KR101613677B1 - 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용한 방법 Download PDF

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Abstract

식 1의 화합물을 포함하는 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용하는 방법을 제공한다. 이에 의하면, 줄기 세포로부터 배아체를 형성하지 않고 빠른 시간 내에 효율적으로 신경 전구 세포로 분화시키고, 신경 전구 세포로부터 신경 세포 또는 신경교세포로 분화시킬 수 있다.

Description

줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용한 방법{Composition for differentiating stem cells to neural precursor cells, and method using the same}
줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다.
인간 배아 줄기 세포(human embyonic stem cell; hESC)와 인간 유도 만능 줄기 세포(human induced pluripotent stem cell; hiPSC)는 거의 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전능성을 갖기 때문에, 그의 특성을 이용하여 부상이나 질병 등으로 조직이 손상되었을 때, 배아 줄기 세포를 원하는 조직으로 분화시켜 그 조직을 재생하는데 이용할 수 있다.
hESC와 hiPSC를 특정 세포 또는 조직으로 분화시키는 경우, hESC 또는 hiPSC 들이 서로 뭉쳐 배아체(embryoid body; EB)를 형성한 다음 세포 또는 조직으로 분화한다. 예를 들어, hESC 또는 hiPSC를 신경 전구 세포(neural precursor cell; NPC)로 분화시키는 경우, hESC 또는 hiPSC들이 뭉쳐서 자란 콜로니를 잘게 부수어 부유 배양(suspension culture)을 하게 되면 둥근 세포 덩어리인 배아체(EB)가 형성되고, 배아체를 다시 배양 용기 바닥에 붙여 부착 배양(adherent culture)하면서 신경 전구 세포로 분화를 유도하게 된다.
그러나, 배아체를 형성하는 과정 때문에, hESC와 hiPSC를 분화시키는데 시간과 노력이 많이 소요되고 대량으로 분화시키기 어려워서 hESC와 hiPSC를 임상적으로 사용하기 어려운 문제가 있었다.
따라서, hESC 또는 hiPSC를 부유 배양하여 배아체를 형성하지 않고 빠르고 간단한 방법으로, hESC 또는 hiPSC의 분화를 유도하는 방법을 개발하는 것이 필요하다.
줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물을 제공한다.
줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
일 양상은 하기 식 1의 화합물을 포함하는 줄기 세포의 신경 전구 세포(neural precursor cell; NPC)로의 분화용 조성물을 제공한다.
[식 1]
Figure 112014098851774-pat00001
상기 식 1의 화합물은 N-히드록실-3-[1-(3-메틸벤질)-2-옥소-1,2,5,6-테트라히드로피리딘-3-일]-프로판아미드이다. 상기 조성물 중 식 1의 화합물의 농도는 예를 들면 0.1 nM 내지 10 mM, 1 nM 내지 1 mM, 10 nM 내지 100 μM, 0.1 μM 내지 10 μM, 또는 0.3 μM 내지 3 μM일 수 있다. 상기 조성물이 세포에 첨가되는 경우 상기 식 1의 화합물의 최종 농도는 예를 들면 0.3 μM 내지 3 μM, 0.3 μM 내지 2 μM, 0.3 μM 내지 1 μM, 0.6 μM 내지 1 μM, 또는 0.9 μM일 수 있다.
용어 "줄기 세포(stem cell)"는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전능성 세포(totipotent cell) 또는 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 다능성 세포(pluripotent cell)를 의미하고, 줄기 세포는 미분화 세포로서 특정 조직의 세포로 분화될 수 있다. 줄기 세포는 배아 줄기 세포(embryonic stem cell; ESC), 성체 줄기 세포(adult stem cell), 또는 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)일 수 있다. 상기 배아 줄기 세포는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것을 말한다. 상기 성체 줄기 세포는 신체 각 조직에 극히 소량만이 존재하는 미분화된 세포로서 죽은 세포나 손상된 조직을 대체하는 세포를 말한다. 상기 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)는 분화가 끝난 체세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 분화 이전의 세포 단계로 되돌려, 배아 줄기 세포처럼 만능성을 유도한 세포를 말한다. 상기 유도 만능 줄기 세포는 예를 들면 인간 영양 세포 비함유 유도 만능 줄기세포(human feeder free-iPSC; hFF-iPSC) 또는 뇨-유도 만능 줄기세포(urine-iPSC)일 수 있다.
상기 신경 전구 세포는 신경 전구 세포의 표식 인자를 가지며 분화 후에 신경계 세포를 만들 수 있는 세포를 말한다. 상기 신경 전구 세포는 신경계 로제트(neural rosette) 구조를 형성할 수 있다.
