1 Mouse Cranial Neural Crest Cell Line(Merck Millipore公司製)等。

本發明之一實施形態中，為了得到用於步驟(2)之神經脊細胞，亦可採取天然存在的神經脊細胞。神經脊細胞係被報告於哺乳類之生體內，於受精後30日前後之人類胚胎的神經管、胎生第9日前後之小鼠胚胎的神經管，及人類、豬及囓齒類之成體皮膚等存在(Betters et al., Developmental biology, 2010, 344(2): 578-592、Jiang et al., Development, 2000, 127(8): 1607-1616、Dupin et al., Developmental biology, 2012, 366(1):83-95、Nagoshi et al., Cell Stem Cell 2, April 2008, 392-403)。亦可使用公知之方法(例如Motohashi et al., Biology open, 2016, 5: 311-322、Pfaltzgraffet al., Journal of Visualized Experiments, 2012, 64:4134)採取如此的神經脊細胞，用於步驟(2)。

[神經脊細胞之擴大培養步驟(2)]
神經脊細胞之擴大培養步驟(2)，為於含有GSK3β抑制劑及鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)之培養基中懸浮培養神經脊細胞的步驟。

此時，所使用的培養基並無特殊限定，例如適宜使用CDM培養基。此外，亦可使用TeSR1培養基、BME培養基、BGJb培養基、CMRL 1066培養基、Glasgow MEM培養基、Improved MEM(IMEM)培養基、Improved MDM(IMDM)培養基、Medium 199培養基、Eagle MEM培養基、αMEM培養基、DMEM培養基(High glucose、Low glucose)、DMEM/F12培養基、Ham培養基、RPMI 1640培養基、Fischer's培養基，及此等之混合培養基等。

GSK3β抑制劑，可無特殊限定地使用上述者。
較佳的GSK3β抑制劑，係選自由CHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、kenpaullone、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及SB415286所成群組的至少一者。特佳的GSK3β抑制劑，係CHIR99021或CP21R7。

本步驟中之GSK3β抑制劑的添加濃度，係為顯示與超過1µM之濃度(或超過1µM且未達5µM之濃度)之CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度。亦可使用
CHIR99021本身作為GSK3β抑制劑。如後所述，使用
CHIR99021本身作為GSK3β抑制劑時，適合的添加濃度，為超過1µM之濃度，較佳為2µM以上且未達5µM、更佳為超過2µM且4.5µM以下、特佳為3µM以上且4.5µM以下。因此，本步驟中使用CHIR99021以外之GSK3β抑制劑時，其添加濃度，係為顯示與超過1µM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度，較佳為顯示與2µM以上且未達5µM的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度，更佳為顯示與超過2µM且4.5µM以下的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度，特佳為顯示與3µM以上且4.5µM以下的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度。
藉由於該濃度的GSK3β抑制劑與bFGF之存在下懸浮培養神經脊細胞，可持續超過9週(63日)之長期的培養期間，培養維持多能性(multipotency)之神經脊細胞並使其增殖。

本發明之一實施形態中，「維持多能性(
multipotency)之神經脊細胞」，係為維持對神經細胞、神經膠細胞及間葉系間質細胞之分化能力，或除此等外對骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞及色素細胞之分化能力。

「維持多能性(multipotency)之神經脊細胞」，可藉由複數方法評估。其方法並無特殊限定，例如，可列舉將評估對象之神經脊細胞分別分化誘導為神經細胞、神經膠細胞及間葉系間質細胞等之方法。若評估對象之神經脊細胞可實際分化為神經細胞、神經膠細胞及間葉系間質細胞等，則可判斷評估對象之神經脊細胞為「維持多能性(multipotency)之神經脊細胞」。別的方法例如可列舉測定標記蛋白質或基因之表現的方法。於評估對象之神經脊細胞中，若轉錄因子SOX10有表現，則可判斷評估對象之神經脊細胞係「維持多能性(multipotency)之神經脊細胞」。SOX10之檢測，可利用使用對該標記蛋白質特異性的抗體之免疫學的分析，例如ELISA、免疫染色、流式細胞儀分析等來進行。標記基因之檢測，可利用於該領域公知之核酸放大方法及/或核酸檢測方法，例如RT-PCR、微陣列、生物晶片等來進行。又，若為在NCC之標記基因即SOX10基因之下游插入編碼報導蛋白質(例如Nano-Lantern(Saito K. et al., "Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging." Nat. Commun., 2012; 3: 1262.))的鹼基序列，且於SOX10之啟動子的控制下表現SOX10與報導蛋白質之融合蛋白的細胞，則亦可使用檢測該報導蛋白質(例如測定螢光強度)之方法。

