CN104958760A - 一种山羊痘灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种山羊痘灭活疫苗及其制备方法。将山羊痘AV41接种BHK-21传代细胞，结果产生CPE，连续接种并收获抗原，对BHK-21细胞毒液灭活后，通过摸索灭活疫苗的制备工艺最终制成效力、安全检验均合格的山羊痘BHK-21灭活疫苗。本发明采用BHK-21细胞取代羊睾丸细胞，完全避免了用同源组织制备疫苗携带病原体的潜在风险，同时又避免了羊睾丸只有在春天才能大量采集的季节性限制，又由于BHK-21细胞的培养成本低于牛、羊睾丸细胞的，因此本发明的山羊痘BHK-21灭活疫苗安全可靠可用于山羊痘的防治，且制备成本降低，具有较好的社会效益和经济效益。

Description

一种山羊痘灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗制备领域，具体地，涉及一种山羊痘BHK-21细胞灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

山羊痘又称“羊天花”，是由山羊痘病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。本病可发生于任何季节，但以春秋两季较常发病，该病发病率和死亡率很高，严重制约着山羊养殖业的发展。目前控制本病最有效的方法是定期进行预防接种。中牧集团兰州生物药厂最早研制出了山羊痘组织苗，后来又成功地研制出了山羊痘弱毒细胞苗，曾获得了农业部开发奖。每年生产上千万头份的山羊痘弱毒活疫苗，供免疫预防用。现有的山羊痘弱毒活疫苗系用免疫原性良好的山羊痘弱毒株接种羊睾丸细胞培养，收获合格的病毒细胞培养液，加适当的稳定剂冷冻真空干燥制成。但上述山羊痘弱毒活疫苗的不足之处在于使用羊睾丸细胞培养病毒成本较高，受限于季节，只有在春天才能大量采集羊睾丸，细胞培养工艺复杂，更主要的是由于用同源细胞繁殖病毒制得的疫苗免疫羊体后存在隐性带毒和毒力返祖的现象，造成目前的活疫苗使用过程不安全的情况。

BHK-21细胞是指幼年叙利亚地鼠肾细胞(BabyHamster SyrianKidney)，1961年建株。原始的细胞株是成纤维细胞，贴壁依赖性。1963年获得单细胞克隆细胞。后经无数次传代后细胞可悬浮生长，它广泛用于增殖各种病毒，生产兽用疫苗。为避免同源组织细胞培养山羊痘病毒带来的隐性带毒和毒力返祖现象，本领域技术人员一直以来致力于研究采用BHK-21细胞培养山羊痘病毒，但效果均不理想，主要表现在收获的病毒液病毒滴度含量低，BHK-21细胞驯化代数多，接种山羊痘病毒的BHK-21细胞需传代次数多，导致生产周期长，病毒收获效果不理想。因此寻找并摸索出一种生产成本低、高效获得山羊痘病毒液的方法用于生产安全的山羊痘疫苗非常迫切。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产工艺简单、应用安全、具有优良保护效果的山羊痘灭活疫苗。

本发明提供的山羊痘灭活疫苗，是将山羊痘病毒接种BHK-21细胞培养，获得山羊痘病毒BHK-21细胞毒液，再经获得灭活、乳化获得。

具体地，BHK-21细胞为生长良好的细胞单层，用胰酶消化后加入含2-5％犊牛血清的乳欧液，待细胞浓度达2-5×10⁶/ml时，用于接种山羊痘病毒；或

BHK-21细胞生长至细胞单层后在摇瓶中悬浮培养2-5代，当细胞浓度达2-5×10⁶/ml时，转至生物反应器中进行细胞扩大培养，待细胞浓度达2-5×10⁶/ml时，转至500L或1000L生物反应器中悬浮培养，当悬浮细胞浓度达到2-5×10⁶/ml以上时可用于接种山羊痘病毒。所述生物反应器可为5L或100L或其他允许的容量范围。

