KR101743799B1 - 아스코르브산을 이용하여 인간 역분화 줄기세포를 신경능선 세포로 분화시키는 방법 및 상기 방법에 의해 형성된 신경능선 세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 a) 인간 역분화 줄기세포를 신경상피 세포로 분화시키는 단계; b) 상기 신경상피 세포에 아스코르브산을 처리하여 신경능선 세포를 형성하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계 이후에 아스코르브산에 의해 형성된 신경능선 세포만을 분리하는 단계를 포함하는, 인간 역분화 줄기세포를 신경능선 세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

Description

아스코르브산을 이용하여 인간 역분화 줄기세포를 신경능선 세포로 분화시키는 방법 및 상기 방법에 의해 형성된 신경능선 세포 {METHOD FOR DEFFERENTIATIONING HUMAN INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS INTO NEURAL CREST CELLS USING ASCORBIC ACID, AND NEURAL CREST CELLS FORMED BY THE USING METHOD}

본 발명은 인간 역분화 줄기세포(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)를 아스코르브산 (ascorbic acid, AA)을 사용하여 신경능선 세포 (neural crest cells, NCCs) 분화시키는 방법, 및 상기 방법으로 형성된 신경능선 세포에 관한 것이다.

줄기세포는 자가 증식이 가능하고 다양한 종류의 신경세포들로 분화 할 수 있으며 뇌신경 질환 치료를 위한 세포 치료제로서 오랫동안 연구되어 오고 있다. 줄기세포를 원하는 특정 세포의 형태로 분화를 유도하기 위해서는 관련 특정 신호 전달 과정의 활성화가 중요하며, 따라서 이와 관련된 인자들의 작용 과정에 대한 정확한 이해가 무엇보다 필요하다.

한편, 신경능선 세포(neural crest cells, NCCs)는 척수신경절, 척수신경, 감각신경절, 자율신경절, 크롬친화세포의 기원이다. 신경능선 세포는 멜라닌 세포(melanocytes), 두부 연골과 뼈(craniofacial cartilage and bone), 평활근(smooth muscle)과 같은 중배엽계(mesenchymal lineage)세포, 혹은 슈반세포(schwann cells)와 같은 말초 신경세포(peripheral neurons) 등의 다양한 계열의 세포로 분화할 수 있어 신경능선 줄기세포 (neural crest stem cells, NCSCs) 혹은 제 4의 점 레이어(germ layer)라 불리며, 새로운 세포치료제의 공급원으로서 연구되어오고 있다. 현재 보고되고 있는 체외에서 신경능선 세포를 획득하는 방법으로는 쥐(mouse), 닭(chick), 혹은 인간(human) 개체로부터 일차 배양하여 얻는 방법이 개발되었으나, 이는 각 개체의 배아로부터 신경관(neural tube)을 분리한 후 미세절단(microdissection)하여 신경능선 세포만을 분리 획득하는 방법으로 실제 세포 치료제로서의 연구, 개발 및 상용화에는 윤리적 문제의 한계가 있다. 최근에는 섬유아세포 성장인자 2(fibroblast growth factor 2, FGF2)와 상피세포성장인자(epidermal growth factor, EGF)를 이용하여 신경능선으로의 분화 등 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cells, hESCs)와 같은 줄기세포로부터 신경능선 세포로의 개발이 연구되고 있으나, 분화를 유도하기까지 고가의 성장인자들을 이용하여야 하고 시간이 오래 걸린다는 문제점이 있다.

또한, 아스코르브산은 포유동물의 뇌신경계에서, 글루코오즈(glucose)로부터 합성이 가능하며, 인간뿐만 아니라 영장류에서 아스코브산은 활성화된 자유 라디칼(free radicals)을 제거하는 항산화제로 작용하며, 뇌의 구조와 대뇌의 기능을 유지 하는데 관여함이 알려져 있다. 또한, 콜리너직(cholinergic)과 같은 신경 전달 물질(neurotanmmission)의 분비에 관여함이 보고되었고(Sandstrom MI, Rebec GV. Extracellular ascorbate modulates glutamate dynamics: role of behavioral activation. BMC Neurosci. 2007, 16;8-32), 슈반세포(schwann cells)에 의해 마이엘린(myelin) 형성을 향상시킬 수 있음이 알려져 왔다.

이에, 본 발명에서는 종래에 사용된 섬유아세포 성장인자 2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 대신에 아스코르브산을 사용하여 비용을 절감함과 동시에, 인간 역분화 줄기세포로부터 신경능선 세포로의 분화능을 증가시키는 방법을 얻고자 하였다.

Sandstrom MI, Rebec GV. Extracellular ascorbate modulates glutamate dynamics: role of behavioral activation. BMC Neurosci. 2007, 16;8-32.

본 발명은 a) 인간 역분화 줄기세포를 신경상피 세포로 분화시키는 단계; b) 상기 신경상피 세포에 아스코르브산을 처리하여 신경능선 세포를 형성하는 단계 및 c) 상기 b) 단계 이후에 아스코르브산에 의해 형성된 신경능선 세포만을 분리하는 단계를 포함하는, 인간 역분화 줄기세포를 신경능선 세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 형성된 신경능선 세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 a) 인간 역분화 줄기세포를 신경상피 세포로 분화시키는 단계; b) 상기 신경상피 세포에 아스코르브산을 처리하여 신경능선 세포를 형성하는 단계 및 c) 상기 b) 단계 이후에 아스코르브산에 의해 형성된 신경능선 세포만을 분리하는 단계를 포함하는, 인간 역분화 줄기세포를 신경능선 세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일예에 의하면, 상기 아스코르브산의 농도는 1 내지 100 uM 일 수 있다.