용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 말한다. 전능성 또는 다능성 배아줄기세포는 특정 형태의 전구세포(예를 들어, 신경 전구 세포)로 분화될 수 있고, 그 뒤 특정 세포(예를 들어, 신경 세포, 신경교세포 등)으로 분화될 수 있다.
상기 조성물은 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 소듐 셀레니트(sodiume selenite), 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다. 인슐린은 이자의 랑게르한스 섬의 β 세포에서 분비되는 펩티드 호르몬이다. 트랜스페린은 β 글로불린의 일종으로 혈청 속에 흡수된 2 분자의 3가 철 이온과 결합하여 세포 증식이나 헤모글로빈 생산에 필요한 철을 트랜스페린 수용체를 매개로 하여 철을 세포 내로 공급하는 철 운반 단백질이다. 소듐 셀레니트는 화학식 Na2SeO3를 갖는 무기 화합물이다.
상기 조성물은 배지일 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지, Ham's F12 배지, 글루타민, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 줄기 세포를 하기 식 1의 화합물의 존재 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
[식 1]
Figure 112014098851774-pat00002
상기 줄기 세포, 식 1의 화합물, 신경 전구 세포, 및 분화는 전술한 바와 같다.
상기 줄기 세포는 최종 농도 0.3 μM 내지 3 μM, 0.3 μM 내지 2 μM, 0.3 μM 내지 1 μM, 0.6 μM 내지 1 μM, 또는 0.9 μM의 식 1의 화합물의 존재 하에서 배양될 수 있다.
상기 방법은 줄기 세포를 배양 접시의 바닥에 부착시켜서 배양하는 부착 배양(attachment culture)으로 배양할 수 있다. 줄기 세포를 부유 배양(suspension culture)하는 경우 세포 분열 초기에 줄기 세포들이 공 모양으로 뭉쳐 형성된 세포 덩어리인 배아체(embryoid body)를 형성할 수 있으나, 일 양상에 의한 방법에 따르면 줄기 세포를 부착 배양하므로 배아체를 형성하지 않을 수 있다.
상기 방법은 줄기 세포를 배양 접시에 부착 및 배양시키기 위해 폴리펩티드가 고정된 배양 접시에서 줄기 세포를 배양할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 단일 단백질 또는 단백질 복합체일 수 있다. 단일 단백질은 예를 들면 비트로넥틴(vitronectin)일 수 있다. 상기 단백질 복합체는 예를 들어 마트리겔(Matrigel™)(BD Biosciences)일 수 있다.
상기 방법은 줄기 세포를 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 소듐 셀레니트(sodiume selenite), 또는 이들의 조합의 추가적인 존재 하에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 소듐 셀레니트(sodiume selenite), 또는 이들의 조합은 줄기 세포 배양 배지에 포함될 수 있다.
상기 방법에서 줄기 세포의 배양 시간은 배양 조건에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어 줄기 세포를 예를 들어 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 또는 12일 동안 배양할 수 있다.
상기 방법에 따라 배양된 줄기 세포는 신경 로제트(neural rosette)를 형성할 수 있다. 신경 로제트는 신경 세포 또는 신경 전구 세포가 장미꽃 모양으로 만든 구조물을 말한다. 상기 방법에 따라 약 5일 동안 배양된 줄기 세포는 신경 로제트를 형성할 수 있다.
또다른 양상은 줄기 세포를 하기 식 1의 화합물의 존재 하에서 배양하여 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화시키는 단계,
[식 1]
Figure 112014098851774-pat00003
; 및
분화된 신경 전구 세포를 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF)의 존재 하에서 배양하여 신경 전구 세포를 신경계 세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 줄기 세포를 신경계 세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
상기 줄기 세포, 식 1의 화합물, 신경 전구 세포, 및 분화는 전술한 바와 같다.
상기 방법은 줄기 세포를 식 1의 화합물의 존재 하에서 배양하여 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화시키는 단계를 더 포함한다.
상기 방법은 분화된 신경 전구 세포를 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF)의 존재 하에서 배양하여 신경 전구 세포를 신경계 세포로 분화시키는 단계를 더 포함한다.
상기 신경 전구 세포는 신경 로제트를 형성하는 세포일 수 있다.
상기 신경 전구 세포는 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF)의 존재 하에서 배양될 수 있다. 상기 방법은 신경 전구 세포를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지, Ham's F12 배지, N2 보충물, BIO, 또는 이들의 조합의 추가적인 존재 하에서 배양할 수 있다.
상기 신경 전구 세포는 예를 들어 계대수 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11 이상으로 배양될 수 있다.
