CN111500542A - 一种牛睾丸支持细胞癌细胞及其在痘病毒分离、培养中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种牛睾丸支持细胞癌细胞及其在痘病毒分离、培养中的应用。所述的牛睾丸支持细胞癌细胞，命名为牛睾丸支持细胞癌细胞BTSCC，其保藏编号为CCTCC NO：C201931。进一步的，本发明还提出了所述的牛睾丸支持细胞癌细胞在分离、培养ORFV和GTPV等痘病毒中的应用。该细胞对ORFV和GTPV细胞毒较为敏感，可以高效增殖ORFV和GTPV病毒，且可以保证病毒的均一、稳定。用该细胞所增殖的病毒滴度与新生牛睾丸支持细胞(NBSC)相当，且生长速度很快，分种率很高，可以用低血清培养条件下生长。利用该细胞分离、培养ORFV和GTPV病毒可提高试验效率，降低试验成本，同时保证了用其制备的疫苗质量的稳定。本发明的提出对痘病毒的培养及其疫苗的规模化生产提供了新的技术手段。

Description

一种牛睾丸支持细胞癌细胞及其在痘病毒分离、培养中的 应用
技术领域
本发明涉及一种癌细胞及其分离方法和应用，特别涉及一种新生牛睾丸支持细胞癌细胞的分离和其培养方法、及其在增殖培养羊传染性脓疱病毒及羊痘病毒等痘病毒中的应用。本发明属于细胞工程技术领域。
背景技术
睾丸支持细胞(Sertoli cell,SC)是生精小管基膜上的上皮细胞，是生精小管内唯一的体细胞。在结构上为生精细胞的分化成熟提供支架，为生精细胞提供支持、营养和保护作用，被称为生精细胞的“保姆细胞”。在精子的分化成熟过程中，支持细胞不但向生精上皮传递促性腺激素，控制生精细胞的有丝分裂、减数分裂及后续分化一系列动态过程，而且对精细胞具有支持、营养、吞噬、释放、分泌等多种功能。其分泌的雄激素结合蛋白(androgen binding protein,ABP)、苗勒氏管抑制物质(mullerian inhibitingsubstance,MIS)、抑制素(inhibin)、激活素(activin)、转化生长因子β(TGFβ)、胰岛素样生长因子1(IGF1)、白介素1和6(IL1，IL6)、生精生长因子(spermatogenic growth factor,SGF)、神经营养素3(neurotrophin3,NT3)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)等，参与生精细胞的分化成熟并协调和保证精子的发生正常有序进行。
睾丸支持细胞强大的分泌功能和免疫豁免功能，已成为细胞联合培养、组织工程及器官移植领域的研究热点之一，在临床移植领域中也具有良好的应用前景。研究发现将大鼠胰岛细胞和大鼠睾丸支持细胞联合微囊化后培养11d，胰岛细胞和支持细胞联合微囊化组的胰岛功能明显好于胰岛细胞和支持细胞分别微囊化的共同培养组及胰岛单独微囊组。将这种联合培养的微囊胰岛置入门静脉可能是未来临床治愈糖尿病的重要途径。另外,发现支持细胞在体外对胰岛B细胞的增殖有显著的促进作用,同时可以使胰岛细胞由成熟状态逆转为幼稚状态,并使胰岛素的分泌水平显著高于对照组。近年有学者将睾丸支持细胞与干细胞体外共培养，结果发现睾丸支持细胞对体外培养的干细胞有促进干细胞的生长的作用。
羊传染性脓疱病(Contagious ecthyma,CE)又名羊传染性脓疱性皮炎(Contagious pustular dermatitis)，俗称“羊口疮(Orf)”，是由副痘病毒成员羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)感染引起的山羊、绵羊和人的一种急性、接触性和嗜上皮性的人兽共患传染病，以在患羊的口唇、蹄、乳房、外阴等处皮肤和黏膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和疣状厚痂为特征。世界动物卫生组织将该病列为需申报类动物疾病，我国将其列为三类动物疫病。