對於GSK3β抑制劑，「與超過1µM之濃度(或「超過1µM且未達5µM之濃度」)的CHIR99021所顯示之效果同等效果」之評估，可基於GSK3β抑制活性來進行。GSK3β抑制劑之GSK3β抑制活性可藉由本身公知之方法來測定，例如可藉由Patsch et al., Nature cell biology, 2015, 17(8):994-1003、Uno et al., Brain Res., 2009, 1296:148-163記載之方法來測定。具體而言，GSK3β抑制活性，能夠以Wnt/β-鏈蛋白路徑中之GSK3β之基因表現調節功能(特別是β-鏈蛋白之磷酸化功能)為指標來測定。更具體而言，係(i)將於GSK3β之控制下抑制了報導基因之表現的細胞，於GSK3β抑制劑之存在下及非存在下培養，(ii)測定在GSK3β抑制劑之存在下及非存在下的報導基因之表現量，及(iii)基於相對於在GSK3β抑制劑之非存在下的報導基因之表現量而言，在GSK3β抑制劑之存在下的報導基因之表現量的增加量，決定GSK3β抑制劑之GSK3β抑制活性(參照實施例9)。
該測定結果中，GSK3β抑制劑顯示與超過1µM之濃度的CHIR99021所顯示之GSK3β抑制活性(抑制%)同等之抑制活性時，則判斷該GSK3β抑制劑顯示「與超過1µM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果」(與CHIR99021所顯示之效果同等之GSK3β抑制活性)。此處，「同等」之值(抑制%)，係表示對基準值各自變動至正或負30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之值，較佳係表示正或負各自15%、10%、5%，或1%之範圍。

對於GSK3β抑制劑，「與超過1µM之濃度(或「超過1µM且未達5µM之濃度」)的CHIR99021所顯示之效果同等效果」之評估，亦可基於以與本說明書實施例之方法相同之方法培養神經脊細胞時，可培養「維持多能性(multipotency)之神經脊細胞」的期間，來更適合地進行。以含有GSK3β抑制劑之培養基培養神經脊細胞時，若相較於培養開始時，可在增加「維持多能性(multipotency)之神經脊細胞」數目的同時，培養與以含有超過1µM之濃度的CHIR99021之培養基培養神經脊細胞時同等期間時，則判斷該GSK3β抑制劑顯示「與超過1µM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果」(與CHIR99021所顯示之效果同等之神經脊細胞增殖活性)。此處，「同等」之值(期間)，係表示對基準值各自變動至正或負30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之值，較佳係表示正或負各自15%、10%、5%，或1%之範圍。

使用CHIR99021本身作為GSK3β抑制劑時，添加濃度係為超過1µM之濃度、較佳為2µM以上且未達5µM、更佳為超過2µM且4.5µM以下、特佳為3µM以上且4.5µM以下。關於CHIR99021，得知了在維持長期期間分化能力之下使神經脊細胞增殖的效果，以2µM以上且未達5µM為高、特別是以3µM以上且4.5µM以下為最高。具體而言，於CHIR99021濃度3-4.5µM時，可持續112日(16週)以上培養維持多能性(multipotency)之神經脊細胞並使其增殖。又，於CHIR99021濃度2µM，亦持續9週(63日)以上維持多能性。另一方面，1µM或5µM時，各自於培養3週(21日)、6週(42日)見到維持多能性之細胞數的降低。
又，使用CP21R7作為GSK3β抑制劑時，添加濃度係為超過0.1µM之濃度、較佳為0.5µM以上、更佳為1µM以上。關於CP21R7，得知了在維持長期期間分化能力之下使神經脊細胞增殖的效果，以0.5µM以上且1µM以下為高。具體而言，CP21R7濃度0.5-1µM時，可持續84日(12週)以上培養維持多能性(multipotency)之神經脊細胞並使其增殖。另一方面，0.1µM時，於培養3週(21日)見到維持多能性之細胞數的降低。

bFGF之添加濃度並無特殊限定，例如為10~200 ng/ml、較佳為20~40ng/ml。

培養基中，除了GSK3β抑制劑及bFGF以外，亦可添加TGFβ抑制劑及/或上皮生長因子(EGF)。TGFβ抑制劑，可無特殊限定地使用上述者。
較佳的TGFβ抑制劑，為選自由SB431542、A83-01、LDN193189、Wnt3A/BIO、BMP4、GW788388、SM16、IN-1130、GW6604及SB505124所成群組的至少一者。特佳的TGFβ抑制劑，為SB431542。
又，TGFβ抑制劑之添加濃度，係依所添加之TGF3β抑制劑種類而適當調整，例如為1~50µM、較佳為5~20µM。
使用SB431542時，添加濃度並無特殊限定，例如可為1~40µM、較佳可為5~20µM、特別可為10µM。
EGF之添加濃度並無特殊限定，例如為5~100ng/ml、較佳為20~40ng/ml。

懸浮培養中，於將步驟(1)所得到之神經脊細胞自培養容器剝離後，於培養基中分散，藉由攪拌或振盪將培養基成分及培養基內氧濃度均勻化，同時形成細胞凝集塊。適合的攪拌速度，係依細胞密度與培養容器之大小來適當設定，但過度的攪拌或振盪會對細胞給予物理壓力，阻礙細胞凝集塊形成。因此，係控制攪拌或振盪速度，使得可使培養基成分及培養基內氧濃度均勻化，且不阻礙細胞凝集塊形成。亦可在不攪拌或振盪下，靜置來進行懸浮培養。
培養溫度並無特殊限定，但係於30~40℃(例如37℃)進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度例如為5%左右。

