CN117431204A - 一种山羊肾悬浮细胞培养山羊痘病毒的方法 - Google Patents

一种山羊肾悬浮细胞培养山羊痘病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种山羊肾悬浮细胞培养山羊痘病毒的方法，所述山羊痘病毒用作牛结节性皮肤病灭活疫苗抗原，所述方法包括：（1）通过驯化和培养山羊肾传代细胞，制备山羊肾悬浮细胞，（2）将所述山羊肾悬浮细胞进行摇瓶扩大培养；（3）接种于生物反应器大规模培养山羊肾悬浮细胞；（4）在摇瓶中或者在生物反应器中对山羊肾悬浮细胞接种山羊痘病毒，培养48~72小时，收获病毒液；其中山羊痘病毒摇瓶培养条件为：山羊肾悬浮细胞培养48‑96小时接毒，接毒细胞密度为1.0×106~3.0×106个/ml，接毒剂量MOI为0.1~2。悬浮细胞培养山羊痘病毒相对于贴壁细胞培养提高了生产效率，降低了成本。

Description

一种山羊肾悬浮细胞培养山羊痘病毒的方法
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，具体涉及一种山羊肾悬浮细胞培养牛结节性皮肤病灭活疫苗病毒（山羊痘病毒，AV41株）抗原的方法。
背景技术
牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)，又称牛结节疹、牛结节性皮炎或牛疙瘩皮肤病，是由痘病毒科、山羊痘病毒属牛结节性皮肤病病毒(LSDV)引起的一种牛全身性感染疫病，特征为发热、皮肤(黏膜、器官)表面广泛性结节、消瘦、淋巴结肿大、皮肤水肿等。牛结节性皮肤病病毒为双链DNA病毒。通过对其DNA进行分析表明，其与山羊痘病毒和绵羊痘病毒的基因组核苷酸有96%的同源性。
目前，在我国可用山羊痘疫苗用于预防牛结节性皮肤病。山羊痘病毒(Goat PoxVirus，GPV)为双股DNA病毒，属于痘病毒科，山羊痘病毒属成员。该病毒嗜上皮性，没有血清型的区别。病毒容易在羔羊及犊牛的睾丸细胞和肾细胞上生长、繁殖，并致明显的细胞病变（CPE）。
专利CN106822888B公开了将山羊痘毒种用无血清MEM培养液水化后，按细胞维持液重量0.1%，0.5%，1%，2%的比例接种山羊肾细胞单层，接种时间分别为山羊肾细胞单层铺满程度为80%，100%，接种后置于37°C培养箱培养，病变达到70%以上时，将细胞瓶移到-20°C反复冻融3次，收获病毒液。
由于山羊痘疫苗的生产过程依赖于转瓶培养技术，所以短时间内难以进行病毒大量增殖生产，因此研制悬浮细胞化牛结节性皮肤病疫苗病毒抗原成为重要任务。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一是一种制备山羊肾悬浮细胞的方法。
本发明的目的之二是一种全悬浮细胞培养牛结节性皮肤病灭活疫苗病毒抗原的方法。
根据本发明，一种制备山羊肾悬浮细胞的方法，包括：（1）将山羊肾传代细胞复苏；（2）将复苏后的山羊肾传代细胞进行低血清浓度驯化：复苏后的山羊肾传代细胞每45-50小时传代一次，每传3~5代均降低DMEM高糖培养液的血清浓度，且山羊肾传代细胞稳定生长，直至培养基血清浓度为2%，由此获得了适宜低血清浓度生长的山羊肾传代细胞；（3）将步骤（2）获得的适宜低血清浓度生长的山羊肾传代细胞进行悬浮培养：将上述山羊肾传代细胞用胰蛋白酶消化，接种于细胞摇瓶进行培养，培养转速为130 r/min；待细胞生长速率趋于稳定后进行传代，传代5~10次，每次传代前将细胞密度调整至1.0×106个ml左右，直至细胞完全失去黏附瓶壁的能力，由此获得以单细胞悬浮方式稳定增殖的山羊肾悬浮细胞。
在一个实施方式中，在步骤（2）中，复苏后的山羊肾传代细胞用含6%胎牛血清的DMEM高糖培养液连续传代培养3次；然后用含4%胎牛血清的DMEM高糖培养液连续传代培养3次；然后用含2%胎牛血清的DMEM高糖培养液连续传代培养3次。
在一个实施方式中，在步骤（2）中，复苏后的山羊肾传代细胞培养48h，当长成单层后，用胰蛋白酶消化细胞，传代于含6%胎牛血清的DMEM高糖培养液中培养，连续传代培养3次；山羊肾传代细胞培养48h，当长成单层后，用 0.25% EDTA-胰蛋白酶消化细胞，以1：2（v/v）的细胞密度传代于含4%胎牛血清的DMEM高糖培养液中培养，连续传代培养3次；山羊肾传代细胞培养48h，当长成单层后，用 0.25% EDTA-胰蛋白酶消化细胞，以1：2（v/v）的细胞密度传代于含2%胎牛血清的DMEM高糖培养液中培养，连续传代培养3次。
在一个实施方式中，在步骤（3）中，将步骤（2）获得的适宜低血清浓度生长的山羊肾传代细胞，用胰蛋白酶消化，接种于细胞摇瓶，进行悬浮培养，培养转速为130 r/min； 48小时后，不用胰蛋白酶消化直接收集山羊肾细胞培养液，离心，收集细胞，接种于细胞摇瓶，培养转速为130 r/min，进行培养；按上述步骤，摇瓶培养传代5~10次，待细胞生长速率趋于稳定后进行传代，每次传代前将细胞密度调整至0.9×106个/ml~1.1×106个/ml，直至细胞完全失去黏附瓶壁的能力，由此获得能以单细胞悬浮方式稳定增殖的山羊肾悬浮细胞。
