KR102010478B1

KR102010478B1 - 줄기 세포의 신경 능선 세포로의 분화용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법

Info

Publication number: KR102010478B1
Application number: KR1020170144751A
Authority: KR
Inventors: 황동연
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2017-11-01
Publication date: 2019-08-13
Also published as: KR20190049178A

Abstract

단백질 키나제 C(PKC) 저해제를 포함하는 줄기 세포의 신경 능선 세포(NCSC)로의 분화용 조성물, 키트, 및 이를 이용하는 방법을 제공한다. 이에 따르면, 성분이 간단하고 저비용인 조성물을 사용하여 줄기 세포로부터 신경 능선 세포로 효율적으로 분화시킬 수 있다.

Description

줄기 세포의 신경 능선 세포로의 분화용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법{Composition and kit for differentiating stem cells to neural crest stem cell, and method using the same}

단백질 키나제 C(protein kinase C: PKC) 저해제를 포함하는 줄기 세포의 신경 능선 세포(neural crest stem cell: NCSC)로의 분화용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다.

신경계 세포는 크게 두 종류로 구분할 수 있는데, 뇌와 척수를 구성하는 중추신경계 세포와, 운동신경, 감각신경, 자율신경 등을 구성하는 말초신경계 세포로 나눠진다. 중추신경계(뇌와 척수)를 구성하는 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte), 및 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)는 만능 줄기 세포에서 분화된 신경 전구 세포(neural stem cell: NSC)를 분화시켜 만들 수 있으며, 반면에 말초신경계를 구성하는 말초신경세포(운동신경, 자율신경, 및 감각신경)과 슈반세포(Schwann cells)는 만능줄기세포에서 분화된 신경능선세포(Neural crest stem cell: NCSC)로부터 유래된다. 따라서 중추신경계 세포와 말초신경계 세포는 만능줄기세포로부터 서로 다른 분화경로를 따라, 각각 신경전구세포와 신경능선세포를 거쳐 만들어지게 되며, 이러한 서로 다른 경로는 주변 환경과 세포 내 신호전달 체계에 따라 좌우되는 것으로 알려져 있다.

말초신경계 세포들이 사멸하면서 생기는 다양한 말초신경계 질환들로 인해 고통받고 있는 사람들은 미국에서만 약 36 만명 정도가 있으며 매년 약 150조 달러의 비용이 들고 있다. 따라서 사회에 큰 사회적/경제적 부담을 주기 때문에 이들을 치료하기 위한 노력들이 시급한 실정이다.

따라서, 대부분이 난치성 그리고 진행성 질환들인 말초신경계 질환들에 대한 가장 근본적인 치료법으로 여겨지는 세포치료법을 개발하기 위해, 만능줄기세포를 말초신경계 세포들의 모세포인 신경능선세포로 효율적으로 분화시키는 방법을 확립하는 것이 필수적이고 매우 중요하다.

줄기 세포의 신경 능선 세포로의 분화용 조성물을 제공한다.

줄기 세포의 신경 능선 세포로의 분화용 키트를 제공한다.

줄기 세포를 신경 능선 세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

일 양상은 단백질 키나제 C(protein kinase C: PKC) 저해제를 포함하는 줄기 세포의 신경 능선 세포(neural crest stem cell: NCSC)로의 분화용 조성물을 제공한다.

용어 "단백질 키나제 C(protein kinase C: PKC)"는 단백질의 세린 및 트레오틴의 히드록시기를 인산화시켜 단백질의 기능을 조절하는 단백질 인산화 효소 중 하나를 말한다. PKC는 디아실글리세롤(diacylglycerol: DAG) 또는 칼슘 이온(Ca² ⁺)의 농도 증가와 같은 신호에 의해 활성화 될 수 있다. 상기 PKC는 포유류에서는 3군으로 분류하는 11종의 다른 분자종 cPKC(α, βⅠ, βⅡ, γ), nPKC(δ, ε, η, θ, μ), 및 aPKC(ξ, λ)가 존재한다. 상기 PKC는 PKC-βⅠ 또는 βⅡ일 수 있다.

