CN109355334A - 一种制备聚肌胞的方法 - Google Patents

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郑其升
许梦微
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Abstract

本发明提供一种制备聚肌胞的方法，涉及生物技术领域，具体涉及一种制备聚肌胞的方法。该制备聚肌胞的方法，包括如下步骤：（1）分别合成聚肌苷酸Poly I和聚胞苷酸尿苷酸Poly CnU，所述Poly CnU中每n个连续的胞苷酸后插入了1个尿苷酸；（2）将聚胞苷酸尿苷酸Poly CnU和聚肌苷酸Poly I退火形成错配的双链核糖核酸Poly I:CnU；（3）将双链核糖核酸Poly I:CnU采用S1核酸酶进行酶切，得到片段大小为n bp的聚肌胞。本发明制备聚肌胞的方法，操作简单，可获得长度一致的聚肌胞。

Description

一种制备聚肌胞的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种制备聚肌胞的方法。
背景技术
聚肌苷酸胞苷酸（简称聚肌胞，Poly I:C）是一种安全高效的先天免疫激活剂，具有广谱抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、增强机体免疫力等多种功能，全球市场容量潜力估值为每年数百亿美元。医学临床上，可用于慢性乙型肝炎、流行性出血热、流行性乙型脑炎、病毒性角膜炎等病毒性疾病治疗，对乳腺癌、前列腺癌等肿瘤的辅助性治疗已处于III期临床实验阶段。兽医临床上，可用于口蹄疫、禽流感、猪瘟等病毒性疫病的预防和治疗，亦可提高畜禽疫苗免疫效力。聚肌胞使用方便、广泛，可以与许多药物同时使用，具有协同或相加作用。无种属特异性，可广泛在家禽、猪、牛等动物上使用，同时还具有抗病毒谱广，毒性小、安全范围大的优点。
上世纪六十年代，Field等成功研制出合成聚肌胞方法。其基本工艺流程是：先分别合成聚肌苷酸（Poly I）和聚胞苷酸（Poly C）单链，然后将之混合退火获得双链聚肌胞。经过几十年的发展，聚肌胞工业化生产已十分成熟。但是，现有生产方法所获得的聚肌胞分子量范围为0.05kb~8.0kb、是长度不一的混合物。50多年来，国内外学者曾尝试各种分离纯化方法，但至今尚未解决。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备聚肌胞的方法，该方法操作简单，可获得长度一致的聚肌胞。
本发明的目的采用下述技术方案实现。
一种制备聚肌胞的方法，包括如下步骤：
（1）分别合成聚肌苷酸Poly I和聚胞苷酸尿苷酸Poly CnU，所述Poly CnU中每n个连续的胞苷酸后插入了1个尿苷酸；
（2）将聚胞苷酸尿苷酸Poly CnU和聚肌苷酸Poly I退火形成错配的双链核糖核酸PolyI:CnU；
（3）将双链核糖核酸Poly I:CnU采用S1核酸酶进行酶切，得到片段大小为n bp的聚肌胞。
在本发明中，n为自然数且12≤n≤1000。
在本发明中，酶切体系包括如下组分：15mg/ml的Poly I:CnU 25μl，10×酶切缓冲液5μl，180U/μl的S1核酸酶1μl，ddH2O 19μl。
优选的技术方案中，所述酶切条件为55-65℃金属浴，酶切反应时间为10min。
本发明巧妙地通过调整投料比，控制聚胞苷酸尿苷酸Poly CnU链中胞苷酸的长度。再将错配的双链核糖核酸采用S1核酸酶进行酶切，获得了片段大小一致的聚肌胞，从而控制聚肌胞的质量及药效。申请人发现，采用其他单链特异性核酸酶进行酶切，并不能获得片段大小一致的聚肌胞。本发明方法简单，易于操作，具有可设计性，能够获得长度一致，结构均一的聚肌胞，且免疫效果不受影响，解决了50多年来尚未解决的技术难题。