상기 신경계 세포는 신경 세포(nerve cell) 또는 신경교세포(neuroglia cell)일 수 있다. 신경 세포는 뉴런(neuron)으로도 불리고, 신경계의 자극과 흥분을 전달하는 세포를 말한다. 신경교세포는 신경 세포에 필요한 물질을 공급하고 신경 세포의 활동에 적합한 화학적 환경을 조성하는 세포를 말한다. 상기 신경교세포는 예를 들어, 성상세포(astrocyte), 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte), 소교세포(microglia), 뇌실막 세포(ependymal cell), 또는 슈반 세포(Schwann cell)일 수 있다.
일 양상에 따른 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용하는 방법에 따라 분화된 신경 전구 세포, 신경 세포, 또는 신경교세포는 뇌 또는 신경계질환에 대한 치료용 조성물로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 세포 치료제일 수 있다. 상기 뇌 또는 신경계 질환은 파킨슨병, 신경통, 관절염, 두통, 정신분열증, 간질, 뇌졸증, 불면증, 치매, 우울증, 디스키네시아(dyskinesia), 알츠하이머 질환, 루이체(lewy body) 치매, 루게릭병, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 다계통 위축(multiple system atrophy), 헌팅톤병, 뚜렛 증후군, 불안, 학습 및 기억 손상, 각종 퇴행성 신경질환, 조울증(bipolar disorder), 자폐증(autism), 주의력 결핍 과잉행동 장애(attention deficit hyperactivity disorder; ADHD) 등의 신경계의 기능 감소 또는 이상으로 인하여 뇌 또는 신경계에 나타나는 질환을 포함한다.
일 양상에 따른 식 1의 화합물을 포함하는 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용하는 방법에 따르면, 줄기 세포로부터 배아체를 형성하지 않고 빠른 시간 내에 효율적으로 신경 전구 세포로 분화시키고, 신경 전구 세포로부터 신경 세포 또는 신경교세포로 분화시킬 수 있다.
도 1a는 화합물 A208의 식을 나타내고, 도 1b는 화합물 A208의 존재 하에서 부착배양 후 5일째의 H9-hESC 세포를 나타내는 사진이다.
도 2a는 A208 화합물의 존재 하에서 5일 동안 배양된 세포들 중에서 신경 전구 세포, 즉 Sox1 발현 세포의 비율(%)을 나타내는 그래프이고, 도 2b는 A208 화합물의 존재 하에서 배양한 일수에 따른 신경 전구 세포, 즉 Sox1 발현 세포의 비율(%)을 나타내는 그래프이고(◆: 배지, ▲: 배지+A208), 도 2c는 A208 화합물의 농도(μM)에 따른 신경 전구 세포, 즉 Sox1 발현 세포의 비율(%)을 나타내는 그래프이다.
도 3a는 A208 화합물의 존재 하에서 5일 동안 배양된 세포에서 신경 전구 세포, 즉 Sox1 및 Pax6 발현 세포의 비율(%)을 나타내는 그래프이고, 도 3b는 A208 화합물의 존재 하에서 5일 동안 배양된 세포의 면역화학염색 결과이고, 도 3c는 A208 화합물의 존재 하에서 5일 동안 배양된 세포의 유세포 분석(flow cytometry) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 ITS 배지 또는 A208 함유 ITS 배지에서 배양된 hESC에서 상향조절 및 하향 조절된 유전자의 수를 나타내는 벤다이어 그램이고, 도 4b는 A208를 함유하는 ITS 배지에서 72 시간 동안 배양된 hESC 세포에서 상향조절된 유전자의 기능을 분류한 그래프이고, 도 4c는 hESC 배양 배지, ITS 배지, 및 A208 함유 ITS 배지에서 36 시간 또는 72 시간 동안 배양된 hESC의 게놈-전체 유전자 발현의 산포도(scatter plot)이다.
도 5a는 hESC를 A208의 존재 하에서 5일 동안 배양하고 5일 이후에 NPC를 팽창하는 과정의 모식도와 배양된 세포의 사진이고, 도 5b는 계대수에 따라 팽창된 세포의 개수이고, 도 5c는 계대수 3(좌측 그래프) 및 계대수 10(우측 그래프)의 세포에서 신경 전구 세포, 즉 Sox1 발현 세포의 비율(%)을 나타내는 유세포 분석 그래프이고, 도 5d는 계대수 5의 세포의 면역화학염색 사진이고(200배 확대), 도 5e는 계대수 5 내지 7의 세포의 면역화학염색 사진이다(200배 확대).
