CN101974488A - 一种永生化的猪胰腺干细胞系及其构建与分化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种永生化的猪胰腺干细胞系及其构建与分化方法，所述的永生化的猪胰腺干细胞系，是以猪胰腺干细胞作为宿主细胞，转染pCI-neo-hTERT真核表达载体，经过G418筛选得到的表达人端粒酶逆转录酶且具有多向分化潜能的转化体。该细胞系在体外传代50代以上仍有较好的活力，保持分裂增殖，不发生衰老和凋亡，是一种永生化的细胞系。将其经过诱导后能够分化形成功能性胰岛细胞团，将其移植到患有糖尿病小鼠模型的体内，能降低其血糖浓度，在两周内能够维持正常的血糖水平。
Description
技术领域
本发明属于细胞工程技术领域，特别涉及一种永生化的猪胰腺干细胞系及其构建与分化方法。
背景技术
糖尿病是全球性医学难题。目前，对糖尿病的治疗虽然有很多方法，但都不能从根本上解决问题。器官移植是一种比较好的解决方法，但主要受制于供体不足和免疫排斥的问题。因此，人们寄希望于干细胞替代疗法能够解决供体不足和免疫排斥的问题：干细胞增殖力强、数量充足、移植排斥反应相对较低。
胰腺干细胞(Pancreatic stem cells)是一类存在于胎儿和成年胰腺组织中的成体干细胞，能自我更新，具有多向分化潜能，其特点是在自然分化过程中首先分化为胰腺组织的各种细胞。然而人类胰腺干细胞存在道德伦理，传染病相互感染等问题，尤其是其供体组织来源极度匮乏，因此人们将移植的替代品转向异种动物-猪。猪的繁殖性能强，组织来源充足，胰岛素结构和生物活性类似于人胰岛素，血糖调定点同人接近，猪胰腺细胞可在人血清中生存对人体无害，因此，猪胰腺干细胞可作为最佳的异种动物供体细胞，对猪胰腺干细胞的研究是糖尿病治疗的新希望。
体外分离、克隆胰腺干细胞作为种子细胞，并定向诱导其分化为功能性胰岛细胞移植治疗糖尿病，是解决胰岛供体短缺的有效途径。西北农林科技大学干细胞研究中心在胰腺干细胞的研究上已开展了一定的基础工作。王赟(猪胰腺干细胞分离与培养[J].中国农业科学，2008，41(8)：2554-2562)，冯若鹏(胎猪胰岛源胰腺干细胞分离培养与诱导分化试验[J].中国农业科学，2007，40(3)：582-587)等先后在猪胰腺干细胞的分离纯化、培养基的筛选以及胰腺干细胞生物学、分子生物学鉴定等方面做了大量的工作；分离到的猪胰腺干细胞在体内定向诱导后已检测到胰岛素和C-肽的分泌。但分离出的胰腺干细胞随着传代次数的提高，其活力越来越差，最终发生凋亡，难以存活。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种永生化的猪胰腺干细胞系及其构建与分化方法，对该干细胞系进行胰岛细胞团诱导，转入糖尿病模型动物后能够恢复其血糖水平。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种永生化的猪胰腺干细胞系，是以猪胰腺干细胞作为宿主细胞，转染pCI-neo-hTERT真核表达载体，经过G418筛选得到的表达人端粒酶逆转录酶且具有多向分化潜能的转化体。
所述的永生化的猪胰腺干细胞系，其细胞为成纤维样，呈多角形和短梭状，有两个或两个以上的核仁，细胞间存在接触抑制。
所述的永生化的猪胰腺干细胞系，在传代培养75代以后人端粒酶逆转录酶还能够被表达。
一种永生化的猪胰腺干细胞系的构建方法，包括以下步骤：
1)将猪胰腺干细胞接种于培养液A，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养；待细胞生长至融合度达到80～90％后进行细胞转染，转染前一天，用胰蛋白酶消化猪胰腺干细胞接种到培养板上，然后用RPMI 1640培养基冲洗，再加入的RPMI1640培养基饥饿1h；