附图说明
图1 错配的双链核糖核酸Poly I:C12U的结构示意图。
图2不同单链特异性核酸酶对Poly I:C12U进行酶切所得产物的电泳图，泳道1为500bp Marker；泳道2为Poly I:C12U；泳道3为Poly I:C12U的S1核酸酶酶切产物；泳道4、5、6分别为Poly I:C12U的绿豆芽核酸酶酶切产物、Poly I:C12U的P1核酸酶酶切产物、Poly I:C12U的核糖核酸酶A酶切产物，泳道7为聚肌胞Poly I:C，泳道8为聚肌胞Poly I:C的S1核酸酶酶切产物。
图3 利用S1核酸酶对Poly I:C500U进行酶切所得产物的电泳图，其中泳道1为2000bpMarker，泳道2为Poly I:C500U，泳道3为Poly I:C500U的S1核酸酶酶切产物。
图4 各组仔猪免疫后的抗体水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此 ：
实施例1制备片段大小为12bp的聚肌胞
本实施例说明采用S1核酸酶酶切错配的双链核糖核酸Poly I:C12U，获得片段大小为12bp的聚肌胞的步骤：
（1）合成错配的双链核糖核酸Poly I:C12U。
送南京金斯瑞生物科技有限公司合成错配的双链核糖核酸Poly I:C12U，片段大小为50bp～5000bp。
双链核糖核酸Poly I:C12U制备方法如下：将胞嘧啶（C）与尿嘧啶（U）按照12:1 的摩尔比进行投料，合成聚胞苷酸尿苷酸Poly C12U。聚胞苷酸尿苷酸Poly C12U中每12个连续的胞苷酸后插入了1个尿苷酸。另外，合成聚肌苷酸PolyI。将聚胞苷酸尿苷酸Poly C12U与聚肌苷酸PolyI退火形成错配的双链核糖核酸Poly I:C12U，退火温度为60℃，退火时间为45s。Poly C12U与Poly I链经碱基配对形成双链时，插入的尿嘧啶导致碱基失配，形成错配的双链核糖核酸PolyI:C12U，具体结构如图1所示。
（2）将Poly I：C12U采用S1核酸酶进行酶切，得到片段大小一致的聚肌胞。
采用单链特异性核酸酶：S1核酸酶（S1 Nuclease）、绿豆芽核酸酶（Mung BeanNuclease）、P1核酸酶（P1 Nuclease）、核糖核酸酶A（Ribonuclease A）分别酶切步骤（1）获得的双链核糖核酸Poly I:C12U，同时设立对照。上述单链特异性核酸酶均购自大连宝生物工程有限公司。
酶切体系（50ul）为：浓度为15mg/ml的Poly I:C12U 25μl， 10×酶切缓冲液5μl，浓度为180U/μl的单链特异性核酸酶1μl，19μl ddH2O。10×酶切缓冲液是含有300mmol/L的NaAc（醋酸钠）、1.0mol/L的NaCl 、10mmol/L的ZnAc2（醋酸锌）和体积百分浓度为50%的甘油的水溶液。对照中以Poly I:C替代Poly I:C12U，其他成分同酶切体系。酶切条件为：在60℃金属浴中反应10min。
（3）电泳检测步骤（2）酶切后的产物，观察对比酶切结果。
电泳检测：取步骤（2）酶切后的产物30μl采用1%琼脂糖凝胶电泳进行分离，结果如图2所示：泳道2为错配的双链核糖核酸Poly I:C12U，条带大小为50bp～5000bp之间；泳道3为Poly I：C12U的S1核酸酶酶切产物，大小为12bp；泳道4、5、6分别为Poly I：C12U的绿豆芽核酸酶酶切产物、Poly I：C12U的P1核酸酶酶切产物、Poly I：C12U的核糖核酸酶A酶切产物，大小均在50bp~500bp之间；泳道7为聚肌胞Poly I:C，条带大小为100bp～500bp之间；泳道7和泳道8大小基本没有变化。综上所述，S1核酸酶对于错配的双链核糖核酸Poly I:C12U的酶切效果最为理想，酶切片段为12bp。
实施例2 Poly I：C500的制备
