CN107937346A - 一种用人尿液细胞作为饲养层培养诱导多能干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用人尿液细胞作为饲养层培养人诱导多能干细胞的方法。用传代培养、冻存复苏后培养的第三至第十二代的人尿液细胞作为滋养层细胞培养由成年男性包皮成纤维细胞重编的人多能干细胞(hiPS)。本发明使用的人尿液细胞代替传统方法中用的小鼠胚胎成纤维细胞或鼠胚成纤维细胞系，培养人诱导多能干细胞，减少了培养体系中异源细胞的污染，且比间充质干细胞更易获得。并证明了该培养体系可使人诱导多能干细胞在体外扩增，且长期维持了hiPS细胞的生物学特性和多能干性，为hiPS进入临床应用提供了可能。

Description

一种用人尿液细胞作为饲养层培养诱导多能干细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用人尿液细胞作为饲养层培养诱导多能干细胞的方法。
背景技术
诱导多能干细胞技术被认为是21世纪以来最令人瞩目的干细胞技术。2006年8月，日本京都大学的Takahashi等[1]在《Cell》上宣称，他们从与胚胎干细胞多潜能性相关的24个基因中，筛选出四个基因(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)，将筛选出的四个基因导入小鼠的皮肤成纤维细胞后，将小鼠皮肤成纤维细胞重新编程为具有类似胚胎干细胞特性的一种新型细胞，该细胞能表达胚胎干细胞特异性的表面标记物，并且具备向三胚层各类型细胞分化的潜能，被称为诱导多能该细胞。人类诱导多能干细胞的获得，揭开了利用干细胞进行自体化医疗的新篇章，也使得诱导多能干细胞技术在再生医学、组织工程、疾病想成机制研究、药物研发与个性化治疗等领域拥有了巨大的应用潜力。
在饲养层上培养人诱导多能干细胞能够很好的抑制多能干细胞分化，因为饲养层细胞能够通过细胞与细胞之间的相互作用或通过分泌各种细胞生长因子、基质等来维持诱导多能干细胞的自我更新和分化潜能。但是传统方法中所用的小鼠胚胎成纤维细胞(MouseEmbryonic Fibroblasts,MEF)会给所培养的人诱导多能干细胞带来异源污染，而《一种用人骨髓间充质干细胞作为滋养层培养人诱导性多能干细胞的方法》(CN 102161980A)中所提到的以骨髓间充质干细胞作为饲养层，存在着细胞难以获得的限制。尿液细胞属于人体代谢废物时夹带出的肾上皮细胞等上皮样细胞，易获得，且在体外可以扩增至二十代以上，以上特点使尿液细胞在作为饲养层方面具有一定的优越性。
发明内容
本发明的目的是提供一种人尿液细胞(Urine Cells,UC)作为饲养层培养培养人诱导多能干细胞(hiPS)的方法，该方法是通过以下技术方案实现：
1)饲养层的细胞的准备：用传代培养、低温冻存复苏后培养的第3至第12代人尿液细胞作为饲养层细胞。制作饲养层时，细胞接种到Matrigel处理过的六孔板，待融合度达到80-90％(约3×104/cm2)，并用10μg/mL的丝裂霉素C处理1小时30分钟，灭活后24小时内使用；
2)人诱导多能干细胞的获得：取成人23-26岁的包皮成纤维细胞，用携带有OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转录因子的逆转录病毒感染两次，恢复培养期加入丁酸钠(NaBT)，感染6天时将细胞重新计数铺到用Matrigel处理过的培养板或培养皿上，更换为mTeSR培养基，每2天换液，直到出现胚胎干细胞状的克隆，挑选、扩增培养；
3)人诱导性多能干细胞的扩增培养：显微镜下机械法(玻璃拉针)挑选类似胚胎干细胞的克隆，用Ⅳ型胶原酶消化8分钟，移液器吸头划成小块传到准备好的饲养层细胞上，每天换液，每4-5天传代一次。
4)人诱导多能干细胞的生物学特性和多能性的维持：在以尿液细胞为饲养层上扩增培养15代以后，用RT-PCR法鉴定扩增培养后人诱导多能干细胞的多能标志表达情况，同时用拟胚体形成法和免疫缺陷小鼠畸胎瘤形成法检测其在体内外是否具有向三胚层分化的潜能。
本发明提供了一种用人尿液细胞作为饲养层获得人多能干细胞的方法，这种由尿液细胞制作的饲养层可长期维持hiPS的生物学特征和多潜能性，由此获得的hiPS没有异源细胞的污染，为其临床应用提供了可能性。本发明使用人尿液细胞(UC)代替传统法中的MEF细胞，培养的hiPS，生长状态良好，具有形成畸胎瘤即具备体内分化的能力(详见实施例)，为hiPS诱导获得的细胞产品能够进入临床应用、体外疾病模型建模提供便利。
附图说明
图1为技术路线图。
图2为不同丝裂霉素C处理时间后尿液细胞形态图。
图3为hiPS细胞在UC细胞制作的饲养层上的生长曲线图。
图4为hiPS细胞多能干细胞标志PCR鉴定图。