도 6a는 인간 섬유아세포 유래 유도만능줄기세포(hFF-iPSC) 또는 인간 소변세포 유래 유도만능줄기세포(urine-iPSC)를 A208의 존재 하에서 5일 동안 배양한 후 세포의 사진이고, 도 6b는 hFF-iPSC를 A208의 존재 하에서 5일 동안 배양한 세포들 중, 신경전구세포, 즉 Sox1 발현 세포의 비율(%)을 나타내는 유세포 분석 그래프이고, 도 6c는 urine-iPSC를 A208의 존재 하에서 5일 동안 배양한 세포들 중, 신경전구세포, 즉 Sox1 발현 세포의 비율(%)을 나타내는 유세포 분석 그래프이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 부착 배양 조건 하에서 인간 만능 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화를 촉진하는 화합물의 확인
1.1. 부착 배양 조건 하에서 인간 만능 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화를 촉진하는 화합물의 스크리닝
부착 배양(adherent culture) 조건 하에서 인간 만능 줄기 세포(human pluripotent stem cell; hPSC)를 신경 전구 세포(neural precursor cell; NPC)로 의 분화를 촉진하는 소분자를 스크리닝하기 위해, 약 270여 종의 화합물을 스크리닝하였다.
H9 hESC(WiCell Research Institute, Inc. Madison, WI, U.S.A.)를 배양액에서 배양하여 수득한 콜로니를 약 20개의 세포 덩어리로 나누고, 각각의 세포 덩어리를 비트로넥틴(vitronectin)이 코팅된 12-웰 플레이트에 접종하였다. 접종된 세포에 DMEM/F12(Life Technologies), 1x GlutaMAX™(Life Technologies), 및 10 ㎍/㎖ 인슐린(Sigma-Aldrich), 9 ㎍/㎖ 트랜스페린(Sigma-Aldrich), 및 14 ng/㎖ 소듐 셀레니트(Sigma-Aldrich)로 이루어진 배지(ITS 배지)를 첨가하였다.
화합물의 스크리닝을 위해, 각 화합물을 세포 배양액에 첨가하고, 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건 하에서 hESC를 배양하였다.
플레이트의 바닥에 배양된 hESC 덩어리의 형태를 매일 관찰하였다. 화합물들 중 A208 화합물로 명명된 N-히드록실-3-[1-(3-메틸벤질)-2-옥소-1,2,5,6-테트라히드로피리딘-3-일]-프로판아미드의 화합물(도 1a)을 배지에 0.5 μM 내지 1 μM의 농도로 첨가한 경우, 첨가 후 5일 만에 신경 로제트(neural rosette)가 매우 효과적으로 유도됨을 확인하였다(도 1b).
1.2. A208의 존재 하에서 배양된 hESC 세포의 유세포 분석
실시예 1.1에서 A208의 존재 하에서 분화된 세포가 신경 전구 세포인지 확인을 하기 위해 유세포 분석(flow cytometry)을 수행하였다.
유세포 분석을 위해, 실시예 1.1에서 A208의 존재 하에서 분화된 세포를 12웰 플레이트의 한 개 웰에 첨가하고, accutase(Life Technologies)를 첨가하였다. 5 분 동안 인큐베이션하여 세포를 단일 세포로 만든 후, 원심분리(200xg, 5 분)하여 세포를 수득하고, 세포에 2%(v/v) 파라포름알데히드(Sigma-Aldrich)를 첨가하고 상온에서 10 분 동안 인큐베이션하여 세포를 고정하였다. 0.1%(v/v) TRITON™ X-100(Sigma-Aldrich)을 포함하는 2%(v/v) 정상 혈청/1xPBS(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)를 세포에 첨가하고, 상온에서 30 분 동안 인큐베이션하여 고정을 블로킹하였다. 신경 전구 세포 표지로서 신경외배엽 세포의 표지인 Sox1 단백질을 발현하는 세포(Sox1+ 세포)의 비율을 분석하기 위해서 피코에리트린(phycoerythrin; PE)-표지된 항-Sox1 모노클로날 항체(1:20 희석)(BD Biosciences)를 사용하여 면역염색하였다. 면역염색된 세포는 BD FACSCalibur flow cytometer(BD Biosciences, Sparks, MD, USA)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다.
유세포 분석을 통해, A208의 존재 하에서 배양된 세포에서 Sox1을 발현하는 세포의 비율(%)을 도 2a 및 도 2b에 나타내었다(도 2a: 5 일 배양, 도 2b: 3 일 내지 12 일 동안 배양, **: 스튜던트 t-검정에 따른 p<0.01). 도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, A208 화합물의 존재 하에서 5 일 동안 배양되었을 때 Sox1 단백질을 발현한 세포의 비율은 약 98.8%였고, 약 6 일 동안 배양하였을 때 최대 수준에 도달한 후 약간 감소하였다.