상기 PKC 저해제는 PKC의 발현 또는 활성을 억제할 수 있다. 상기 PKC 저해제는 PKC-β 저해제일 수 있다. 상기 PKC 저해제는 예를 들어, 2-[1-(3-디메틸아미노프로필)-5-메톡시인돌-3-일]-3-(1H-인돌-3-일) 말레이미드(2-[1-(3-Dimethylaminopropyl)-5-methoxy indol-3-yl]-3-(1H-indol-3-yl) maleimide)(제품명 Go 6983); 3-[1-(3-이미다졸-1-일 프로필-1H-인돌-3-일)-4-아닐리노-1H-피롤-2,5-디온 (3-(1-(3-Imidazol-1-yl propyl)-1H-indol-3-yl)-4-anilino-1H-pyrrole-2,5-dione)(제품명 PKC-베타 저해제); 3-(1H-인돌-3-일)-4-[2-(4-메틸피페라진-1-일)퀴나졸린-4-일]피롤-2,5-디온((3-(1H-indol-3-yl)-4-[2-(4-methylpiperazin-1-yl)quinazolin-4-yl]pyrrole-2,5-dione)(제품명 AEB071 또는 Sotrastaurin); 3-{1-[3-(아미디노티오)프로필]-1H-인돌-3-일}-3-(1-메틸-1H-인돌-3-일)말레이미드 메탄 술포네이트((3-{1-[3-(amidinothio)propyl]-1H-indol-3-yl}-3-(1-methyl-1H-indol-3-yl)maleimide methane sulfonate)(제품명 Ro-31-8220); 13-히드록시옥타데카디엔산(13-hydroxyoctadecadienoic acid); 비스인돌일말레이미드(bisindolylmaleimide)(제품명 GF 109203X); 2,6-디아미노-N-([1-옥소트리데실)-2-피페리디닐]메틸)헥산아미드(2,6-Diamino-N-([1-oxotridecyl)-2-piperidinyl]methyl)hexanamide)(NPC-15437); 4'-디메틸아미노-4'-히드록시스타우로스포린(4'-demethylamino-4'-hydroxystaurosporine)(제품명 Staurosporine); 및 3-(13-메틸-5-옥소-6,7-디히드로-5H-인돌로[2,3-a] 피롤로 [3,4-c] 카르바졸-12(13H)-일 프로판니트릴(3-(13-methyl-5-oxo-6,7-dihydro-5H-indolo[2,3-a] pyrrolo [3,4-c] carbazol-12(13H)-yl) propanenitrile)(제품명 Go6976)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

상기 조성물 중 PKC 저해제의 농도는 약 0.001 μM 내지 약 1000 μM, 약 0.01 μM 내지 약 750 μM, 약 0.1 μM 내지 약 500 μM, 약 0.1 μM 내지 약 250 μM, 약 0.1 μM 내지 약 100 μM, 약 0.1 μM 내지 약 75 μM, 약 0.1 μM 내지 약 50 μM, 약 0.1 μM 내지 약 25 μM, 약 0.1 μM 내지 약 10 μM, 약 0.5 μM 내지 약 10 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 2 μM 내지 약 8 μM, 약 4 μM 내지 약 6 μM, 또는 약 5 μM일 수 있다.

상기 조성물은 세포 배양용 배지일 수 있다.

상기 조성물은 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco Modified Eagle's Medium: DMEM), Ham's F12 배지, DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), F-10 영양 배지(Nutrient M), 최소 필수영양 배지(Minimum Essential Media: MEM), RPMI 배지 1640, Opti-MEM I 감손 혈청 배지(Reduced Serum Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), 알파-MEM, 및 신경 기본(Neurobasal) 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 Ham's F12 영양 혼합물, B27 보충제(Supplement), F-10 영양 혼합물(Nutrient Mixture), F-12 영양 혼합물, N2 보충제, HT 보충제, G-5 보충제, 지질 보충제, 및 ITS(인슐린, 트랜스페린, 및 셀레늄) 보충제로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 더 포함할 수 있다.

용어 "줄기 세포(stem cell)"는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전능성 세포(totipotent cell) 또는 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 다능성 세포(pluripotent cell)를 의미하고, 줄기 세포는 미분화 세포로서 특정 조직의 세포로 분화될 수 있다. 상기 줄기 세포는 배아줄기세포(embryonic stem cell: ESC), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPSC), 핵치환배아줄기세포(nuclear transfer embryonic stem cell; NT-ESC), 또는 성체 줄기 세포(adult stem cell) 일 수 있다. 상기 배아줄기세포는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내 세포 괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것을 말한다. 상기 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)는 분화가 끝난 체세포에 세포 역분화 관련 유전자들을 주입하여 초기단계의 전능성 줄기세포 단계로 되돌려, 배아줄기세포처럼 만능성을 유도한 세포를 말한다. 상기 유도 만능줄기세포는 예를 들면 인간 피부세포 유래 유도만능줄기세포(human dermal fibroblast-iPSC: hDF-iPSC), 혈액세포 유래 유도만능줄기세포(blood cell-iPSC), 또는 뇨세포 유래 유도만능줄기세포(urine-iPSC)일 수 있다. 상기 핵치환배아줄기세포는 난자의 핵을 제거하고 체세포의 핵으로 치환한 뒤 이 세포로부터의 초기 발생 과정 중에 형성되는 포배기 배아에서 내 세포 괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 전능성 세포를 말한다. 상기 성체줄기세포는 신체 각 조직에 극히 소량만이 존재하는 미분화된 세포로서 죽은 세포나 손상된 조직을 대체하는 세포를 말한다.

