CN102286535A - 一种成纤维细胞转分化为肝干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药生物工程技术领域。肝移植是目前终末期肝脏疾病唯一有效的治疗方式，但供肝来源的缺乏使其临床应用受到很大的限制。肝干细胞具有自我更新能力和分化为肝细胞及胆管细胞的双向分化能力，能为肝细胞移植治疗提供理论上无限数目的供体细胞。本发明提供一种成纤维细胞转分化为肝干细胞的方法，是应用c-Jun、Foxa2、Hnf1β三个转录因子将成纤维细胞重编程为肝干细胞，该细胞具有肝干细胞所特有自我更新和双向分化的特性。本发明制备得到的诱导型肝干细胞可作为急性肝衰竭和终末期肝脏疾病细胞治疗理想的细胞来源，可作为药物筛选和制备组织化工程肝脏的种子细胞，还可为肝干细胞的细胞生物学特性及肝脏发育等研究提供一个理想的研究平台。

Description

一种成纤维细胞转分化为肝干细胞的方法
技术领域
本发明涉及医药生物工程技术领域，具体涉及一种成纤维细胞转分化为肝干细胞的方法。
背景技术
肝移植是目前终末期肝脏疾病唯一有效的治疗方式，但供肝来源的缺乏使其临床应用受到很大的限制。近二十年来，作为原位肝移植的替代方案，临床上一直致力于开展肝细胞移植技术的研究，并取得了一定的疗效，尤其是在各种原因导致的急性肝衰竭病患中具有一定的应用前景，然而这一方法仍然非常依赖于捐献的供体器官，其供体不足的问题仍未得到有效解决。即使成功实施了移植的病人，因为所获得的是异体器官或细胞，仍然不得不终生服用抗免疫排斥药物。近年来，利用胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)和诱导多潜能干细胞(induced Pluripotent Stem cells，iPSc)，诱导分化为肝干细胞或肝细胞，成为肝细胞移植技术研究中的热点问题。然而，目前ESCs/iPSCs的肝向诱导分化方案普遍存在效率低、系统复杂、重复性差等问题。同时，人ESCs的应用还存在伦理学和免疫学问题。近期的研究也表明，iPSc分化后的细胞也具有免疫原性，使得iPS细胞诱导而来的肝细胞应用前景堪忧。
实现不同种类成体细胞间直接转化，从一种分化状态进入另一种分化状态，省略了先将一种分化细胞重编程为胚胎干细胞样细胞，再诱导其分化为所需的成熟细胞的过程，是当前再生医学的重大进步。利用病人自体的其他细胞转化为肝脏细胞，直接移植到病患的肝脏以替代失去功能的肝脏细胞，或制备组织工程化肝脏用于危急肝病患者的移植治疗，是解决肝脏疾病细胞治疗中细胞来源缺乏问题的一个新的重要策略。
2011年5月12日，国际著名学术期刊《自然》在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所惠利健课题组关于转化型肝脏细胞的研究成果。该研究以p19ARF基因剔除小鼠尾巴上的成纤维细胞为实验材料，转入Gata4，Hnf1a和Foxa3等3个转录因子成功将小鼠尾巴上的纤维细胞转化为成熟的肝细胞。该研究首次证明肝脏以外的体细胞可以被诱导直接转化为肝细胞，为将来从病人自身体细胞诱导获得肝脏细胞进行移植应用奠定了基础。这一发现在国际上尚属首次(参见文献：Huang PY，He ZY，Ji SY，Sun HW，XiangD，Liu CC，Hu YP，Wang X，Hui LJ.Induction of functional hepatocyte-like cellsfrom mouse fibroblasts by defined factors.Nature 2011，May 11 on line.)。