所述的培养液A为：RPMI 1640培养基中添加其体积比20％的FBS，还包含1mmol/L的丙酮酸钠、10mmol/L的尼克酰胺、0.1mmol/L的β-巯基乙醇、2mmol/L的谷氨酰胺、20ng/mL的EGF、20ng/mL的bFGF、100IU/mL青霉素和100mg/mL的链霉素；
2)将溶液A与溶液B混合，室温下孵育20min，然后将溶液A与溶液B的混合液逐滴加入RPMI 1640培养基饥饿的猪胰腺干细胞，混匀，在37℃、5％的CO2中保温5～6h；保温完成后，更换为培养液A继续培养；
所述的溶液A为：480μl RPMI1640培养基+20μl脂质体混合，室温孵育5min；
所述的溶液B为：492μl RPMI 1640培养基+8μg pCI-neo-hTERT质粒混合，室温孵育5min；
3)转染48h后，在培养基A中添加G418并维持其浓度为400μg/mL进行筛选；筛选两周后，转染后存活的细胞开始呈克隆状生长，筛选一个月后，将G418的浓度维持在200μg/mL继续进行筛选，待细胞单层铺满整个培养皿后传代培养；得到稳定转染pCI-neo-hTERT的猪胰腺干细胞；
4)将稳定转染pCI-neo-hTERT的猪胰腺干细胞转移到培养液B中，在37℃、5％CO2条件下培养，培养超过50代后得到永生化的胰腺干细胞系；
所述的培养液B为：低糖DMEM培养基中添加其体积比15％的FBS，还包含0.1mmol/L的β-巯基乙醇、2mmol/L的谷氨酰胺、100IU/mL青霉素和100mg/mL/链霉素。
一种永生化的猪胰腺干细胞系的诱导分化成胰岛细胞团的方法，包括以下步骤：
1)将永生化的猪胰腺干细胞系转移到含有质量分数1％的BSA、100mmol/L的烟碱、10ng/mL的exendin-4、1mmol/L的丁酸钠、2mmol/L的谷氨酰胺、1mmol/L的β-巯基乙醇、20ng/mL的EGF、20ng/mL的bFGF和10ng/mL的Activin A的RPMI 1640/B27培养液上，在37℃、5％CO2的条件下培养进行初步分化诱导1周；
2)将初步分化诱导后的细胞转移到含有质量分数1％的BSA、100mmol/L的烟碱、10ng/mL的exendin-4、1mmol/L的丁酸钠、2mmol/L的谷氨酰胺、1mmol/L的β-巯基乙醇、10ng/mL的β-细胞素和10ng/mL的Activin A的RPMI 1640/B27培养液上，在37℃、5％CO2的条件下悬浮培养1周，诱导分化得到胰岛样细胞团。
所述的胰岛样细胞团表现为DTZ阳性、PDX1阳性、C-肽阳性、胰岛素阳性以及Nestin弱阳性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1)本发明通过将pCI-neo-hTERT真核表达载体转染猪胰腺干细胞，重组后的猪胰腺干细胞表达人端粒酶逆转录酶，以解决分离出的胰腺干细胞随着传代次数的提高活力差和难以存活的问题，经过G418筛选得到具有多向分化潜能的永生化的猪胰腺干细胞系；
2)本发明筛选获得的永生化的猪胰腺干细胞系，其生长状况良好，1∶3传代的培养时间由未转染前的6～7天缩减至3天，且细胞的生命力较之以前大大提高，便于规模化的应用；在体外传代50代以上仍有较好的活力，保持分裂增殖，不发生衰老和凋亡，是一种永生化的细胞系，目前已能够传至81代。
3)本发明筛选获得的永生化的猪胰腺干细胞系，其营养要求较低，原始分离得到的猪胰腺干细胞的培养需要20％的胎牛血清、EGF、bFGF及尼克酰胺等各种营养因子，而现在只要求15％的胎牛血清，降低了培养的成本。
4)将筛选获得的永生化的猪胰腺干细胞系，经过诱导后能够分化形成功能性胰岛细胞团，将其移植到患有糖尿病小鼠模型的体内，能降低其血糖浓度，在两周内能够维持正常的血糖水平。