本步驟中之培養期間，只要係可得到目標細胞數之期間即可。本步驟中，可持續長期期間，培養維持多能性(multipotency)之神經脊細胞並使其增殖。維持多能性(multipotency)之神經脊細胞佔培養細胞集團之比例，至少可維持20%以上、30%以上、40%以上；較佳為50%以上、60%以上、70%以上；更佳為80%以上、90%以上、95%以上。
其間，適當進行細胞之繼代。繼代例如於播種後每5~8日進行。繼代間隔，較佳於足夠細胞凝集塊之擴大的期間，且較可認為細胞凝集塊變得過大而使氧或營養素不易到達細胞凝集塊內部之細胞的期間更短之期間來進行。
藉由本步驟，可培養維持多能性(multipotency)之神經脊細胞並使其增殖之期間，並無特殊限定，例如，可為7日、14日、21日、28日、35日、42日、49日、56日、63日、70日、77日、84日、91日、98日、105日，或112日以上，較佳為35日以上、更佳為42日以上、又更佳為63日以上、特佳為84日以上、最佳為112日以上。

[培養基]
本發明亦提供用於上述神經脊細胞之製造方法及增殖方法之包含神經脊細胞之培養基。培養基之較佳組成係如上述。

[細胞保存物]
又，本發明亦提供以上述神經脊細胞之製造方法及增殖方法所得到的包含神經脊細胞之冷凍保存物。該神經脊細胞，係SOX10表現陽性且NCC之細胞表面抗原標記之p75表現陽性。

冷凍保存物，可藉由將神經脊細胞之製造方法及增殖方法所得到的神經脊細胞自培養基分離，懸浮於冷凍保存液中並冷凍來製造。神經脊細胞自培養基之分離只要藉由細胞過濾器(cell strainer)或離心分離進行即可。分離後之細胞可依需要洗淨。冷凍保存物，可為除了神經脊細胞以外且包含其他細胞集團者，較佳為包含經純化之神經脊細胞。神經脊細胞之純化，例如可藉由以上述標記表現為指標之細胞分選，藉以與其他細胞集團分離以進行。細胞保存液只要使用以往細胞之冷凍保存所用的試藥即可。例如，市售的Cryostem Freezing Medium及
CELLBANKER(註冊商標)等。

冷凍保存物，可利用作為用以自神經脊細胞分化誘導，而得到神經細胞、神經膠細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞及色素細胞之起始材料。又，冷凍保存物，可利用於製作以神經脊細胞為構成要素的組織模式。

[自神經脊細胞製造各種細胞之方法]
本發明之神經細胞、神經膠細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞或色素細胞之製造方法，包含以下步驟。此等當中的步驟(i)，係與本發明之神經脊細胞之製造方法之步驟(2)或本發明之神經脊細胞之增殖方法相同。
(i)於含有GSK3β抑制劑及鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)之培養基中懸浮培養神經脊細胞之步驟，其中該培養基含有顯示與超過1μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度之GSK3β抑制劑，及
(ii)使步驟(i)所得到之神經脊細胞，分化為選自由神經細胞、神經膠細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞及色素細胞所成群組的至少一種細胞之步驟。

[對各種細胞之誘導步驟]
依照本發明之神經脊細胞之製造方法及增殖方法，可得到維持分化為神經細胞、神經膠細胞及間葉系間質細胞之多能性(multipotency)，或此等以外之分化為骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞及色素細胞之多能性(multipotency)之神經脊細胞。
神經脊細胞對神經細胞、神經膠細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞及色素細胞之各細胞的分化誘導，可遵照文獻公知(例如非專利文獻1~4)之方法進行。

具體而言，對神經細胞之分化誘導，可基於非專利文獻1或非專利文獻4記載之方法來進行。
例如，將神經脊細胞播種於經Fibronectin被覆之培養盤，交換為添加有N-2 Supplement(17502-048、Gibco)、BDNF(028-16451、和光純藥)、GDNF(074-06264、和光純藥)、NT-3(141-06643、和光純藥)、NGF(141-07601、和光純藥)之DMEM/F12，於37℃、5%CO₂ 下培養14日。
或者，將神經脊細胞播種於培養盤，以含有10μM SB431542及1μM CHIR99021之CDM培養基培養1日後，交換為添加有B-27 Supplement(17504-044、Gibco)、N-2
Supplement、L-glutamine(073-05391、和光純藥)、
Penicillin/Streptomycin(15140-122、Gibco)、BDNF、
GDNF、NT-3、NGF之Neurobasal medium(21103-049、
Gibco公司)，於37℃、5%CO₂ 下培養35日。
培養後，以4%多聚甲醛將細胞固定，藉由免疫染色法確認表現TUBB3蛋白質之神經細胞的分化出現。

對神經膠細胞之分化誘導，能夠以與非專利文獻1或非專利文獻4記載之方法之對神經細胞之分化誘導相同的手法來進行。分化誘導期間結束後，藉由GFAP蛋白質之表現確認對神經膠細胞之分化出現。