成熟肝细胞不能在体外扩增、不易操作且移植后不具有增殖优势。相比而言，肝干细胞具有自我更新能力和分化为肝细胞及胆管细胞的双向分化能力，能为肝细胞移植治疗提供理论上无限数目的供体细胞，利用肝干细胞进行肝细胞移植治疗各种终末期肝病被认为是最有前途的方法之一。更重要地是，将体细胞如皮肤的成纤维细胞或血液中分离的淋巴细胞，直接转化为肝干细胞，完全不涉及到伦理问题；同时，由于无需经过先将体细胞重编程为胚胎干细胞样细胞、再由胚胎干细胞样细胞分化为肝干细胞这一复杂环节，避免了使细胞获得免疫原性的问题，因此这一方案的建立具有极其重要的临床应用价值。
目前尚未见有从成纤维细胞重编程为肝干细胞的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种由成纤维细胞转分化为肝干细胞的方法。
本发明人认为诱导成纤维细胞直接转分化为肝干细胞，既能为细胞移植提供充足的细胞来源，又可以避免细胞移植过程中的免疫排斥的问题。
本发明应用c-Jun、Foxa2、Hnf1β等3个转录因子可将成纤维细胞重编程为肝干细胞，该细胞具有肝干细胞所特有自我更新和双向分化的特性。
本发明提供了一种由成纤维细胞转分化为肝干细胞的方法，技术方案如下：
1、构建c-Jun、Foxa2、Hnfβ慢病毒载体，经酶切鉴定和测序验证。
2、进行慢病毒载体的包装、浓缩与滴度测定。
3、制备小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast，MEF)。
4、诱导MEF向肝干细胞(Induced Hepatic Stem Cells，iHSCs)的转分化。
5、鉴定诱导型肝干细胞(iHSC)的形态特征及生物学特性。
具体方法如下：
1、c-Jun、Foxa2、Hnf1β慢病毒载体的构建
分别对c-Jun(NCBI Reference Sequence：NM_010591.2)、Foxa2(NCBIReference Sequence：NM_010446.2)和Hnf1β(NCBI Reference Sequence：NM_009330.2)设计克隆引物如下：
c-Jun正向引物GATCGGATCCGCCACCATGACTGCAAAGATGGAAACGACCT
反向引物GATCGTCGACAAACGTTTGCAACTGCTGCGTTAGC
Foxa2正向引物GATCGGATTCGCCACCATGCTGGGAGCCGTGAAGATGGAA
反向引物GATCGTCGACGGATGAGTTCATAATAGGCCTGGAG
Hnf1β正向引物GATCGGATCCGCCACCATGGTGTCCAAGCTCACGTCGCTC
反向引物GATCGTCGACCCAGGCTTGCAGTGGACACTGTTTAC
通过PCR的方法从怀孕12.5天的小鼠胚胎胎肝cDNA中分别扩增目的基因片段，PCR产物与慢病毒载体pWPT-GFP-V5(Addgene plasmid 12255)用BamH1与Sal1双酶切，回收酶切后目的基因片段和载体骨架片段，将目的基因片段和载体骨架片段用T4DNA连接酶连接，转化DH5a后分别得到pWPT-Jun-V5、pWPT-Hnf1β-V5和pWPT-Foxa2-V5载体。
2、慢病毒载体的包装、浓缩与滴度测定
按照invitrogen公司lipofectamine2000的操作说明，将8μg pWPT-Jun-V5(或pWPT-Hnf1β-V5或pWPT-Foxa2-V5)、4μg psPAX2(Addgene plasmid12260)和2μg pMD2.G(Addgene plasmid 12259)质粒导入293T细胞中产生慢病毒颗粒。
转染48小时后，收集病毒上清，0.45μm滤膜过滤后，用Clontech公司的lenti-XTM concentrator(cat#631231)浓缩病毒。将浓缩后的病毒分装、存放于-70℃。