본 발명의 다른 예에 의하면, 상기 아스코르브산의 농도는 1 내지 50 uM 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 예에 의하면, 상기 a) 단계는 넌이센셜 아미노산, 베타-머캅토에탄올, 1X N2 보충물 및 페니실린/스트렙토마이신으로 구성된 뉴로베이잘 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 예에 의하면, 상기 c) 신경능선 세포만을 분리하는 단계는 p75에 특이적으로 염색된 신경능선 세포들만을 분리하는 단계일 수 있다.

본 발명의 또 다른 예에 의하면, 상기 신경능선 세포만을 분리하기 위해 트립신-이디티에이(trypsin-EDTA)를 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 예에 의하면, 상기 b) 단계 이후에 분리한 신경능선 세포의 분화 능력을 체외 및 체내에서 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 예에 의하면, 상기 신경능선 세포를 확인하는 단계는 신경능선 세포 특이인자인 p75, AP2-α 및 HNK-1 중 하나 이상의 발현을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 인간 역분화 줄기세포를 신경능선 세포로 분화시키는 방법에 의해 형성된 신경능선 세포를 제공한다.

본 발명의 인간 역분화 줄기세포를 신경능선 세포로 분화시키는 방법은, 인간 역분화 줄기세포로부터 신경세포로의 분화 과정에서 분화 초기 단계에 아스코르브산을 처리하여 배양할 경우, 신경능선 세포로 분화된 세포의 수가 증가되는 장점이 있다. 상기와 같이 유도된 신경능선 세포는 신경계 세포 및 중배엽계 세포로 용이하게 분화시킴으로써 손상된 신경계의 치료 및 중배엽계 조직 및 구조들의 세포 대체 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에서 제조된 신경능선 세포를 세포 특이 인자를 이용하여 분리하는 과정을 통해서 순수한 신경능선 세포를 얻을 수 있다는 장점이 있다.

또한, 본 발명은 인간 역분화 줄기세포를 이용함으로서 중추 신경계로부터 분리한 신경능선 세포 혹은 배아줄기세포에 비해, 신경능선 세포의 공급원으로 윤리적인 문제가 없으므로 보다 접근성이 뛰어나며 임상적 적용을 위한 충분한 수의 개체를 제공할 수 있다는 점과 고가의 다양한 성장인자들이 아닌 보다 저렴한 아스코르브산만을 사용함으로서 경제적이라는 장점을 갖는다.

도 1은 체외(in vitro)에서 인간 역분화 줄기세포로부터 신경능선세포로의 단계별 분화 사진(A)과 뇌의 각 영역의 전구체 특이적으로 발현되는 인자들의 면역 염색 결과 사진(B)이다.
도 2는 아스코르브산을 농도별(25 μM, 50 μM, 그리고 100 μM)로 처리하였을 때의 사진(A)과 각 세포들에서 신경능선 특이 인자인 p75의 유전자 발현을 RT-PCR(B)로 확인한 결과 사진이다. (C)에서는 다양한 신경능선 세포 특이 인자인 p75, HNK-1, 그리고 AP2-α의 발현을 면역 형광 기법으로 확인하였고, 더 나아가 25 μM 아스코르브산과 FGF2를 처리하여 상기 인자들의 발현 정도를 FACS를 통해 정량 분석한 결과(D)이다.
도 3은 p75에 특이적으로 염색되는 신경능선 세포만을 fluorescence-activated cell sorting을 이용하여 분리하기 전(A)과 분리 후(A'), 분리한 신경능선 세포의 배양 1일째 사진(B)과 다양한 신경능선 인자들(Snail, Pax3, Sox9, S0x10, HNK-1, p75, 그리고 Slug)의 발현 차이를 분화 전(iPSCs)과 분화 후 분리된 신경능선 세포(분리 후 p75+ 세포)에서 RT-PCR(C)로 확인한 결과이다.
도 4는 분리된 신경능선 세포들을 중배엽계 세포인 근세포(myofibroblast)로 분화시켰을 때의 광학 사진과 α-smooth muscle actin(α-SMA)로 면역 형광 염색(A)한 결과이다. B에서는 각각 지방세포(adipogenic cells)를 확인하기 위한 오일 레드 오(oli red O) 염색, 연골세포(chondrogenic cells)를 보기 위한 알시안 블루(Alcian Blue) 염색, 그리고 뼈세포(osteogenic cells)를 확인하기 위해 알리자린 레드(alizarin red) 염색을 시행한 결과 사진이다.
도 5는 분리한 신경능선 세포를 쥐의 손상된 척수에 이식한 후 이 세포들의 체내(in vivo)에서의 생존여부를 확인한 결과이다. 이식한 신경능선 세포의 경우 인간 유래 세포이므로 인간 핵(human nucleus, hNu-green)을 염색하여 체내의 다른 세포들과 구분하였다. 점선으로 표시된 부분은 injured area 이다.

본 발명은 a) 인간 역분화 줄기세포를 신경상피 세포로 분화시키는 단계; b) 상기 신경상피 세포에 아스코르브산을 처리하여 신경능선 세포를 형성하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계 이후에 아스코르브산에 의해 형성된 신경능선 세포만을 분리하는 단계를 포함하는, 인간 역분화 줄기세포를 신경능선 세포로 분화시키는 방법에 대한 것이다.

상기 인간 역분화 줄기세포는 인간 배아 줄기세포의 특징을 가지고 있기 때문에 대체세포로의 이용 가능성이 높고, 질병을 가지고 있는 환자의 체세포를 이용한 질병특이 줄기세포 모델을 확립할 수 있는 장점이 있다. 또한, 상기 신경능선 세포는 척수신경절, 척수신경, 감각신경절, 자율신경절, 크롬친화세포의 기원으로서, 멜라닌 세포, 신경세포 등 다양한 계열의 세포로 분화할 수 있다.