한편, 0.3 μM 내지 3μM의 A208의 존재 하에서 배양된 세포에서 Sox1을 발현하는 세포의 비율(%)을 도 2c에 나타내었고, 음성 대조군으로 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO)(Sigma-Aldrich)를 사용하였다(◆: DMSO, ▲: A208). 도 2c에 나타난 바와 같이, A208은 약 0.9 μM의 농도에서 Sox1 발현 세포의 비율이 가장 크다는 것을 확인하였다.
1.3. A208의 존재 하에서 배양된 hESC 세포에서 신경 전구 세포 마커의 발현 여부의 확인
Sox1 발현 세포가 신경 전구 세포의 마커인 Pax6을 발현하는지 여부를 유세포 분석을 통해 확인하였다. 면역염색을 위해 Alexa Fluor® 647-표지된 항-Pax6 항체(1:20 희석)(Invitrogen)를 사용하였고, 유세포 분석은 상기 방법과 동일한 과정으로 수행하였다. 유세포 분석 결과를 도 3a에 나타내었다. 도 3a에 나타난 바와 같이, 1 μM의 A208의 존재 하에서 배양된 hESC 세포가 전체 세포 중 약 97.5%였다.
한편, 신경 전구체 세포(neural precursor cell; NPC)의 마커인 Sox1, Nestin, NCAM, 및 Musash1 단백질과, 로제트-특이적인 밀착 연접(tight junction)의 마커인 Zo-1 단백질의 발현을 면역화학염색법으로 확인하였다. 면역화학염색을 위해 사용한 1차 항체는 다음과 같다: 항-Sox1 항체(1:200 희석)(Millipore), 항-Musashi 1 항체(1:200 희석)(Millipore), 항-Nestin 항체(1:500 희석)(Millipore), 항-Zo-1 항체(1:100 희석)(BD Biosciences), 항-NCAM 항체(1:500 희석)(Millipore). 형광을 나타내기 위한 2차 항체로서는 Alexa 546-접합된 염소 항-마우스 IgM(Invitrogen), Alexa 488-접합된 염소 항-래빗 IgG(Invitrogen), 및 Alexa 488-접합된 염소 항-마우스 IgG(Invitrogen)를 사용하였다. 면역염색 후 형광사진은 LSM510 confocal microscope (Carl Zeiss, Gotingen, Germany)를 사용하여 얻었다. 면역화학염색법의 결과를 도 3b에 나타내었다(200배 확대). 도 3b에 나타난바 같이, NPC의 마커인 Sox1, Nestin, NCAM, 및 Musash1 단백질이 A208의 존재 하에서 배양된 hESC 세포에서 발현되었다. 따라서, 상기 세포들은 A208에 의해 분화되어 신경 로제트 구조를 형성하는 것을 확인하였다.
Nestin, Sox2, 및 Pax6의 발현을 확인하기 위해, Sox1은 PE-표지된 항-Sox1 모노클로날 항체(1:20 희석)(BD Biosciences)를 사용하고, Pax6는 Alexa Fluor® 647-표지된 항-Pax6 항체(1:20 희석)(Invitrogen)를 사용하고, Nestin은 1차 항체인 항-Nestin 항체(1:500 희석)(Millipore)로 인큐베이션한 다음 2차 항체인 Alexa 488-접합된 염소 항-마우스 IgM(1:500 희석)(Invitrogen)을 사용하여 형광으로 표지하였다. 유세포 분석은 BD FACSCalibur flow cytometer(BD Biosciences, Sparks, MD, USA)를 사용하여 수행하였다. 유세포 분석 방법은 실시예 1.2에 기재된 방법에 따라 수행하였고 그 결과를 도 3c에 나타내었다. 면역화학 염색법의 결과와 유사하게, 유세포 분석에서도 A208의 존재 하에서 배양된 hESC 세포 중 역 99%가 Nestin, Sox2, 및 Pax6을 발현하는 것을 확인하였다.
1.4. A208의 존재 하에서 배양된 hESC 세포의 유전자 발현 양상 분석
A208의 존재 하에서 hESC를 배양한 후 세포 유전자의 발현 양상을 분석하기 위해, hESC 배양 배지(mTeSR1)(StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada), ITS 배지, 및 1 μM의 A208을 함유하는 ITS 배지에 H9-hESC 콜로니를 접종하고, 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건 하에서 36 시간 또는 72 시간 동안 배양하다.