상기 줄기 세포는 포유동물, 예를 들면, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소 또는 고양이 유래의 세포일 수 있다.

용어 "신경 능선(neural crest)"는 척추 동물의 배에서 외배엽으로부터 유래하고, 신경관(neural tube)의 바로 위, 등부분 표피 밑의 정중선을 따라 위치하는 삭상의 외배엽성 세포 집단을 말한다. 신경 능선은 횡단면에 종종 관모양으로 신경관 위에서 볼 수 있고, 신경주름(neural fold) 바깥쪽 가장자리의 세포집단이 탈상피함으로써 생긴다. 신경 능선은 발생이 진행되면서 좌우로 갈라져 신경관의 가장자리를 통과하여 하강하고, 배체 내에 넓게 이동하여 신경절, 간충직, 두부, 새궁골격계, 색소세포 등으로 분화할 수 있다. 신경 능선 세포(neural crest stem cell: NCSC)은 좌우 양쪽의 두 신경주름이 서로 결합하여 탈상피할 때 결합 부위에서 배 안쪽으로 나타난 세포들일 수 있다. 신경 능선 세포는 그 위치에 따라 크게 머리 신경능선세포(cranial neural crest), 심장신경능선세포(cardiac neural crest), 몸통 신경능선세포(trunk neural crest). 및 엉치 신경능선세포(vagal and sacral neural crest cell)로 구분할 수 있다.

상기 신경 능선 세포는 P75 단백질, HNK1, 또는 이들의 조합을 발현할 수 있다. 상기 신경 능선 세포는 SOX10, AP2, FoxD3, NOTCH1, SNAIL, 빈쿨린(vinculin), 골형성단백질(bone morphogenetic protein: BMP)-4, BMP-7, 또는 이들의 조합을 더 발현할 수 있다. 상기 신경능선세포는 SOX1을 발현하지 않을 수 있다. SOX1은 중추신경계 세포들의 모체인 신경전구세포(neural precursor cell: NPC)에서 발현될 수 있다.

용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 및 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 말한다. 전능성 또는 다능성 줄기세포는 특정 형태의 전구세포를 거친 뒤 특정 세포로 완전히 분화될 수 있다. 상기 배아줄기세포, 유도만능줄기세포, 또는 핵치환배아줄기세포는 상기 신경능선 세포로 분화될 수 있다. 상기 신경능선세포는 말초신경세포, 슈반세포, 멜라닌 세포, 뼈, 연골, 근육세포 등으로 분화할 수 있다.

다른 양상은 일 양상에 따른 조성물, 및 배양 접시를 포함하는 줄기 세포의 신경 능선 세포로의 분화용 키트를 제공한다.

상기 조성물, 줄기 세포, 신경 능성 세포, 및 분화는 전술한 바와 같다.

상기 배양 접시는 세포 배양 용기를 말하고, 배양 접시의 재질, 크기, 및 모양과 관계없이 세포 배양 용기를 포함한다.

상기 배양 접시는 부유 배양(suspension culture)용 배양 접시 또는 부착 배양(adherent culture)용 배양 접시일 수 있다. 상기 부착 배양용 배양 접시는 폴리펩티드가 코팅된 것일 수 있다. 상기 상기 폴리펩티드는 줄기세포를 부착 또는 배양하기 위한 폴리펩티드일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 예를 들어 비트로넥틴(vitronectin: VTN), 라미닌(laminine), 피브로넥틴(fibronectin), 폴리오르니틴(poly ornithine), 또는 마트리겔(Matrigel™)이다.