该病最早发现于欧洲，目前，几乎所有养羊国家和地区均存在。现有流行病学调查研究资料显示，成年羊群中即使采用抗病毒药物以及抗生素治疗，发病率仍为60％，死亡率为24.7％，羔羊的死亡率高达93％。因此，该病一旦发生，将给养羊户造成重大的经济损失，严重危害肉羊产业的健康发展，更为严重的是此病可以通过伤口感染饲养人员，表现为感染者手背、指间和前臂部出现疱疹和破溃。例如2005年8月中国福建省永安市有8名羊场养殖工人因感染羊传染性脓疱病毒而发病,2013年6月云南省玉溪市江川县动物疾病预防与控制中心一名工作人员在给发病羊采样和拍照时不慎被羊咬伤手指而感染该病。因此，羊传染性脓疱不但严重危害肉羊产业的健康发展，而且威胁人类的身体健康，是一种危害较为严重的人畜共患传染病。
对于病毒性传染病快速、有效的分离病原是诊断和疫病防控工作的关键。可以持续增殖该病毒的细胞是病毒诊断和后续研究最重要的工具之一。ORFV可在牛、羊的皮肤细胞、肾细胞以及犊牛和羔羊的睾丸细胞上生长，并产生细胞病变，但是病毒滴度低,据最近研究表明利用胎羊鼻甲骨粘膜上皮细胞(OFTu)分离羊传染性脓疱病毒具有细胞培养方便、分离病毒效率高、病毒增殖效价高等优点，但存在获取该细胞比较复杂(需要羊胚胎),在疫苗生产中需要大量的动物提供组织等问题。
在中国，虽然青海省畜牧兽医科学院兽医研究所和甘肃省畜牧兽医研究所已研制出羊传染性脓疱弱毒疫苗，但其制备工艺复杂、落后，繁殖羊传染性脓疱弱毒抗原必须用新生牛睾丸原代细胞。而制备这种细胞程序复杂，生产成本高，生产效率较低下，这给疫苗厂规模化生产羊传染性脓疱弱毒疫苗带来不便，企业也难以获得丰厚的利润。同时，每次繁殖羊口疮抗原所用的新生牛睾丸品种不一，这就很难保证生产的弱毒疫苗的质量稳定性，此外，新生牛睾丸还有携带其他病原的潜在危险。另外，目前兽用疫苗已向抗原高效浓缩，纯化，最大程度降低动物免疫副反应方向发展(人医疫苗生产标准)，因此，利用癌细胞来生产疫苗抗原，成为可能。能够高效增殖羊传染性脓疱病毒等痘病毒的癌化细胞系，对实验室分离病毒和疫苗研发具有非常重要的现实意义。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种用于高效分离、培养羊传染性脓疱病毒、羊痘病毒等痘病毒的牛睾丸支持细胞癌细胞，该细胞系是通过对新生牛睾丸支持细胞进行分离和纯化后，通过细胞单克隆筛选获得。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明中所述的牛睾丸支持细胞癌细胞，命名为牛睾丸支持细胞癌细胞BTSCC(Bovine testicular supporting cell carcinoma BTSCC)，分类命名为牛睾丸支持细胞癌细胞BTSCC(Bovine testicular supporting cell carcinoma BTSCC)，该细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：C201931，保藏时间为2019年3月1日。
本发明的一种牛睾丸支持细胞癌细胞BTSCC是通过以下步骤制备得到的：
本发明从培养的一批次牛睾丸原代细胞中分离、纯化得到可有限传代20代的牛睾丸支持细胞有限传代细胞系(NBSC)，采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入建立的有限传代细胞系NBSC，对NBSC有限传代细胞系进行永生化改造。经梯度浓度G418进行筛选，得到抗G418阳性克隆：hTERT-NBSC。从筛选的hTERT-NBSC细胞种提取RNA,利用RT-PCR方法检测转染细胞中外源性hTERT的表达，获得抗G418且外源性hTERT阳性克隆：hTERT-NBSC。并将该细胞进行传代至10代后，用有限稀释法获得hTERT-NBSC单克隆细胞株16株。通过裸鼠致瘤试验发现：hTERT-NBSC 2#永生化单克隆细胞株和Hela细胞接种裸鼠后于第7天皮下形成结节，触摸有波动感，结节逐渐增大，向深部浸润，裸鼠情况较差；至第30天时，接种hTERT-NBSC 2#永生化单克隆细胞株的裸鼠，接种部位肿块大小约20mm(图1)；接种Hela细胞的裸鼠，接种部位肿块大小约10mm。病理学检查发现接种hTERT-NBSC 2#和接种Hela细胞的裸鼠在皮下形成肿瘤。组织切片检查发现，细胞排列紊乱，极性消失，可见大量核分裂相(图2)。由此证明hTERT-NBSC 2#为肿瘤细胞且为恶性肿瘤细胞即为癌细胞，命名为牛睾丸支持细胞癌细胞BTSCC(Bovine testicular supportingcell carcinoma BTSCC)。
