CN102743750B - 一种复方免疫增强剂、禽用疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及复方免疫增强剂及其在制备兽用疫苗中的应用。复方免疫增强剂含有5ng～10mg/mL的聚肌胞、10ng～10mg/mL的胞壁酰二肽、10ng～5mg/mL的左旋咪唑、10ng～5mg/mL的雷西莫特和10ng～5mg/mL咪喹莫特。本免疫增强剂与H5亚型禽流感灭活疫苗混合，可使提前1周产生抗体，抗体效价提高1.8log2以上。含有以上复方疫苗免疫增强剂的H5亚型禽流感疫苗、H9亚型禽流感疫苗或传染性支气管炎疫苗免疫鸡后，均可缩短抗体产生的窗口期，提高疫苗的抗体效价，免疫持续期延长，降低感染发病的几率。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及复方免疫增强剂。
背景技术
现有各类兽用疫苗主要包括活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗。灭活疫苗因其安全性，得到广泛的应用。常用的兽用灭活疫苗和亚单位疫苗均只能激发机体产生体液免疫，且激发机体产生抗体的时间较长，一般需要在免疫后3~4周达到各类疫苗规定的抗体效价。在这段缺乏免疫保护窗口期，存在巨大疫病风险。如高致病性禽流感常规疫苗，其免疫后抗体效价达到我国规定的保护标准要求（7log2）至少需要3周，而在这3周的窗口期内一旦发生高致病性禽流感，将会导致灾难性后果，对养殖户和养禽业造成重大损失。更重要的是，由于禽流感病毒对人具有感染性，因此，发生高致病性禽流感，亦对公共卫生安全造成严重威胁。因此，缩短现有禽流感疫苗免疫后的窗口期，具有重要意义。同时，提高禽流感疫苗的抗体效价和免疫持续期，可以减少免疫次数，减少人力和物力投入，并降低免疫带来的应激反应，这对于临床生产具有重要经济意义。
H9亚型禽流感是危害养禽业发展的重要传染病之一。现有H9亚型禽流感疫苗在免疫后3至4周才能达到国家规定的7log2的抗体水平要求。而在此期间，一直处于免疫保护的窗口期，受H9亚型禽流感的威胁。因此，临床生产亟需一种能提高现有禽流感疫苗抗体效价的免疫增强剂。
现有传染性支气管炎疫苗需用弱毒活疫苗进行基础免疫，再用灭活疫苗加强免疫才能获得较好的免疫效果。采用两次免疫法，导致出现至少1个月的免疫保护窗口期，而且传支弱毒活疫苗易受母源抗体的干扰，导致免疫失败。
现用兽用疫苗利用矿物油包被水相抗原制成油乳剂疫苗，矿物油的主要作用是暂时储存抗原，提高疫苗抗原的缓释性。以矿物油为递送系统的各类灭活油乳剂疫苗激发机体产生的抗体效价不高，特别是类似传支病毒免疫原性不强的抗原，且抗体维持时间较短，几乎不能激发机体产生有效的细胞免疫。
因此，临床亟需一种能提高现有灭活疫苗免疫效果，缩短免疫保护窗口期，具有较长抗体维持期，并能提高灭活疫苗细胞免疫效果的免疫增强剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种复方免疫增强剂，该复方免疫增强剂能够使疫苗的免疫窗口期缩短，显著提高抗体效价，延长抗体持续期。
本发明的另一目的是提供所述复方免疫增强剂的制备方法，该方法简单，易操作。
本发明的另一目的是提供一种含有所述的复方免疫增强剂的禽用疫苗，该禽用疫苗的免疫窗口期短，抗体效价高，抗体持续期长。
本发明的再一目的是提供所述禽用疫苗的制备方法，该方法简单，易操作。
本发明提供一种复方免疫增强剂，该复方免疫增强剂含有5ng～10mg/mL的聚肌胞、10ng～10mg/mL的胞壁酰二肽、10ng～5mg/mL的左旋咪唑、10ng～5mg/mL的雷西莫特和10ng～5mg/mL咪喹莫特。
所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的质量浓度比为1:（1～10）:（1～10）:(1～10):(1～10)。
所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的质量浓度比为1:(2～5):(2～5):(3～6):(3～6)。