病毒滴度的测定，按Clontech公司的lenti-X qPCR Titration Kit(cat#632165)提供的标准操作方法进行测定。
3、小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast，MEF)的制备
取怀孕12.5天的小鼠胚胎，去除头部和内脏后，用剪刀将躯干部分剪碎，胰蛋白酶消化后，将单细胞悬液接种于0.2％明胶包被的培养皿，培养至90％汇合时进行传代。
4、诱导MEF向肝干细胞(Induced Hepatic Stem Cells，iHSCs)分化
各病毒以感染复数M.O.I＝50感染MEF，感染3天后更换为SCM-A培养液[DMEM/F12(Invitrogen，Cat#10565)含5％FBS(Hyclone，Cat#SH30070.03)、1×青链霉素(Invitrogen，Cat#15140-122)、0.1mM 2-Mer(Invitrogen，Cat#21985-023)、10ng/ml HGF(R&D，Cat#2207-HG)、10ng/ml EGF(R&D，Cat#236-EG-200)、1×ITS(Sigma，Cat#I1884)、10-7M Dex(Sigma，Cat#D1756)、10ng/mlNicotinamide(Sigma，Cat#N0636-100G)和50μg/ml(Gentamycin Sigma，Cat#46305-250MG)]，每3天换液。每天观察细胞的生长状况与形态变化。连续培养3周后，可见到上皮样克隆形成，挑取单克隆。
5、鉴定上述方法得到的诱导型肝干细胞(iHSC)的形态特征及生物学特性，包括：
5.1iHSC光镜下形态特征；
5.2RT-PCR检测iHSC细胞的分子表型；
5.3免疫细胞化学检测iHSC细胞肝细胞、胆管细胞及上皮细胞标志物；
5.4iHSC的核型分析；
5.5iHSC的生长特征；
5.6iHSC的致瘤性评价；
5.7iHSC双向分化特性鉴定；
5.8iHSC在丁酸钠诱导后的超微结构特征。
鉴定结果表明：
(1)iHSC为形态均一的小三角形上皮样细胞。细胞体积较小，细胞核较大，圆形，有1～3个核仁，大多数细胞有胞质突起，在传代过程中该细胞的形态基本保持不变。
(2)iHSC具有强大的增殖能力。目前该细胞系已在体外培养达3个月之久，传代20代以上，而且其增殖能力相对稳定。核型分析显示染色体数目正常，荷瘤实验表明该细胞系无致瘤性。
(3)iHSC表达肝干细胞相关的分子标志。RT-PCR结果显示，该细胞系表达肝干细胞相关的分子标志(如AFP、Alb、CK8、CK18、CK19、Ttr等)，提示iHSC具有和肝干细胞相似的表达特征。
(4)体外诱导分化研究显示iHSC具有双向分化潜能。在丁酸钠作用下，iHSC的生长受到明显抑制并有双核细胞的出现。RT-PCR和Real-time PCR以及免疫细胞化学结果显示Alb在诱导后表达增强，肝细胞的功能蛋白G6PD、TDO均被诱导表达。另外，胆管细胞标志BG、GGT和CK19均可表达。这些结果提示，iHSC在丁酸钠诱导下可向肝细胞和胆管细胞方向分化。
本发明还提供了根据上述方法得到的肝干细胞。
肝干细胞最本质的特征在于具有向成熟肝细胞和胆管上皮细胞分化的双向潜能。iHSC可以分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞，具有向肝细胞和胆管细胞的双向分化潜能，具有肝干细胞的特征。以上研究结果表明，本发明应用c-Jun、Foxa2、Hnf1β等3个转录因子可将成纤维细胞重编程为肝干细胞，该细胞具有肝干细胞所特有自我更新和双向分化的特性。