附图说明
图1为永生化的猪胰腺干细胞形态学特征显微显示图；
图2为RT-PCR检测永生化的猪胰腺干细胞系hTERT表达的结果图；
图3为永生化的猪胰腺干细胞系的胰腺干细胞特征性标志鉴定图；
图4为永生化的猪胰腺干细胞系的胚胎干细胞特征性标志鉴定图；
图5为永生化的猪胰腺干细胞系和诱导分化后的胰腺干细胞特征性标志基因表达检测图；
图6为永生化的猪胰腺干细胞系的胚胎干细胞特征性标志基因表达检测图；
图7为永生化的猪胰腺干细胞系的细胞生长曲线图，其中横坐标为时间(天数)，纵坐标为细胞数(104)；
图8为永生化的猪胰腺干细胞系诱导分化后的特征性标志鉴定图；
图9为胰岛样细胞团移植小鼠糖尿病模型后的血糖浓度变化曲线，其中横坐标为时间(天数)，纵坐标为血糖浓度。
具体实施方式
本发明提供一种永生化的猪胰腺干细胞系，是以猪胰腺干细胞作为宿主细胞，转染pCI-neo-hTERT真核表达载体，经过G418筛选得到的表达人端粒酶逆转录酶且具有多向分化潜能的转化体。该细胞系在体外传代50代以上仍有较好的活力，保持分裂增殖，不发生衰老和凋亡，是一种永生化的细胞系。以下通过对永生化的猪胰腺干细胞系的构建、细胞形态特征、标志物的基因及免疫鉴定、诱导分化，以及移植糖尿病模型体内的血糖变化试验来做一详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
1、pCI-neo-hTERT真核表达载体
pCI-neo-hTERT可以通过载体连接构建或者商购，本发明具体用到的pCI-neo-hTERT载体是购自Addgene公司的。
2、永生化的猪胰腺干细胞系的构建
永生化的猪胰腺干细胞系的构建具体包括以下步骤：
1)猪胰腺干细胞的分离与培养
将无菌采集的胎猪胰腺置于预冷的PBS中冲洗，并除去周围的脂肪、筋膜，然后剪切为1mm3左右的组织块，加入CDH酶于37℃消化30min。期间不时振荡，终止消化后过200目筛网，500r/min离心3min，并清洗2次，用台盼兰染色计算细胞活力；
按每孔2×105个细胞接种于12孔板，加入培养液A置于37℃、5％CO2的培养箱中培养；所述的培养液A为：RPMI 1640培养基中添加其体积比20％的FBS(胎牛血清)，还包含1mmol/L的丙酮酸钠、10mmol/L的尼克酰胺、0.1mmol/L的β-巯基乙醇、2mmol/L的谷氨酰胺、20ng/mL的EGF、20ng/mL的bFGF、100IU/mL青霉素和100mg/mL的链霉素，RPMI1640培养液购买自Gibico。
2)脂质体转染法进行pCI-neo-hTERT真核表达载的转染：
待细胞融合度达到80～90％后，进行表达载体的转染；转染前一天，用0.25％胰蛋白酶消化猪胰腺干细胞，以合适的密度(约5×105个细胞/孔)接种到6孔培养板上；将待转染的细胞用RPMI 1640培养基冲洗细胞两遍后，加入500μl的RPMI 1640培养基饥饿1h。
与此同时，将溶液A与溶液B混合，室温下孵育20min；其中，溶液A：480μl RPMI 1640培养基+20μl脂质体(Lipofectamine 2000)，总体积500μl，室温孵育5min；溶液B：492μl RPMI 1640培养基+8μg pCI-neo-hTERT质粒，总体积500μl，室温孵育5min；
将溶液A与溶液B的混合液逐滴加入培养板的孔中，摇动培养板，轻轻混匀，然后在37℃、5％的CO2中保温5～6h；同时设立未转染空白对照。保温完成后，更换为培养液A，在37℃、5％的CO2培养箱中继续培养。
3)转染48h后，在培养基A中添加G418使其浓度为400μg/mL进行筛选；筛选5天后细胞大量死亡。两周后，存活的细胞开始呈克隆状生长，说明在此状态下，已有G418抗性细胞开始生长；筛选一个月后，将G418的浓度维持在200μg/mL继续筛选，待细胞单层铺满整个培养皿后传代培养；得到稳定转染pCI-neo-hTERT的猪胰腺干细胞。