本发明还提供一种制备所述复方免疫增强剂的方法，包括下述步骤：
（1）配制水相溶液：在磷酸盐缓冲液中加入聚肌胞、胞壁酰二肽和左旋咪唑，然后加入吐温-80，配制成水相溶液；
（2）配制油相溶液：在白油中加入雷西莫特、咪喹莫特，然后加入司盘-80配制成油相溶液；
（3）将所述水相溶液与油相溶液充分混合，即得所述复方免疫增强剂。
本发明还提供一种禽用疫苗，所述禽用疫苗中含有5ng～10mg/mL的聚肌胞、10ng～10mg/mL的胞壁酰二肽、10ng～5mg/mL的左旋咪唑、10ng～5mg/mL的雷西莫特和10ng～5mg/mL咪喹莫特；所述禽用疫苗中还含有灭活疫苗抗原。
所述禽用疫苗中聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的质量浓度比为1:(1～10):(1～10):(1～10): (1～10)。
所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的质量浓度比为1:(2～5):(2～5):(3～6):(3～6)。
所述禽用疫苗为H5亚型禽流感疫苗、H9亚型禽流感疫苗或传染性支气管炎疫苗。
本发明还提供一种制备所述禽用疫苗的方法，包括下述步骤：
（1）配制水相溶液：在磷酸盐缓冲液中加入聚肌胞、胞壁酰二肽和左旋咪唑，然后加入吐温-80，配制成水相溶液；
（2）在所述水相溶液中加入灭活疫苗抗原，混匀后得到灭活抗原溶液；
（3）配制油相溶液：在白油中加入雷西莫特、咪喹莫特，然后加入司盘-80配制成油相溶液；
（4）将所述灭活抗原溶液与油相溶液充分混合，即得所述复方免疫增强剂。
有益效果：本发明的复方免疫增强剂，由于其各成分的协同作用，使疫苗的免疫窗口期缩短，显著提高抗体效价，延长抗体持续期。本发明复方免疫增强剂与H5亚型禽流感灭活疫苗混合使用免疫鸡，与常规疫苗比较，抗体产生提前1周，即免疫窗口期缩短1周，提高抗体效价1.8log2以上，抗体持续期延长1个月。本发明复方免疫增强剂与传染性支气管炎灭活疫苗M41混合使用仅免疫一次，免疫鸡后4周的抗体效价，与常规操作的两次免疫后的抗体效价相当。本发明含有该复方免疫增强剂的禽用疫苗的免疫窗口期短，抗体效价高，抗体持续期长。所述禽用疫苗的制备方法，简单，易操作。
附图说明
图1显示各组免疫后血清HI抗体效价。
图2 显示免疫后HI抗体持续期。
图3显示各组免疫后血清HI抗体效价。
具体实施方式
实施例1 复方免疫增强剂、禽用疫苗的配制
（1） 试验材料
聚肌胞、咪喹莫特、雷西莫特、胞壁酰二肽，以及抗寄生虫类药物左旋咪唑购自SIGMA公司。白油购自法国埃索公司，吐温-80和司盘-80购自广东肇庆超能实业有限公司。配制磷酸盐缓冲液的无机盐购自国药集团化学试剂有限公司。
（2） 试验方法
水相溶液的配制：首先配制磷酸盐（PBS）缓冲液，其配方中含Na2HPO4为1.44g/L，KH2PO4为1.44g/L，NaCl为8g/L，KCl为0.2g/L，以双蒸水溶解上述盐，调整pH为7.0，灭菌后备用。然后在所述PBS缓冲液中加入聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑，然后加入吐温-80，配制成水相溶液，所述吐温-80在水相溶液的体积百分含量为4%。
油相溶液的配制：在白油中加入雷西莫特、咪喹莫特和司盘-80配制成油相溶液，司盘-80在油相溶液中的体积百分含量为4%。
将所述水相溶液和油相溶液混合均匀，配制成含有5ng～10mg/mL聚肌胞、10ng～10mg/mL胞壁酰二肽、10ng～5mg/mL左旋咪唑、10ng～5mg/mL雷西莫特和10ng～5mg/mL咪喹莫特的复方免疫增强剂。
所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的质量浓度比为1:(1～10):(1～10):(1～10):(1～10)。
所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的质量浓度比为1:(2～5):(2～5):(3～6):(3～6)。