山羊肾悬浮细胞摇瓶培养工艺优选为：培养基为BSL培养基，最适细胞接种密度1.0×106个/ml，转速为：130 r/min。
根据本发明制备山羊肾悬浮细胞的方法获得的山羊肾悬浮细胞，保藏编号是CGMCC NO.45735。
根据本发明，一种山羊肾悬浮细胞培养山羊痘病毒的方法，所述山羊痘病毒用作牛结节性皮肤病灭活疫苗抗原，包括：（1）通过驯化和培养山羊肾传代细胞，制备山羊肾悬浮细胞，（2）将山羊肾悬浮细胞进行摇瓶扩大培养；（3）接种于生物反应器大规模培养山羊肾悬浮细胞；（4）在摇瓶中或者在生物反应器中对山羊肾悬浮细胞接种山羊痘病毒，培养48~72小时，收获病毒液；其中山羊痘病毒摇瓶培养条件为：山羊肾悬浮细胞培养48-96小时接毒，接毒细胞密度为1.0×106~3.0×106个/ml，接毒剂量 MOI 为0.1~2，培养温度为35~ 37℃，病毒收获时间为48~72 小时；生物反应器中山羊痘病毒培养条件是：接毒剂量 MOI 为0.1~1，生长密度达 个/ml 进行病毒接种。
在 15L反应器最佳山羊肾悬浮细胞培养工艺为：最适细胞接种密度 1.0×106 个/ml，转速为： 80-100 r/min；50L反应器最佳山羊肾悬浮细胞培养工艺为：最适细胞接种密度 1.0×106 个/ml，转速为：80-100 r/min；200L 生物反应器最适细胞接种密度 1.0×106个/ml，转速为：60-100r/min。
山羊痘病毒AV41株的最佳摇瓶培养工艺为：山羊肾悬浮细胞培养72小时接毒，接毒细胞密度为2.0×106个/ml，接毒剂量 MOI 为0.1，培养温度为 37℃，病毒收获时间为接毒后72 小时。
生物反应器中山羊痘病毒增殖条件为： pH值7.0 ±0.1、温度37 ℃、溶氧（DO）50%±10%、转速 40-80 r/min。
根据本发明的方法，还包括将获得的山羊痘病毒灭活后与佐剂相混合，以制备疫苗。
本公开还涉及所述方法获得的山羊痘病毒用于制备牛结节性皮肤病灭活疫苗的用途。
本公开还涉及本发明的山羊肾悬浮细胞在培养山羊痘病毒中的应用。
本发明的优势：
本发明的起始生物材料山羊肾传代细胞相对于原代细胞更加稳定和纯净。原代细胞是从羊体内取肾做成原代细胞，羊体可能会感染其他病原体，其肾细胞可能也会携带其他病原体，包括一些病毒或者支原体。山羊肾传代细胞是可以连续传代的，没有外源病毒的污染，因此更加纯净，性能也更加稳定。传代细胞较原代细胞解决了原代细胞来源难、制备技术复杂、成本高、易污染、安全性存在隐患等难题。
悬浮细胞培养山羊痘病毒相对于贴壁细胞培养提高了生产效率和抗原质量，降低了成本。采用生物反应器的细胞悬浮培养技术，是在连续封闭的系统中进行，利用在线监控功能控制各种运行参数，使得细胞自由生长、培养条件稳定，低血清培养及收获抗原无需胰酶消化细胞的优势，使得操作步骤简化、污染机会降低、取样简单、放大方便，单位体积培养的抗原含量高，在提高了生产规模和效率的同时，又能有效控制产品质量。
附图说明
图1是山羊肾细胞驯化前后显微镜图，其中图1中的（a）图是驯化前的山羊肾传代细胞，图1中的（b）图是驯化后的适宜低血清浓度生长的山羊肾传代细胞；
图2是山羊肾悬浮细胞的显微镜图；
图3是山羊肾悬浮细胞的细胞生长曲线图；
图4是山羊肾细胞悬浮细胞F10代次染色体图；
图5是山羊肾细胞悬浮细胞F25代次染色体图。
具体实施方式
下面，参照附图对本申请的具体实施方式进行详细的说明。
生物材料和试剂：
山羊肾传代细胞，液氮冻存。由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。
山羊痘病毒（AV41株）生产毒种，由中国兽医药品监察所提供和检验。
DMEM高糖培养基，购自 gibco公司；胰蛋白酶，购自 gibco 公司；BSL培养基，均购自广州微优细胞细胞科技有限公司。
检验用培养基：无菌检验用硫乙醇酸盐培养基(TG)、酪胨琼脂（GA）和胰酪大豆胨液体培养基（TSB)，支原体检验用培养基，均购自北京中海生物科技有限公司。
胎牛血清 PAN公司生产的胎牛血清。
DMSO SIGMA，批号：056K0173。
GENMED染色体核型分析试剂盒 购自上海杰美基因医药科技有限公司。
本发明所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：山羊肾悬浮细胞驯化及培养
1.1 细胞复苏和传代
1.1.1 细胞复苏 从液氮罐中取出山羊肾传代细胞（F10代），置于37℃水浴完全浴解。取T25细胞瓶加入10ml 含8%胎牛血清的DMEM高糖培养液，将解冻的细胞迅速转移至该细胞瓶，置37℃、5% CO2条件下培养24小时后，弃去培养液，加入10ml 含8%胎牛血清的DMEM高糖培养液，置37℃、5% CO2条件下继续培养。