본 발명의 일예에 의하면, 상기 a) 단계는 인간 역분화 줄기세포(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)를 N2 보충물(supplement)을 포함한 무혈청(serum-free) DMEM/F12 배지로 배양하는 단계를 포함하는, 신경상피 세포의 형성에 관한 것이다.

또한, 상기 b) 단계는 상기 a) 단계에서 유도된 신경상피 세포를 N2 보충물(supplement) 및 1 내지 100 μM의 아스코르브산을 첨가한 무혈청 DMEM/F12 배지로 배양하여 신경능선 세포(neural crest cells, NCCs)로 분화시키는 것에 관한 것이다.

또한, 상기 c) 단계는 상기 b) 단계 이후에 순수하게 신경능선 세포만을 얻기 위해서 신경능선 세포 특이 인자인 p75로 세포를 염색하여 순수한 신경능선 세포만을 분리시키는 것에 관한 것이다.

본 발명의 다른 예에 의하면, 신경상피 세포를 신경능선 세포로 분화시키기 위해 사용하는 아스코르브산의 농도는 1 내지 100 uM 일 수 있다.

상기 범위를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 국한하지는 않는다.

본 발명의 또다른 예에 의하면, 상기 아스코르브산의 농도는 1 내지 50 uM 일 수 있다. 보다 바람직하게는, 아스코르브산의 농도가 25 uM 일 때, 신경능선 세포로의 분화능이 가장 높게 나타날 수 있다.

본 발명의 또다른 예에 의하면, 상기 a) 단계는 넌이센셜 아미노산, 베타-머캅토에탄올, 1X N2 보충물 및 페니실린/스트렙토마이신으로 구성된 뉴로베이잘 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 예에 의하면, 상기 c) 신경능선 세포만을 분리하는 단계는 p75에 특이적으로 염색된 신경능선 세포들만을 분리하는 단계일 수 있다.

본 발명의 또다른 예에 의하면, 상기 신경능선 세포만을 분리하기 위해 트립신-이디티에이(trypsin-EDTA)를 이용할 수 있다.

본 발명의 또다른 예에 의하면, 상기 b) 단계 이후에 분리한 신경능선 세포의 분화 능력을 체외 및 체내에서 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 예에 의하면, 상기 신경능선 세포의 분화 능력을 확인하는 단계는 신경능선 세포 특이인자인 p75, AP2-α 및 HNK-1 중 하나 이상의 발현을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 인간 역분화 줄기세포를 신경능선 세포로 분화시키는 방법에 의해 형성된 신경능선 세포를 제공한다.

또한, 본 발명의 또다른 예에 의하면, 본 발명의 방법에 의해 형성된 신경능선 세포를 근세포, 지방세포, 연골세포 및 뼈세포 등으로 분화시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에서 보다 상세히 설명한다.

단, 하기 실시 예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 의해 한정되지 아니한다.

< 실시예 및 비교예 >

실시예 1. 25 μM의 아스코르브산을 처리하여 인간 역분화 줄기세포로부터 신경능선 세포로의 분화

1.1 인간 역분화 줄기세포의 유지 배양

인간 역분화 줄기세포주는 WiCell에서 구입한 iPS(IMR90)-4를 사용하였으며, 이 세포는 성장인자들을 뺀 마트리젤(Matrigel^TM, Invitrogen)을 미리 도포해 둔 배양 접시에서 mTeSR^TM1(Stem Cell Technologies) 배지로 7일간 배양하며 매일 새로운 배지로 바꿔 주며 배양하였다. 이 세포의 계대 배양은 2 mg/ml의 디스페이즈(Dispase, Invitorgen)을 사용하여 7일에 한 번씩 진행하였다. 분화시작 전이나 계대 배양을 시행하기 전에 부분적으로 분화된 형태의 세포들의 제거는, 직접 그 끝을 구부려지게 만든 파스테르 파이펫(Pasteur pipette)을 이용하여 스테레오마이크로 현미경(stereomicroscope) 하에서 분화된 세포들을 제거하였다.

이렇게 유지 배양된 인간 역분화 줄기세포는 배양 7일째의 세포들을 신경계 세포로의 분화를 위해 사용하였다.

1.2 인간 역분화 줄기세포로부터 신경상피 세포로의 분화

인간 역분화 줄기세포로부터 신경상피 세포 형성을 위해서는 필수적으로 무혈청 DMEM/F12 배지에 N2 보충물을 추가한 배양액을 사용하였으며, 이 때 이 세포들을 새로운 배양 접시로의 이동은 필요로 하지 않는다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.

본 발명에서는 인간 역분화 줄기세포로부터 신경계 세포로의 분화를 위해 부착 배양법을 적용하였다. 인간 역분화 줄기세포를 mTeSR^TM1로 7일간 배양 한 후, 신경계로의 분화 시 초기 단계의 세포인 신경상피(NE) 세포로의 분화를 유도하기 위해 무혈청 DMEM/F12(Invitorgen) 배지에 1% 넌이센셜 아미노산(nonessential amino acid, Invitrogen), 0.1 mM 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol, Sigma-Aldrich), 1X N2 보충물(Supplement, Invitrogen), 그리고 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)로 구성된 뉴로베이잘 배지(neurobasal media)로 바꿔 준 후 이틀에 한 번씩 새로운 배지로 바꿔주며 7일간 배양하였다. 상기 신경상피 세포들의 경우 신경 능선세포 중에서의 초기의 단계의 세포들로 nestin 혹은 Pax 6는 발현하지만 Sox1은 발현하지 않는 세포들이다.