禽用疫苗中含有5ng～10mg/mL的聚肌胞、10ng～10mg/mL的胞壁酰二肽、10ng～5mg/mL的左旋咪唑、10ng～5mg/mL的雷西莫特和10ng～5mg/mL咪喹莫特；所述禽用疫苗中还含有灭活疫苗抗原。该禽用疫苗含有上述复方免疫增强剂。为了与现有疫苗相区分，在实施例2－5中将该禽用疫苗均称为含有复方免疫增强剂的禽用疫苗。
所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的质量浓度比为1:(1～10):(1～10):(1～10):(1～10)。
所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的质量浓度比为1:(2～5):(2～5):(3～6):(3～6)。
所述禽用疫苗为H5亚型禽流感疫苗、H9亚型禽流感疫苗或传染性支气管炎疫苗。
制备禽用疫苗的方法：
第一种方法，配制母液，所述母液的成分与所述复方免疫增强剂相同，所述母液中聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、咪喹莫特、雷西莫特浓度为禽用疫苗中相应物质浓度的10倍；将所述母液与现有疫苗按照体积比为1:9混合均匀，即得到禽用疫苗。饲养户在实际操作过程中，能够将该复方免疫增强剂与各种现有疫苗混合使用，操作方便，灵活。
第二种方法，包括如下步骤：（1）配制水相溶液：在磷酸盐缓冲液中加入聚肌胞、胞壁酰二肽和左旋咪唑，然后加入吐温-80，配制成水相溶液；（2）在所述水相溶液中加入灭活疫苗抗原，混匀后得到灭活抗原溶液；（3）配制油相溶液：在白油中加入雷西莫特、咪喹莫特，然后加入司盘-80配制成油相溶液；（4）将所述灭活抗原溶液与油相溶液充分混合，即得禽用疫苗。这种方法，对于疫苗生产企业来说，操作更加的方便易行。
采用上述两种方法制备的相同配方的禽用疫苗，在免疫效果上相同。特别列举出两种方法，是为了满足不同用户操作方便的需要。
配制禽用疫苗：H5亚型禽流感疫苗、H9亚型禽流感疫苗和传染性支气管炎疫苗。各种禽用疫苗分别配制三种配方：禽用疫苗A、B和C。禽用疫苗A中聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、咪喹莫特、雷西莫特的浓度分别为：5ng/mL、10ng/mL、10ng/mL、15ng/mL和15ng/mL，将禽用疫苗A简称为A-VA1；禽用疫苗B中聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、咪喹莫特、雷西莫特的浓度分别为1μg/mL、5μg/mL、5μg/mL、6μg/mL和6μg/mL，将禽用疫苗B简称为B-VA1；禽用疫苗C中聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、咪喹莫特、雷西莫特的浓度分别为1mg/mL、4mg/mL、4mg/mL、4mg/mL和4mg/mL，将禽用疫苗C简称为C-VA1。
本实施例中的重量单位根据配制体积，可以为纳克、微克、毫克或克。
本实施例中，免疫增强剂的各组分可以在给出的配比范围内灵活进行组合，在此不一一例举。除添加上述免疫增强剂成分外，以上方法制备疫苗是熟悉本领域的技术人士所知悉的常规方法。
实施例2 复方免疫增强剂对H5亚型禽流感疫苗免疫效力和抗体持续期的影响
（1）试验材料
采用现有的H5亚型禽流感疫苗，按照实施例1第一种方法制备含复方免疫增强剂的H5亚型禽流感疫苗A、B和C。H5亚型禽流感疫苗A、B和C分别简称A-VA1-Re5、B-VA1-Re5、C-VA1-Re5。H5亚型禽流感疫苗和H5亚型禽流感标准检测抗原均购自哈尔滨维科生物技术开发公司。制苗用白油购自法国埃索公司（Esso, Marcol 52），吐温-80和司盘-80购自广东肇庆超能实业有限公司。无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）鸡系从北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购买鸡胚，经自行孵化后于隔离器内饲养，饲养至28日龄待用。