本发明的创新点在于：1)本发明将成纤维细胞诱导直接转化为肝干细胞，不同于文献报道中诱导为成熟的肝细胞；2)本发明采用c-Jun、Foxa2和Hnf1β三个转录因子，不同于文献报道的Gata4，Hnf1a和Foxa3；3)本发明采用的是未经遗传修饰的野生型成纤维细胞，不同于文献报道的需采用p19ARF基因剔除小鼠的成纤维细胞。
本发明制备得到的诱导型肝干细胞可作为急性肝衰竭和终末期肝脏疾病细胞治疗理想的细胞来源，可作为药物筛选和制备组织化工程肝脏的种子细胞，还可为肝干细胞的细胞生物学特性及肝脏发育等研究提供一个理想的研究平台。
附图说明
图1是慢病毒载体示意图。
其中A是慢病毒空载体；B是含目的基因的慢病毒载体。
图2是MEF细胞感染病毒3周后形态的变化。
其中A：MEF细胞感染c-Jun、Foxa2、Hnf1β病毒3周后形成上皮样克隆(放大倍数：100×)；B：A图的局部400×放大视野；C：MEF感染GFP病毒3周后仍呈成纤维样(放大倍数：400×)。
图3是RT-PCR检测iHSC细胞中基因的表达。
其中1：Liver；2：Fetal Liver(E12.5)；3：iHSC p4；4：MEF；5：H2O。
图4是iHSC细胞共染Albumin和CK19。
其中A是Albumin(橙色)；B是CK19(绿色)；C是Albumin和CK19的叠加图(同时叠加DAPI细胞核染色)。
图5是iHSC细胞共染Albumin和AFP。
其中A是AFP(绿色)；B是Albumin(红色)；C是Albumin和AFP的叠加图(同时叠加DAPI细胞核染色)。
图6是iHSC细胞表达E-Cadherin。
图7是iHSC细胞的染色体计数(放大倍数：1000×)。
图8是iHSC细胞和MEF细胞的生长曲线(重复测量方差分析，p＜0.001，n＝6，)。
图9是丁酸钠诱导后iHSC细胞的ICG摄入与排出实验。
其中A：丁酸钠诱导6天后iHSC细胞摄入ICG，B：ICG摄入6小时后被排出。
图10是丁酸钠诱导前后iHSC细胞基因表达的变化。
其中1：Liver，2：Fetal Liver，3：iHSC P4，4：iHSC P6，5：MEF，6：iHSC P6丁酸钠诱导6天，7：H2O。
图11是iHSC丁酸钠诱导后超微结构的变化(放大倍数：5000×)。
其中A：丁酸钠诱导前的细胞；B：丁酸钠诱导后的细胞胞浆中含有丰富的细胞器(a：线粒体；b：溶酶体：c：粗面内质网和核糖体；d：糖元；e：桥粒；f：毛细胆管微绒毛)。
具体实施方式
下面结合本发明的实施例和附图对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：成纤维细胞转分化为肝干细胞
1、c-Jun、Foxa2、Hnf1β慢病毒载体的构建
分别对c-Jun(NCBI Reference Sequence：NM_010591.2)、Foxa2(NCBIReference Sequence：NM_010446.2)、Hnf1β(NCBI Reference Sequence：NM 009330.2)设计克隆引物，由上海生工生物工程有限公司合成。在正向与反向引物两端分别引入BamH1与Sal1酶切位点，正向引物起始密码子前加上Kozak sequence(GCCACC)。由于各基因与V5tag融合表达，下游引物去掉基因自身的终止密码子。克隆引物见表1：
表1：克隆引物
Figure BDA0000069028540000061