1.3 신경상피 세포로부터 신경능선 세포로의 분화

신경상피 세포로부터 좀 더 분화된 형태인 신경 능선세포로의 분화를 유도하기 위해 25 μM의 아스코르브산을 뉴로베이잘 배지에 첨가하여 7일간 더 배양하여 신경능선 세포로 분화시켰다.

실시예 2. 50 μM의 아스코르브산을 처리하여 인간 역분화 줄기세포로부터 신경능선 세포로의 분화

상기 실시예 1의 1.3에서, 아스코르브산을 50 μM 사용한 점을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 인간 역분화 줄기세포를 신경능선세포로 분화시켰다.

실시예 3. 100 μM의 아스코르브산을 처리하여 인간 역분화 줄기세포로부터 신경능선 세포로의 분화

상기 실시예 1의 1.3에서, 아스코르브산을 100 μM 사용한 점을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 인간 역분화 줄기세포를 신경능선세포로 분화시켰다.

비교예 1. FGF2 을 처리하여 인간 역분화 줄기세포로부터 신경능선 세포로의 분화

상기 실시예 1의 1.3에서, 아스코르브산 대신에 20 ng/ml의 섬유아세포 성장인자 2(fibroblast growth factor 2, FGF2, R&D)를 사용한 점을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 인간 역분화 줄기세포를 신경능선세포로 분화시켰다. 이 때, FGF2에 의해 유도된 신경능선세포들의 경우 전뇌(forebrain) 전구체(precursor)로서 Sox1과 Otx2을 특이적으로 발현하고 후뇌(hindbrain) 전구체에서 특이적으로 발현되는 Olig2는 발현되지 않는다.

실험예 1. 실시예 및 비교예의 면역염색관찰

인간 역분화 줄기세포로부터 신경능선 세포로의 분화를 유도하고자 부착 배양법을 적용하였다. 인간 역분화 줄기세포에서 신경계 초기 세포인 neuroepithelial (NE) 세포로의 분화를 유도하기 위해 무혈청 DMEM/F12(Invitorgen) 배지에 1% 넌이센셜 아미노산(nonessential amino acid, Invitrogen), 0.1 mM 베타-머캅토에탄올(-mercaptoethanol, Sigma-Aldrich), 1X N2 보충물(Supplement, Invitrogen), 그리고 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)로 구성된 뉴로베이잘 배지(neurobasal media)로 이틀에 한 번씩 새로운 배지로 바꿔주며 7일간 배양하였다. 그 다음으로 NE 세포에서 신경전구세포 혹은 신경능선 세포로의 분화를 유도하기 위해 25 μM, 50 μM, 그리고 100 μM의 아스코르브산 혹은 20 ng/ml 섬유아세포 성장인자 2(fibroblast growth factor 2, FGF2, R&D)를 뉴로베이잘 배지에 첨가하여 7일간 더 배양하였으며, 각 단계별마다 halogen을 광원으로하는 microscope (NSI-100, SAMWON)를 이용하여 사진을 촬영하였다.

또한, 신경능선 세포의 형성을 확인하고자 신경 전구세포 혹은 신경능선 세포의 특이적 표식자로 면역 형광 염색기법과, mRNA(messenger RNA)를 추출하여 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)로 유전자 발현을 분석하여 신경능선 세포로의 분화 여부를 확인하였다. 발달상에서 보면 신경능선 세포는 신경판의 주변부에서 발생하는 세포로, 따라서 체외에서 분화된 신경능선 세포들의 경우 신경 전구세포의 주변에서 관찰되었으며, 이에 대한 확인은 Pax6에 염색되는 세포들의 주변부에서 신경능선 세포 특이 인자들의 발현으로 확인하였다.

도 1은 체외에서 인간 역분화 줄기세포로부터 신경능선세포로의 단계별 분화 사진(A)과 뇌의 각 영역의 전구체에 특이적으로 발현되는 인자들의 면역 염색 결과 사진(B)이다. 도 1A의 첫 번째 사진은 7일간 배양된 인간 역분화 줄기세포의 전형적인 모습을 나타낸다. 또한, 도 1A의 두 번째 사진 내지 네 번째 사진을 참고하면, 각 분화 단계의 세포들의 모양을 확인할 수 있으며, 특히 분화 시작 후 14일째의 신경능선세포들의 경우 각각의 인자를 처리한 두 실험군인 실시예 및 비교예(AA 및 FGF) 모두에서 이 세포들의 전형적인 구조라 할 수 있는 신경 로젯(neural rosette) 형태를 관찰할 수 있었다.

실험예 2. RT - PCR 분석을 이용한 신경능선 세포의 분화 확인

TRIzol 시약을 이용하여 각 실험 군들에 해당하는 세포에서 RNA를 분리하였다. 분리된 각각의 RNA 1 μg를 Themoscript 역 전사 폴리머제이즈 연쇄 반응(Themoscript reverse trancription polymerase chain reaction) 시스템(Invitorgen)을 이용하여 cDNA로 전환하였다. PCR 반응의 경우, 하기 표의 프라이머(primer)를 사용하여 하기 와 같이 반응하였다.

					어닐링
명칭	포워드 프라이머		리벌스프라이머		온도 (℃)	생성물
SOX10	tgcagcacaagaaagaccc		gccacatcaaaggtctccat		60	400bp
p75	agccaaccagaccgtgtgt		ttgcagctgttccacctctt		55	663bp
PAX3	agccgcatcctgagaagtaa		ttctgcgctgtttcctcttt		55	202bp
HNK1	gcaagaagggcttcactgac		gcccccagaatagaaaggag		56	165bp
SOX9	agaaggaccacccggattac		cggcaggtactggtcaaact		50	401bp
SLUG	ctttagaaggcggcttgatg		gcacggagctataggtgctc		55	194bp
SNAIL	tttaccttccagcagcccta		cccactgtcctcatctgaca		55	207bp
GAPDH	accacagtccatgccatcac		tccaccaccctgttgctgta		58	450bp

DNA 템플레이트(template) 10pmol/μl, 포워드 프라이머(forward primer) 10pmol/μl, 리벌스 프라이머(reverse primer) 10pmol/μl, 5x PCR 마스터 믹스(master mix, ELPIS Biotech), 그리고 멸균된 증류수를 넣어 20μl로 반응액을 준비하고, 변선 94℃ 40초; 어닐링 온도는 상기 표 참조 40초; 증폭 72℃ 40초; 35 사이클로 하여 증폭하였다. 이 때 GAPDH를 인터널 컨트롤(internal control)로 하여 각 유전자들의 발현 차이를 비교하였다.