4)传代的稳定转染pCI-neo-hTERT的猪胰腺干细胞，于培养液B中在37℃、5％CO2条件下培养，细胞呈梭形单层贴壁生长，细胞间存在接触抑制行为，培养超过50代后得到永生化的胰腺干细胞系；所述的培养液B为：
低糖DMEM培养基中添加其体积比15％的FBS，还包含0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、2mmol/L谷氨酰胺、100IU/mL青霉素和100mg/mL的链霉素。
3、永生化的胎猪胰腺干细胞系的鉴定
3.1细胞形态学特征
将永生化的猪胰腺干细胞在相差显微镜下观察形态变化，并与未转染的胎猪胰腺干细胞进行比较。具体结果如图1所示，其中，图A为原代分离的猪胰腺干细胞(PSC)，图B为未转染组的PSC，图C，D为转染pCI-neo-hTERT后的猪胰腺干细胞(iPSC)，与未转染的细胞猪胰腺干细胞相比，细胞形态相似，为成纤维样，大多数细胞呈多角形和短梭状，呈网络状排列，细胞间存在接触抑制，图E为对转染后的PSC进行吉姆萨染色，细胞核比较明显，有2个或2个以上的核仁，能够看到明显的细胞分裂相(箭头标志)。
3.2RT-PCR检测永生化的胎猪胰腺干细胞系中目标基因hTERT(人端粒酶逆转录酶)的表达
根据GenBank中已发表的人的端粒酶反转录酶基因参考序列(登录号为NM-198253)，设计并人工合成一对特异性检测引物P，该对引物能够扩增大小为264bp的片段；引物P为：
上游引物：gtgtgctgcagctcccatttc 21；
下游引物：gctgcgtctgggctgtcc 18；
细胞总RNA的提取：分别取胰蛋白酶消化传代后(传代第35代、传代第75代)pCI-neo-hTERT转染的猪胰腺干细胞，PBS洗涤2～3次；然后加入1mL Trizol混匀，室温下静置5min进行细胞裂解，将裂解物转移到离心管，并向离心管中加入0.2mL氯仿，震荡，室温下静置15min，4℃，10000r/min离心15min；离心后取上层部分移入另一支离心管，加入0.2mL异丙醇，上下颠倒，轻轻混匀，室温下静置30min，4℃，10000r/min离心15min；弃上清，加入1mL 75％乙醇振荡，7500r/min离心5min；将沉淀自然干燥(室温下放置10min左右)，用30μL DEPC水重悬RNA。
PCR扩增进行第一链cDNA的合成：
PCR扩增体系为：5×PrimeScript Buffer 2μL，500ng的总RNA，逆转录酶(PrimeScript RT Enzyme Mix)0.5μL，Random 6mers 2μL，Oliqo(dT)Primer0.5μL，RNase Free H2O补齐至10μL；混匀，37℃孵育30min，然后85℃延伸5s，得到第一链cDNA。
PCR扩增双链cDNA，反应体系如下：双纯水9.1μl，10×PCR Buffer 1.5μl，MgCl21.5μl，上、下游引物各0.3μL，Taq酶0.1μl，dNTP Mixture 1.2μl，第一链cDNA 1.0μl，总体积为15.0μl。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54-58℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃再延伸10min，4℃保存。
取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所示，作为参考对照的β-actin在未转染、转染后传代第35代、转染后传代第75代均有明显的表达；未转染组不表达hTERT，而外源性的目的基因hTERT在转染后传代第35代细胞仍高表达，转染后传代第75代细胞依然有hTERT的表达。