以小鼠E12.5天的胎肝cDNA为模板，用PCR的方法分别扩增目的基因片段，PCR反应体系为50μl，含上下游引物(10μm)各1μl，2.5mM dNTP5μl，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TaKaRa)0.5μ1，5×PrimeSTAR buffer10μl，反应条件：98℃10秒，68℃2分钟，30循环。PCR产物与慢病毒载体pWPT-GFP-V5(Addgene plasmid 12255，图1A)用BamH1与Sal1双酶切，回收酶切后目的基因片段和载体骨架片段，将目的基因片段和载体骨架片段用T4DNA连接酶连接，转化DH5α后分别得到pWPT-Jun-V5、pWPT-Hnf1β-V5和pWPT-Foxa2-V5载体(图1B)。经酶切鉴定大小和方向正确后，委托上海桑尼生物科技有限公司测序验证正确。
2、慢病毒载体的包装、浓缩与滴度测定
按照invitrogen公司lipofectamine2000的操作说明，将8μg pWPT-Jun-V5(或pWPT-Hnf1β-V5或pWPT-Foxa2-V5)、4μg psPAX2(Addgene plasmid12260)和2μg pMD2.G(Addgene plasmid 12259)质粒导入293T细胞中产生慢病毒颗粒。
转染48小时后，收集病毒上清，0.45μm滤膜过滤后，用Clontech公司的lenti-XTM concentrator(cat#631231)浓缩病毒。将浓缩后的病毒分装、存放于-70℃。
病毒滴度的测定，按Clontech公司的lenti-X qPCR Titration Kit(cat#632165)提供的标准操作方法进行测定。c-Jun、Foxa2和Hnf1β病毒浓缩前的滴度分别为：6.5×105IFU/mL、7.8×105IFU/mL和4.5×105IFU/mL，浓缩后的滴度分别为：1.9×107IFU/mL、2.2×107IFU/mL和1.8×107IFU/mL。
3、小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast，MEF)的制备
(1)培养器皿的预处理：以0.2％明胶覆盖培养皿的底壁，室温下放置30min后，将0.2％明胶吸出，室温晾干后备用；
(2)给孕12.5天的小鼠注射约0.5mL阿佛丁麻醉后，实施断颈法处死小鼠；
(3)用70％乙醇擦拭腹部，剪开皮肤并把皮肤向后拉，暴露出腹壁。剪开腹壁以暴露出子宫。将子宫移到100mm的皿里，用10mL PBS洗三遍；
(4)用剪刀剪开胚囊，并将胚胎移到培养皿中；
(5)小心去除胚胎的头和内脏(所有深色的东西)，将胚胎躯干部分转移到青霉素小瓶中，用2mL PBS洗三遍；
(6)用眼科剪将组织剪碎，加入2mL的0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA，将悬液移入50mL离心管中，并在37℃孵育大约20min，每隔5min振荡几次。
(7)充分吹打后加入10mL培养基终止消化，静置5min后，将上层约8mL的细胞悬液移入培养皿中，置37℃，5％CO2培养6小时后，换液。
(8)细胞约90％汇合时传代。
4、诱导MEF向肝干细胞(Induced Hepatic Stem Cells，iHSCs)的转分化
(1)将1×105个第三代MEF细胞接种于0.2％明胶包被的6孔板中。
(2)12小时后，参照测得的病毒滴度，各病毒按感染复数M.O.I＝50，取一定的体积的病毒悬液混合后加入到培养板中，37℃，5％CO2培养6小时后，换液。
(3)3天后传代于包被明胶的100mm培养皿中，同时更换SCM-A培养液(DMEM/F12含5％FBS、1×青链霉素、0.1mM 2-Mer、10ng/ml HGF、10ng/mlEGF、1×ITS、10-7M Dex、10ng/ml Nicotinamide和50μg/ml Gentamycin)。每3天换液一次。