本实施例描述制备聚肌胞Poly I:C500的方法。Poly I：C500是指片段大小为500bp的Poly I：C。
送南京金斯瑞生物科技有限公司合成错配的双链核糖核酸Poly I:C500U，片段大小为500bp-5000bp。其制备方法如下：先将胞嘧啶（C）与尿嘧啶（U）按照摩尔比为500:1进行投料，合成聚胞苷酸尿苷酸Poly C500U。聚胞苷酸尿苷酸Poly C500U中每500个连续的胞苷酸后插入了1个尿苷酸。同时合成聚肌苷酸PolyI。将聚胞苷酸尿苷酸Poly C500U与聚肌苷酸PolyI退火形成错配的双链核糖核酸Poly I：C500U。
将Poly I:C500U采用S1核酸酶进行酶切，得到片段大小一致的聚肌胞。酶切体系（50ul）为：15mg/ml的Poly I:C500U 25μl，5μl 10×酶切缓冲液，180U/μl的单链特异性核酸酶1μl，19μl ddH2O。10×酶切缓冲液是含有300mmol/L的NaAc（醋酸钠）、1.0mol/L的NaCl 、10mmol/L的ZnAc2（醋酸锌）和体积百分浓度为50%的甘油的水溶液。酶切条件为：在60℃金属浴中反应10min。
将酶切产物进行电泳检测，结果如图3所示，Poly I:C500U经S1核酸酶酶切后得到了大小为500bp的目的片段，符合预期，将目的条带胶回收后，即得纯化后Poly I：C500。
实施例3 Poly I:C500动物免疫试验
（1）试剂与材料
将实施例2制备的Poly I:C500，记为PIC500。将南京金斯瑞生物科技有限公司合成的聚肌胞作为对照，标记为PIC，片段大小为0.5kb~5.0kb。
（2）动物免疫试验
选取45日龄的非免疫健康仔猪（猪O型口蹄疫液相阻断ELISA中和抗体滴度≤1:8）30头，随机分为3组，每组10头，分别标记G1、G2及对照组G3。所用疫苗为猪O型口蹄疫灭活疫苗商品苗，购自中农威特生物科技股份有限公司。G1组仔猪每头免疫2ml猪O型口蹄疫灭活疫苗商品苗和15mg/ml的PIC500溶液0.2ml（溶剂为PBS缓冲液）；G2组仔猪每头免疫2ml猪O型口蹄疫灭活疫苗商品苗和15mg/ml的PIC溶液0.2ml（溶剂为PBS缓冲液）；G3组仔猪每头免疫2ml猪O型口蹄疫灭活疫苗商品苗（表1）。免疫方式均为肌肉注射。
表1免疫分组
（3）免疫后抗体检测
于免疫后28d采血，各组仔猪采血分离血清，用猪O型口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒（购自兰州兽医研究所）检测抗体。从图4可以看到，PIC500与PIC相比，免疫增强效果相似，说明这种酶切作用并不影响其免疫效果。

Claims (4)

1.一种制备聚肌胞的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）分别合成聚肌苷酸Poly I和聚胞苷酸尿苷酸Poly CnU，所述Poly CnU中每n个连续的胞苷酸后插入了1个尿苷酸；
（2）将聚胞苷酸尿苷酸Poly CnU和聚肌苷酸Poly I退火形成错配的双链核糖核酸PolyI:CnU；
（3）将双链核糖核酸Poly I:CnU采用S1核酸酶进行酶切，得到片段大小为n bp的聚肌胞。
2.根据权利要求1所述制备聚肌胞的方法，其特征在于n为自然数且12≤n≤1000。
3.根据权利要求1或2所述制备聚肌胞的方法，其特征在于酶切体系包括如下组分：15mg/ml的Poly I:CnU 25μl，10×酶切缓冲液5μl，180U/μl的S1核酸酶1μl，ddH2O 19μl。
4.根据权利要求3所述制备聚肌胞的方法，其特征在于所述酶切条件为55-65℃金属浴，酶切反应时间为10min。
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