對間葉系間質細胞之分化誘導，可基於非專利文獻1記載之方法來進行。具體而言，例如，將神經脊細胞以6.5×10⁴ 個/cm² 之密度播種於培養皿，以含有10μM SB431542及1μM CHIR99021之CDM培養基培養1日。1日後，將培養基交換為含有10% fetal bovine serum(FBS、Nichirei)之αMEM (Nacalai Tesque)。約4日後見到細胞之形態變化。細胞之繼代係藉由以0.25% trypsin-EDTA (GIBCO)將細胞剝離，以1.0×10⁴ 個/cm² 之密度播種來進行。分化誘導開始14日後，對於人類間葉系間質細胞之表面抗原標記CD73、CD44、CD45及CD105之表現，進行FACS解析，確認對間葉系間質細胞之分化。

對骨細胞之分化誘導，可基於非專利文獻1記載之方法來進行。具體而言，例如，將上述間葉系間質細胞播種2.5×10⁵ 個於經Fibronectin被覆之培養盤，以含有10%FBS、0.1μM dexa-methasone、50μg/ml ascorbic acid及10mM β-glycerophosphate之αMEM培養2週。培養基僅在最初1週，2日交換1次。藉由茜素紅染色來檢測鈣化性結節，確認對骨細胞之分化。

對軟骨細胞之分化誘導，可基於非專利文獻1記載之方法來進行。具體而言，例如，將上述間葉系間質細胞以1.5×10⁵ 個/5μl之濃度，懸浮於含有1% (v/v)ITS+ premix(BD)、0.17mM AA2P、0.35mM Proline(Sigma)、0.1mM dexamethasone(Sigma)、0.15%(v/v) glucose (Sigma)、1mM Na-pyruvate (Invitrogen)、2mM GlutaMax、0.05 mM MTG、40ng/ml PDGF-BB及1% (v/v) FBS (Nichirei)之DMEM：F12(Invitrogen)。於經Fibronectin被覆之培養盤，點上細胞懸浮液5μl，培養1小時。1小時後添加1ml之上述分化誘導培養基。於分化誘導開始後第3~5日添加10 ng/ml之TGFβ3 (R&D)、於第10日添加50ng/ml之BMP4。培養16日，藉由愛爾新藍(alcian blue)染色確認軟骨細胞之分化出現。

對角膜細胞之分化誘導，可基於非專利文獻1記載之方法來進行。具體而言，例如，將神經脊細胞播種於經Fibronectin被覆之培養盤，以含有10μM SB431542及1μM CHIR99021之CDM培養基培養1日。1日後、將培養基交換為藉由將human corneal endothelial cell以CDM培養基培養所製成的條件培養基。將培養基2日交換1次，分化誘導開始後第12日藉由免疫染色法確認角膜細胞之標記分子ZO-1的表現、藉由qPCR確認COL4A1及COL8A1之表現。

對色素細胞之分化誘導，可基於非專利文獻1記載之方法來進行。具體而言，例如，將神經脊細胞播種於經Fibronectin被覆之培養盤，以含有10μM SB及1μM CHIR之CDM培養基培養1日。1日後，將培養基交換為含有1μM CHIR、25ng/ml BMP4及100nM endothelin-3 (American Peptide Company)之CDM培養基。將培養基2日交換1次。於第7日藉由MITF及c-KIT基因之表現確認色素細胞的分化。

所得到之神經細胞、神經膠細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞及色素細胞，各自可利用作為再生醫療用之細胞製劑。

神經脊細胞，為具有分化為神經細胞、神經膠細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞及色素細胞等之許多種類之細胞的多能性(multipotency)與自我增殖能力之細胞。基於在神經脊細胞所觀察到的如此能力，神經脊細胞對再生醫療用之細胞醫藥等的應用受到期待。若可有效率地維持或增殖維持多能性(multipotency)之神經脊細胞，則其大量製造成為可能。進一步地，若可配製維持多能性(multipotency)之神經脊細胞的保存物，則有作為細胞醫藥之原料的有用性。例如，以位於自幹細胞分化為目標細胞(例如神經細胞)中之中間點的細胞(例如神經脊細胞)為起始原料，於細胞醫藥之製造中，以製造方法之簡化、製造期間之縮短、製造成本之減低等為目的，有進行探討，可認為本發明具有可對該目的提供有用的技術之可能性。進一步地，其不僅是細胞醫藥品之製造，對於利用各種細胞之篩選系統的構築等亦可同樣的考量。

[實施例]

[實施例1：神經脊細胞之擴大培養]
[自iPSC分化誘導為NCC]
遵照非專利文獻1記載之方法使人類iPSC分化為神經脊細胞(Neural Crest Cell：NCC)。iPSC係使用非專利文獻4記載之SOX10-Nano-Lantern Reporter Human iPSC(201B7株)。該細胞株係於NCC之標記基因即SOX10基因之下游插入有編碼螢光蛋白Nano-Lantern(Saito K. et al.,
"Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging." Nat. Commun., 2012; 3: 1262.)之鹼基序列者，於SOX10之啟動子的控制下表現SOX10與Nano-Lantern之融合蛋白。

將iPSC播種於被覆有Matrigel之培養皿，以TeSR1培養基接著培養4日後，以含有10µM SB431542 (TGFβ抑制劑)及1µM CHIR99021(GSK3β抑制劑)之CDM培養基接著培養10日，分化為NCC。

[NCC之擴大培養]
將NCC自培養皿剝離，以含有10µM SB431542、3µM CHIR99021、40ng/ml bFGF及40ng/ml EGF之CDM培養基進行懸浮培養。細胞之繼代係每7日進行。