다른 양상은 배양 접시에 줄기 세포를 접종하는 단계; 및 상기 줄기 세포를 일 양상에 따른 조성물의 존재 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 줄기 세포를 신경 능선 세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

상기 배양 접시, 줄기 세포, 조성물, 신경 능선 세포, 및 분화는 전술한 바와 같다.

상기 방법은 배양 접시에 줄기 세포를 접종하는 단계를 포함한다. 상기 줄기 세포는 기본 배양 배지의 존재 하에서 접종될 수 있다.

상기 방법은 상기 줄기 세포를 일 양상에 따른 조성물의 존재 하에서 배양하는 단계를 포함한다.

상기 방법에서 줄기 세포의 배양 시간은 배양 조건에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어 줄기 세포를 예를 들어 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 또는 약 15일 동안 배양할 수 있다. 상기 방법에서 줄기 세포를 약 30℃ 내지 약 40℃, 약 30℃ 내지 약 37℃, 또는 약 37℃에서 배양할 수 있다.

상기 방법에서 줄기 세포를 배양 접시의 바닥에 부착시켜서 배양하는 부착 배양(attachment culture)으로 배양할 수 있다.

상기 방법에서 줄기 세포를 배양 접시의 바닥에 부착시키지 않고 배양하는 부유 배양(suspension culture)으로 배양할 수 있다. 줄기 세포를 부유 배양(suspension culture)하는 경우 세포 분열 초기에 줄기 세포들이 공 모양으로 뭉쳐 형성된 세포 덩어리인 배아체(embryoid body)를 형성할 수 있다. 상기 방법은 줄기 세포를 부유 배양하여 배아체(embryoid body: EB)를 수득하는 단계; 및 상기 배아체를 부수어 수득된 세포를 부착 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 부유 배양은 약 1일 내지 약 10일, 약 1일 내지 약 9일, 약 1일 내지 약 8일, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 5일, 약 3일 내지 약 5일, 또는 약 5일 동안 배양하여 수행될 수 있다.

상기 부유 배양은 상기 PKC 저해제를 포함하는 배지에서 배양될 수 있다.

상기 부착 배양은 약 1일 내지 약 15일, 약 1일 내지 약 14일, 약 1일 내지 약 13일, 약 1일 내지 약 12일, 약 1일 내지 약 11일, 약 1일 내지 약 10일, 약 1일 내지 약 9일, 약 1일 내지 약 8일, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 또는 약 2일 내지 약 5일 동안 배양하여 수행될 수 있다.

상기 부착 배양은 섬유아세포 증식 인자 2(fibroblast growth factor 2: FGF2)를 포함하는 배지에서 배양될 수 있다. 상기 FGF2를 포함하는 배지는 Ham's F12 영양 혼합물, B27 보충제(Supplement), F-10 영양 혼합물(Nutrient Mixture), F-12 영양 혼합물, N2 보충제, HT 보충제, G-5 보충제, 지질 보충제, 인슐린, 트랜스페린, 및 셀레늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 더 포함할 수 있다.

상기 줄기 세포를 약 3일 내지 약 15일, 약 3일 내지 약 14일, 약 3일 내지 약 13일, 약 3일 내지 약 12일, 약 3일 내지 약 11일, 약 3일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 8일, 약 3일 내지 약 7일, 또는 약 3일 내지 약 6일 동안 배양하여 수행될 수 있다.

상기 방법으로 배양된 세포 중 신경 능선 세포의 비율은 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상일 수 있다.

일 양상에 따른 단백질 키나제 C(PKC) 저해제를 포함하는 줄기 세포의 신경 능선 세포(NCSC)로의 분화용 조성물, 키트 및 이를 이용하는 방법에 따르면, 성분이 간단하고 저비용인 조성물을 사용하여 줄기 세포로부터 신경 능선 세포로 효율적으로 분화시킬 수 있다.