（2）试验方法
免疫和分组：根据“规程”， 4周龄鸡免疫0.3mL/鸡，5周龄以上的鸡按0.5mL/鸡免疫，免疫途径为肌肉或皮下注射。本次试验取35日龄鸡，经颈部皮下途径按0.3mL/鸡接种，设立含复方免疫增强剂的A-VA1-Re5、B-VA1-Re5、C-VA1-Re5疫苗组和H5亚型禽流感疫苗组（现有疫苗，缩写为Re-5常规苗组）、以及空白对照组（不免疫），共5组，各免疫组均有20只鸡，空白对照组10只鸡。
（3）复方免疫增强剂对H5亚型禽流感疫苗免疫效力的影响
采血和抗体效价检测：免疫后第2周和第3周经静脉采血，分离血清，用H5亚型禽流感标准检测抗原，采用微量血凝抑制试验(HI)检测血清抗体效价，HI检测方法参考2010年版《中国兽药典》。根据每组鸡的几何平均抗体效价（GMT）和方差（SD），比较复方免疫增强剂对现有H5亚型禽流感疫苗的免疫增强效果。
结果
在免疫后2周，含复方免疫增强剂的疫苗组的抗体效价高于常规疫苗效价至少1.6log2，达到或高于常规疫苗免疫后3周的抗体效价，与规程要求的常规疫苗免疫后3周的合格抗体效价（7log2）一致。即含复方免疫增强剂的疫苗能将免疫窗口期缩短1周。免疫后3周，含免疫复方增强剂的疫苗组的抗体效价均高于常规疫苗组抗体效价，含免疫复方增强剂疫苗组之间的几何平均抗体效价相当，而常规疫苗刚达到规程要求的合格水平，详见图1。经One-Way ANOVA，Tukey分析表明，含复方免疫增强剂疫苗的抗体效价与常规疫苗组抗体效价差异显著（P＜0.05）。在图1中以*表示。
试验结果表明，不同剂量的复方免疫增强剂配方均能提高H5亚型禽流感疫苗抗体效价，具有明显的免疫增强作用，且能缩短免疫窗口期。
（4）复方免疫增强剂对H5亚型禽流感疫苗的抗体持续期的影响
采血和抗体效价检测：免疫后第2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24周经静脉采血，分离血清，用H5亚型禽流感标准检测抗原，采用微量血凝抑制试验(HI)检测血清抗体效价。
结果和结论
从免疫后2周开始检测抗体，含复方免疫增强剂的H5亚型禽流感疫苗在免疫后的抗体均高于常规疫苗组。A-VA1-Re5疫苗组在免疫后2~18周抗体效价在7log2以上，B-VA1-Re5疫苗组在免疫后2~20周抗体效价在7log2以上，C-VA1-Re5疫苗组在免疫后2~22周抗体效价均在7log2以上，均符合规程要求。而常规疫苗免疫后仅在第3周到第6周抗体效价维持在7log2，此后抗体效价持续下降至4log2。详见图2。
试验结果表明，本发明中的复方免疫增强剂能缩短现有H5亚型禽流感疫苗免疫窗口期1周，提高H5亚型禽流感疫苗抗体效价，并在后续的抗体持续期中比常规疫苗维持较高的效价长达14-18周，具有显著的免疫增强作用。
实施例3复方免疫增强剂对H9亚型禽流感疫苗免疫效力的影响
（1）试验材料
采用现有的H9亚型禽流感疫苗，按照实施例1第一种方法制备含复方免疫增强剂的H9亚型禽流感疫苗A、B和C。含复方免疫增强剂的H9亚型禽流感疫苗A、B和C分别简称为A-VA1-H9、B-VA1-H9、C-VA1-H9。现有的H9亚型禽流感疫苗和H9禽流感检测抗原均购自南京天邦生物科技有限公司。
（2）试验方法
免疫和分组：根据《兽用生物制品质量标准汇编（2006-2008）》，简称“规程”， 4周龄鸡免疫0.3mL/鸡，5周龄以上的鸡按0.5mL/鸡免疫，免疫途径为肌肉或皮下注射。本次试验取35日龄鸡，经颈部皮下途径按0.3mL/鸡接种，设立含A-VA1-H9、B-VA1-H9、C-VA1-H9组和H9常规疫苗组以及空白对照组（不免疫），共5组，各免疫组每组各20只鸡，空白对照组10只鸡。H9常规疫苗组采用现有的H9亚型禽流感疫苗，由南京天邦生物科技有限公司提供。