图5为hiPS体外分化(拟胚体)实验及三胚层分化PCR鉴定图。
图6为hiPS体内分化(裸鼠畸胎瘤)实验小鼠注射细胞图及畸胎瘤组织切片H&E染色图。
具体实施方式
下面根据附图，结合具体实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例尿液细胞作为饲养层培养人诱导多能干细胞
本发提供了一种利用人尿液细胞制作饲养层培养人诱导多能干细胞的方法，具体方案参见图1。
1.尿液细胞的分离与培养、冻存与复苏
1)尿液细胞的分离与培养将新鲜尿液细胞转移到加有5mL双抗的50mL离心管中(在无菌条件下操作避免污染)，400g离心10分钟，弃去上清，留1mL上清液，重悬细胞，将所有细胞转移到同一个50mL离心管中，加入10mL PBS清洗细胞，200g离心10分钟，弃掉上清，只留下0.2mL上清液，加入1mL尿液细胞培养基重悬细胞，并将细胞转移到12孔板中。3-4天后换液，弃去悬浮不贴壁细胞，可见有方向细胞贴壁。之后每3天换液一次，15天左右原代细胞贴壁融合度达到90-95％,单层排列细胞，不堆叠生长。用0.25％胰酶消化传代，初始1:2，4-5代后可按1:3比例分皿传代培养，并标记为相应代次细胞。传代培养过程中每2-3天换液一次，待细胞培养基变为明显“鲜黄”(无分红)色需要更换培养基。
2)尿液细胞的冻存冻存时，将处于对数生长期的尿液细胞消化后，用冻存液(50％FBS+40％尿液培养基+10％DMSO)重悬细胞，冻存浓度最佳为0.5-1×106个，转入冻存管，并转入程序降温盒内，标记上细胞的名称、代次、冻存时间和保存人姓名。于-80℃过夜后转入液氮中。
3)尿液细胞的复苏复苏时，从液氮中取出细胞放入37℃恒温水浴箱中快速解冻，待冻存液解冻至小冰晶后，移入超净台。在无菌条件下，取出细胞悬液，1000g离心5min，弃去上清，用新鲜的尿液细胞培养基重悬细胞，轻柔混匀后，接种于六孔板或培养皿中，第2天更换新鲜的培养基。细胞经过1-2天休眠期后开始迅速增殖，复苏后细胞状态与冻存前基本一致。
2.尿液细胞作为饲养层细胞的准备
取3-12代尿液细胞作为饲养层的细胞。将六孔板预先用Matrigel处理1小时以上，弃去Matrigel更换为新鲜的尿液细胞培养基，将尿液细胞以3×104/cm2,待融合度达到80％,用10μg/mL的丝裂霉素C处理1小时30分钟灭活，灭活后细胞的形态与灭活前基本一致(见图2)。灭活后的细胞在24小时内使用。
3.以尿液细胞为饲养层培养人皮肤成纤维细胞重编程的hiPS
取成年人包皮成纤维细胞，用携带有Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc转录因子的逆转录病毒感染两次。感染结束后在恢复培养基中加入丁酸钠，恢复培养4天后更换为mTeSR培养基，培养直至出现肉芽肿样克隆团，将克隆挑取到尿液细胞制作的饲养层上，随后每2天更换一次培养基。
4.以尿液细胞制作饲养层培养hiPS
1)HiPS在尿液细胞饲养层上的传代及形态
显微镜下及时除去分化细胞，待克隆团出现“发黄”克隆团或面积较大(40×倍数下可观察到铺满视野)时更换饲养层并传代。用DPBS清洗克隆团，1mg/mL的Ⅳ型胶原酶消化5-10分钟，轻轻吹散成小团块，接种到准备好的饲养层细胞上,37℃5％CO2条件下培养。每2d更换一次培养基。hiPS每4-5d传代一次，扩增后主要使用机械法传代，即用玻璃拉针将细胞从饲养层上分割刮下，并吹散成小团块(尽量避免吹散成单细胞)，1:2传代到新的饲养层上。
实验结果HiPS细胞在尿液细胞饲养层上成团生长，边缘清晰，界限明显，大部分细胞为圆形，核仁明显，边界为类成纤维样细胞(见图1)。
2)HiPS细胞在尿液细胞饲养层培养体系上的生长动力学
将第5代hiPS细胞以5×104个/孔分别接种到第3/7/12代尿液细胞制作的12孔饲养层上(UC-3、UC-7、UC-12)，各设三个复孔。培养3-4天后从饲养层上将hiPS细胞用机械传代法将hiPS从饲养层上刮下来，取10μL计数，计算扩增倍数同时将剩余细胞按1:2接种到新的饲养层上，各设3个复孔，继续培养。一次类推，共传代3次，计算扩增倍数。
实验结果表明HiPS细胞在尿液细胞饲养层培养体系中可持续扩增，扩增倍数随着细胞量基数的增加呈“指数”上升趋势。
5.HiPS在尿液细胞饲养层的培养体系上扩增培养至10代后生物学特性和多能性的维持状况
1)HiPS细胞表达多能干细胞标志的基因表达情况
收集在人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中扩增培养10代以后的hiPS细胞，用Trizol提取总RNA，随后进行RT-PCR，检测多能干细胞标志基因的表达情况：包括Klf4、Sox2、c-Myc、Oct4以及Nanog、Lin28等。同时以人包皮成纤维细胞(HFF)为对照。