将分离的hTERT-NBSC 2#癌细胞分别接种ORFV和GTPV细胞强毒，发现该细胞对ORFV和GTPV细胞强毒后都很敏感；该细胞增殖ORFV其TCID50均在6.0以上，增殖GTPV其TCID50均在4.0以上与牛睾丸支持细胞NBSC相当。
进一步的，本发明还提出了所述的牛睾丸支持细胞癌细胞在分离、培养痘病毒中的应用。
其中，优选的，所述的痘病毒包括羊传染性脓疱病毒及羊痘病毒。
其中，优选的，所述的牛睾丸支持细胞癌细胞能够在低血清培养条件下分离、培养痘病毒。
其中，优选的，所述的低血清培养条件是指在50ml/L FBS条件下。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明从永生化的hTERT-NBSC阳性细胞中筛选出一株肿瘤细胞，并证明其为恶性肿瘤细胞；证实健康幼龄牛或胎牛睾丸支持细胞中天然存在肿瘤细胞；证实羊口疮病毒可以在肿瘤化牛睾丸支持细胞高效增殖；另外，该细胞对ORFV和GTPV细胞毒较为敏感，可以高效增殖ORFV和GTPV病毒，且可以保证病毒的均一、稳定。用该细胞所增殖的病毒滴度与新生牛睾丸支持细胞NBSC相当；同时，生长速度很快(30h长满单层)，分钟率很高(可达到1:4～1:5)，且可以用低血清培养条件下生长。利用该细胞分离、培养ORFV和GTPV病毒可提高试验效率，降低试验成本。利用该细胞生产疫苗简化了生产工艺、缩短了生产周期，降低了生产成本，同时还保证了制备得到的羊传染性脓疱病和羊痘疫苗的质量稳定(制备抗原浓缩、纯化)。因此，本发明的提出对痘病毒的培养及其疫苗的规模化生产提供了新的技术手段。
附图说明
图1为pCI-neo-hTERT表达载体图谱及酶切鉴定；
图2为hTERT-NBSC阳性克隆细胞；
图3为hTERT-NBSC细胞阳性克隆hTERT基因RT-PCR检测；
其中，M:DL2000marker；1:hTERT-NBSC阳性克隆细胞第4代；2:hTERT-NBSC阳性克隆细胞第9代；
图4为hTERT-NBSC 2#单克隆克隆接种裸鼠肿瘤生长情况；
其中，A:hTERT-NBSC2#单克隆细胞接种后7天；B:hTERT-NBSC2#单克隆细胞接种后30天；C:hTERT-NBSC2#单克隆细胞接种后30天；
图5为Hela细胞接种裸鼠肿瘤生长情况；
其中，A:Hela细胞接种后7天；B:Hela细胞接种后30天；C:CEF细胞接种后30天
图6为hTERT-NBSC2#单克隆细胞和Hela细胞接种裸鼠肿瘤组织病理切片(HE染色400×)；
其中，A、B:hTERT-NBSC2#单克隆细胞接种裸鼠肿瘤组织病理切片；C、D:Hela细胞接种裸鼠肿瘤组织病理切片；
图7为hTERT-NBSC2#单克隆细胞接种裸鼠肿瘤肺转移裸鼠肿瘤组织病理切片(HE染色400×)；
其中，A、B:hTERT-NBSC2#单克隆细胞接种裸鼠后发生的肿瘤肺转移；C、D：健康裸鼠肺对照；
图8为hTERT-NBSC 3#,5#单克隆细胞株、NBSC细胞和CEF接种裸鼠，病理学切片(HE染色400×)；
其中，A、心脏；B、肝脏；C脾脏；D肺脏；E肾脏；F淋巴结；
图9为hTERT-NBSC 2#单克隆细胞核异型性分析；
其中，A:hTERT-NBSC2#细胞核大小、形状多形性；B:hTERT-NBSC2#巨核细胞；C:hTERT-NBSC2#双核细胞；D:hTERT-NBSC2#三核细胞；E:hTERT-NBSC2#三核细胞，奇异核；F:hTERT-NBSC2#奇异核，多极分裂相；
图10为BTSCC细胞血清依赖性试验。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[实施例1]新生牛睾丸支持细胞癌细胞(BTSCC)的发现与分离
1.1 pCI-neo-hTERT质粒转染NBSC细胞