(4)每天观察细胞的生长状况与形态变化。连续培养3周后，可见到上皮样克隆形成(图2A、B)，而感染GFP对病毒的MEF细胞在培养3周后，仍呈成纤维细胞样(图2C)
(5)挑取单克隆于24孔板中继续培养，传代，扩增。
实施例2：诱导型肝干细胞(iHSC)的形态特征及生物学特性的鉴定
(1)iHSC光镜下形态特征
iHSC的直径大约为10μm、细胞核大、细胞核中有2～4个明显的核仁。在低密度培养时，细胞呈三角形；生长成片后，呈“铺路石”样紧密排布，形态均一，为典型的上皮细胞(图2B)。在体外培养中，iHSC的形态学特征表明该细胞系为较原始的上皮细胞，具有旺盛增殖能力的可连续传代细胞系，细胞之间有接触抑制，不会发生层叠生长的现象，说明iHSC不是恶性化的细胞。
(2)RT-PCR检测iHSC细胞的分子表型
抽取iHSC第4代的总RNA，RNase-free的DNase I消化去除基因组，RT-PCR检测Alb、AFP、CK8、CK18、CK19、Tat、Ttr、G6PD、EpCAM、E-cadherin等基因在iHSC细胞系的表达。结果发现iHSC细胞系中表达肝细胞分子标志Alb、Ttr；肝干细胞的分了标志：AFP、EpCAM；肝细胞和胆管细胞都表达的分子标志如CK8、CK18；肝的胆管/卵圆细胞的分子标志CK19。而检测不到成熟的肝细胞标志G6PD、Tat的表达，见图3。
(3)免疫细胞化学检测iHSC细胞肝细胞、胆管细胞及上皮细胞标志物
iHSC细胞接种在明胶包被的载玻片上，待细胞80％融合后，用4％多聚甲醛固定10分种，细胞飞片用于免疫细胞化学检测。免疫细胞化学检测结果表明iHSC细胞同时表达肝细胞的标志物albumin、胆管细胞标志物CK19和未成熟肝细胞的标志物AFP(图4、图5)。iHSC细胞表达上皮细胞标志物E-Cadherin(图6)。结合RT-PCR的结果表明iHSC是一种不成熟的肝细胞，类似肝干细胞。
(4)iHSC核型分析
通过秋水仙素阻断细胞有丝分裂于分裂中期，制备了iHSC(第5代)的染色体，观察了这代细胞15个分散良好的分裂相并记数染色体数，结果显示其中93％的染色体为正常的核型(见图7)。
(5)iHSC的生长特征
用MTT法绘制第六代iHSC细胞的生长曲线，如图8所示，以在SCM-A培养基中生长的MEF为对照，两者的生长曲线有明显区别，MEF对照组生长缓慢。iHSC生长曲线为典型的S型，接种后经过短暂潜伏期(1天)就可以增殖，在接种第二天即进入对数生长期，接种第4天进入平台期，细胞增值能力逐渐下降。通过做图法可知，细胞群体倍增时间约约为19小时。
(6)iHSC的致瘤性
分别将1×104、1×105、1×106个iHSC细胞移植到NOD/SCID免疫缺陷小鼠肋侧皮下，共观察8w，未见肿瘤发生，说明iHSC没有发生恶性转化，无致瘤性。
(7)iHSC双向分化特性
第六代iHSC细胞经5mmol/L丁酸钠诱导6天后，进行吲哚菁绿(Indocardiogreen，ICG)摄入与排出试验。诱导后的iHSC与未诱导的iHSC置于1mg/mL的ICG溶液中，置于37℃，5％CO2培养30分钟后，用PBS洗三遍，更换新鲜培养液，在倒置显微镜下观察，未诱导的iHSC细胞未见ICG的摄入，而5mmol/L丁酸钠诱导后的iHSC可见ICG的摄入(图9A)。继续培养6小时后观察到诱导后的iHSC细胞可将摄入的ICG排出细胞外(图9B)。说明诱导后的部分细胞具有成熟肝细胞的功能。