检测结果显示这些基因在hiPS细胞中都有表达。
2)HiPS在体外形成EB向三胚层分化情况
将在尿液细胞为饲养层的培养体系中扩增培养10代以后的hiPS细胞用玻璃拉针刮下，以细胞团块的方式接种在超低黏吸附六孔板中，用分化培养液(包含20％FBS、1×β-巯基乙醇、1×非必须氨基酸、1×GlutMAX和DMEM基础培养基)在37℃5％CO2条件下培养4-5天后，接种到Matrigel处理后的六孔板中，继续用分化培养基培养5天。实验结果显示，hiPS细胞在悬浮状态下能够形成“圆润的”拟胚体(见图5)，贴壁后，hiPS细胞可以分化成具有不同形态的细胞。将分化的细胞培养4天以上，用Trizol提取总RNA做PCR分析，检测三胚层标记性基因的表达情况。
结果显示，分化后的细胞三胚层标记基因表达都有增加(AFP和SOX17为内胚层标志基因，brachyury和BMP4为中胚层标志基因，MAP2和PAX6为外胚层标志基因)，其中外胚层基因表达增加最为明显。表明尿液细胞饲养层培养体系可以支持hiPS细胞维持多向分化潜能。
3)HiPS在体内形成畸胎瘤向三胚层分化情况
将在尿液细胞饲养层的培养体系中的扩增到10代以后的hiPS细胞从饲养层上刮下，用DPBS清洗2次，再用mTeSR基础培养基重悬，加入1/5体积的Matrigel，共200μL注射到免疫缺陷型小鼠背部皮下，每个注射点的细胞为2×106。注射后观察成瘤状况，待瘤体达到1cm3后，将畸胎瘤瘤体去除，制作石蜡切片并进行H&E染色，观察hiPS细胞分化为三胚层细胞的情况。
实验结果表明，在尿液细胞饲养层上培养了10代以后的细胞，能够观察到畸胎瘤切片中出现神经组织、血管上皮样细胞、腺样组织和软骨组织的典型细胞(见图6)。表明，在尿液细胞饲养层上培养了10代以上的细胞在体内仍然具有分化为三胚层细胞的能力，维持了多向分化潜能。
通过以上实施例结果证明，本发明所述的一种用人尿液细胞作为饲养层培养人诱导多能干细胞的方法能够较好地维持hiPS细胞的增殖活性和分化潜能。以人尿液细胞制作饲养层能够减少培养hiPS细胞时的异源污染，同时，尿液细胞是一种很好取材的人体细胞，具有易获得、容易扩增的特性，能够保障饲养层的不间断供给。
以上对本发明的具体实施例进行了详细的描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (5)

1.一种用人尿液细胞作为饲养层培养人诱导多能干细胞的方法，其特征在于，该方法通过以下技术方案实现：
(1)饲养层细胞的准备：用传代培养、低温冻存复苏后培养的人尿液细胞作为饲养层细胞，接种到用Matrigel处理后的六孔板上，细胞融合度80％左右，并用10μg/mL的丝裂霉素C处理1小时30分钟灭活，灭活后24-48h内使用；
(2)人诱导多能干细胞的获得：取成人23-26岁的包皮成纤维细胞，用逆转录病毒感染两次，恢复培养期加入丁酸钠(NaBT)，感染6天时将细胞重新计数铺到用Matrigel处理过的培养板或培养皿上，更换为mTeSR培养基，每2天换液，直到出现胚胎干细胞状的克隆，挑选、扩增培养；
(3)人诱导性多能干细胞的扩增培养：挑选类似胚胎干细胞的克隆，用Ⅳ型胶原酶消化8分钟，移液器吸头划成小块传到准备好的饲养层细胞上，每天换液，每5天传代一次；
(4)人诱导多能干细胞的生物学特性和多能性的维持：在以尿液细胞为饲养层上扩增培养15代以后，用RT-PCR法鉴定扩增培养后人诱导多能干细胞的多能标志表达情况，同时用拟胚体形成法和免疫缺陷小鼠畸胎瘤形成法检测其在体内外是否具有向三胚层分化的潜能。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的饲养层细胞为第三至第十二代的人尿液细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的尿液细胞是通过收取志愿者的尿液，通过多次离心洗涤的方法收集到的肾上皮细胞等人体排出尿液时夹带的多种上皮样细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的hiPS细胞是通过含有转录因子的OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四种转录因子的逆转录病毒方式诱导人包皮成纤维细胞重编程获得的诱导性多能干细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述挑选克隆的方法为用玻璃拉针从其他细胞和培养板中剥离出多能干细胞，然后利用200μL枪头吸取克隆。
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