从培养的牛睾丸原代细胞中分离、纯化得到可有限传代20代的牛睾丸支持细胞有限传代细胞系(NBSC)，采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入建立的有限传代细胞系NBSC中，对NBSC有限传代细胞系进行永生化改造，pCI-neo-hTERT表达载体图谱及酶切鉴定结果如图1所示。梯度浓度G418进行筛选，得到抗G418阳性克隆：hTERT-NBSC(图2)。从筛选的hTERT-NBSC细胞种提取RNA,利用RT-PCR方法检测转染细胞中外源性hTERT的表达。
检测结果如图3显示，在hTERT-NBSC两个不同代次的细胞中均能扩增出约为400bp的特异性片段，片段长度与预期一致。筛选出阳性细胞表达了hTERT基因，表明hTERT基因成功的转入NBSC细胞中，并得到有效表达(图3)。
1.2 hTERT-NBSC单克隆细胞筛选及生物学特性测定
通过有限稀释法将hTERT阳性的hTERT-NBSC(10代)细胞传至96孔板中，挑取其中只有单个细胞长成的克隆孔，再扩大培养到24孔板、6孔板。共获得16株单克隆的hTERT-NBSC细胞，依次命名为hTERT-NBSC1#～16#。将筛选的hTERT-NBSC单克隆细胞株分别接种6孔板，观察细胞分种率，细胞长满单层时间；接种ORFV细胞毒各单克隆细胞株产生CPE情况。我们发现hTERT-NBSC单克隆细胞株2#，分种率可达1:4～1:5；细胞长满单层(接种密度1×106个/mL)所需时间为30小时左右；接种ORFV细胞强毒75％产生CPE所需时间为65小时左右。其余各单克隆株分种率为1:3；长满单层时间48小时左右；接种ORFV细胞强毒75％产生CPE所需时间均为65小时左右(表1)。
表1 hTERT-NBSC单克隆细胞生长特性及病毒增殖情况
Figure BDA0002453935960000061
Figure BDA0002453935960000071
1.3 hTERT-NBSC 2#单克隆细胞裸鼠致瘤试验
将第60代hTERT-NBSC 2#，3#，5#永生化单克隆细胞株和第16代NBSC细胞；同时设Hela细胞阳性对照组，CEF(鸡胚成纤维细胞)阴性对照。各以活细胞和细胞破碎组，以细胞浓度106-107/0.2ml的细胞浓度，接种裸鼠，进行分组裸鼠致瘤试验。结果如表2所示：
表2 hTERT-NBSC 2#单克隆细胞裸鼠致瘤试验
Figure BDA0002453935960000072
Figure BDA0002453935960000081
由表2可见，hTERT-NBSC 2#永生化单克隆细胞株和Hela细胞接种裸鼠后于第7天皮下形成结节，触摸有波动感，结节逐渐增大，向深部浸润，裸鼠情况较差；至第30天时，接种hTERT-NBSC 2#永生化单克隆细胞株的裸鼠，接种部位肿块大小约20mm(图4)；接种Hela细胞的裸鼠，接种部位肿块大小约10mm(图5)。
hTERT-NBSC 3#，5#单克隆细胞株、第16代NBSC细胞和阴性对照CEF接种裸鼠，细胞组和破碎细胞组裸鼠，在观察期内裸鼠健康状况良好，接种部位(颈背部)无肿瘤形成(图5C)。接种后2月取材，组织学观察表明接种区组织结构与未接种部位无明显区别。
病理学检查发现接种hTERT-NBSC 2#和接种Hela细胞的裸鼠在皮下形成肿瘤。组织切片检查发现，细胞排列紊乱，极性消失，可见大量核分裂相(图6)。肿瘤发病裸鼠在接种后30天，肿瘤发生肺转移(图7A、B)。
hTERT-NBSC 3#、5#单克隆细胞株、第16代NBSC细胞和阴性对照CEF接种裸鼠，细胞组和破碎细胞组裸鼠，在观察期内裸鼠健康状况良好，在剖检和心、肝、脾、肺、肾、淋巴结病理切片中均为发现与肿瘤相关的特征性病理变化(图8)。
1.4 hTERT-NBSC 2#单克隆细胞株细胞核异型性分析
将培养12h的hTERT-NBSC 2#单克隆细胞株用100ng/ml终浓度的DAPI进行细胞核染色分析发现：hTERT-NBSC 2#单克隆细胞株细胞比正常细胞核增大，细胞核大小、形状不一。出现巨核、双核、三核、奇异核、核分裂像增多，特别是出现不对称性、多极性病理性核分裂(图9)。由此证明，hTERT-NBSC 2#单克隆细胞株为肿瘤细胞且为恶性肿瘤细胞即癌细胞，命名为睾丸支持细胞癌细胞BTSCC(Bovine testicular supporting cell carcinomaBTSCC)，该细胞系已于2019年3月1日送交武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO：201931。