도 1은 PKC-베타 저해제(PKCI)를 함유한 정성배지 1에서 약 10일 동안 2차원 부착배양된 hESC의 이미지와 P75, HNK1, 및 SOX1 표지를 검출하는 유세포 분석 결과를 나타내는 그래프이다(윗줄: 배양된 세포의 이미지, 가운데 줄: P75 및 HNK1에 대한 유세포 분석 그래프, 아랫줄: SOX1에 대한 유세포 분석 그래프).
도 2a 및 도 2b는 각각 PKC-베타 저해제 또는 Go6983를 함유한 정성배지 1에서 약 4일간 (EB) 부유배양하고, 이후 매트리겔(matrigel, Invitrogen)이 도포된 배양 용기에서 약 5일 동안 부착배양된 세포의 현미경 이미지 및 세포의 유세포 분석 결과를 나타내는 그래프이다(도 2a: PKC-베타 저해제 함유 정성배지 1, 도 2b: (왼쪽) PKC-베타 저해제 함유 정성배지 1, (오른쪽) Go6983 함유 정성배지 1, 윗줄: 배양된 세포의 이미지, 가운데 줄: P75 유세포 분석 그래프, 아랫줄: SOX1 유세포 분석 그래프).
도 3은 PKC-베타 저해제를 함유한 정성배지 2에서 약 4일간 (EB) 부유배양하고, 이후 마트리겔(matrigel, Invitrogen)이 도포된 배양 용기에서 약 5일 동안 부착배양된 hESC의 이미지, 및 hESC의 유세포 분석 결과를 나타내는 그래프이다(윗줄: 배양된 세포의 이미지, 가운데 줄: P75 유세포 분석 그래프, 아랫줄: SOX1 유세포 분석 그래프).
도 4는 EB 부유배양 후 부착배양의 배양 과정의 모식도이다.
도 5a 및 도 5b는 부착배양에서 각각 정성배지 3 및 정성배지 4를 사용하여 배양된 hESC 및 iPSC의 유세포 분석 결과를 나타내는 그래프이다(윗줄: P75 유세포 분석 그래프, 아랫줄: SOX1 유세포 분석 그래프).

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 인간 만능 줄기세포를 신경 능선 세포로 분화

1. PKC 저해제의 존재 하에서 2차원 부착 배양 방법의 이용

H9 인간 배아 줄기 세포(human embryonic stem cell: hESC)(WiCell Research Institute, Inc. Madison, WI, U.S.A.)를 배양액에서 배양하여 수득한 콜로니를 accutase(Life Technologies)를 사용하여 단일 세포로 만들었다. 단일 세포로 된 세포를 비트로넥틴(vitronectin XF)(STEMCELL Technologies)이 코팅된 12-웰 플레이트에 접종하였다. 접종된 세포에 DMEM/F12(Life Technologies), 10 ㎍/㎖의 인슐린(Sigma-Aldrich), 9 ㎍/㎖의 트랜스페린(Sigma-Aldrich), 및 14 ng/㎖의 소듐 셀레니트(Sigma-Aldrich)를 포함한 정성배지(defined medium)(이하, "정성배지 1"이라고 함)를 가하여 세포 배양액을 준비하였다.

준비된 세포 배양액에 PKC 저해제로서 5 ㎍/㎖의 3-[1-(3-이미다졸-1-일 프로필-1H-인돌-3-일)-4-아닐리노-1H-피롤-2,5-디온(3-(1-(3-Imidazol-1-yl propyl)-1H-indol-3-yl)-4-anilino-1H-pyrrole-2,5-dione)(PKC-베타 저해제)(Millipore)을 첨가하였다. 음성 대조군으로 약물 대신에 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide: DMSO)(Sigma-Aldrich)를 사용하였다. 37℃의 온도 및 5% CO₂의 조건 하에서 hESC를 약물의 존재에서 약 10일 동안 부착 배양(adherent culture)하였다. 배양된 세포를 현미경으로 확인하고, 그 이미지를 도 1에 나타내었다(도 1의 윗줄).

배양된 세포에 accutase(Life Technologies)를 첨가하고, 5 분 동안 인큐베이션하여 세포를 단일 세포로 만들었다. 세포 배양액을 원심분리(200xg, 5 분)하여 세포를 수득하였다. 수득된 세포에 2%(v/v) 파라포름알데히드(Sigma-Aldrich)를 첨가하고 상온에서 10 분 동안 인큐베이션하여 세포를 고정하였다. 0.1%(v/v) TRITON™ X-100(Sigma-Aldrich)을 포함하는 2%(v/v) 정상 혈청/1xPBS(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)를 상기 세포에 첨가하고, 상온에서 30 분 동안 인큐베이션하여 고정을 블로킹하였다. 신경 능선 세포(Neural crest stem cell: NCSC)의 표지인 P75 단백질 및 HNK1 단백질, 또는 신경 전구 세포(neural precursor cell: NPC)의 표지인 SOX1을 발현하는 세포의 비율을 분석하기 위해, 피코에리트린(phycoerythrin: PE) 표지된 항-P75 모노클로날 항체(1:50 희석)(Miltenyi Biotec), 플루오레세인 이소티오시안산염(Fluorescein isothiocyanate: FITC) 표지된 항-HNK1 모노클로날 항체(1:50 희석)(Ancell Corporation), 및 피코에리트린(phycoerythrin: PE)-표지된 항-Sox1 모노클로날 항체(1:100 희석)(BD Biosciences)를 사용하여 면역염색하였다. 면역염색된 세포는 BD FACSCalibur flow cytometer(BD Biosciences, Sparks, MD, USA)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다. 유세포 분석 결과를 도 1에 나타내었다(도 1의 가운데 줄 및 아랫줄).