1.1.2 细胞低血清浓度驯化 采用逐步降低培养基血清浓度的方法驯化山羊肾传代细胞以适应低浓度或无血清培养基中生长。具体地，复苏后的山羊肾传代细胞培养48h，当长成单层后，用 0.25% EDTA-胰蛋白酶消化细胞，以1：2（v/v）的细胞密度传代于含6%PAN胎牛血清的DMEM高糖培养液中培养，连续传代培养3次。山羊肾传代细胞培养48h，当长成单层后，用 0.25% EDTA-胰蛋白酶消化细胞，以1：2（v/v）的细胞密度传代于含4%胎牛血清的DMEM高糖培养液中培养，连续传代培养3次。根据细胞状态，每48h对细胞传代一次，每传3代均降低DMEM高糖培养液的血清浓度，且山羊肾传代细胞均可稳定生长，直至培养基血清浓度为2%。由此获得了适宜低血清浓度生长的山羊肾传代细胞。
1.1.3 细胞的悬浮培养 将上述山羊肾传代细胞，用0.25%EDTA-胰蛋白酶消化，按1.0×106个/ml细胞密度接种于125ml 硅化处理的细胞摇瓶，加入30ml BSL培养基，置37℃、5% CO2摇床进行悬浮培养。培养转速为130 r/min。 48 小时后，不用胰蛋白酶消化直接收集山羊肾细胞培养液，以 800 r/min 离心5-10分钟，弃上清，收集细胞，以1.0×106个/ml细胞密度接种于 125ml 细胞摇瓶，每瓶培养体积为 30~50ml，培养转速为130 r/min，置37℃、5% CO2条件下培养。按上述步骤，摇瓶培养传代5~10次。待细胞生长速率趋于稳定后进行传代，每次传代前将细胞密度调整至0.9×106个/ml~1.1×106个/ml（约 1.0×106个/ml），直至细胞完全失去黏附瓶壁的能力，能以单细胞悬浮方式稳定增殖，由此获得能以单细胞悬浮方式稳定增殖的山羊肾悬浮细胞。将该细胞命名为山羊肾悬浮细胞，代次为第1代（F1），按照细胞密度为 1.0×107 个/ml进行分装，液氮保存。将该山羊肾悬浮细胞的传代F10进行生物保藏，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2023年10月27日，保藏编号是CGMCCNO.45735。该山羊肾悬浮细胞命名为GKSC-F10，分类命名为山羊肾细胞（caprae renibuscellulis）。
1.1.4细胞镜检状态 传代细胞在显微镜下观察贴壁均匀，细胞边缘清晰，细胞连接紧密；细胞悬浮培养后呈现出单细胞悬浮生长状态，山羊肾传代细胞驯化前后显微镜下观察情况见图 1，图1中的（a）图是驯化前的山羊肾传代细胞，图1中的（b）图是驯化后的适宜低血清浓度生长的山羊肾传代细胞。山羊肾悬浮细胞边缘清晰干净，呈现出较好的单细胞悬浮生长状态，呈圆形，细胞大小均一，折光性一致；生长速率稳定，细胞存活率达95%以上，参见图2。
1.2 细胞摇瓶培养工艺优化
1.2.1培养基的筛选 取F1代山羊肾悬浮细胞，按1.1.3培养方式在 CRFK培养基、MDCK细胞专用培养基、BSL培养基三种不同培养基中培养，每隔24小时取样进行细胞计数，绘制细胞生长曲线：观察山羊肾悬浮细胞的生长状态，选择最适培养基。如图3所示，发现BSL培养基中细胞生长最好。BSL培养基为最适培养基。
1.2.2接种密度优化 将摇瓶细胞（F1代山羊肾悬浮细胞）以初始接种密度0.5×106个/ml、1.0×106个/ml和1.5×106个/ml三个不同浓度，分别接种于125ml摇瓶中进行培养，工作体积为30ml，每隔24小时取样进行细胞计数，绘制细胞生长曲线：观察山羊肾悬浮细胞的生长状态，选择最适接种密度。对应初始接种密度0.5×106个/ml、1.0×106个/ml和1.5×106个/ml在不同时间的细胞密度分别如表1A、表1B、表1C所示。发现，当初始接种密度为个/ml 时，细胞生长密度在72h可达到最大化，细胞可生长至/>个/ml（如表1B所示）。
表1A
表1B
表1C
实施例2：生物反应器大规模培养山羊肾悬浮细胞
2.1 山羊肾悬浮细胞复苏
从液氮罐取出 3支冻存的山羊肾悬浮细胞，置37℃水浴下，不时摇动使其尽快融化，常温条件下，加入 27ml BSL 培养基 800r/min 离心 5分钟，打开冻存管盖，轻轻吸取上清弃去，勿吸取细胞沉淀，加入 BSL 培养基重悬细胞。将30ml 培养基加入细胞悬液，摇匀，使复苏终体积为30 ml。置 37℃、5%CO2，培养箱中培养，摇床转速为130 r/min。
2.2 细胞扩大培养 细胞培养72小时，细胞密度为5.0×106个/ml，用 BSL 培养基制成密度为 个/ml 的细胞悬液，分装于细胞摇瓶中，置 37℃、5%CO2培养箱中培养，72小时后即可按照 1：4 -1: 5比例（相当于100ml细胞悬液可以扩大到400~500ml体系培养）进行传代。
2.3 反应器培养
15L反应器工艺研究
以初始接种密度个/ml接种于15L反应器，工作体积为8-10L，初始转速为80r/min，根据取样细胞状态调整转速80-100r/min，每隔24小时取样进行细胞计数。最终确定最合适培养条件：搅拌转速 80 -100r/min、pH值7.0（±0.1）、温度37℃、溶氧（DO）50%±10%。研究发现，当初始接种密度为 1.0×106个/ml 时，转速在80-100r/min，细胞生长延滞期较短，对细胞生长影响小，可达到最大细胞密度。
50L反应器工艺研究