擴大培養開始後之總細胞數的變化示於圖1、SOX10表現陽性細胞率的變化示於圖2。為了測定SOX10表現陽性細胞率，係使用StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent (Invitrogen)將細胞凝集塊解離，配製單一細胞溶液。將懸浮於添加有1µg/m之PI (Propidium Iodide, Wako)的FACS buffer (2%BSA HBSS)之單一細胞溶液，以附35µm耐綸網目之管(BD Falcon)過濾後，供流式細胞分析儀(FACS Aria, BD Biosciences)分析，測定活細胞(PI陰性細胞)中之GFP陽性細胞比例。總細胞數於全部期間增加，於培養第121日亦確認到高的SOX10表現陽性細胞率。SOX10表現，係具有多分化能力之NCC的標記。該結果表示NCC持續在長期的培養期間於維持分化能力下增殖。

[實施例2：培養基添加物之濃度探討]
探討GSK3β抑制劑、bFGF及EGF之濃度，於NCC之擴大培養時對NCC之自我增殖能力及分化能力所造成的影響。以下無特別提及的條件，係與實施例1同樣地進行擴大培養。

圖3顯示以bFGF及EGF之濃度為20ng/ml(A)或40ng/ml(B)，CHIR99021之濃度為1、2、3、5µM時之總細胞數的變化。CHIR99021濃度1µM或2µM時1週的細胞增殖比例為8-30倍(亦參照後述實施例8)。又，圖4顯示以bFGF及EGF之濃度為40ng/ml，CHIR99021之濃度為3、3.5、4、4.5、5µM時之總細胞數的變化。bFGF、EGF及CHIR99021之濃度，對總細胞數的變化不造成影響。

圖5顯示以bFGF及EGF之濃度為20ng/ml(A)或40ng/ml(B)，CHIR99021之濃度為1、2、3、5µM時之SOX10表現陽性細胞率的變化。又，圖6顯示以bFGF及EGF之濃度為40ng/ml，CHIR99021之濃度為3、3.5、4、4.5、5µM時之SOX10表現陽性細胞率的變化。CHIR99021之濃度為3-4.5µM時，於長期之培養期間(培養第121日)亦確認到90%以上之SOX10表現陽性細胞率。CHIR99021之濃度為2µM時，亦在比較長期的培養期間(培養第63日)中，確認到約55%以上之SOX10表現陽性細胞率。另一方面，CHIR99021之濃度為5µM時，至培養第42日為止維持約55%以上之SOX10表現陽性細胞率，但培養第63日SOX10表現陽性細胞率降低至約5%以下。CHIR99021之濃度為1µM時，於短期之培養期間(培養第21日)，觀察到SOX10表現陽性細胞率之降低，於培養第63日之SOX10表現陽性細胞率為約25%以下。再者，bFGF及EGF1之濃度，對SOX10表現陽性細胞率之變化不造成影響。

[實施例3：GSK3β抑制劑之探討]
除了將NCC之擴大培養所用的GSK3β抑制劑由CHIR99021變更為CP21R7以外係與實施例1同樣地進行NCC之擴大培養。CP21R7之濃度為0.1、0.5或1µM。

SOX10表現陽性細胞率之變化示於圖7。CP21R7濃度0.5或1µM時，於培養第84日亦確認到高的SOX10表現陽性細胞率。另一方面，CP21R7濃度0.1µM時，於短期之培養期間(培養第21日)SOX10表現陽性細胞率開始降低。

[實施例4：神經脊細胞對神經細胞之分化誘導]
確認實施例1所擴大培養之NCC對神經細胞之分化能力。
基於非專利文獻4記載之方法進行對神經細胞之分化誘導。
將經30日擴大維持培養之NCC於培養盤播種5×10⁵ 個，以含有10μM SB431542及1μM CHIR99021之CDM培養基培養1日。1日後，交換為添加有B-27 Supplement(17504-044、Gibco)、N-2 Supplement(17502-048、Gibco)、L-
glutamine(073-05391、和光純藥)、Penicillin/Streptomycin (15140-122、Gibco)、BDNF(028-16451、和光純藥)、GDNF(074-06264、和光純藥)、NT-3(141-06643、和光純藥)、NGF(141-07601、和光純藥)之Neurobasal medium (21103-049、Gibco公司)，於37℃、5%CO₂ 下培養35日。上述培養期間中每3~4日進行培養基交換。

添加4%多聚甲醛(和光純藥)於4℃溫控放置1小時，進行細胞之固定。與作為1次抗體之抗TUBB3抗體 (845502、Bioregend公司)及抗GFAP抗體(ab7260、abcam公司)反應，進一步依序與作為2次抗體之與1次抗體之免疫動物配合的Alexa488標識2次抗體(Invitrogen公司)及Alexa568標識2次抗體反應後，以螢光顯微鏡觀察。
確認到由經30日維持培養之NCC分化而出現表現TUBB蛋白質的神經細胞，及表現GFAP蛋白質的神經膠細胞。

進一步地，使用經84日擴大維持培養之NCC，同樣地確認對神經細胞之分化能力。
其結果，確認到對神經細胞(Peripherin陽性細胞)及神經膠細胞(GFAP陽性細胞)之分化。

