CN102533681A

CN102533681A - 一种山羊口疮病毒毒力弱化方法

Info

Publication number: CN102533681A
Application number: CN2011104528357A
Authority: CN
Inventors: 陈德坤; 尚川川; 田婷婷; 罗军
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2011-12-30
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明涉及一种山羊传染性脓疱病毒毒力弱化方法，其利用犊牛睾丸细胞系，通过羊口疮病毒的连续传代培养，致使羊口疮病毒毒力致弱，为羊口疮病毒弱毒疫苗的制备与生产提供了稳定可靠的方法，用以获得大量的稳定的疫苗。本发明包括以下步骤：1）羊口疮病毒的分离与初步培养；2）羊口疮病毒在犊牛睾丸细胞系连续传代培养直到毒力弱化。步骤1）中，羊口疮病毒的初步培养采用犊牛睾丸细胞系培养，犊牛睾丸细胞系的培养液为M199、DMEM（高糖）、RPMI-1640培养基。步骤1）中，羊传染性脓疱病毒分离于患病山羊的口唇部结痂。步骤2）中，犊牛睾丸细胞系是通过导入端粒酶逆转录基因（hTERT）方法制备的。

Description

一种山羊口疮病毒毒力弱化方法

一、技术领域：

本发明涉及一种山羊口疮病毒毒力弱化方法，具体涉及利用犊牛睾丸细胞系将山羊口疮病毒连续传代培养使其毒力弱化的方法。

二、背景技术：

羊传染性脓疱俗称羊口疮 (Orf virus)，是绵羊和山羊的一种由口疮病毒所致的人兽共患传染病，世界动物卫生组织 (OIE) 将该病列为需申报类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。本病几乎分布于世界所有养羊国家，自然情况下主要侵害绵羊和山羊，山羊较为多发。本病常呈群发性流行，3~6月龄羔羊最易感染，成年羊发病较少，病羊和带毒羊是本病的传染源。病毒可随病羊的唾液、脓疱和水疱分泌物以及脱落的痂皮排出，其传播途径主要是经损伤的皮肤或黏膜而感染。健康羊与病羊直接接触，或接触被病羊污染的饲槽、饲料、饮水、用具、垫草、牧场及厩舍等而感染。

目前，在羊口疮的高发区，并没有商品化的羊口疮疫苗进行生产和销售。在上世纪80年代，兰州畜牧兽医研究所曾经选育出毒力弱化的羊口疮病毒毒株，达到了很好的保护率。但是随着羊口疮的流行，大量的地方株被鉴定，羊口疮病毒出现了诸多的血清型，原来的弱毒株并不能为所有的山羊提供有效的保护。而且以前的弱毒株的弱化是利用的羊口疮野毒株在原代犊牛睾丸细胞进行连续培养，获得细胞培养物，加入适当的保护剂后加工而成的，这样就需要大量的犊牛睾丸进行分离培养，耗费时间和财力。同时，在利用犊牛睾丸细胞进行传代时，由于犊牛的睾丸来源不稳定，容易造成批次间的差异性。同时犊牛来源的检疫不完善会造成疫苗生产的污染。

三、发明内容：

本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种山羊口疮病毒毒力弱化方法，其利用犊牛睾丸细胞系，通过羊口疮病毒的连续传代培养，致使羊口疮病毒毒力致弱，为羊口疮病毒弱毒疫苗的制备与生产提供了稳定可靠的方法，用以获得大量的稳定的疫苗。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种山羊传染性脓疱病毒毒力弱化方法，其特征在于包括以下步骤：1）羊口疮病毒的分离与初步培养；2）羊口疮病毒在犊牛睾丸细胞系连续传代培养直到毒力弱化。

步骤1）中，羊口疮病毒的初步培养采用犊牛睾丸细胞系培养，犊牛睾丸细胞系的培养液为M199、DMEM（高糖）、RPMI-1640培养基。（此三类培养基皆可以用于犊牛睾丸细胞系的培养。完全培养基含10%的犊牛血清，犊牛睾丸细胞系在37℃，5%CO₂培养2～3天可以用于接种病毒）