以初始接种密度个/ml接种于50L反应器，工作体积为40L，初始转速为60r/min，根据取样细胞状态调整转速60-100r/min，每隔24小时取样进行细胞计数，绘制细胞生长曲线。最终确定最合适培养条件：搅拌转速 80-100 r/min、pH值7.0（±0.1）、温度37℃、溶氧（DO）50%±10%。研究表明，当初始接种密度为/>个/ml 时，细胞生长延滞期较短，可达到最大细胞密度。
200L反应器工艺研究
分别设置不同的初始接种密度接种于200L反应器,工作体积为150L，初始转速为60r/min，根据取样细胞状态调整转速60-100r/min，每隔24小时取样进行细胞计数并测定葡萄糖含量，当葡萄糖含量低于2g/L时及时补糖，绘制细胞生长曲线。在对搅拌速度的研究中，分别设置不同的搅拌速度，观察细胞生长情况。
最终确定最合适培养条件：初始接种密度个/ml，搅拌转速 60-100 r/min、pH值7.0（±0.1）、温度37℃、溶氧（DO）50%±10%。
实施例3：山羊肾悬浮细胞种子库的建立
3.1 细胞库建立
3.1.1 细胞复苏和传代 从液氮罐中取出山羊肾悬浮细胞F1代，置于37℃水浴完全浴解。按1×106个/ml 细胞密度接种于125ml细胞摇瓶，加入BSL培养基，培养转速为110~130r/min，置37℃、5% CO2条件下进行悬浮培养。当细胞密度达到5×106个/ml，细胞活力达到90%以上时，进行传代，每2~3日传代一次，连续传至第5代（F5）。记录传代过程中细胞的密度和细胞活力。
3.1.2 细胞冻存 收集F2、F5代细胞悬液，取20ml细胞悬液冻存于-80℃用于后续检验，其余细胞经1200r/min，离心10分钟，弃掉上清，用BSL培养基重悬细胞，调整细胞密度至1×107个/ml，然后用80%BSL培养基+20% DMSO与细胞悬液等体积混匀，分装细胞至冻存管，1.5 ml/支，细胞含量为1.2×107个细胞/支，标明细胞名称、批次、代次、细胞数、冻存日期、细胞管数。-80℃程序降温过夜，第二天转移到液氮中储存，作为原始细胞库。
3.2 基础细胞库的建立
3.2.1 细胞传代 取1支F5代细胞，接种于60ml基础培养基中，细胞密度为1×106个/ml，置37℃，5% CO2，110~130r/min 摇床中悬浮培养。当细胞密度达到5×106个/ml，活细胞达到90%以上时，进行传代，每2~3日传代一次，连续传至第15代（F15）。记录传代过程中细胞的密度和活细胞比例。
3.2.2 细胞冻存 收集F6、F10、F15代细胞悬液，按照3.1.2方法，调整细胞密度至1×107个/ml，冻存到液氮中，作为基础细胞库。
3.3 工作细胞库的建立
3.3.1 细胞传代 取1支F15代细胞融化，接种于60ml基础培养基中，使其细胞密度为1×106个/ml，置37℃，5% CO2，110~130r/min 摇床中悬浮培养。当细胞密度达到5×106个/ml，细胞活力达到90%以上时，进行传代，每2~3日传代一次，连续传至第35代（F35）。记录传代过程中细胞的密度和活细胞比例。
3.3.2 细胞冻存 收集F17、F20、F25代细胞悬液，按照3.1.2方法，调整细胞密度至1×107个/ml，冻存到液氮中。F25代次定为生产最高限制代次细胞；F35代次定为高于最高代次10代细胞。
3.4 细胞鉴定 取F10、F15、F25、F35代细胞进行显微镜检查和纯净性检验，取F10、F25代悬浮细胞进行胞核学和致瘤性试验。
3.4.1 显微镜检查 取F10、F15、F25、F35代培养48~72小时细胞，显微镜下观察细胞形态。
山羊肾细胞连传35代，各代细胞镜检形态正常，均呈现出单细胞悬浮生长状态，呈圆形，细胞大小均一，边缘光滑、形态整齐，折光性一致；生长速率稳定，细胞存活率达90%以上。具体结果见下表。
表2 细胞库各代次信息
3.4.2 胞核学检验
3.4.2.1 抽样 取F10、F25细胞，各取50个处于有丝分裂中的细胞进行染色体检查。
3.4.2.2 染色体检查
染色体标本制备 取对数生长期山羊肾细胞悬浮细胞，加入秋水仙素至终浓度为0.1~0.4μg/ml，37℃培养箱孵育60 分钟。反应结束后，1200r/min离心10分钟，弃去上清，轻轻吹散细胞，加入8ml 0.4% w/v KCl溶液进行低渗处理，37℃温箱孵育70分钟。反应结束后，加入3ml 固定液（甲醇：冰醋酸＝3:1）终止反应，1200r/min离心10分钟。离心后，弃上清，利用底部残液，用一次性滴管或用手轻弹离心管壁将细胞团块吹散。用固定液固定2~3次，每次滴加3ml左右固定液，1200r/min离心10分钟。最后重悬于适量的固定液中。利用空气干燥法将固定的细胞滴于干净的玻片上。将玻片浸泡于新鲜配制的Giemsa染色液中染色8分钟后取出，冲净，晾干。然后在显微镜下观察。结果见下表和图4~图5。
表3 细胞染色体条数统计结果
从上表和图4~图5结果可以看出，基础代次细胞（F10代）染色体模式数为56 ，工作细胞库最高代次细胞（F25代）染色体模式数为56。细胞核型比较结果表明，山羊肾悬浮细胞在基础细胞库（F10代）、工作细胞库最高代次细胞（F25代）中均存在染色体标志，核型相同。