배양된 세포를 수득하고, 전체 RNA를 NucleoSpin RNA II kit(MACHEREY-NAGEL GmbH, Duren, Germany)를 사용하여 분리한 다음, 2 ㎍의 RNA를 (주)마크로젠(Korea)에 의뢰하여 Illumina DNA 어레이(Illumina, San Diego,CA, USA)를 이용한 게놈-전체 유전자 발현 양상(genome-wide gene expression profile)을 분석하였다.
세포의 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 도 4a 내지 도 4c에 나타내었다(P<0.05). 도 4a는 ITS 배지 또는 A208 함유 ITS 배지에서 배양된 hESC에서 상향조절 및 하향 조절된 유전자의 수를 나타내는 벤다이어 그램이고, 도 4b는 A208를 함유하는 ITS 배지에서 72 시간 동안 배양된 hESC 세포에서 상향조절된 유전자의 기능을 분류한 그래프이고, 도 4c는 hESC 배양 배지, ITS 배지, 및 A208 함유 ITS 배지에서 36 시간 또는 72 시간 동안 배양된 hESC의 게놈-전체 유전자 발현의 산포도(scatter plot)이다. 도 4c에서 점선은 유전자 발현 수준에서 ±2배 차이를 나타낸다(아래쪽 점선; 2배 감소, 위쪽 점선; 2배 증가, 점선 사이: 2배 이하 변화). 도 4c에서 왼쪽부터 i)0 시간의 hESC(즉, A208 미첨가)와 ITS 배지에서 36 시간 배양한 hESC, ii)0 시간의 hESC(즉, A208 미첨가)와 A208 함유 ITS 배지에서 36 시간 배양한 hESC, iii)ITS 배지에서 36 시간 배양한 hESC와 A208 함유 ITS 배지에서 36 시간 배양한 hESC, 및 iv)ITS 배지에서 72 시간 배양한 hESC와 A208 함유 ITS 배지에서 72 시간 배양한 hESC의 발현 양상을 비교한 그래프이다.
도 4a에 나타난 바와 같이, A208의 존재 하에서 36시간 배양 및 72 시간 배양시 각각 855 종 및1,216 종의 유전자가 2배 이상 차등 발현됨을 확인하였다. 도 4b에 나타난 바와 같이, A208에 의해 강하게 발현된 유전자들은 신경 세포 분화; 전뇌 발생; 신경 세포 발생; 및 신경 세포 분화와 관련된 세포 형태형성 관련 유전자로 분류되었다. 또한, 도 4c에 나타난 바와 같이, A208에 의해 Lhx2(발생하는 B 세포, 전뇌, 및 신경 망막에서 발현되는 LIM homeobox 유전자), SIX3(전뇌와 눈의 배 발생에 중요한 유전자인 SIX homeobox 3), 및 SLITRK1(신경 돌기가 밖으로 자라는 것에 관련된 SLIT and NTRK-like family member 1)과 같은 초기 신경 유전자가 강하기 유도되었음을 확인하였다.
1.5. A208의 존재 하에서 배양된 hESC 세포로부터 신경 전구 세포로 분화의 유도
실시예 1.1에 기재된 바와 같이, A208의 존재 하에서 배양된 hESC 세포를 신경 전구 세포(NPC)로 분화시키기 위해, A208의 존재 하에서 hESC 세포를 5일 동안 배양하고, 형성된 신경 로제트를 기계적으로 분리하였다(도 5a). 분리된 로제트를 마트리겔™(BD Biosciences, San Jose, CA, U.S.A)이 코팅된 배양 접시로 옮기고, 접시에 DMEM/F12(Life Technologies, Carlsbad, CA, U.S.A.), 1x N2 보충물(제조사), 20 ng/㎖ bFGF(CHA Biotech Co.Daejon, Korea), 및 0.5 μM BIO(Tocris, Bristol, United Kingdom)로 이루어진 NPC 팽창 배지를 첨가하였다. 팽창율(expansion rate; 세포 수 당 변화 배수)를 산출하기 위해, 직경 3 ㎝의 접시에 7x103 개의 세포를 접종하고(1 세대), 배양하면서 세포의 수를 측정하였다(도 5b). 매 3 일 내지 4 일에 계대(passage)되었고, NPC의 수가 계대수가 증가함에 따라 급격하게 증가하였고, 계대수 10에서 약 3.2x107 개의 세포에 도달하였다(약 4,571배 증가).