3.3胰腺干细胞相关标记的鉴定
3.3.1免疫组化或免疫荧光检测
将永生化的胎猪胰腺干细胞用4％多聚甲醛固定后，免疫染色进行胰腺干细胞特征性标志和胚胎干细胞标志的鉴定，同时以PBS为阴性对照进行染色。
免疫组化染色方法均按照HistostainTM-Plus Kits染色试剂盒说明书进行。免疫荧光染色方法为：
a.将细胞用4％多聚甲醛固定10min，用PBS洗涤3次；
b.加入0.1％TritionX-100室温作用10min，PBS洗3次，每次作用5min；
c.加入1％BSA的封闭液作用30min；
d.加入一抗，4℃过夜；
e.PBS洗3次，每次作用5min，加入荧光二抗；
f.PBS洗3次，荧光显微镜下观察。
胰腺干细胞特征性标志PDX1、波形蛋白(Vim)、PC1/3、葡萄糖转录因子(Glut2)、hTERT的免疫荧光染色结果分别如图3所示，其中，左边第一列分别为PDX1、Vim、PC1/3、Glut2和hTERT的特异性荧光染色，中间第二列分别为PDX1、Vim、PC1/3、Glut2和hTERT染色细胞的细胞核DAP1显色，右边第三列分别为PDX1、Vim、PC1/3、Glut2和hTERT的特异性荧光染色与其对应的DAPI核显色的两个图像的合成图，结果表明我们得到的永生化的胎猪胰腺干细胞表达PDX1、波形蛋白(Vim)、PC1/3、葡萄糖转录因子(Glut2)、hTERT等。
胚胎干细胞标志Oct-4、Nanog、Sox2、c-Myc、Klf4，增殖细胞标志PCNA免疫组化染色分别如图4所示，结果显示均为阳性，这表明细胞具有多能性，具有向其他胚层细胞分化的潜能。
3.3.2PCR检测胰腺干细胞、诱导后的胰岛细胞团和胚胎干细胞标记基因的表达
以PCR扩增的第一链cDNA为模板，各个标志物相对应的引物(如表1所示)进行PCR扩增(反应条件如3.2和表1)，然后对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
表1胰腺干细胞和胚胎干细胞相关标志物及其相应的PCR扩增引物
| 标志物 | 上游引物 | 下游引物 | 扩增片段 | Tm温 |
| Vim | 5′-gtccaagtttgccgacctct-3′ | 5′-agcgcatccacttcacagg-3′ | 123bp | 58℃ |
| Ngn3 | 5′-gcgagttggcactgagca-3′ | 5′-aagctgtggtccgctatgc-3′ | 220bp | 58℃ |
| Mafa | 5′-ttcagcaaggaggaggtcat-3′ | 5′-acaggtcccgctctttgg-3′ | 190bp | 58℃ |
| NeuroD1 | 5′-agctcccatgtcttccacgta-3′ | 5′-gaagttgccgttgatgctga-3′ | 144bp | 58℃ |
| PC1/3 | 5′-aacaggggagacaaggaaagg-3′ | 5′-cgaggcactgctgatggag-3′ | 128bp | 58℃ |
| Glut2 | 5′-ttgccttggatgagttatgtga-3′ | 5′-gcgtggtccttgactgaaaa-3′ | 120bp | 58℃ |
| Pdx1 | 5′-gagcccgaggagaacaagc-3′ | 5′-tgacagccagctccaccc-3′ | 121bp | 58℃ |
| Insulin | 5′-aagcgtggcatcgtggag-3′ | 5′-tcaggactttattgggttttgg-3′ | 128bp | 58℃ |