3.4.3 纯净性检验 取F10、F15、F25、F35代培养48~72小时细胞，按照现行《中国兽药典》（三部）附录进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验。
无菌检验：F10、F15、F25、F35代细胞无菌检验结果均为阴性，详见下表。
表4 不同代次细胞无菌检验结果
注：TG即硫乙醇酸盐流体培养基；TSB即胰酪大豆胨液体培养基；GA即为酪胨琼脂培养基。
支原体检测 F10、F15、F25、F35代细胞检测结果均为阴性。
外源病毒检验
样品制备 取F10、F15、F25、F35代细胞悬液经-80℃ 3次反复冻融后，2000~3000 g离心10分钟，取上清液作为待检样品。
样品的接种和细胞继代 按照现行《中国兽药典》（三部）牛用活疫苗、毒种和细胞进行外源病毒检验：致细胞病变检查和红细胞吸附性检查采用Vero细胞、MDBK细胞；荧光抗体采用MDBK。将处理好的F10、F15、F25、F35代细胞液样品2.0 ml，接种到已长成良好单层MDBK的25cm2培养瓶中，轻轻晃动细胞培养瓶，使接种液均匀分布于细胞单层上，置37℃吸附1小时后加入细胞维持液置37℃，5% CO2培养箱中继续培养；另取Vero细胞一瓶作为正常对照细胞。根据细胞生长情况，培养4～7日后，进行细胞继代，期间继代3代。
致细胞病变检查 样品接种Vero、MDBK细胞后，每天观察细胞生长情况，如果接种细胞出现细胞病变，而对照细胞无病变，判为外源病毒污染；如果细胞无病变，将最后一次继代的细胞继续培养3日，每天显微镜下观察细胞病变情况，若未观察到明显的细胞病变，再用姬姆萨染色液对单层细胞进行染色。观察单层细胞，检查包涵体、巨细胞或其他由外源病毒引起的致细胞病变效应（CPE）的出现情况。
致细胞病变检查结果 山羊肾细胞的F10、F15、F25、F35代分别接种Vero、MDBK细胞后，在连续继代培养的12天观察期内，均未观察到细胞病变，与Vero、MDBK正常细胞对照的生长状况完全一致。观察期结束时，取上述三种细胞用姬姆萨染色液对单层细胞进行染色，未观察到细胞包涵体、巨细胞；也未见外源病毒引起的CPE，详见下表。
表5 不同细胞库细胞CPE观察结果
注：表中分数的分子表示出现的CPE的瓶数，分母表示细胞传代瓶数
红细胞凝集和红细胞吸附性外源病毒检查 将Vero细胞、MDBK细胞第三次继代的培养物继续培养4～7日后，取上清分别采用0.5%的豚鼠红细胞和0.5%鸡红细胞进行红细胞凝集性检测；另取每个代次接种的不同细胞各2瓶用PBS洗涤单层细胞3次，每瓶加入1ml0.2%的豚鼠红细胞和0.2%鸡红细胞的等量混合悬液，分别于2~8℃和20~25℃放置30分钟，用PBS洗涤1次，检查红细胞吸附情况。
红细胞凝集和红细胞吸附性外源病毒检查结果 山羊肾细胞的F10、F15、F20、F25、F40代细胞裂解液接种Vero、MDBK细胞，均未观察到红细胞吸附现象。将Vero细胞、MDBK细胞第三次继代的培养物继续培养4～7日后，取上清分别进行红细胞凝集性检测，均未观察到红细胞凝集现象。
荧光抗体检查
细胞继代 已分别接种F10、F15、F25、F35代细胞液样品的MDBK细胞，将第三次继代细胞培养物用胰酶消化分散后，制备成细胞悬液分装至24孔细胞培养板，继续培养3天；而作为正常细胞对照的MDBK细胞培养瓶用同样方式消化后，也各分装到一个24孔细胞培养板。
阳性对照接种 将MDBK细胞对照培养板中8孔接种BVDV，每孔0.1ml（含100TCID50）。接种后培养板继续培养3日后用于荧光抗体检查。
荧光抗体检查结果 山羊肾细胞的F10、F15、F25、F35代细胞裂解液接种MDBK，对第四次继代的细胞用BVDV间接荧光抗体检测试剂盒进行检测，接种样品细胞均无特异性荧光，而接种BVDV、病毒的阳性对照均出现特异性荧光。详细见下表。
表6：病毒检验结果（荧光抗体）
实施例4：山羊痘病毒（AV41株）摇瓶培养
4.1 山羊肾悬浮细胞复苏与传代
4.1.1 细胞复苏 从液氮中取出3支冻存的山羊肾悬浮细胞（F10代或其传代F20），浸入37℃水浴使其尽快融化，加入27ml培养基（BSL培养基），常温条件下离心（800r/min，5分钟），吸取上清并弃去，加入30ml 培养基重悬细胞，加入 125ml 细胞培养摇瓶，使复苏终体积为 30ml。置37℃、5%CO2培养箱培养，摇床转速设定为 130r/min。
4.1.2 细胞传代 将从液氮复苏的山羊肾悬浮细胞按照初始接种密度 1.0×106个/ml培养 72 小时，细胞密度达到个/ml，用 BSL 培养基制成密度为/>个/ml细胞悬液，分装于细胞摇瓶中，置37℃、5%CO2培养箱，按照 1：4~1：5 比例进行传代培养。
结果表明，山羊肾悬浮细胞培养 72小时后，细胞密度达到5.0×106 个/ml，细胞存活率良好，分散无结团。
4.2 山羊痘病毒AV41株在摇瓶中培养工艺研究
4.2.1 不同细胞密度对病毒增殖影响 当细胞培养72小时，细胞密度达到个/ml以上时，分别稀释到/>、/>、/>，以病毒感染复数（MOI) 为 0.1接种山羊痘病毒AV41株，于病毒培养48、60、72、84、96、108 小时分别无菌取样，样品冻融 1次，测定收获病毒/>，以确定最适接毒时间。其它培养条件：转速 130 r/min，pH 值7.0，培养温度 37℃。