도 2는 아스코르브산을 농도별(25 μM, 50 μM, 그리고 100 μM)로 처리하였을 때의 사진(A)과, 각 세포들에서 신경능선 특이 인자인 p75의 유전자 발현을 RT-PCR(B)로 확인한 결과 사진이다.

도 2의 (B)에서는 각 분화 단계별 세포들에서 신경능선 세포 특이 인자인 p75의 발현 차이를 RT-PCR(B)로 확인해 본 결과, 25 μM 아스코르브산을 처리한 군인 실시예 1이 다른 군들보다 그 발현이 확연히 높았음을 확인할 수 있었다.

본 발명에 있어 아스코르브산에 의한 신경능선 세포의 증식 정도를 확인하기 위하여, 신경전구세포로의 분화 유도 시 중요한 인자로 알려진 섬유아세포 성장인자 2(fibroblast growth factor 2, FGF2)를 첨가한 비교예 1과 비교해 본 결과, 신경능선 세포의 형성정도가 아스코르브산을 첨가한 것에 비해 현저히 낮았다.

따라서, 인간 역분화 줄기세포로부터 신경능선 세포로의 분화에 있어서 아스코르브산이 중요하게 작용한다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 면역 형광 염색기법을 통한 신경능선 세포의 분화 확인

세포들을 면역 형광 염색을 위해, 세포를 PBS 중의 4% 포름알데히드(formaldehyde)로 상온에서 30분간 고정하였다. 이후 세포를 PBS로 5분씩 3회 세척하고, 0.2% 트립톤(tripton) X-100으로 20분간 침투 후, PBS로 5분씩 3회 세척하였다. 또한 염색 시 항체들의 비 특이적 결합을 방지하고자 10% 정상 염소 혈청(normal goat serum)으로 블로킹(blocking)시켰다. 사용된 각각의 일차 항체들과 사용한 희석 농도는 하기 표와 같으며, 4℃에서 밤새 반응시켰다. 그 후 일차 항체를 제거하고, 세포를 PBS로 5분씩 3회 세척한 후, 각 조건에 해당하는 플루오레세인(fluorescein)이 부착된 이차 항체를 1:200으로 희석하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 PBS로 5분씩 3회 세척하고 핵은 DAPI로 염색한 후 공 초점 현미경(confocal microscope, Carl Zeiss Inc)을 통해 세포에서 각 인자들의 발현을 확인하였다.

명칭	회사	촉매 번호	희석
p75	Advanced targeting system	AB-N07	1:200
HNK1	Sigma	C6608	1:200
AP2-α	DSHB	3B5	1:200
Nestin	Millipore	MAB5326	1:200
Pax6	Covance	PRB278P	1:200
Sox1	R&D	AF3369	1:200
Otx2	R&D	AF1979	1:200
Olig2	Santa Cruz	SC19969	1:200
βIII-tubulin	Millipore	AB9354	1:1000
S100	Dakocytomation	Z0311	1:200
Human Nuclei	Millipore	MAB1281	1:100
APC	Abcam	Ab16794	1:200
GFAP	DAKO	Z0334	1:1000
PLP	Abcam	ab9311	1:500
α-SMA	Abcam	ab32575	1:200
CollagenII	Abcam	ab21291	1:500

상기의 면역 형광 염색 기법을 통해, 도 1의 B에서 신경계(neuroectodermal lineage)로의 분화 시작 후 7일째에 초기 신경 전구세포에 해당하는 신경상피 세포에서 Pax6와 nestin의 발현은 관찰되었으나 후기 인자인 Sox1은 발현되지 않았다. 또한 뇌의 각 영역별 전구체에서 특이적으로 발현되는 인자들의 경우, FGF2에 의해 유도된 신경능선세포들에서는 Sox1과 전뇌/중뇌 전구체에서 발현되는 Otx2의 발현이 확인되었고, 아스코르브산을 처리한 군에서는 Sox1의 발현과 약간의 Otx2 발현이 확인되었다. 그러나 후뇌 전구체 특이 인자인 Olig2는 두 군 모두에서 관찰되지 않았다.

도 2의 C에서는 실시예 1과 비교예 1에 의한 신경능선 세포로의 분화를 상기 기법을 통해 확인하였다. 그 결과 각각의 신경능선 세포 특이 인자들인 p75, AP2-α, 그리고 HNK-1이 Pax6를 발현하는 세포들의 주변부에서 발현됨을 확인할 수 있었다.