도 1에 나타난 바와 같이, hESC를 PKC 저해제를 함유한 정성배지 1에서 배양하였을 경우, 배양된 세포는 NPC 표지인 SOX1을 거의 발현하지 않았고, NCSC 표지인 HNK1과 P75를 많이 발현함을 확인하였다. 반면에, 정성배지 1 및 DMSO를 함유한 정성배지 1에서 배양된 세포는 HNK1과 P75의 발현 수준이 낮았다. 따라서, hESC를 PKC 저해제를 함유한 정성배지 1에서 배양할 경우, NCSC로의 분화 효율이 높음을 확인하였다.

2. PKC 저해제의 존재 하에서 3차원 배아체( EB ) 부유 배양을 포함한 방법의 이용

(1) PKC 저해제를 함유한 정성배지 1을 부유 배양에 사용

먼저 hESC들이 뭉쳐서 자란 콜로니를 잘게 부수어 PKC-베타 저해제를 함유한 정성배지 1에서 4일 간 부유 배양(suspension culture) 하였다. 4일 후 둥근 세포 덩어리인 배아체(embryoid body: EB)를 잘게 부수고, PKC-베타 저해제를 함유한 정성배지 1에서 5일 간 배양 용기 바닥에 부착 배양하였다. 배양 후, 실시예 1에 기재된 바와 같이 P75 발현 세포(즉, NCSC) 및 SOX1 발현 세포(즉, NPC)를 유세포 분석 방법으로 확인하였다. 음성 대조군으로 PKC 저해제를 함유하지 않는 정성배지 1에서 배양된 세포를 사용하였다.

한편, PKC-베타 저해제 이외에 다른 PKC 저해제인 Go6983(Tocris Bioscience)를 함유한 정성배지 1을 이용하고, 상기와 동일하게 세포를 배양하였다.

PKC-베타 저해제 또는 Go6983를 함유한 정성배지 1에서 약 4일 동안 부유배양하고 약 5일 동안 부착배양된 세포의 현미경 이미지 및 세포의 유세포 분석 결과를 각각 도 2a 및 도 2b에 나타내었다(도 2a: PKC-베타 저해제 함유 정성배지 1을 4일간 부유배양 시 사용, 도 2b: Go6983 함유 정성배지 1을 4일간 부유배양 시 사용, 윗줄: 배양된 세포의 이미지, 가운데 줄: P75 유세포 분석 그래프, 아랫줄: SOX1 유세포 분석 그래프).

도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, hESC를 PKC-베타 저해제 및 또 다른 PKC 저해제인 Go6983을 함유한 정성배지 1에서 배아체를 거치는 방법으로 배양하였을 경우, 배양된 세포는 NPC 표지인 SOX1을 거의 발현하지 않았고, NCSC 표지인 P75를 많이 발현함을 확인하였다.

따라서, hESC를 PKC 저해제를 함유한 정성배지 1에서 EB 형태로 부유배양할 경우, NCSC로의 분화 효율이 높음을 확인하였다.

(2) PKC 저해제를 함유한 정성배지 2를 부유배양에 사용

hESC를 실시예 1.2.(1)에 기재된 바와 같이 EB를 거치는 방법으로 배양하였다. 다만, 실시예 1과 2 (1)에서 사용한 정성배지 1 대신에 아래 기술한 정성배지 2을 사용하였다.

DMEM/F12(Invitrogen), 20%(v/v) Knockout 혈청 대체물(Knockout Serum Replacement: KSR, Invitrogen), 1% 비필수 아미노산(Nonessectial Amino Acids: NEAA)(Invitrogen), 0.1 mM β-머캅토에탄올(β-ME)(Invitrogen), 및 0.5 μM 도르소모르핀(dorsomorphin) 혹은 DMH1(Tocris)을 포함한 정성배지 2를 준비하였다. 도르소모르핀 혹은 DMH1은 BMP 저해제로서 기능한다. 이 정성배지 2에 PKC-베타 저해제를 추가로 첨가했을 때, 대부분의 세포들(>84.2%)이 신경능선세포(P75+ 및 SOX1-)로 분화하였다.