| Oct4 | 5′-gaagctggacaaggagaagct-3′ | 5′-catgctctccaggttgcctc-3′ | 247bp | 58℃ |
| Sox2 | 5′-ccagcgcatggacagtta-3′ | 5′-tggagtgggaggaagaggta-3′ | 323bp | 54℃ |
| Nanog | 5′-gcgaatcttcaccaatg-3′ | 5′-tttctgccacctcttac-3′ | 407bp | 54℃ |
| c-Myc | 5′-ctggtgggcgagatcatca-3′ | 5′-cactgccatgaatgatgttcc3′ | 304bp | 54℃ |
| Klf4 | 5′-cactgtctcatcaggagtca-3′ | 5′-cgacggtgcacgaggagaca-3′ | 525bp | 55℃ |
| c-Kit | 5′-accgcactgccactgat-3′ | 5′-taagccctgcactccac-3′ | 427bp | 54℃ |
| PCNA | 5′-agtggagaacttggaaatggaa-3′ | 5′-gagacagtggagtggcttttgt-3′ | 154bp | 58℃ |
胰腺干细胞相关标记基因的表达情况如图5所示，从上到下依次为Vim、Ngn3、Mafa、NeuroD1、PC1/3、Glut2和PDX1，各个标志物基因均被表达，说明其具有胰腺干细胞的特征。而在诱导后，Vim的表达减弱；而Ngn3，Mafa，PC1/3，NeuroD1，Glut2，Insulin的表达增强；PDX1一直表达，说明胰腺干细胞已向胰岛细胞分化。
胚胎干细胞相关标记基因的表达情况如图6所示，其中，M为：DL2000Maker，泳道1～7依次分别为Oct4、Sox2、Nanog、c-Myc、Klf4、c-Kit、PCNA标志物基因，各个标志物基因均被表达，泳道8为转染的目标基因hTERT。
4、生长曲线的测定
取传代的永生化的猪胰腺干细胞(第35代和75代细胞)，以1×104个/孔的细胞密度接种24孔培养板上，每天取3孔，胰蛋白酶消化悬浮细胞，基础培养液中和，细胞计数，取平均值记作当天细胞数，连续计数7天。以细胞数(104)为纵坐标，培养天数(d)为横坐标，绘制生长曲线，结果如图7所示。比较转染hTERT传代后的第35代和75代细胞生长曲线，其中1～3天为潜伏期，4～7天一直为对数增长期，且对数增长期明显超过未转染的第24代猪胰腺干细胞细胞，说明永生化的猪胰腺干细胞具有很强的增殖能力。
5、永生化的猪胰腺干细胞系的功能学特征
胰腺干细胞存在于胰腺组织，能自我更新，具有多向分化潜能的发育早期细胞。体外分离、克隆胰腺干细胞，并定向诱导其分化为功能性胰岛移植治疗糖尿病，是解决胰岛供体短缺的有效途径。
本发明将永生化的胎猪胰腺干细胞系进行诱导，使其定向分化成为胰岛样细胞团，以用来治疗小鼠糖尿病模型，通过相关分子和免疫荧光检测、高糖刺激胰岛素释放试验及移植小鼠糖尿病模型检测其血糖水平。
5.1胰岛样细胞团的诱导分化
1)将永生化的猪胰腺干细胞系转移到含有质量分数1％的BSA、100mmol/L的烟碱、10ng/mL的exendin-4、1mmol/L的丁酸钠、2mmol/L的谷氨酰胺、1mmol/L的β-巯基乙醇、20ng/mL的EGF、20ng/mL的bFGF和10ng/mL的Activin A的RPMI1640/B27培养液上，在37℃、5％CO2的条件下培养进行初步分化诱导1周；