계대수에 따라 배양된 세포의 유형을 확인하기 위해, 계대수 3과 계대수 10의 세포가 Sox1을 발현하는지 여부를 확인하였다. 유세포 분석은 실시예 1.2에 기재된 바와 같이 수행하였고, 그 결과를 도 5c에 나타내었다(좌; 계대수 3, 우; 계대수 10). 도 5c에 나타난 바와 같이, 계대수 10의 세포 중 약 94% 이상이 Sox1 단백질을 발현하였다. 따라서, 계대수 10 이후의 세포는 NPC의 특징이 있다는 것을 확인하였다.
또한, 계대수 5의 세포가 NPC로 분화하였는지를 확인하기 위해, 대표적인 NPC 마커인 Nestin, Sox1, Musashi 1, 및 Pax6와, 미분화된 hESC의 마커인 Oct4 및 Tra1-60의 발현을 면역화학염색법으로 확인하였다. 면역화학염색을 위해 사용한 1차 항체는 다음과 같다: 항-Oct4 항체(1:500 희석)(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), 항-TRA-1-60 항체(1:500 희석)(Santa Cruz Biotechnology, Inc.), 항-Sox1 항체(1:200 희석)(Millipore, Bedford, MA, USA), 항-Pax6 항체(1:200 희석)(DSHB, Iowa, IA, USA), 항-Musashi 1 항체(1:200 희석)(Millipore), 항-Nestin 항체(1:500 희석)(Millipore), 항-Ki67 항체(1:300 희석)(Vision Biosystems, Newcastle, UK). 형광을 나타내기 위한 2차 항체로서는 Alexa 546-접합된 염소 항-마우스 IgM(Invitrogen), Alexa 488-접합된 염소 항-래빗 IgG(Invitrogen), 및 Alexa 488-접합된 염소 항-마우스 IgG(Invitrogen)를 사용하였다. 면역염색 후 형광사진은 LSM510 confocal microscope(Carl Zeiss, Gotingen, Germany)를 사용하여 수득하고, 그 형광 사진을 도 5d에 나타내었다. 도 5d에 나타난 바와 같이, 계대수 5의 세포는 Nestin, Sox1, Musashi 1, 및 Pax6를 발현하였지만, Oct4 및 Tra1-60을 발현하지 않았다. 따라서, 계대수 5의 세포가 NPC로 분화하였음을 확인하였다.
A208에 의해 유도된 NPC의 세포 유형을 확인하기 위해, 계대수 5 내지 7의 NPC에서 신경 세포의 마커인 Tuj1, 성상세포의 마커인 GFAP, 및 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte)의 마커인 O4가 발현 여부를 확인하였다. 면역화학염색을 위해 사용한 1차 항체는 다음과 같다: 항-GFAP 항체(1:200 희석)(Millipore), 항-O4 항체(1:100 희석)(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA), 및 항-Tuj1 항체(1:1000 희석)(Covance, Princeton, NJ, USA). 형광을 나타내기 위한 2차 항체로서는 Alexa 546-접합된 염소 항-마우스 IgM(Invitrogen), Alexa 488-접합된 염소 항-래빗 IgG(Invitrogen), 및 Alexa 488-접합된 염소 항-마우스 IgG(Invitrogen)를 사용하였다. 면역염색 후 형광사진은 LSM510 confocal microscope(Carl Zeiss, Gotingen, Germany)를 사용하여 수득하고, 그 형광 사진를 도 5e에 나타내었다. 도 5e에 나타난 바와 같이, NPC가 Tuj1, GFAP, 및 O4를 발현하여 A208에 의해 유도된 NPC는 신경 세포, 성상세포, 및 올리고덴드로사이트로 분화하는 다능성이라는 것을 확인하였다.
실시예 2. 인간 유도 만능 줄기 세포에서 A208에 의한 분화
인간 배아 줄기 세포와 마찬가지로 인간 유도 만능 줄기 세포(human induced pluripotent stem cells; hiPSCs)도 A208에 의해 부착 배지에서 신경 전구 세포로 분화되는지 여부를 확인하였다.