表7：不同接毒细胞密度对山羊痘病毒AV41株增殖影响
结果表明，当细胞生长 72 小时后稀释到接毒，产毒效果最好，病毒培养72小时病毒滴度为107.18 TCID50/0.1ml。
4.2.2 不同接毒剂量对病毒增殖影响 当细胞培养72小时，细胞密度达到个/ml以上时，稀释到/>个/ml分别以 MOI 为 0.01、0.1、1和2接种山羊痘病毒AV41株，于接毒后 48小时定点取样，样品冻融 1次，测定收获病毒TCID50，以确定最佳接毒量。其它培养条件：130 r/min，pH 值7.0，培养温度 37℃。
表8：不同接毒量对病毒增殖的影响
/>
如上表所示，当病毒感染复数MOI 为0.1时产毒效果最好。因此，鉴于大生产种毒用量考虑，选择 MOI 为 0.1 为最佳接毒剂量。
4.2.3 不同病毒收获时间对病毒增殖影响 将山羊肾悬浮细胞以初始密度 个/ml 接种于 125ml 摇瓶中，细胞培养 72小时,对半稀释后分别于接毒后培养48、60、72、84、96、108小时无菌取样，样品冻融1次测定收获病毒TCID50，以确定最适收毒时间。其它培养条件： 130 r/min，pH 值7.0，培养温度 37℃。结果发现当病毒培养72小时收获，病毒滴度可以达到107.18TCID50/0.1ml。
4.2.4 不同培养温度对病毒增殖影响 将山羊肾悬浮细胞以1.0×106个/ml 的密度接种5个 125ml 摇瓶中，细胞培养72小时，稀释到个/ml以MOI 为 0.1 按种山羊痘病毒AV41株，摇瓶培养温度分别设定 33℃、34℃、35℃、36℃和37℃进行培养，于病毒培养 48、60、72、84、96、108小时进行无菌取样，样品冻融1次，测定收获病毒TCID50， 以确定山羊痘病毒AV41株培养最适温度。其它培养条件：130 r/min，pH 值7.0，培养温度 37℃。
表9： 不同培养温度对病毒增殖的影响
结果表明，37℃培养条件下收获病毒滴度最高为 107.18 TCID50/0.1ml。因此，选择37℃为最佳病毒增殖温度。
4.3 病毒效价测定方法
将上述冻融1次的病毒样品进行 10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9接种山羊肾细胞单层，每孔0.1ml，每个稀释度接种5孔。置37℃、5%CO2培养箱培养5~7日，观察细胞病变，计算TCID50。
实施例5：生物反应器大规模培养山羊痘病毒
5.1 山羊肾悬浮细胞复苏
5.1.1 细胞复苏 从液氮中取出3支冻存的山羊肾悬浮细胞，侵入37℃水浴使其尽快融化，加入27ml培养基,常温条件下离心（800r/min，5分钟），吸取上清并弃去，加入30ml培养基重悬细胞，加入 125ml 细胞培养摇瓶,使复苏终体积为30ml。置37℃、5% CO2培养箱培养，摇床转速设定为130 r/min。
5.1.2 细胞扩大培养 细胞培养72小时，细胞密度为 5.0×106个/ml，用BSL培养基制成密度为 1.0×106 个/ml 的细胞悬液，分装于细胞摇瓶中，置 37℃、5%CO2培养箱培养，72小时后，细胞密度达到5.0×106个/ml即可按照1：4~1：5比例进行传代。
5.2 15L生物反应器中山羊痘病毒增殖工艺研究
依据在摇瓶接毒所得数据及生物反应器培养山羊痘病毒优化工艺参数，将摇瓶细胞以初始接种密度 1.0×106个/ml接种 15L 生物反应器，工作体积设定 6L，当细胞培养72 小时，细胞密度达到 5.0×106 个/ml以上时，对半稀释，以MOI 为 0.1接种山羊痘病毒，于接毒后36 小时定点取样，样品冻融 1次，测定病毒含量（TCID50/0.1ml ）。参数设定为： pH值7.0 ±0.1、温度37℃、溶氧（DO）50 %±10%、转速 60-80 r/min。
5.2.1 不同PH对病毒增殖影响 依据在摇瓶接毒所得数据及生物反应器培养山羊痘病毒优化工艺参数，将摇瓶细胞以初始接种密度 1.0×106个/ml接种 15L 生物反应器，工作体积设定 6L，当细胞培养 72 小时，细胞密度达到 5.0×106 个/ml以上时，接种山羊痘病毒，补加维持液6L，分别设置PH为6.9±0.1、7.0±0.1、7.1±0.1，其他参数不变（温度37 ℃、溶氧（DO） 50 ±10%、转速 80 r/min），于接毒后36 小时定点取样，样品冻融 1次，测定病毒含量（TCID50/0.1ml ），以确定接毒最佳PH。
表10：15L反应器不同PH对病毒增殖影响
5.3 200L生物反应器中山羊痘病毒增殖工艺研究
5.3.1 摇瓶细胞扩大培养
细胞培养72小时，细胞密度为 5.0×106个/ml，用 BSL培养基制成密度为 1.0×106个/ml 的细胞悬液，分装于细胞摇瓶中，置 37℃、5%CO2培养箱培养，72小时后，细胞密度达到5.0×106个/ml即可按照 1：4~1：5比例进行传代。