먼저 hESC들이 뭉쳐서 자란 콜로니를 잘게 부수어 PKC-베타 저해제를 추가로 첨가한 정성배지 2에서 약 4일 간 부유 배양(suspension culture) 하였다. 약 4일 후 둥근 세포 덩어리인 배아체(embryoid body: EB)를 잘게 부수고, 약 5일 간 마트리겔(matrigel, Invitrogen)이 도포된 배양 용기 바닥에 부착 배양하였다.

약 5일 동안 세포를 부착 배양한 후(즉, 분화시작 후 총 9일 째), 실시예 1에 기재된 바와 같이 P75 발현 세포(즉, NCSC) 및 SOX1 발현 세포(즉, NPC)를 유세포 분석 방법으로 확인하였다.

약 5일, 약 7일, 및 약 9일 동안 배양된 세포의 현미경 이미지, 및 약 9일 동안 배양된 세포의 유세포 분석 결과를 도 3에 나타내었다(윗줄: 배양된 세포의 이미지, 아랫줄: 유세포 분석 그래프).

도 3에 나타난 바와 같이, hESC를 PKC 저해제를 더 함유한 정성배지 2에서 배아체(EB)를 거치는 방법으로 배양하였을 경우, 배양된 세포는 NPC 표지인 SOX1을 거의 발현하지 않았고, NCSC 표지인 P75를 많이 발현함을 확인하였다. 따라서, hESC를 PKC 저해제를 함유한 정성배지 2에서 배양할 경우, NCSC로의 분화 효율이 높음을 확인하였다.

(3) 부유배양 후 부착배양에서 배양 시 정성배지 3과 4의 사용

hESC를 실시예 2.(1)와 2.(2)에 기재된 바와 같이 먼저 정성배지 1 혹은 2에 PKC 저해제를 첨가한 후 EB 상태로 4일 간 부유배양하였다. 그 이후 자란 EB들을 비트로넥틴(R&D Systems)이나 마트리겔(matrigel, Invitrogen)이 코팅된 배양용기에 부착하여 추가로 2 내지 5일 간 배양하여 분화시켰다. 이 부착배양 시, 정성배지 3 [기본배지(Invitrogen), ITS 보충제(즉, 인슐린(Invitrogen), 트랜스페린(Invitrogen), 및 셀레늄(Invitrogen) 포함), 및 FGF-2 (CHA Biotech)] 혹은 정성배지 4[기본배지(Invitrogen), N2 보충제(Invitrogen), 인슐린(Invitrogen), 및 FGF-2(CHA Biotech)]를 사용하였다. 배양 과정의 모식도를 도 4에 나타내었다.

hESC를 부유배양과 부착배양을 하여 분화시키고, 1.에 기재된 바와 같이 P75 발현 세포(즉, NCSC) 및 SOX1 발현 세포(즉, NPC)를 유세포 분석 방법으로 확인하였다. 도 5는 hESC를 PKC-베타 저해제가 첨가된 정성배지 1로 EB 부유배양(4일)하고 비트로넥틴이 도포된 배양용기에 바닥에 붙여 5일 간 정성배지 3을 이용하여 부착배양 시킨 후의 분화양상을 분석한 결과이다. 도 6은 hESC를 PKC-베타 저해제가 첨가된 정성배지 1로 EB 부유배양(4일)하고 비트로넥틴이 도포된 배양용기에 바닥에 붙여 5일 간 정성배지4를 이용하여 부착배양 시킨 후의 분화 양상을 분석한 결과이다 (윗줄: P75 유세포 분석 그래프, 아랫줄: SOX1 유세포 분석 그래프).

한편, 상기 분화 방법이 줄기세포주 간의 차이가 있는지를 알아보기 위해, 3종의 인간 배아줄기세포와 2종의 iPS 세포주를 사용하여 동일하게 실험을 진행하였다. 사용된 인간 배아줄기세포는 H9-hESC(WiCell Research Institute, Inc. Madison, WI, U.S.A.), CHA6-hESC(Kangnam CHA Hospital, Seoul, Korea), 및 SNU4-hESC(서울대학교병원)이고, iPS 세포주는 iPSC-1(Lee et al, Biomaterials, 2014, 35:8330-8338) 및 iPSC-2(Lee et al, Biomaterials, 2014, 35:8330-8338)였다. 부착배양에서 정성배지 3을 사용한 결과를 도 5a에 나타내고, 정성배지 4를 사용한 결과를 도 5b에 나타내었다.