실험예 4. Flow cytometer 분석을 통한 신경능선 세포의 분화 확인

Flow cytometer 분석을 위해, 분화 시작 후 14일째 세포들을 PBS로 한 번 세척한 후 트립신-이디티에이(trypsin-EDTA)를 37℃에서 3-5분간 처리하였다. 그 후 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함한 배지를 넣어 트립신-이디티에이의 활성화를 멈춘 후, 1500 rpm에서 3분간 원심분리를 시행하였다. 이 후 상층액은 버리고 가라앉은 세포층의 세척을 위해 PBS 5 ml을 넣어 리서스펜딩(resuspending)한 후, 단일 세포(single-cell) 형태로 떨어진 세포들을 얻기 위해 리서스펜팅한 세포들을 30 μm 셀 스트레이너(cell strainer, BD Bioscience)에 통과 시켰다. 그 후 상기와 같은 조건으로 원심분리를 시행하였다. 단일 처리된 세포들에 4% 포름알데히드(formaldehyde)를 넣어 상온에서 30분간 고정한 후 PBS로 1회 세척하고 0.2% 트립톤(tripton) X-100으로 20분간 침투 후, PBS로 1회 세척하였다. 상기 표와 같이 희석된 p75, HNK-1, 혹은 AP2-α 일차 항체를 상온에서 2시간 처리 후 각 조건에 해당하는 플루오레세인(fluorescein)이 부착된 이차 항체를 1:200으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰고, 그 후 PBS로 3회 세척 후 FACSCalibur(BD Science)를 시행 후 CellQust Pro(BD Science)를 이용하여 각 인자들의 발현 정도를 분석하였다.

도 2의 D에서 25 μM 아스코르브산 및 FGF2에 의해 인간 역분화 줄기세포로부터 신경능선 세포로의 분화 정도를 정량 분석하기 위해 상기와 같은 방법으로 샘플들을 준비하였다. 그 결과 FGF2를 처리한 군에서 각 인자들인 p75, HNK-1, AP2-α가 각각 24.07%, 28.96%, 그리고 37.16% 발현되었으나, 아스코르브산을 처리한 군에서는 각각 39.75%, 48.65%, 그리고 47.77%로 각 인자들의 발현이 더 높았음을 확인할 수 있었다.

따라서 본 결과로부터, 25 μM의 아스코르브산에 의한 신경능선 세포로의 분화(실시예 1)가 FGF2에 의해 분화된 신경능선 세포보다 더 증가한 것을 RT-PCR 결과(도 2의 B)에서처럼 확인할 수 있었다.

실시예 4. p75 에 특이적으로 염색된 신경능선 세포들만의 분리

순수하게 신경능선 세포만을 얻기 위해서 신경능선 세포 특이 인자인 p75로 세포를 염색한 후 fluorescence-activated cell sorter (FACS) 기법으로 p75에 특이적으로 염색된 신경능선 세포들만을 분리하였다. 구체적으로는,

상기와 같이 25uM의 아스코르브산에 의해 유도된 살아 있는 신경능선 세포를 분리하기 위해, 세포들을 PBS로 한 번 세척한 후 트립신-이디티에이(trypsin-EDTA)를 37℃에서 3~5분간 처리하였다. 상기 실험예 4에서와 같은 과정을 통해 단일 세포를 획득한 후, 1차 항체 반응을 위해 다음과 같이 준비한다. 2% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 넣은 PBS로 p75를 1:200으로 희석한 후 상기의 세포와 얼음 위에서 25분간 반응시킨다. 그 후 세포를 1mg/ml BSA가 들어간 PBS로 5분간 1회 세척하고, 이차 항체를 암상태의 얼음 위에서 15분간 반응 시킨다. 이 후 세포를 1mg/ml BSA가 들어간 PBS로 5분간 2회 세척 후, FACSDiva 소프트웨어(software, BD Bioscience)로 분석하고 FACSAria III(BD Bioscience)로 분리하였다. p75에 염색된 세포들은 25 μM 아스코르브산과 2% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함한 신경분화 배지가 들어간 5 ml의 FACS 튜브(BD Bioscience)에 분리되었다. 분리된 세포들은 Matirgel^TM(Invitrogen)로 미리 도포된 배양 접시에 옮겨 배양하였다.

상기에서 분리한 세포가 신경능선 세포임을 한 번 더 확인하고자 다양한 신경능선 세포 특이적 인자들의 발현을 RT-PCR로 확인하였다.

도 3은 p75에 특이적으로 염색되는 신경능선 세포만을 fluorescence-activated cell sorting을 이용하여 분리하기 전(A)과 분리 후(A'), 분리한 신경능선 세포의 배양 1일째 사진(B)과 다양한 신경능선 인자들(Snail, Pax3, Sox9, S0x10, HNK-1, p75, 그리고 Slug)의 발현 차이를 분화 전(iPSCs)과 분화 후 분리된 신경능선 세포(분리 후 p75+ 세포)에서 RT-PCR(C)로 확인한 결과이다.

도 3의 (A')를 통해서 대부분의 p75에 염색된 세포들임을 확인할 수 있었고, (B), (C)를 통해서 대부분의 인자들이 분리한 세포들에서 높게 발현됨을 확인할 수 있었다. 따라서 상기와 같이 분리된 세포들은 신경능선 세포임을 다시 확인하였다.

실험예 5. 체외에서 분리한 신경능선 세포의 중배엽계 세포로의 분화

5.1 근세포(myofibroblast)로의 분화 유도 및 확인

25 uM의 아스코르브산을 사용하여 분리한 신경능선 세포의 중배엽으로의 분화 가능성을 확인하기 위해 하기와 같이 분화를 시행하였다. 하기 분화 유도 과정에서는 알파-최소 필수 배지(α-minimal essential medium, α-MEM)에 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)를 첨가한 배지를 기본 배지로 하여 사용하였다. 먼저 분리한 신경능선 세포를 중배엽 전구세포(mesechymal precursor cells, MPCs)로 유도하기 위해 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 첨가된 α-MEM 배지로 5-7일간 배양하였고, 이후 근세포(myofibroblast cells)로의 분화를 유도하기 위해 같은 배지로 2주간 더 배양하였다.