本发明的山羊痘灭活疫苗是将山羊痘病毒接种BHK-21细胞后，37±0.5℃条件下培养；调pH值在7.2-7.4范围内。更具体地，山羊痘病毒接种BHK-21细胞后，当细胞病变≥75％时，速冻速融2-3次，收获细胞病毒液，再接种BHK-21细胞，培养方法同前，连续传3代，取第3代山羊痘病毒BHK-21细胞毒液，使每0.1ml病毒含量≥10^-4.5TCID₅₀。

本发明还提供了上述山羊痘灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)转瓶培养或悬浮培养BHK-21细胞；

(2)将山羊痘病毒接种BHK-21细胞培养，获得山羊痘病毒BHK-21细胞毒液，再经获得灭活、乳化获得。

其中，步骤(1)转瓶培养BHK-21细胞方法为将BHK-21细胞培养为生长良好的细胞单层，用胰酶消化后加入含2-5％犊牛血清的乳欧液待细胞浓度达2-5×10⁶/ml时，用于接种山羊痘病毒；

步骤(1)悬浮培养BHK-21细胞的方法为：BHK-21细胞生长至细胞单层后在摇瓶中悬浮培养2-5代，当细胞浓度达2-5×10⁶/ml时，转至5L或100L生物反应器中进行细胞扩大培养，待细胞浓度达2-5×10⁶/ml时，转至500L或1000L生物反应器中悬浮培养，当悬浮细胞浓度达到2-5×10⁶/ml以上时可用于接种山羊痘病毒。上述接种细胞浓度优选2×10⁶/ml。

其中，步骤(2)山羊痘病毒接种BHK-21细胞后，37±0.5℃条件下培养15-25h；调pH值在7.1-7.4范围内。

优选地，步骤(2)山羊痘病毒接种BHK-21细胞后，37℃条件下培养20h；调pH值为7.2。

具体地，步骤(2)山羊痘病毒接种BHK-21细胞后，当细胞病变≥75％时，速冻速融2-3次，收获细胞病毒液，再接种BHK-21细胞，培养方法同前，连续传3代，取第3代山羊痘病毒BHK-21细胞毒液，使每0.1ml病毒含量≥10^-4.5TCID₅₀。

在本发明的实施例中，接种用的山羊痘病毒为山羊痘弱毒株AV41，由中国兽医药品监察所提供。

步骤2)所述灭活为向山羊痘病毒BHK-21细胞毒液中加入甲醛，使甲醛终浓度为0.1-0.3％，30-38℃下作用24-36h。优选甲醛终浓度为0.2％，37℃作用24h。

步骤2)所述乳化为油相与灭活后山羊痘病毒BHK-21细胞毒液按照质量比1:1乳化，乳化温度为25-30℃，搅拌时间为0.5-3h，搅拌速度60-150r/min；所述油相为206佐剂。优选搅拌速度120-130r/min。更优选地，搅拌速度为120r/min。

本发明提供的山羊痘油乳剂灭活疫苗的具有如下优点：用BHK-21细胞取代传统的羊睾丸细胞培养山羊痘病毒，完全避免了用同源组织制备疫苗携带病原体的潜在风险，同时又避免了羊睾丸只有在春天才能大量采集的季节性限制，可以大大降低成本。病毒经充分灭活后不存在活病毒，疫苗接种羊体后不会因毒力返强导致羊发病，从根本上能解决疫苗的不安全、不稳定的问题，并且本发明的疫苗可使接种后的羊产生高水平的抗体，获得较好的免疫保护，免疫持续期达12个月。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明采用的山羊痘病毒弱毒株AV41制备疫苗，该弱毒株的编号0302，由中国兽药监察所提供。

实施例1 山羊痘灭活疫苗的制备

1、转瓶细胞病毒毒制备：

取生长良好BHK-21细胞单层，弃去营养液，用胰酶消化好后加入含2％犊牛血清的乳欧液，将生产用山羊痘毒种接种于用胰酶消化好的BHK-21细胞悬液中，补足细胞维持液，置37℃培养，每日观察细胞病变。约20小时后，当细胞病变达到75％时收获病毒培养物。