도 5a 및 5b에 나타난 바와 같이, 모든 세포주로부터 유사한 분화 양상 결과를 얻을 수 있었다.

따라서 초반 4일 간의 부유배양 이후에 비트로넥틴으로 코팅한 배양용기에 부착배양할 때 정성배지 3과 4 모두 NCSC로 분화를 잘 시키는 것을 확인하였다.

Claims

단백질 키나제 C(protein kinase C: PKC) 저해제를 포함하는 줄기 세포의 신경 능선 세포(neural crest stem cell: NCSC)로의 분화용 조성물로서,
상기 PKC 저해제는 PKC-α, PKC-βⅠ, PKC-βⅡ, PKC-γ, PKC-δ, 및 PKC-ξ로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 키나제 C의 저해제인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 PKC 저해제는 PKC의 활성을 억제하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 PKC 저해제는 PKC-βⅠ 또는 PKC-βⅡ의 저해제인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 PKC 저해제는
2-[1-(3-디메틸아미노프로필)-5-메톡시인돌-3-일]-3-(1H-인돌-3-일) 말레이미드(2-[1-(3-Dimethylaminopropyl)-5-methoxy indol-3-yl]-3-(1H-indol-3-yl) maleimide); 및
3-[1-(3-이미다졸-1-일 프로필-1H-인돌-3-일)-4-아닐리노-1H-피롤-2,5-디온 (3-(1-(3-Imidazol-1-yl propyl)-1H-indol-3-yl)-4-anilino-1H-pyrrole-2,5-dione)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco Modified Eagle's Medium: DMEM), DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), F-10 영양 배지(Nutrient M), 최소 필수영양 배지(Minimum Essential Media: MEM), RPMI 배지 1640, Opti-MEM I 감손 혈청 배지(Reduced Serum Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), 알파-MEM, 및 신경 기본(Neurobasal) 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 더 포함하는 것인 조성물.
청구항 5에 있어서, Ham's F12 영양 혼합물, B27 보충제(Supplement), F-10 영양 혼합물(Nutrient Mixture), F-12 영양 혼합물, N2 보충제, HT 보충제, G-5 보충제, 지질 보충제, 및 ITS(인슐린, 트랜스페린, 셀레늄) 보충제로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 더 포함하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 줄기 세포는 배아 줄기 세포(embryonic stem cell: ESC), 성체 줄기 세포(adult stem cell), 또는 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 신경 능선 세포는 P75 단백질, HNK1, 또는 이들의 조합을 발현하는 세포인 조성물.
청구항 1의 조성물, 및 배양 접시를 포함하는 줄기 세포의 신경 능선 세포로의 분화용 키트.
청구항 9에 있어서, 상기 배양 접시는 부유 배양(suspension culture)용 배양 접시 또는 부착 배양(adherent culture)용 배양 접시인 것인 키트.
배양 접시에 줄기 세포를 접종하는 단계; 및
상기 줄기 세포를 청구항 1의 조성물의 존재 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 줄기 세포를 신경 능선 세포로 분화시키는 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 줄기 세포를 부착 배양하는 것인 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 줄기 세포를 부유 배양하는 것인 방법.
청구항 13에 있어서, 상기 방법은 줄기 세포를 부유 배양하여 배아체(embryoid body: EB)를 수득하는 단계; 및
상기 배아체를 부수어 수득된 세포를 부착 배양하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 부유 배양은 1일 내지 10일 동안 배양하는 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 부유 배양은 PKC 저해제를 포함하는 배지에서 배양되는 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 부착 배양은 1일 내지 15일 동안 배양하는 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 부착 배양은 섬유아세포 증식 인자 2(fibroblast growth factor 2: FGF2)를 포함하는 배지에서 배양되는 것인 방법.
청구항 18에 있어서, FGF2를 포함하는 배지는 Ham's F12 영양 혼합물, B27 보충제(Supplement), F-10 영양 혼합물(Nutrient Mixture), F-12 영양 혼합물, N2 보충제, HT 보충제, G-5 보충제, 지질 보충제, 인슐린, 트랜스페린, 및 셀레늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 더 포함하는 것인 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 줄기 세포를 3일 내지 15일 동안 배양하는 것인 방법.