2)将初步分化诱导后的细胞转移到含有质量分数1％的BSA、100mmol/L的烟碱、10ng/mL的exendin-4、1mmol/L的丁酸钠、2mmol/L的谷氨酰胺、1mmol/L的β-巯基乙醇、10ng/mL的β-细胞素和10ng/mL的Activin A的RPMI 1640/B27培养液上，在37℃、5％CO2的条件下悬浮培养1周，诱导分化得到胰岛样细胞团。
5.2胰岛样细胞团的鉴定
将胰岛样细胞团接种于贴壁的48孔板内或6孔板内。48孔板用于免疫荧光检测，6孔板用于做高糖刺激后的胰岛素检测。
48孔板培养24h后的免疫荧光染色检测的结果，如图8所示，其中，左边第一列分别为PDX1、C-肽、Insulin、Nestin特异性荧光染色，中间第二列分别为PDX1、C-肽、Insulin、Nestin特异性荧光染色细胞的DAP1核染色，右边第三列分别为PDX1、C-肽、Insulin、Nestin特异性荧光染色与其对应的DAP1核染色的两个图像的合成结果，结果表明：我们得到的永生化细胞表达PDX1、C-肽、胰岛素，Nestin弱阳性。
分别以5.6和25mmol/L的葡萄糖刺激胰岛素释放液刺激诱导胰岛样细胞团释放胰岛素。6孔板培养24h后吸出诱导培养液，PBS(-)冲洗3遍后，加入0.4mL/孔无血清、含5.6mmol/L(低糖)和25mmol/L(高糖)葡萄糖浓度的刺激液刺激胰岛素释放。3.5小时后收集刺激后培养液，-20℃冷冻储存待测。放射免疫测定法测定刺激液中胰岛素与C-肽含量，结果如见表2所示。可以看出胰岛样细胞在受到葡萄糖刺激液的刺激后，在体外能够释放胰岛素和C-肽。
表2葡萄糖刺激胰岛样细胞团的释放试验
a：与对照组相比，刺激组胰岛素和C-肽的释放量差异极显著(P＜0.01)
c：与低糖刺激组相比，高糖刺激组胰岛素和C-肽的释放量差异极显著(P＜0.01)
5.3被诱导分化的胰岛样细胞团移植小鼠糖尿病模型后的血糖体内检测
用链尿佐菌素(STZ)处理小鼠制备小鼠糖尿病模型，使小鼠血糖达27mmol/L以上时，说明小鼠糖尿病模型制备成功。以正常的小鼠作为对照，将模型分为移植培养液组、未诱导的细胞组和诱导的胰岛样细胞团组，腹腔注射移植后正常饲喂小鼠，移植后每3天检测小鼠体内的血糖浓度，根据检测结果绘制的血糖浓度变化曲线如图9所示，其中，横坐标为移植后的时间(天数，d)，纵坐标为小鼠的血糖浓度(mmol/L)。由图9所示的血糖浓度变化曲线可以看出，在移植诱导的胰岛样细胞团后小鼠的血糖浓度即开始下降，诱导的胰岛样细胞团移植后7天血糖浓度即可达到正常小鼠的水平，在此后的2周内能够维持正常的血糖浓度，随后血糖的浓度又开始上升，到第22天后血糖浓度与移植培养液的模型小鼠血糖浓度相当。移植未诱导细胞组小鼠血糖有所下降，但明显较诱导细胞移植组要高，未移植细胞组血糖一直维持糖尿病状态，这表明诱导的胰岛样细胞团具有确切的生理功能，能够在体内降低糖尿病模型血糖的浓度。
<110>西北农林科技大学
<120>一种永生化的猪胰腺干细胞系及其构建与分化方法
<160>2
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>hTERT基因PCR扩增上游引物
<400>1
gtgtgctgca gctcccattt c 21
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>hTERT基因PCR扩增下游引物
<400>2
gctgcgtctg ggctgtcc 18
Claims (6)
1.一种永生化的猪胰腺干细胞系，其特征在于，是以猪胰腺干细胞作为宿主细胞，转染pCI-neo-hTERT真核表达载体，经过G418筛选得到的表达人端粒酶逆转录酶且具有多向分化潜能的转化体。
2.如权利要求1所述的永生化的猪胰腺干细胞系，其特征在于，其细胞为成纤维样，呈多角形和短梭状，有两个或两个以上的核仁，细胞间存在接触抑制。