采血和抗体效价检测 免疫后第2、3、4周经静脉采血，分离血清，用H9禽流感检测抗原，采用微量血凝抑制试验(HI)检测血清抗体效价。根据每组鸡的几何平均效价和方差，比较免疫增强剂对疫苗的免疫增强效果。
（3）结果和结论
抗体效价 在免疫后2周，含复方免疫增强剂的疫苗组的抗体效价高于常规疫苗效价至少0.8log2，接近于常规疫苗免疫后3周的抗体效价。含复方免疫增强剂的疫苗能将免疫窗口期缩短1周。免疫后3和4周，含复方免疫增强剂疫苗组的抗体效价均高于常规疫苗组抗体效价，含复方免疫增强剂疫苗组之间的几何平均抗体效价相当，详见图3。经One-Way ANOVA，Tukey分析，含免疫增强剂疫苗的抗体效价与常规疫苗组抗体效价差异显著（P＜0.05）。在图3中以*表示。
试验结果表明，复方免疫增强剂能提高H9亚型禽流感疫苗抗体效价，具有明显的免疫增强作用，且能缩短免疫窗口期1周。
实施例4 复方免疫增强剂提高传染性支气管炎疫苗M41株免疫效力试验
（1）试验材料
传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus, IBV）H120株和M41株购自中国兽医药品监察所，经本室用11日龄无特定病原（Specific Pathogen Free，SPF）鸡胚繁殖制备。
传染性支气管炎病毒M41株灭活疫苗抗原的制备方法：抗原系用M41病毒经接种11日龄SPF鸡胚扩繁后，经初步离心除杂处理后M41株抗原含量为107.2个鸡胚半数感染量/0.1mL（107.2EID50/0.1mL)，β-丙内脂灭活。
传染性支气管炎病毒H120株疫苗抗原的制备方法：抗原系用H120病毒经接种11日龄SPF鸡胚扩繁后，经初步离心除杂处理后H120株抗原含量为106.8个鸡胚半数感染量/0.1mL（106.8EID50/0.1mL)。
传染性支气管炎诊断抗原采用荷兰BioChek国际通用进口的M41传染性支气管炎标准抗原作为血凝抑制抗原。
SPF鸡系从北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购买鸡胚，经自行孵化后于隔离器内饲养至使用。制苗用白油购自法国埃索公司，吐温-80和司盘-80购自广东肇庆超能实业有限公司。
（2）试验方法
采用传染性支气管炎病毒M41株灭活疫苗抗原，并参考“规程”，调整抗原用量达到规程要求，按照实施案例1第二种方法制备含复方免疫增强剂的传染性支气管炎疫苗A、B和C。所述含复方免疫增强剂的传染性支气管炎疫苗A、B和C，分别缩写为A-VA1-M41、B-VA1-M41和C-VA1-M41。
H120株活疫苗的制备方法：按照规程制备的不含免疫增强剂的H120株活疫苗。
M41常规灭活苗的制备方法：按照规程制备的不含免疫增强剂的M41常规灭活苗。
免疫和分组：参考 “规程”，取1月龄SPF鸡，共分为6组，10只鸡/组。其中1组用H120株活疫苗按1羽份/鸡进行首免。其余5组不免，并与H120株活疫苗免疫组隔离饲养。经H120株活疫苗免疫的10只鸡在免疫后21天采血，此时鸡为51日龄，再经颈部皮下免疫M41常规灭活苗，0.3mL/鸡。未免疫的5组鸡中，任意选4组分别命名为A-VA1-M41组、B-VA1-M41组、C-VA1-M41组和M41常规灭活苗组，各组鸡在51日龄时分别免疫对应于组名的疫苗A-VA1-M41、B-VA1-M41、C-VA1-M41和M41常规灭活苗。另外留一组鸡不免作为空白对照。
采血和抗体效价检测 在51日龄仅对H120首免组的鸡进行采血，在79日龄，对每只鸡进行采血，用传染性支气管炎诊断抗原测定各组鸡的血清抗体效价，比较HI抗体水平。用M41传染性支气管炎标准抗原，采用微量血凝抑制试验(HI)检测血清抗体效价。
（3）结果和结论
本次试验中，空白对照鸡的HI效价较低，经H120株活疫苗作基础免疫后再用M41常规灭活苗加强免疫（缩写为H120+M41二免），其抗体水平高于H120首免6.5倍（27.73/25.04=22.69≈6.5），符合规程中至少提高3倍抗体效价的要求。