2、悬浮细胞病毒毒制备：

取工作种细胞1支，复苏贴壁培养2代，细胞生长至单层后再摇瓶中悬浮培养3代，当细胞浓度达到2×10⁶/ml以上转移至5L、100L生物反应器中，进行细胞扩大培养，待细胞浓度达到2×10⁶/ml以上转移至500L、1000L生物反应器悬浮培养，并定时观察细胞。当生物反应器悬浮细胞浓度达到2×10⁶/ml以上，将生产用山羊痘BHK-21细胞毒种，接种于悬浮细胞液中，置37℃培养，定时取样显微镜下观察，20小时内悬浮细胞出现死亡、崩解、破碎，活率小于5％停止培养，收获培养物，取样进行检验。加入山羊痘弱毒株AV41，分散，37℃培养。36小时左右调pH至7.2，4天细胞产生CPE。5天CPE可达75％以上，速冻速融2-3次，收获，再接种BHK-21细胞，同上方法连续传代3代(F3)。将F3分别用BHK_-21细胞和羊睾丸细胞测定TCID₅₀。病毒含量TCID₅₀≥10^-4.5/0.1ml。

3、鉴别检验：将毒液用乳欧液或乳汉液作100倍稀释与等量抗山羊痘病毒特异性血清混合，37℃水浴中和1小时后，接种绵羊睾丸单层细胞，观察5日，不出现细胞病变。

4、山羊痘BHK-21细胞毒液的灭活及灭活检验

加甲醛溶液对BHK-21细胞毒液进行了灭活。具体为向山羊痘病毒BHK-21细胞毒液中加入甲醛，使甲醛终浓度为0.2％，37℃下作用24h。

将灭活后的毒液接入羊睾丸细胞和BHK-21细胞，并设未灭活阳性对照，观察细胞CPE，结果未灭活阳性全部病变，灭活样品无CPE。

5、山羊痘BHK-21细胞油乳剂灭活苗的配制

206佐剂与灭活后山羊痘病毒BHK-21细胞毒液按照质量比1:1乳化，乳化温度为30℃，搅拌时间为2h，搅拌速度为120r/min。

实施例2 山羊痘灭活苗效力检验

山羊痘抗体阴性山羊的筛选：通过反复试验，建立了山羊痘细胞中和试验：将待测羊血清1：4稀释后与200个TCID₅₀的羊痘毒液37℃中和1小时，接入生长良好的牛睾丸细胞，同时设病毒对照、阴性对照、山羊痘阳性血清对照，观察细胞病变，病毒对照出现典型病变，阴性对照、山羊痘阳性血清对照无病变，试验成立。待测羊血清中和样出现病变，则该血清羊痘抗体阴性。对试验用羊进行了山羊痘抗体的测定，成功筛选出了山羊痘抗体阴性的山羊。

按照农业部442号公告《兽用生物制品注册分类及注册资料要求》，对实施例1配制的3批疫苗进行安全和效力检验。选用山羊痘抗体阴性的山羊，每批疫苗腹侧部皮下免疫山羊5只，1mL/只，21天后，连同条件对照羊2只用1000个ID₅₀剂量攻击羊痘强毒(原始种毒AV40,第27代，1983-7-6由中国兽药监察所供应)，分两点，0.5mL/点，腹侧皮内注射，观察15天。结果判定：对照羊2/2出现继发痘反应，免疫羊局部引起轻微红肿反应，经过3-5天自行消退，4/5以上保护，疫苗判为合格。结果3批试验苗5/5保护，对照羊2/2出现继发痘反应。

实施例3 山羊痘灭活疫苗安全性检验

按照农业部442号公告《兽用生物制品注册分类及注册资料要求》，对实施例1配制的3批疫苗进行安全检验，方法如下：

每批疫苗接种山羊痘抗体阴性的山羊2只，3ml/只，腹侧部皮下注射，接种羊，局部引起轻微红肿反应，经过3-5天自行消退，观察15天，不出现继发痘肿。

体重350～450g的健康豚鼠每只皮下注射2ml和18～22g的健康小白鼠每只皮下注射0.5ml，观察7天。

每批灭活抗原注射山羊痘抗体阴性的山羊3只，腹侧部皮内注射，1ml/只，分两点，0.5ml/点，观察15天，不应出现任何特性性症状。安检羊接种部位引起轻微红肿反应，经过3-5天自行消退；免疫羊注射部位引起轻微红肿反应，经过3-5天自行消退。结果显示以上3批实验室配制的山羊痘灭活苗均安全。