[實施例5：神經脊細胞對色素細胞之分化誘導]
確認實施例1所擴大培養的NCC對神經細胞之分化能力。
基於非專利文獻1記載之方法，進行對黑色素細胞之分化誘導。
將經84日擴大維持培養之NCC播種於經Fibronectin被覆之6well培養盤，以含有10μM SB431542及1μM
CHIR99021之CDM培養基培養1日。1日後，交換為添加有BMP4及Endothelin-3(和光純藥)之CDM培養基，於37℃、5%CO₂ 下培養7日。上述培養期間中每2日進行培養基交換。

添加4%多聚甲醛於4℃溫控放置1小時，進行細胞之固定。與作為1次抗體之抗MITF抗體(Sigma公司)反應，進一步依序與作為2次抗體之與1次抗體之免疫動物配合的Alexa568標識2次抗體(Invitrogen公司)反應後，以螢光顯微鏡觀察。確認到由經84日維持培養之NCC分化而出現表現MITF蛋白質的黑色素細胞。

[實施例6：神經脊細胞對間葉系間質細胞之分化誘導]
確認實施例1所擴大培養之NCC對間葉系間質細胞之分化能力。
基於非專利文獻1記載之方法進行對間葉系間質細胞之分化誘導。
將經84日擴大維持培養之NCC播種於經Fibronectin被覆之直徑6cm之細胞培養用培養皿，以含有10μM
SB431542及1μM CHIR99021之CDM培養基培養1日。1日後，將培養基交換為CTS StemPro MSC SFM(Gibco, A1033201)。細胞之繼代係藉由以StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent(Invitrogen公司)剝離細胞，以1.0-2.0×10⁶ 個/dish(10cm dish的情況時)之密度播種來進行。

對於對間葉系間質細胞之分化誘導開始14日後的NCC，使用人類間葉系間質細胞之表面抗原標記的抗體即CD73抗體(BD)、CD44抗體(BD)、CD45抗體(BD)及CD105抗體(eBioscience)進行免疫染色後，進行FACS解析。確認到由經84日維持培養之NCC分化而出現表現CD44、CD73及CD0105之各蛋白質，且不表現CD45蛋白質之間葉系間質細胞。

[實施例7：神經脊細胞對骨細胞、軟骨細胞或脂肪細胞之分化誘導]
確認實施例1所擴大培養之NCC對骨細胞、軟骨細胞或脂肪細胞之分化能力。
基於非專利文獻1記載之方法進行對骨細胞、軟骨細胞或脂肪細胞之分化誘導。
以實施例6記載之方法使經84日擴大維持培養之NCC分化為間葉系間質細胞。將間葉系間質細胞以4.0×10⁴ 個/ well播種於經Fibronectin被覆之12well培養盤，以含有10%FBS、0.1μM dexa-methasone、50μg/ml ascorbic acid及10mM β-glycerophosphate之αMEM培養4週，進行對骨細胞之分化誘導。培養基係2-3日交換1次。藉由茜素紅染色檢測鈣化性結節，確認到對骨細胞之分化。

對軟骨細胞之分化誘導係如下般進行。首先將由經84日擴大維持培養之NCC所分化誘導的間葉系間質細胞以1.5×10⁵ 個/5μl之濃度，懸浮於含有1% (v/v) ITS+ premix(BD)、0.17mM AA2P、0.35mM Proline (Sigma)、0.1mM dexamethasone (Sigma)、0.15%(v/v) glucose (Sigma)、1mM Na-pyruvate(Invitrogen)、2mM GlutaMax、0.05mM MTG、40ng/ml PDGF-BB及1% (v/v) FBS(Nichirei)之DMEM：F12(Invitrogen)，於經Fibronectin被覆之12well培養盤點上細胞懸浮液5μl/well，培養1小時。1小時後添加1ml/well之進一步添加10ng/ml之TGFβ3(R&D)及100 ng/ml之BMP7(和光純藥)的培養基。培養10日，藉由愛爾新藍染色確認軟骨細胞之分化出現。

對脂肪細胞之分化誘導係如以下般進行。將由經84日擴大維持培養之NCC所分化誘導的間葉系間質細胞以4.0×10⁴ 個/well播種於經Fibronectin被覆之24well培養盤，以hMSC-Human Mesenchymal Stem Cell Adipogenic Differentiation Medium BulletKit(Lonza Japan)所附屬之培養基培養4週。培養基係2-3日交換1次。藉由油紅O染色，檢測經染色之細胞內的油滴，確認到對脂肪細胞之分化。

骨細胞之茜素紅S染色係如下般進行。首先添加100%乙醇於室溫溫控放置10分鐘，進行細胞之固定。與Alizarin-Red staining Solution(MERCK MILLIPORE公司)反應，以水洗淨並乾燥後，以顯微鏡觀察。
軟骨細胞之愛爾新藍染色，係藉由使添加4%多聚甲醛(和光純藥)，於室溫溫控放置30分鐘經固定之細胞，與1%愛爾新藍染色液(MUTO PURE CHEMICALS CO.)反應後，以水洗淨並乾燥來進行。
脂肪細胞之油紅O染色，係藉由將細胞以10%福馬林於室溫固定1小時，與使Oil Red O Solution以isopropanol稀釋為0.5%者與水以3:2混合而得的染色液在室溫反應1小時，以水洗淨來進行。油滴之觀察係以顯微鏡進行。