3.如权利要求1所述的永生化的猪胰腺干细胞系，其特征在于，永生化的猪胰腺干细胞系在传代培养75代以后人端粒酶逆转录酶还能够被表达。
4.一种永生化的猪胰腺干细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将猪胰腺干细胞接种于培养液A，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养；待细胞生长至融合度达到80～90％后进行细胞转染，转染前一天，用胰蛋白酶消化猪胰腺干细胞接种到培养板上，然后用RPMI 1640培养基冲洗，再加入的RPMI1640培养基饥饿1h；
所述的培养液A为：RPMI 1640培养基中添加其体积比20％的FBS，还包含1mmol/L的丙酮酸钠、10mmol/L的尼克酰胺、0.1mmol/L的β-巯基乙醇、2mmol/L的谷氨酰胺、20ng/mL的EGF、20ng/mL的bFGF、100IU/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素；
2)将溶液A与溶液B混合，室温下孵育20min，然后将溶液A与溶液B的混合液逐滴加入RPMI 1640培养基饥饿的猪胰腺干细胞，混匀，在37℃、5％的CO2中保温5～6h；保温完成后，更换为培养液A继续培养；
所述的溶液A为：480μl RPMI1640培养基+20μl脂质体混合，室温孵育5min；
所述的溶液B为：492μl RPMI 1640培养基+8μg pCI-neo-hTERT质粒混合，室温孵育5min；
3)转染48h后，在培养基A中添加G418并维持其浓度为400μg/mL进行筛选；筛选两周后，转染后存活的细胞开始呈克隆状生长，筛选一个月后，将G418的浓度维持在200μg/mL继续进行筛选，待细胞单层铺满整个培养皿后传代培养；得到稳定转染pCI-neo-hTERT的猪胰腺干细胞；
4)将稳定转染pCI-neo-hTERT的猪胰腺干细胞转移到培养液B中，在37℃、5％CO2条件下培养，培养超过50代后得到永生化的胰腺干细胞系；
所述的培养液B为：低糖DMEM培养基中添加其体积比15％的FBS，还包含0.1mmol/L的β-巯基乙醇、2mmol/L的谷氨酰胺、100IU/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素。
5.一种永生化的猪胰腺干细胞系诱导分化成胰岛样细胞团的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将永生化的猪胰腺干细胞系转移到含有质量分数1％的BSA、100mmol/L的烟碱、10ng/mL的exendin-4、1mmol/L的丁酸钠、2mmol/L的谷氨酰胺、1mmol/L的β-巯基乙醇、20ng/mL的EGF、20ng/mL的bFGF和10ng/mL的Activin A的RPMI 1640/B27培养液上，在37℃、5％CO2的条件下培养进行初步分化诱导1周；
2)将初步分化诱导后的细胞转移到含有质量分数1％的BSA、100mmol/L的烟碱、10ng/mL的exendin-4、1mmol/L的丁酸钠、2mmol/L的谷氨酰胺、1mmol/L的β-巯基乙醇、10ng/mL的β-细胞素和10ng/mL的Activin A的RPMI 1640/B27培养液上，在37℃、5％CO2的条件下悬浮培养1周，诱导分化得到胰岛样细胞团。
6.如权利要求5所述的永生化的猪胰腺干细胞系诱导分化成胰岛细胞团的方法，其特征在于，所述的胰岛样细胞团表现为DTZ阳性、PDX1阳性、C-肽阳性、胰岛素阳性以及Nestin弱阳性。
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