근세포로 분화 유도 후, 이를 확인하기 위하여 광학현미경으로 관찰하고, 상기와 같이 유도 분화된 세포를 근세포 특이적으로 발현되는 인자인 α-SMA로 면역 형광 염색을 시행한 결과, 도 4의 A에서처럼 α-SMA가 발현됨을 확인할 수 있었다.

5.2 지방세포(adipogenic cells)로의 분화 유도 및 확인

지방세포(adipogenic cells)로의 분화는 상기의 분리된 신경능선 세포 유래 중배엽 전구세포(AA-NCC-MPCs) 세포 밀집도가 90%에 이르렀을 때, 1 mM 덱사메타손(dexamethasone, Sigma), 10 μg/ml 인슐린(Insulin, Sigma), 그리고 0.5 mM 1-메틸-3-이소부필잔틴(1-methyl-3-siobutylxanthine, IBMX)(Sigma)를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 들어간 α-MEM에 첨가한 배양액으로 AA-NCC-MPCs를 3주 이상 배양하여 지방세포로의 분화를 유도하였다.

지방세포로의 분화되었음을 확인하기 위하여, 지방세포의 액포(vacuole)에 축적되어 있는 지질을 지방세포에 특이적으로 반응하는 오일 레드 오 용액 (oil red O solution)을 사용하여 염색을 시행하였다. 이를 통해서 세포의 액포들에 지질이 풍부하게 축적된 것을 확인함으로써 도 4의 B의 첫 번째 사진과 같이 염색된 지질을 확인할 수 있었다.

5.3 연골세포(chondrogenic cells)로의 분화 유도 및 확인

연골세포(chondrogenic cells)로 분화를 유도하기 위해, 5 ml의 구명배지(defined medium)에 1.0 x 10⁶개의 AA-NCC-MPCs를 15 ml 폴리프로필렌 코니컬 튜브(polypropylene conical tube)에 넣은 후 1200rpm으로 3분간 원심 분리하여 세포 펠렛(cell pellet)로 만들어 배양 접시에 세포 펠렛이 풀어지지 않도록 넣은 후 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함한 α-MEM 배지에 TGFα-3 10ng/ml, 그리고 아스코르브산 200 μM을 첨가한 배양액으로 4주 이상 배양하였다.

연골세포로 분화 여부를 확인하기 위해, pH 2.5의 3% 아세트산(glacial)에 녹인 알시안 블루(alcian blue)로 분화된 세포를 30분간 염색 후 정세수로 5-10분간 3번씩 세척하였다. 그 결과 도 4의 B의 두 번째 사진과 같이 연골세포로 분화된 세포들은 다중층의 기질(matrix) 형태를 보였으며 알시안 블루에 의해 연골의 프로테오글리칸(proteoglycan)을 염색된 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 결과를 통해 AA-NCC-MPCs를 상기와 같이 분화를 시행하였을 때 이들 세포가 연골세포로 분화되었음을 확인할 수 있었다.

5.4 뼈세포(osteogenic cells)로의 분화 유도 및 확인

뼈세포(osteogenic cells)로 분화시키기 위해, 분리한 AA-NCC-MPCs를 4.0 x 10³개/24 well의 저 밀도로 플레이팅(plating) 하여 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함한 α-MEM 배지에 베타 글리세롤 포스파트(β-glycerol phosphate) 10 mM, 덱사메타손(dexamethasone) 0.1 mM, 그리고 아스코르브산 200 μM를 넣은 배지로 3에서 4주간 배양하였다.

뼈세포로 분화되었음을 확인하기 위해, 상기 세포들을 -20℃에서 차가운(ice-cold) 95% 에탄올로 고정한 후 pH 4.2의 40 mM 알리자린 레드 에스(alizarin red S)용액으로 1시간 동안 염색하였다. 이 후 정제수로 5-10분간 3-5회 세척하고 다시 PBS로 15분간 세척하였다. 그 결과 도 4의 B의 세 번째 사진과 같이 분화된 세포들 중에서 석회화된 뼈 조직을 비색 정량할 수 있는 알리자린 레드(alizarin red)에 염색된 세포들이 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 AA-NCC-MPCs가 뼈세포 분화되었음을 확인할 수 있었다.

실험예 6. 손상된 쥐의 척수로 분리한 신경능선 세포의 이식

모든 동물실험은 단국대학교 동물관리 위원회(Insititutional Animal Care and Use Committee)의 지침에 따라 수행하였다.

12주령 암컷 Sprague-Dawley rat(SD rat, 무게 230-250g)을 사용하였으며, 다음과 같이 두 그룹으로 나누었다.

상기 분리한 신경능선 세포를 쥐의 손상된 척수에 이식하여, 체내 환경에서 생존과 분화를 확인하였다.

그룹 A: 분리한 신경능선 세포를 이식할 그룹

그룹 B: 네거티브 컨트롤로서 PBS를 만을 주입한 그룹

쥐의 척수 손상 모델을 제작하기 위하여, 동물을 이소플란(isoflurane, Forane)으로 마취하였다. 마취 후 쥐의 등 쪽 피부와 근육을 순차적으로 절개한 후, 척수 T9-T10을 노출시키기 위해 그 부위의 척추 뼈를 제거(laminectomy)하였다. 노출된 T9-T10 부위를 인피니트 호리즌 스파이널 코드 임팩터(Infinite Horizon Spinal Cord Impactor, IH Impactor, Precision System & Instrumentation)를 이용하여 200 kdyne 힘으로 추를 떨어뜨려 드웰 시간(dwell time) 0초로 하여 컨투젼(contusion)을 가했다. 만성 척수 손상 쥐에서 이식한 세포의 생존을 확인하기 위해 9일 후에 분리한 신경능선 세포를 이식을 진행하였다. 손상 후 9일째에 마리 당 총 2.0 x 10⁶ 개의 세포를 Hamilton syringe를 이용하여 분당 4.0 x 10⁵ 개의 속도로 5분간 손상된 척수부위에 주입하였다. 세포 주입 후 근육과 피하 층 그리고 등 피부를 블랙 실크(black silk)로 봉합하였다. 수술 직후 모든 동물들에 복강으로 노말 살린(normal saline)을 주입하였고, 박테리아 감염과 뉴로패틱(neuropathic) 고통(pain)을 줄이기 위해 40mg/kg의 폰티암(fontiam, Hanmi Phama)은 근육주사로 10 mg/kg의 타이레놀(Tylenol, Janssen Phamaceutica)은 오랄 주입(oral administration)하였다. 또한 하루에 두 번씩 방광(bladder)을 짜주었다.