5.3.2 15L反应器细胞扩大培养
摇瓶细胞培养72小时，细胞密度为 5.0×106个/ml，用 BSL培养基制成密度为1.0×106 个/ml 的细胞悬液，放入15L反应器，参数设定为： pH值7.0 ±0.1 、温度37 ℃、溶氧（DO） 50 %±10%、转速 80 r/min。 72小时后，细胞密度达到5.0×106个/ml即可按照1：4~1：5比例进行传代。
5.3.3 200L反应器细胞扩大培养
15L反应器细胞培养72小时，细胞密度为 5.0×106个/ml，用 BSL培养基制成密度为 1.0×106个/ml 的细胞悬液，放入200L反应器，参数设定为： pH值7.0 ±0.1、温度37℃、溶氧（DO） 50 %±10%、转速40- 80 r/min。 72小时后，细胞密度达到5.0×106个/ml即可按照 1：4~1：5比例进行传代。
5.3.4 200L反应器接毒工艺
当细胞培养 72 小时，细胞密度达到 5.0×106 个/ml以上时，对半稀释，以MOI为 0.1接种山羊痘病毒，于接毒后36 小时定点取样，样品冻融 1次，测定病毒含量（TCID50/0.1ml ）。参数设定为： pH值7.0 ±0.1、温度37 ℃、溶氧（DO） 50 %±10%、转速 40-80 r/min。
结果表明，最适接毒剂量 MOI 为0.1，最佳接毒时间为细胞生长 72 小时，生长密度达 5.0×106 个/ml 进行病毒接种，培养 72 小时可获得高滴度的病毒液，病毒含量可达107.38TCID50/0.1ml。说明了山羊痘病毒AV41株高度具备在山羊肾悬浮细胞大规模增殖的特性，能够用于以生物反应器为基础的大规模产业化生产。
实施例6. 山羊痘病毒AV41株最高代次免疫原性研究
根据《兽用生物制品技术标准文件编写要求》，基础毒种免疫原性评价采用基础最高代次最小免疫剂量进行。制品最小免疫剂量为1.0ml/头，取基础种毒最高代次F60代制备牛结节性皮肤病灭活疫苗后，以1.0ml/头剂量进行免疫。
材料
制苗用毒种：采用本发明山羊肾悬浮细胞增殖培养的山羊痘病毒AV41株基础种毒最高代次毒种F60。
攻毒用强毒株：牛结节性皮肤病检验用强毒，新疆株LSDV/Xinjiang/China/2019，病毒含量为105.4TCID50/ml（104.46 ID50/0.25ml）。
中和抗体测定用毒株：山羊痘病毒AV41株，病毒含量为105.2TICD50/0.1ml。
试验动物：5月龄健康易感牛（山羊痘病毒中和抗体效价≤l∶4），品种为秦川牛和西门塔尔牛。
抗体效价测定 取山羊痘病毒 AV41株基础种毒F60代，按工艺规程制备抗原，半成品检验合格后（病毒含量为106.5TCID50/ml，无菌）进行灭活浓缩，与206佐剂（以体积百分比1：1）乳化制成牛结节性皮肤病灭活疫苗(抗原病毒含量为106.0TCID50/ml)。选择5月龄健康易感牛（山羊痘病毒中和抗体效价≤l∶4）8头，随机分为2组，第1组：5头/组，第2组：3头/组。取制备好的疫苗，分别按每组免疫剂量1.0ml/头对第1组牛进行颈部肌肉接种，第2组为空白对照组同条件隔离饲养。所有试验牛于首免后7、14、21、28日颈静脉采血，无菌分离血清。分别测定每份血清对山羊痘病毒AV41株（GTPV）的中和抗体效价。各组免疫后不同时间的抗体水平见下表。
表11
从上表可见，首免后7日，除1头牛外（＜l∶8），其余4头中和抗体效价均达到l∶13.6以上；首免14日后，除1头牛外（＜l∶8），其余4头中和抗体效价均达到l∶16以上；二免后7日（首免后21日）中和抗体效价均达到l∶64以上；二免后14日（首免后28日）中和抗体效价均达到l∶40.3以上。
攻毒试验 首次免疫后 35日对所有试验牛进行攻毒。提前2日将免疫组与对照组共8头试验牛分别转入各自动物舍，且每日测温，将其平均值作为基础体温。攻毒当日对所有牛左、右两侧腹部剃毛，分别在两侧腹部下方，每侧各皮内接种3个稀释度的强毒稀释液，每个稀释度重复接种4个点，每点0.1ml。攻毒时，采用1ml注射器进行注射，且尽量使高稀释度与低稀释度间隔分布，各稀释度排列的示意参见下表。
表12 试验牛胸腹部接种点分布示意
攻毒后各免疫试验牛均未见流涎、流泪和流鼻液等症状，体温亦在正常范围；免疫组1头试验牛低稀释度（10-1）注射位点出现肿胀、结痂等，在观察期后期腹部出现继发结节，皮肤隆起。免疫组其他4头牛均未出现牛结节性皮肤病病毒所引起的临床症状，4/5保护。
攻毒对照组，3头牛均表现出食欲减退，眼睛和鼻腔可见黏性分泌物，除接种部位痘肿外，腹部及其他部位皮肤出现继发性结节。
攻毒对照组试验牛剖检后可见，心、肝、脾、肺、肾、肠系膜等部位出现结节。免疫组试验牛心、肝、脾、肺、肾、肠系膜等部位均未出现结节。
由此可见，用最高代次（F60代）的山羊痘AV41种毒制备的牛结节性皮肤病灭活疫苗，对5月龄以上牛采用1.0ml/头进行免疫后攻毒，能为试验牛提供较好的保护，该牛结节性皮肤病灭活疫苗免疫原性良好。