实施例4 山羊痘灭活疫苗免疫持续期试验

1、疫苗试验一组苗：实施例1制备的山羊痘BHK-21细胞灭活苗；试验二组苗：羊睾丸组织细胞灭活苗，中牧实业股份有限公司兰州生物药厂质检研发处实验室制备。

2、实验动物挑选品种、来源相同，1-4岁，用细胞中和试验测定山羊痘抗体为阴性的山羊48只。

3、强毒种AV40：由中国兽药监察所提供。用筛选出的山羊痘抗体阴性山羊对中国兽药监察所提供的山羊痘强毒的进行了ID₅₀测定，10^-5、10^-6、10^-7、10^-8每个滴度腹侧皮内接种山羊两只，1mL/只，观察15天，山羊出现继发痘判为阳性。测定了山羊痘强毒的ID₅₀。

4、免疫接种及攻毒将以上48只山羊分成二组，每组各20只，另8只作为非免疫对照。分别用试验一组苗和试验二组苗在腹侧皮内免疫，1ml/只，免疫前、免疫后30天、60天、90天、180天、270天、采血测定抗体，在免疫后第3、6、9、12月分别从每试验组随机拉羊5只，连同条件相同的对照2只，用1000ID₅₀的AV40攻毒，观察保护情况。

5、对羊的免疫保护结果：从下表可以看出，两组苗在免疫后3个月，6个月，9个月，12个月后都能达到4/5以上保护，而非免疫对照组在3个月，6个月，9个月，12个月都是2/2全身发痘，说明用该两组苗免疫山羊后12个月都能有效抵抗强毒株的攻击，使羊只处于很好的免疫状态，因此将两组苗的免疫持续期定为12个月是可靠、准确的。

表1

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种山羊痘灭活疫苗，其特征在于，是将山羊痘病毒接种BHK-21细胞培养，获得山羊痘病毒BHK-21细胞毒液，再经灭活、乳化获得。

2.制备权利要求1所述山羊痘灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)转瓶培养或悬浮培养BHK-21细胞；

(2)将山羊痘病毒接种BHK-21细胞培养，获得山羊痘病毒BHK-21细胞毒液，再经灭活、乳化获得。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)转瓶培养BHK-21细胞方法为将BHK-21细胞培养为生长良好的细胞单层，用胰酶消化后加入含2-5％犊牛血清的乳欧液，待细胞浓度达2-5×10⁶/ml时用于接种山羊痘病毒；

悬浮培养BHK-21细胞的方法为：BHK-21细胞生长至细胞单层后在摇瓶中悬浮培养2-5代，当细胞浓度达2-5×10⁶/ml时，转至生物反应器中进行细胞扩大培养，当悬浮细胞浓度达到2-5×10⁶/ml时可用于接种山羊痘病毒。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中悬浮培养BHK-21细胞的方法中，当悬浮细胞浓度达到2-5×10⁶/ml时接种山羊痘病毒。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)山羊痘病毒接种BHK-21细胞后，37±0.5℃条件下培养15-25h；调pH值在7.1-7.4范围内。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)山羊痘病毒接种BHK-21细胞后，37℃条件下培养20h；调pH值为7.2。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)山羊痘病毒接种BHK-21细胞后，当细胞病变≥75％时，速冻速融2-3次，收获细胞病毒液，再接种BHK-21细胞，培养方法同前，连续传3代，取第3代山羊痘病毒BHK-21细胞毒液，使每0.1ml病毒含量≥10^-4.5TCID₅₀。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述灭活为向山羊痘病毒BHK-21细胞毒液中加入甲醛，使甲醛终浓度为0.1-0.3％，30-38℃下作用24-36h。

9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述乳化为油相与灭活后山羊痘病毒BHK-21细胞毒液按照质量比1:1乳化，乳化温度为25-30℃，搅拌时间为0.5-3h，搅拌速度60-150r/min。

10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的山羊痘病毒为山羊痘弱毒株AV41。