[實施例8：培養基添加物之濃度探討2]
探討NCC之擴大培養中的bFGF之濃度，對NCC之自我增殖能力及分化能力所造成的影響。對於以下無特別提及的條件，係與實施例1同樣地進行擴大培養。

圖8顯示以CHIR99021之濃度為1.5 µM，以bFGF之濃度為10、12.5、15.0、17.5 ng/ml時之總細胞數的變化；圖9顯示SOX10表現陽性細胞率之變化。bFGF濃度對SOX10表現陽性率不造成影響。

總細胞數之變化行為於上述bFGF之濃度範圍中大致相同，細胞增殖比例係1週6-13倍之範圍。由於實施例2中之1週的細胞增殖比例，於CHIR99021濃度1µM 或2µM、bFGF濃度20ng/ml或40ng/ml，為更高範圍的8-30倍(參照圖3)，故暗示了bFGF有助於NCC之自我增殖能力，20‐40ng/ml為其適當的濃度範圍。

[實施例9：GSK3β抑制活性之測定]
確立用以評估GSK3β抑制劑之GSK3β抑制活性的實驗系統。

於Wnt/β-鏈蛋白路徑中，GSK3β係於Wnt-配位體非存在下對β-鏈蛋白之磷酸化發揮功能。經磷酸化之β-鏈蛋白係受到泛素化而於蛋白酶體內分解，因此Wnt-β-鏈蛋白路徑下游之基因表現受到抑制。該路徑中GSK3β被抑制時，β-鏈蛋白不會被分解，且移動至核內，與T-Cell Factor (TCF)/Lymphoid Enhancer Factor(LEF)等其他轉錄因子一起誘導Wnt-β-鏈蛋白路徑下游之基因表現。CellSensor LEF/TCF-bla HCT-116 Cell Line(Thermo Fisher, K1676)，係接入LEF/TCF並穩定表現，且接入報導基因(beta-lactamase reporter gene)在LEF/TCF之控制下表現。該細胞株中於Wnt-配位體非存在下之報導基因的表現，係成為GSK3β之功能(β-鏈蛋白之磷酸化功能)抑制的指標。藉由使用該細胞株之分析，來測定GSK3β抑制劑之GSK3β抑制活性。

分析係根據Invitrogen公司之實驗指南(
CellSensor(註冊商標)LEF/TCF-bla HCT 116 Cell-based Assay Protocol)來進行。
具體而言，將LEF/TCF-bla HCT-116 Cell懸浮於分析培養基(OPTI-MEM, 0.5% dialyzed FBS, 0.1 mM NEAA, 1 mM Sodium Pyruvate, 100 U/mL/100 μg/mL Pen/Strep) (312,500 cells/mL)。將細胞懸浮液播種於分析培養盤之各孔(10,000 cells/well)，培養16-24小時。
將GSK3β抑制劑(此處係使用CHIR99021)添加至孔中(濃度0.316、1.00、3.16、10.0、31.6、100、316、1000、3160、10000 nM)，培養5小時。
將beta-lactamase之基質溶液(LiveBLAzer-FRET B/G (CCF4-AM) Substrate Mixture)添加至各孔中(8 μL / well)，溫控放置2小時。以螢光盤分析儀測定螢光值。測定係對各濃度條件以2個孔進行。

結果示於「表1」。1µM之CHIR99021所顯示之GSK3β抑制活性以螢光值計係113.5(2個孔之平均值)。
對於CHIR99021以外之GSK3β抑制劑，亦藉由本實驗系統測定於各濃度條件之螢光值，遵照固定方法製成檢量線，藉此可決定顯示與1µM之CHIR99021所顯示之GSK3β抑制活性(以螢光值計係113.5)同等之GSK3β抑制活性的濃度。

[表1]

[圖1] 表示神經脊細胞之擴大培養開始後之總細胞數變化的圖(實施例1)。縱軸表示總細胞數，「1.E+」表示為10的乘數。例如，若為「1.E+04」，係意指10000個。橫軸表示培養日數。

[圖2] 表示神經脊細胞之擴大培養開始後之SOX10表現陽性細胞率變化的圖(實施例1)。縱軸表示SOX10表現陽性細胞率(%)，橫軸表示培養日數。

[圖3] 以bFGF及EGF之濃度為20ng/ml(A)或40ng/ml (B)，以CHIR99021之濃度為1、2、3或5µM(各自表示為1×、2×、3×、5×)，進行神經脊細胞之擴大培養，顯示測定總細胞數變化之結果的圖(實施例2)。縱軸表示總細胞數，「1.E+」表示為10的乘數。例如，若為「1.E+04」，係意指10000個。橫軸表示培養日數。

[圖4] 以bFGF及EGF之濃度為40ng/ml，以CHIR99021之濃度為3、3.5、4、4.5或5µM，進行神經脊細胞之擴大培養，顯示測定總細胞數變化之結果的圖(實施例2)。縱軸表示總細胞數，「1.E+」表示為10的乘數。