步骤1）中，羊口疮病毒分离于患病山羊的口唇部结痂。

步骤2）中，犊牛睾丸细胞系是通过导入端粒酶逆转录基因（hTERT）方法制备的。

步骤2）中，羊口疮病毒连续传代到85代以后直到毒力弱化。

现有的羊口疮病毒毒力弱化，需要以新生犊牛睾丸为原料，采用常规的原代细胞制备方法制备出睾丸原代细胞，用以增殖羊口疮病毒，经80余代次才能达到毒力弱化目的。然而，原代细胞有制备程序复杂、批次间细胞质量数量差异等缺点。

本发明具有的优点和效果如下：不需要采集制备睾丸原代细胞，直接用本种子细胞系，进行羊口疮病毒传代弱化毒力。传代细胞生物学性能稳定，批次间细胞质量稳定，批次之间差异很小。细胞系用于弱化病毒更适于实验室操作相对于制备原代睾丸细胞，其技术操作程序简单、省时，价格便宜。

四、附图表说明：

图1为未接种羊口疮病毒细胞系细胞图；

图2为接种48h后病变，细胞变圆，脱落图；

图3为接种96h后大量细胞变圆，出现空斑图。

五、具体实施方式：

本发明为一种山羊传染性脓疱病毒毒力弱化方法，包括以下步骤：1）羊口疮病毒的分离与初步培养；2）羊口疮病毒在犊牛睾丸细胞系连续传代培养直到毒力弱化。羊口疮病毒的初步培养采用犊牛睾丸细胞系培养，犊牛睾丸细胞系的培养液为M199、DMEM（高糖）、RPMI-1640培养基。（此三类培养基皆可以用于犊牛睾丸细胞系的培养。完全培养基含10%的犊牛血清，犊牛睾丸细胞系在37℃，5%CO₂培养2～3天可以用于接种病毒。羊口疮病毒分离于患病山羊的口唇部结痂。犊牛睾丸细胞系是通过导入端粒酶逆转录基因（hTERT）方法制备的。

羊口疮病毒连续传代到85代以后直到毒力弱化。

以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的使用范围（参见图1-3）。

1、山羊口疮病毒的分离与初步培养

采集患病奶山羊的口唇结痂，加入8～10ml的无菌PBS缓冲液进行浸泡，同时加入3～5倍正常用量的青链霉素。24～36h后研磨，把悬浊液置于4℃过夜。第二天取出悬浊液4000rpm，离心10min，取上清液0.22??m滤膜过滤除菌，300??L～500??L接种犊牛睾丸细胞系，连续盲传5代后，再接种犊牛睾丸细胞系后的48h、96h可观察到细胞病变。

2、羊口疮病毒在犊牛睾丸细胞系连续传代培养直到毒力弱化

当细胞病变达到80%~90%后或细胞变圆，-20℃冰冻细胞培养液24h以上，反复冻融3次，然后无菌收集细胞培养物。同时以此代病毒接种细胞系，进行病毒传代，病毒传代到第85代，细胞产生病变变慢（7～10天）。利用此羊口疮病毒对山羊进行口唇划痕接种，观察产生病变情况，此病毒的接种组产生了明显轻于强毒株的病变，并且口唇部病变的持续时间短于强毒株（参见表1）表1为羊口疮病毒毒力弱化效果测定，即此细胞系可以用于羊口疮病毒弱毒制备。

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Claims

1.一种山羊传染性脓疱病毒毒力弱化方法，其特征在于包括以下步骤：1）羊口疮病毒的分离与初步培养；2）羊口疮病毒在犊牛睾丸细胞系连续传代培养直到毒力弱化。

2.根据权利要求1所述的一种山羊传染性脓疱病毒毒力弱化方法，其特征在于：步骤1）中，羊口疮病毒的初步培养采用犊牛睾丸细胞系培养，犊牛睾丸细胞系的培养液为M199、DMEM 高糖、RPMI-1640培养基；完全培养基含10%的犊牛血清，犊牛睾丸细胞系在37℃，5% CO₂培养5-7天可以用于接种病毒。

3.根据权利要求1所述的一种山羊传染性脓疱病毒毒力弱化方法，其特征在于：步骤1）中，羊传染性脓疱病毒分离于患病山羊的口唇部结痂。

4.根据权利要求1所述的一种山羊传染性脓疱病毒毒力弱化方法，其特征在于：步骤2）中，犊牛睾丸细胞系是通过导入端粒酶逆转录基因（hTERT）方法制备的。

5.根据权利要求1所述的一种山羊传染性脓疱病毒毒力弱化方法，其特征在于：步骤2）中，羊口疮病毒连续传代到85代以后直到毒力弱化。