上述仅为本发明的较佳实施例。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明的技术构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，均属于本发明的保护范畴。

Claims (10)

1.一种制备山羊肾悬浮细胞的方法，其中，所述方法包括：
（1）将山羊肾传代细胞复苏；
（2）将复苏后的山羊肾传代细胞进行低血清浓度驯化：复苏后的山羊肾传代细胞每45-50h传代一次，每传3~5代均降低DMEM高糖培养液的血清浓度，且山羊肾传代细胞稳定生长，直至培养基血清浓度为2%，由此获得适应低血清浓度生长的山羊肾传代细胞；
（3）将步骤（2）获得的适应低血清浓度生长的山羊肾传代细胞进行悬浮培养：将上述山羊肾传代细胞用胰蛋白酶消化，接种于细胞摇瓶进行培养，培养转速为110-130 r/min；待细胞生长速率趋于稳定后进行传代，传代5~10次，每次传代前将细胞密度调整至0.9×106个/ml~1.1×106个/ml，直至细胞完全失去黏附瓶壁的能力，由此获得以单细胞悬浮方式稳定增殖的山羊肾悬浮细胞。
2.根据权利要求1所述的制备山羊肾悬浮细胞的方法，其中，在步骤（2）中，复苏后的山羊肾传代细胞用含6%胎牛血清的DMEM高糖培养液连续传代培养3次；然后用含4%胎牛血清的DMEM高糖培养液连续传代培养3次；然后用含2%胎牛血清的DMEM高糖培养液连续传代培养3次；
优选地，在步骤（2）中，复苏后的山羊肾传代细胞培养48h，当长成单层后，用胰蛋白酶消化细胞，传代于含6%胎牛血清的DMEM高糖培养液中培养，连续传代培养3次；然后所述山羊肾传代细胞培养48h，当长成单层后，用胰蛋白酶消化细胞，以1：2（v/v）的细胞密度传代于含4%胎牛血清的DMEM高糖培养液中培养，连续传代培养3次；然后所述山羊肾传代细胞培养48h，当长成单层后，用胰蛋白酶消化细胞，以1：2（v/v）的细胞密度传代于含2%胎牛血清的DMEM高糖培养液中培养，连续传代培养3次。
3.根据权利要求1所述的制备山羊肾悬浮细胞的方法，其中，在步骤（3）中，将步骤（2）获得的适宜低血清浓度生长的山羊肾传代细胞用胰蛋白酶消化，接种于细胞摇瓶，进行悬浮培养，培养转速为130 r/min；48小时后，不用胰蛋白酶消化直接收集山羊肾细胞培养液，离心，收集细胞，接种于细胞摇瓶，培养转速为130 r/min，进行培养；按上述步骤，摇瓶培养传代5~10次，待细胞生长速率趋于稳定后进行传代，每次传代前将细胞密度调整至0.9×106个/ml~1.1×106个/ml，直至细胞完全失去黏附瓶壁的能力，由此获得能以单细胞悬浮方式稳定增殖的山羊肾悬浮细胞。
4.根据权利要求1所述的制备山羊肾悬浮细胞的方法，其中，所述山羊肾悬浮细胞的摇瓶培养工艺为：培养基为BSL培养基，细胞接种密度1.0×106个/ml，转速为：130 r/min。
5.根据权利要求1所述的制备山羊肾悬浮细胞的方法，其中，还包括建立山羊肾悬浮细胞种子库。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备山羊肾悬浮细胞的方法获得的山羊肾悬浮细胞，保藏编号是CGMCC NO.45735。
7.一种山羊肾悬浮细胞培养山羊痘病毒的方法，所述山羊痘病毒用作牛结节性皮肤病灭活疫苗抗原，所述方法包括：（1）通过驯化和培养山羊肾传代细胞，根据权利要求1-5的方法制备山羊肾悬浮细胞，（2）将所述山羊肾悬浮细胞进行摇瓶扩大培养；（3）接种于生物反应器大规模培养山羊肾悬浮细胞；（4）在摇瓶中或者在生物反应器中对山羊肾悬浮细胞接种山羊痘病毒，培养48~72小时，收获病毒液；其中山羊痘病毒摇瓶培养条件为：山羊肾悬浮细胞培养48-96小时接毒，接毒细胞密度为1.0×106~3.0×106个/ml，接毒剂量 MOI 为0.1~2，培养温度为35~ 37℃，病毒收获时间为48~72 小时；生物反应器中山羊痘病毒培养条件是：接毒剂量 MOI 为0.1~1，生长密度达 个/ml 进行病毒接种。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，在 15L反应器中山羊肾悬浮细胞培养条件为：细胞接种密度 1.0×106 个/ml，转速为： 80-100 r/min；50L反应器中山羊肾悬浮细胞培养条件为：细胞接种密度 1.0×106 个/ml，转速为：80-100 r/min；200L 生物反应器中细胞接种密度是 1.0×106个/ml，转速为：60-100r/min；
优选地，山羊痘病毒AV41株的摇瓶培养条件为：山羊肾悬浮细胞培养72小时接毒，接毒细胞密度为2.0×106个/ml，接毒剂量 MOI 为0.1，培养温度为 37℃，病毒收获时间为接毒后72 小时；
更优选地，生物反应器中山羊痘病毒增殖条件为： pH值7.0 ±0.1、温度37 ℃、溶氧（DO）50 %±10%、转速 40-80 r/min。
9.权利要求7或8所述的方法获得的山羊痘病毒用于制备牛结节性皮肤病灭活疫苗的用途。
10.权利要求6所述的山羊肾悬浮细胞在培养山羊痘病毒中的应用。
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