[实施例2]新生牛睾丸支持细胞癌细胞BTSCC血清依赖性试验
用MTT法检测牛睾丸支持细胞癌细胞BTSCC细胞的血清依赖性，具体如下：
(1)第30代、40代、50代、60代的BTSCC和第12代BTSCC细胞或NBSC细胞按1×104个细胞/孔接种于96孔培养板。
(2)接种后24h，分别用50m L/L FBS、100m L/L FBS、200m L/L FBS的DMEM/F12培养液更换细胞液。每个梯度做3个重复孔，同时设3个空白孔。
(3)置37℃、条件分数比为5％CO2饱和湿度培养箱中孵育14h。
(4)加入10μL MTT(10mg/m L)反应液，37℃继续孵育2～4h，直至在显微镜下可见明显的针尖状的紫色结晶。
(5)加100μL DMSO至各孔中，包括空白孔，轻轻混匀。
(6)避光作用2～4h，在酶联免疫检测仪上测定光吸收值，测定波长为490nm。以空白孔调零，并绘制曲线图。
细胞血清依赖性检测发现，各代次BTSCC和NBSC细胞均不能在无血清培养基中生长，换液后第2d开始有细胞变圆、漂浮、死亡；BTSCC细胞在50ml/L FBS条件下促增殖能力较强而NBSC细胞的促增殖作用较弱，而100ml/L和200ml/L FBS则可显著促进两种细胞的增殖(p<0.05)，其中200ml/L FBS对hTERT-NBSC的促增殖作用较100ml/L浓度的更为明显，两者间差异显著(p<0.05)(图10)。这提示BTSCC和NBSC相比对血清依赖性差异较大。可以在低血清培养条件下培养。
[实施例3]BTSCC细胞的传代及其对ORFV和GTPV的增殖试验
将BTSCC细胞进行连续传代，记录每一代次细胞长满单层的时间，每传5代，接种同一代次的ORFV细胞强毒(lgTCID50≥6.0)和ORFV细胞强毒(lgTCID50≥4.0)，观察ORFV，GTPV对BTSCC细胞株的CPE，并测定其TCID50。
试验证实，BTSCC细胞在传代至65代时，细胞株仍保持旺盛的活力。且对ORFV和GTPV病毒保持很高的增殖能力，细胞产生CPE比较规律，ORFV病毒滴度(lgTCID50)均在6.20以上；GTPV病毒滴度(lgTCID50)均在4.20以上，结果见表3。
表3 BTSCC的传代及其对ORFV的增殖情况
Figure BDA0002453935960000101
综上所述，本发明成功发现和分离了一株牛睾丸支持细胞癌细胞(BTSCC),该细胞可以高效增殖ORFV和GTPV病毒，且可以保证病毒的均一、稳定。同时，该细胞生长速度很快(30h长满单层)，分种率很高(可达到1:4)，且可以用低血清培养条件下生长。利用该细胞分离、培养ORFV和GTPV病毒可提高试验效率，减低试验成本。利用该细胞生产疫苗简化了生产工艺、缩短了生产周期，降低了生产成本，同时还保证了制备得到的羊传染性脓疱病和羊痘疫苗的质量稳定(制备抗原浓缩、纯化)。因此，本发明的提出对羊传染性脓疱病和羊痘疫苗的规模化生产提供了新的技术手段。

Claims (5)

1.一种牛睾丸支持细胞癌细胞，命名为牛睾丸支持细胞癌细胞BTSCC，该细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：C201931，保藏时间为2019年3月1日。
2.权利要求1所述的牛睾丸支持细胞癌细胞在分离、培养痘病毒中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的痘病毒包括羊传染性脓疱病毒及羊痘病毒。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的牛睾丸支持细胞癌细胞在低血清培养条件下分离、培养痘病毒。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的低血清培养条件是指在50ml/L FBS条件下。
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