提取5mmol/L丁酸钠诱导后iHSC细胞的总RNA，RNase-free的DNase I消化去除基因组，RT-PCR检测丁酸钠诱导前后一些成熟肝细胞标志基因的表达变化。电泳结果显示原本在MEF中不表达的HNF4a在iHSC是表达的，说明该基因被激活，但在丁酸钠诱导6天后，HNF4a表达下调。TDO、G6PD、GGT等一些成熟肝细胞的分子标记被丁酸钠诱导后表达，另外，肝细胞和胆管细胞都表达的分子标志c-met(肝细胞生长因子受体)和造血干细胞的分子标志CD45也被诱导表达，胆管细胞的分子标志BG亦被诱导表达，见图10。以上结果说明iHSC可被丁酸钠诱导向肝向和胆管方向分化，同时也说明丁酸钠的诱导分化不是特异的。
(8)iHSC在丁酸钠诱导后的超显微结构变化
对丁酸钠诱导20天的iHSC细胞进行透射电镜观察，可见诱导前的细胞胞浆少，细胞器不丰富，细胞间界限分明，无紧密连接(图11A)。诱导后的细胞胞质内具有丰富的细胞器，包括丰富的线粒体、溶酶体、核糖体、排列整齐的粗面内质网、以及大量的糖原颗粒，与诱导前细胞形成鲜明的对比。并可见到细胞间胆管样结构，腔内有较多绒毛样突起，其旁有细胞间紧密连接(图11B)。以上超微结构的变化提示iHSC可以分化为成熟的肝细胞。
Figure IDA0000069028620000011

Claims (6)

1.一种由成纤维细胞转分化为肝干细胞的方法，该方法包括以下步骤：
A、构建c-Jun、Foxa2、Hnf1β慢病毒载体；
B、进行慢病毒载体的包装、浓缩与滴度测定；
C、制备小鼠胚胎成纤维细胞；
D、诱导小鼠胚胎成纤维细胞向肝干细胞的转分化。
2.根据权利要求1所述的由成纤维细胞转分化为肝干细胞的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：
A、c-Jun、Foxa2、Hnf β慢病毒载体的构建
设计克隆引物如下：
Jun正向引物如SEQ ID NO：1所示，反向引物如SEQ ID NO：2所示；
Foxa2正向引物如SEQ ID NO：3所示，反向引物如SEQ ID NO：4所示；
Hnf1β正向引物如SEQ ID NO：5所示，反向引物如SEQ ID NO：6所示；
通过PCR的方法从小鼠胎肝cDNA中分别扩增目的基因片段，PCR产物与慢病毒载体pWPT-GFP-V5用BamH1与Sal1双酶切，回收酶切后目的基因片段和载体骨架片段，将目的基因片段和载体骨架片段用T4DNA连接酶连接，转化DH5a后分别得到pWPT-Jun-V5、pWPT-Hnf1β-V5和pWPT-Foxa2-V5载体；B、慢病毒载体的包装、浓缩与滴度测定
按照invitrogen公司lipofectamine2000的操作说明，将8μg pWPT、4μgpsPAX2和2μg pMD2G质粒导入293T细胞中产生慢病毒颗粒；
转染48小时后，收集病毒上清，0.45μm滤膜过滤后，用Clontech公司的lenti-XTM concentrator浓缩病毒，将浓缩后的病毒分装、存放于-70℃；
病毒滴度的测定，按Clontech公司的lenti-X qPCR Titration Kit提供的标准操作方法进行测定；
C、小鼠胚胎成纤维细胞的制备
取怀孕12.5天的小鼠胚胎，去除头和内脏后，用剪刀将躯干部分剪碎，胰蛋白酶消化后，将单细胞悬液接种于0.2％明胶包被的培养皿，约90％融合时传代；
D、诱导小鼠胚胎成纤维细胞向肝干细胞分化
各病毒以感染复数M.O.I＝50感染小鼠胚胎成纤维细胞，感染3天后更换SCM-A培养液，每3天换液，连续培养3周后，可见到上皮样克隆形成，挑取单克隆。
3.根据权利要求1或2所述的方法得到的肝干细胞。
4.一种如权利要求3所述的肝干细胞在制备治疗急性肝衰竭和终末期肝脏疾病细胞来源中的应用。
5.一种如权利要求3所述的肝干细胞在制备组织化工程肝脏的种子细胞中的应用。
6.一种如权利要求3所述的肝干细胞在药物筛选中的应用。
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