hFF-hiPSC와 urine-iPSC는 공지된 방법에 따라 준비였다. 구체적으로, 인간 체세포인 섬유아세포(fibroblast) 수득하고, DMEM/F12 기본 배지(Life Technologies), 10%(v/v) 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)(Life Technologies), 1x 페니실린/스트렙토마이신(Life Technologies)이 함유된 배지에 접종하고, 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건 하에서 배양하였다. 뇨 유래 상피세포(urethral epithelial cell)는 약 100 ㎖ 내지 약 200 ㎖의 소변를 400xg에서 30 분간 원심분리하여 수득하였다. 수득된 상피 세포를 신장 상피 세포 성장 배지(Renal Epithelial Cell Growth Medium; REGM)(Lonza, Walkersville, MD, USA) 과 MesenGro® 배지(StemRD, Burlingame, CA, USA)를 1:1(v/v)로 혼합한 배지에 접종하고, 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건 하에서 배양하였다. 이들 세포들로부터 iPSC를 제작하기 위해, 3종류의 역분화유도 플라스미드(pCXLE-hOCT4-shp53, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL)(Addgene, Cambridge, MA, USA)를 Neon Transfection System (Invitrogen)을 이용하여 세포 내에 도입하였다. 도입 후 5일째 되는 날에 배양된 세포를 비트로넥틴(1x PBS 중 5 ㎍/㎖)(BD Biosciences)이 도포된 배양 용기로 옮기고, 25일간 DMEM/F12(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 15% KnockOutTM SR XenoFree CTS(Invitrogen), 1x 성장 보충물(Life Technologies), 1% 비-필수 아미노산no acids(non-essential amino acids; NEAA)(Invitrogen), 0.1 mM β-머캅토에탄올(Invitrogen), 1%(w/v) 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen), 8 ng/㎖ 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF)(CHA Biotech Co., Daejeon, Korea), 1% GlutaMAX(Invitrogen). 5 μM Go6983(Tocris, Ellisville, MO, USA), 10 nM 트리코스타틴 A(trichostatin A; TSA)(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 함유한 배지에서 배양하여 iPSC 콜로니를 수득하였다.
실시예 1.1에 기재된 바와 같이, 1 μM의 A208 화합물을 첨가한 배지에서 hiPSC를 배양하였다. 배양된 hiPSC가 Sox1 단백질을 발현하는지 여부를 확인하기 위해, 실시예 1.2에 기재된 바와 같이 유세포 분석을 수행하였다.
도 6a는 hFF-iPSC 또는 urine-iPSC를 A208의 존재 하에서 5 일 동안 배양한 후 세포의 사진이고, 도 6b는 hFF-iPSC를 A208의 존재 하에서 5 일 동안 배양한 세포 중, 신경 전구 세포의 마커인 Sox1 발현을 나타내는 유세포 분석 그래프이고, 도 6c는 urine-iPSC를 A208의 존재 하에서 5 일 동안 배양한 세포 중, 신경 전구 세포의 마커인 Sox1 발현을 나타내는 유세포 분석 그래프이다. 도 6b 및 도 6c에 나타난 바와 같이, hiPSCs도 A208에 의해 부착 배지에서 신경 전구 세포로 분화됨을 확인하였다.

Claims (15)

  1. 하기 식 1의 화합물을 포함하는 줄기 세포의 신경 전구 세포(neural precursor cell; NPC)로의 분화용 조성물:
    [식 1]
    Figure 112014098851774-pat00004
    .
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기 세포는 배아 줄기 세포(embryonic stem cell; ESC), 성체 줄기 세포(adult stem cell), 또는 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)인 것인 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 유도 만능 줄기 세포는 인간 영양 세포 비함유 유도 만능 줄기세포(human feeder free-iPSC; hFF-iPSC) 또는 뇨-유도 만능 줄기세포(urine-iPSC)인 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 식 1의 화합물의 농도는 0.3 μM 내지 3 μM인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 소듐 셀레니트(sodiume selenite), 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것인 조성물.
  6. 줄기 세포를 하기 식 1의 화합물의 존재 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화시키는 방법:
    [식 1]
    Figure 112014098851774-pat00005
    .
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 식 1의 화합물의 농도는 0.3 μM 내지 3 μM인 것인 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 줄기 세포를 부착 배양하는 것인 방법.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 줄기 세포를 단일 단백질 또는 단백질 복합체가 코팅된 배양 접시에서 배양하는 것인 방법.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 방법은 줄기 세포를 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 소듐 셀레니트(sodiume selenite), 또는 이들의 조합의 추가적인 존재 하에서 배양하는 것인 방법.
  11. 청구항 6에 있어서, 상기 방법은 줄기 세포를 3 일 내지 12 일 동안 배양하는 것인 방법.
  12. 청구항 6에 있어서, 상기 줄기 세포는 신경 로제트(neural rosette)를 형성하는 것인 방법.
  13. 줄기 세포를 하기 식 1의 화합물의 존재 하에서 배양하여 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화시키는 단계,
    [식 1]
    Figure 112014098851774-pat00006
    ; 및
    분화된 신경 전구 세포를 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF)의 존재 하에서 배양하여 신경 전구 세포를 신경계 세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 줄기 세포를 신경계 세포로 분화시키는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 신경계 세포는 신경 세포 또는 신경교세포인 것인 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 신경교세포는 성상세포 또는 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte)인 것인 방법.
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