A-VA1-M41（7.82log2）、B-VA1-M41（7.89log2）和C-VA1-M41（8.04log2）组免后28天，鸡只的HI平均抗体效价均略高于与H120+M41加强免疫组（7.732log2），远高于M41常规灭活苗免疫组（4.37log2）和H120首次免疫时的效价（5.04log2）。含复方免疫增强疫苗组与M41常规灭活苗比较，经One-Way ANOVA,Tukey分析，差异极显著，P＜0.0001。详见表1。
试验结果表明，含复方免疫增强剂的传染性支气管炎疫苗免疫后能达到与H120株活疫苗作基础免疫再用M41常规灭活苗加强免疫的效果，复方免疫增强剂能显著增强M41疫苗的免疫效果。H120株活疫苗作基础免疫再用M41常规灭活苗加强免疫的方法，不仅操作麻烦，而且首免后的效价很低，免疫窗口期较长，如果采用含复方免疫增强剂的传染性支气管炎疫苗，不仅能够缩短免疫窗口期，而且操作简单。
表1免疫IB疫苗后鸡血清的HI效价
注：a,针对IB病毒的HI效价低于2log2，判为非特异性血凝，故对照组不计平均血凝价。
“***”表示,与M41常规灭活苗比较，经One-Way ANOVA,Tukey分析，差异极显著，P＜0.0001。
实施例5 安全性检测
（1）试验材料
参照实施例2方法制备A-VA1-Re5、B-VA1-Re5、C-VA1-Re5。SPF鸡系从北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购买鸡胚，经自行孵化后于隔离器内饲养至使用。
（2）试验方法
将28日龄SPF鸡分成140只。各种疫苗免疫组，10只鸡/组。对照组20只鸡。A-VA1-Re5组、B-VA1-Re5组、C-VA1-Re5组均在第28天免疫一次与组名相对应的疫苗，每只鸡经颈部皮下免疫0.3mL疫苗；Re-5组在第28天免疫一次现有的H5亚型禽流感疫苗，每只鸡经颈部皮下免疫0.3mL疫苗。2A-VA1-Re5组（免疫A-VA1-Re5）、2B-VA1-Re5组（免疫B-VA1-Re5）、2C-VA1-Re5组（免疫C-VA1-Re5）和2Re-5组（免疫现有的H5亚型禽流感疫苗）在第28天均免疫一次，每只鸡经颈部皮下免疫0.6mL疫苗。A-VA1-Re5+A-VA1-Re5组（免疫A-VA1-Re5）、B-VA1-Re5+B-VA1-Re5组（免疫B-VA1-Re5）、C-VA1-Re5+C-VA1-Re5组（免疫C-VA1-Re5）和Re-5+Re-5（免疫现有的H5亚型禽流感疫苗）组经2次免疫，第一次在第28天，每只鸡经颈部皮下免疫0.3mL疫苗，过14天后，即42日龄，每只鸡经颈部皮下再免疫0.3mL疫苗。
一次免疫组，包括一次免疫0.3mL疫苗组和0.6mL疫苗组，均在免疫后第7天和第14天分别从各组中随机抽出5只，另从对照组中随机抽出5只，扑杀，观察疫苗吸收情况。
两次免疫组，在第二次免疫结束后，第7天和第14天分别从各组中随机抽出5只，另从对照组中随机抽出5只，扑杀，观察疫苗吸收情况。
免疫后连续观察14天，记录是否出现任何发病症状，以及采食和饮水情况。
（3） 结果和结论
1．连续观察14天，所有鸡只饮水采食正常，无任何异常情况。
2.一次免疫0.3mL组疫苗吸收情况。在免疫后第7天，从A-VA1-Re5组、B-VA1-Re5组、C-VA1-Re5组和Re-5组，对照组随机抽取5只，经扑杀，剖检疫苗注射部位的疫苗吸收情况。各疫苗免疫组在疫苗注射部位含有一些淡黄色米粒或粟粒大小类似脂肪样颗粒物。空白对照组无此淡黄色米粒大小类似脂肪样颗粒物。在免疫后第14天，扑杀每组余下的5只鸡，仅B-VA1-Re5组和C-VA1-Re5组中各有1只鸡在注射部位含有淡黄色粟粒大小类似脂肪样颗粒物，其余鸡均与空白对照无异。详见表2。
3.一次免疫0.6mL组疫苗吸收情况。在免疫后第7天，从2A-VA1-Re5组、2B-VA1-Re5、2C-VA1-Re5组和2Re-5，对照组随机抽取5只，经扑杀，剖检疫苗注射部位的疫苗吸收情况。各疫苗免疫组均在疫苗注射部位含有少量粟粒大小乳白色颗粒，部分鸡含有米粒大小或粟粒大小淡黄色类似脂肪样颗粒物。空白对照组正常。在免疫后第14天，扑杀每组余下的5只鸡，个别免疫组的鸡含有米粒大小或粟粒大小淡黄色类似脂肪样颗粒物，其余正常。空白组正常。详见表2。