[圖5] 以bFGF及EGF之濃度為20ng/ml(A)或40ng/ml (B)，以CHIR99021之濃度為1、2、3或5µM(各自表示為1×、2×、3×、5×)，進行神經脊細胞之擴大培養，顯示測定SOX10表現陽性細胞率變化之結果的圖(實施例2)。縱軸表示SOX10表現陽性細胞率(%)，橫軸表示培養日數。

[圖6] 以bFGF及EGF之濃度為40ng/ml，以CHIR99021之濃度為3、3.5、4、4.5或5µM，進行神經脊細胞之擴大培養，顯示測定SOX10表現陽性細胞率變化之結果的圖(實施例2)。縱軸表示SOX10表現陽性細胞率(%)，橫軸表示培養日數。

[圖7] 顯示使用CP21R7作為GSK3β抑制劑之神經脊細胞之擴大培養開始後之SOX10表現陽性細胞率變化的圖(實施例3)。縱軸表示SOX10表現陽性細胞率(%)，橫軸表示培養日數。

[圖8] 以bFGF之濃度為10、12.5、15.0、17.5 ng/ml，進行神經脊細胞之擴大培養，顯示測定總細胞數變化之結果的圖(實施例8)。縱軸表示總細胞數，「1.E+」表示為10的乘數。

[圖9] 以bFGF之濃度為10、12.5、15.0、17.5 ng/ml，進行神經脊細胞之擴大培養，顯示測定SOX10表現陽性細胞率變化之結果的圖(實施例8)。縱軸表示SOX10表現陽性細胞率(%)，橫軸表示培養日數。

Claims

一種神經脊細胞之製造方法，其包含以下步驟： (1)得到神經脊細胞之步驟、 (2)於含有GSK3β抑制劑及鹼性纖維母細胞生長因子之培養基中將神經脊細胞懸浮培養之步驟，其中該培養基含有顯示與超過1μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度之GSK3β抑制劑。
如請求項1之製造方法，其中前述培養基進一步含有TGFβ抑制劑。
如請求項1之製造方法，其中前述培養基為CDM培養基。
如請求項1之製造方法，其中前述培養基進一步含有上皮生長因子。
如請求項1之製造方法，其中前述GSK3β抑制劑為選自由CHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、 kenpaullone、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及SB415286所成群組的至少一者。
如請求項5之製造方法，其中前述GSK3β抑制劑為CHIR99021。
如請求項2之製造方法，其中前述TGFβ抑制劑為選自由SB431542、A83-01、LDN193189、Wnt3a/BIO、 BMP4、GW788388、SM16、IN-1130、GW6604及 SB505124所成群組的至少一者。
如請求項1之製造方法，其中前述步驟(2)中，神經脊細胞係於播種後每5~8日繼代。
如請求項1之製造方法，其中前述步驟(1)，為由幹細胞分化誘導神經脊細胞之步驟。
一種神經脊細胞之增殖方法，其包含以下步驟： (I)於含有GSK3β抑制劑及鹼性纖維母細胞生長因子之培養基中將神經脊細胞懸浮培養之步驟，其中該培養基含有顯示與超過1μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度之GSK3β抑制劑。
一種培養基，其含有GSK3β抑制劑、鹼性纖維母細胞生長因子及神經脊細胞，且含有顯示與超過1μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度之GSK3β抑制劑。
如請求項11之培養基，其進一步含有TGFβ抑制劑。
如請求項11之培養基，其中前述培養基為CDM培養基。
如請求項11之培養基，其進一步含有上皮生長因子。
如請求項11之培養基，其中前述GSK3β抑制劑為選自由CHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、 kenpaullone、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及SB415286所成群組的至少一者。
如請求項15之培養基，其中前述GSK3β抑制劑為CHIR99021。
如請求項12之培養基，其中前述TGFβ抑制劑為選自由SB431542、A83-01、LDN193189、Wnt3a/BIO、 BMP4、GW788388、SM16、IN-1130、GW6604及 SB505124所成群組的至少一者。
一種冷凍保存物，其包含以如請求項1之製造方法所得到之神經脊細胞。
一種神經細胞、神經膠細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞或色素細胞之製造方法，其包含以下步驟： (i)於含有GSK3β抑制劑及鹼性纖維母細胞生長因子之培養基中將神經脊細胞懸浮培養之步驟，其中該培養基含有顯示與超過1μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度之GSK3β抑制劑，及 (ii)使步驟(i)所得到之神經脊細胞，分化為選自由神經細胞、神經膠細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞及色素細胞所成群組的至少一種細胞之步驟。
一種將具有多能性之神經脊細胞長期間培養之方法，其包含以下步驟： (1)得到神經脊細胞之步驟、 (2)於含有GSK3β抑制劑及鹼性纖維母細胞生長因子之培養基中將神經脊細胞懸浮培養之步驟，其中該培養基含有顯示與超過1μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度之GSK3β抑制劑。
一種用以將具有多能性之神經脊細胞長期間培養之使用，其係使用含有鹼性纖維母細胞生長因子，與顯示與超過1μM之濃度的CHIR99021所顯示之效果同等效果的濃度之GSK3β抑制劑之培養基。