6.1 면역 조직 화학을 위한 조직 샘플의 제조

이식한 신경능선 세포가 손상된 척수 환경에서 생존 여부를 확인하기 위해, 이식 3일 후 분리한 신경능선 세포의 생존 여부를 확인하기 위하여, 세포 이식 후 3일째에 쥐를 희생하기 위해 쥐를 이소플란(isoflurane, Forane)으로 마취한 후 우심방을 열었다. 그 즉시 1 μl/ml 헤파린을 넣은 PBS를 좌심실에 28 ml/min 속도로 펌프를 이용하여 주입한 후 4% 포름알데하이드(formaldehyde)로 펄퓨젼(perfusion)하였다. 척수 조직만을 잘라내어 4% 포름알데하이드(formaldehyde)에 넣어 4℃에서 24시간 동안 보관한 후, 30% 스크로즈(Sucrose, Sigma)에 담궈 4℃에서 3일 동안 보관하였다. 분리한 척수에서 에피센터(epicenter)를 기준으로 커달(caudal) 1mm와 (rostral) 1mm로 해서 총 2mm로 손상 척수 부위를 잘라내어 M1 컴파운드(compound, Termo)에 넣어 표본 제작 후 -80℃에 보관하였다.

6.2 면역 조직 화학 분석

상기 7.1과 같이 준비된 조직 샘플을 냉동 절편기(Cryocut Microtome, Leica Biosystems Nussloch GmbH)로 16 μm 두께로 절편 조각을 만들었다. 면역 형광 염색을 위해 냉동 절편을 완벽하게 건조시킨 후, 0.2% 트리톤(Triton) X-100을 5분간 처리하고 PBS로 3회 세척한 다음, 상온에서 10% 혈청으로 샘플을 블로킹하고 일차 항체를 처리하여 4℃에서 오버나이트(overnight)로 반응 시켰다. 그 후 1:200으로 희석된 이차 항체를 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이 후 PBS로 3회 세척 후 DAPI로 세포 핵을 염색한 후 마운팅 용액(mounting soultion, Vector)을 처리한 후 마무리하였다. 결과 확인은 공초점 현미경(Confocal microscope, Zeiss)으로 촬영하였다.

손상된 척수에 주입된 세포가 생존하는 지 여부를 확인하기 위해, 인간 세포의 핵을 염색하는 휴면 뉴클레이(human nuclei, hNu-green)로 염색한 결과, 도 5의 A와 B에서 보이는 것과 같이 이식한 세포들이 존재함을 관찰할 수 있었으며, 이는 이식한 세포들이 손상된 환경(in vivo)에서도 생존함을 의미한다.

상기 실시예를 통해서, 인간 역분화 줄기세포를 신경능선 세포로 분화시키는 과정에서 아스코르브산을 처리하는 경우, 신경능선 세포로의 증식 정도가 아스코르브산을 사용하지 않은 경우에 비해서 훨씬 높다는 것을 알 수 있다.

또한, 상기 실험예를 통해서, 본 발명의 방법을 이용하여 제조된 신경능선 세포를 중배엽계 세포(근세포, 지방세포, 연골세포, 뼈세포)로 분화시킬 수 있음을 확인하였다.

Claims (9)

1. a) 인간 역분화 줄기세포를 신경상피 세포로 분화시키는 단계; 및
   b) 상기 신경상피 세포에 아스코르브산을 처리하여 신경능선 세포를 형성하는 단계 및
   c) 상기 b) 단계 이후에 아스코르브산에 의해 형성된 신경능선 세포만을 분리하는 단계를 포함하는, 인간 역분화 줄기세포를 신경능선 세포로 분화시키는 방법으로,
   상기 방법은 섬유아세포 성장인자 2 (FGF2)를 사용하지 않으며,
   상기 아스코르브산의 농도는 25 uM이고,
   상기 a) 단계는 넌이센셜 아미노산, 베타-머캅토에탄올, 1X N2 보충물 및 페니실린/스트렙토마이신으로 구성된 뉴로베이잘 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 청구항 1에 있어서, 상기 c) 신경능선 세포만을 분리하는 단계는 p75에 특이적으로 염색된 신경능선 세포들만을 분리하는 단계인 것을 특징으로 하는 인간 역분화 줄기세포를 신경능선 세포로 분화시키는 방법.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 신경능선 세포만을 분리하기 위해 트립신-이디티에이(trypsin-EDTA)를 이용하는 것을 특징으로 하는 인간 역분화 줄기세포를 신경능선 세포로 분화시키는 방법.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 b) 단계 이후에 분리한 신경능선 세포의 분화 능력을 체외 및 체내에서 확인하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 역분화 줄기세포를 신경능선 세포로 분화시키는 방법.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 신경능선 세포의 분화 능력을 확인하는 단계는 신경능선 세포 특이인자인 p75, AP2-α 및 HNK-1 중 하나 이상의 발현을 확인하는 것을 특징으로 하는 인간 역분화 줄기세포를 신경능선 세포로 분화시키는 방법.
9. 삭제

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