4.二次免疫组疫苗吸收情况。在第二次免疫后第7天，从A-VA1-Re5+ A-VA1-Re5组、B-VA1-Re5+B-VA1-Re5组、C-VA1-Re5+C-VA1-Re5组和Re-5+Re5以及对照组各抽取5只，经扑杀剖检疫苗注射部位吸收情况。各疫苗免疫组均在疫苗注射部位含有少量粟粒大小乳白色颗粒，部分鸡含有米粒大小或粟粒大小淡黄色类似脂肪样颗粒物。空白对照组正常。在免疫后第14天，扑杀每组余下的5只鸡，个别免疫组的鸡含有米粒大小或粟粒大小淡黄色类似脂肪样颗粒物，其余正常。空白组正常。详见表2。
5.免疫后饮水采食等状况提示，含免疫增强剂的疫苗免疫后对鸡的正常饮食不产生明显影响。根据含免疫增强剂疫苗组与常规疫苗组经0.3mL和0.6mL免疫一次，以及0.3mL免疫二次剖检后的结果比对，含复方免疫增强剂疫苗组的吸收与常规疫苗组无明显差异。结果提示，免疫增强剂不影响疫苗的正常吸收，含免疫增强剂疫苗对免疫鸡安全。
表2鸡疫苗吸收情况
本发明的实施方式仅用于举例说明本发明的目的，但不构成本发明在除鸡之外其他禽类、家畜或宠物上使用的限制，亦不构成本发明在其他兽用疫苗抗原上使用的限制。
Claims (8)
1.一种复方免疫增强剂，其特征在于该复方免疫增强剂含有5ng～10mg/mL的聚肌胞、10ng～10mg/mL的胞壁酰二肽、10ng～5mg/mL的左旋咪唑、10ng～5mg/mL的雷西莫特和10ng～5mg/mL咪喹莫特。
2.根据权利要求1所述复方免疫增强剂，其特征在于所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的质量浓度比为1:（1～10）:（1～10）:(1～10):(1～10)。
3.根据权利要求2所述的复方免疫增强剂，其特征在于：所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的质量浓度比为1:(2～5):(2～5):(3～6):(3～6)。
4.一种制备权利要求1所述复方免疫增强剂的方法，包括下述步骤：
(1)配制水相溶液：在磷酸盐缓冲液中加入聚肌胞、胞壁酰二肽和左旋咪唑，然后加入吐温-80，配制成水相溶液；
(2)配制油相溶液：在白油中加入雷西莫特、咪喹莫特，然后加入司盘-80配制成油相溶液；
(3)将所述水相溶液与油相溶液充分混合，即得所述复方免疫增强剂。
5. 一种禽用疫苗，其特征在于所述禽用疫苗中含有5ng～10mg/mL的聚肌胞、10ng～10mg/mL的胞壁酰二肽、10ng～5mg/mL的左旋咪唑、10ng～5mg/mL的雷西莫特和10ng～5mg/mL咪喹莫特；所述禽用疫苗中还含有灭活疫苗抗原，所述禽用疫苗为H5亚型禽流感疫苗、H9亚型禽流感疫苗或传染性支气管炎疫苗。
6.根据权利要求5所述禽用疫苗，其特征在于所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的质量浓度比为1:(1～10):(1～10):(1～10): (1～10)。
7.根据权利要求6所述禽用疫苗，其特征在于：所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的质量浓度比为1:(2～5):(2～5):(3～6):(3～6)。
8.一种制备权利要求5所述禽用疫苗的方法，包括下述步骤：
（1）配制水相溶液：在磷酸盐缓冲液中加入聚肌胞、胞壁酰二肽和左旋咪唑，然后加入吐温-80，配制成水相溶液；
（2）在所述水相溶液中加入灭活疫苗抗原，混匀后得到灭活抗原溶液；
（3）配制油相溶液：在白油中加入雷西莫特、咪喹莫特，然后加入司盘-80配制成油相溶液；
（4）将所述灭活抗原溶液与油相溶液充分混合，即得所述禽用疫苗；
所述禽用疫苗为H5亚型禽流感疫苗、H9亚型禽流感疫苗或传染性支气管炎疫苗。
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