CN108138174A

CN108138174A - C4二羧酸的制造方法

Info

Publication number: CN108138174A
Application number: CN201680060732.7A
Authority: CN
Inventors: 金田实郎
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2015-10-28
Filing date: 2016-10-27
Publication date: 2018-06-08
Also published as: US10787686B2; US20180327791A1; WO2017073640A1

Abstract

本发明提供一种提高了C4二羧酸生产能力的转化细胞。一种转化细胞，其中，包含编码由序列号2所示的氨基酸序列、序列号22所示的氨基酸序列、或与该序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的多肽的外来多核苷酸。

Description

C4二羧酸的制造方法

技术领域

本发明涉及一种生物学的C4二羧酸制造。

背景技术

C4二羧酸作为酸味料或抗菌剂、pH调节剂在食品工业中被利用于各种各样的用途，此外，也用作合成树脂或生物分解性聚合物的原料等，为工业的价值高的物质。C4二羧酸工业上通过源自石化原料的化学合成、或微生物发酵的任意种而制造。从前，为了成本更低，化学合成法为主流，但近年来，从原料的昂贵、或环境负荷等观点出发，利用以循环再生资源为原料的微生物发酵的制造方法备受关注。

已知有作为C4二羧酸之一的富马酸可以使用根霉属菌(Rhizopus)等发酵菌而制造。根霉属菌将葡萄糖作为碳源生产富马酸，排出至菌体外。迄今为止，关于用于根霉属菌的富马酸高生产化的方法，已知有培养法的改良或变异育种的高生产率菌株的制作等。但是，由于根霉属菌的遗传学的背景还没有充分地进行研究，因此，利用基因重组的根霉属菌的富马酸高生产化技术的开发不容易，报道也少。仅报道有将编码源自酿酒酵母的丙酮酸羧化酶的基因导入至戴尔根霉(专利文献1)、及将编码源自大肠杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因导入至米根霉(非专利文献1)引起的富马酸生产率提高。

(专利文献1)中国专利公报第103013843号

(非专利文献1)Metabolic Engineering,2012,14:512-520

发明内容

本发明提供一种转化细胞，其中，包含编码由序列号2所示的氨基酸序列、序列号22所示的氨基酸序列、或与该序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的多肽的外来多核苷酸。

本发明还提供一种C4二羧酸的制造方法，其中，包含将上述转化细胞进行培养。

进而，本发明提供一种转化细胞的制造方法，其中，包含将编码由序列号2所示的氨基酸序列、序列号22所示的氨基酸序列、或与该序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸、或含有其的载体导入至宿主细胞。

进而，本发明提供一种宿主细胞中的C4二羧酸生产能力的提高方法，其中，包含将编码由序列号2所示的氨基酸序列、序列号22所示的氨基酸序列、或与该序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸、或含有其的载体导入至宿主细胞。

具体实施方式

本发明涉及一种具有对于宿主细胞的C4二羧酸生产能力提高效果的多肽、编码该多肽的基因、含有该基因的转化细胞、及使用有该转化细胞的C4二羧酸的制造方法。

本发明人进行了深入研究的结果发现：使由序列号2或序列号22所示的氨基酸序列构成的多肽的表达增强的细胞使其C4二羧酸生产能力提高。

本发明提供一种具有细胞的C4二羧酸生产能力提高功能的多肽、及该多肽的表达被强化(例如导入有编码该多肽的基因)的转化细胞。本发明的转化细胞可以生产更多的C4二羧酸。因此，本发明的转化细胞是为了C4二羧酸的生物学的生产而有用的。本发明的上述及其它特征及优点由以下的本说明书的记载进一步明确。

(1.定义)

本说明书中，氨基酸序列或核苷酸序列的同一性利用Lipman-Pearson法(Science,1985,227:1435-1441)进行计算。具体而言，使用遗传信息处理软件GENETYCSVer.12的同源性分析程序的氨基酸序列×氨基酸序列最大匹配或核苷酸序列×核苷酸序列最大匹配，通过将Maches作为-1、将Mismatches作为1、将Gaps作为1、*N+2进行分析而算出。

本说明书中，与氨基酸序列或核苷酸序列有关的“至少80％的同一性”是指80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、进一步更优选96％以上、进一步更优选97％以上、进一步更优选98％以上、另外优选99％以上的同一性。

本说明书中，氨基酸序列或核苷酸序列上的“相当的区域”可以通过以给予最大的相同性的方式使目标序列和参照序列(例如序列号2表示的氨基酸序列)进行比对(alignment)而确定。氨基酸序列或核苷酸序列的比对可以使用公知的算法而实行，其步骤是本领域技术人员所公知的。例如，就比对而言，可以基于上述的Lipman-Pearson法等通过手操作而进行，也可以通过在默认设置中使用Clustal W多重比对程序(Thompson,J.D.etal,1994,Nucleic Acids Res.22:4673-4680)而进行。Clustal W例如可以在欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute：EBI[www.ebi.ac.uk/index.html])、或国立遗传学研究所运营的日本DNA数据库(DDBJ[www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html])的网站上利用。通过上述的比对而对应于参照序列的任意的区域所匹配的目的序列的区域在该任意的区域中被看作“相当的区域”。

本说明书中的“1个或多个氨基酸被缺失、取代、附加、或插入的氨基酸序列”是指1个以上10个以下、优选1个以上8个以下、更优选1个以上5个以下、进一步优选1个以上3个以下的氨基酸被缺失、取代、附加、或插入的氨基酸序列。另外，本说明书中的“1个或多个核苷酸被缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列”是指：1个以上30个以下、优选1个以上24个以下、更优选1个以上15个以下、进一步更优选1个以上9个以下的核苷酸被缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列。本说明书中，氨基酸或核苷酸的“附加”中包含对序列的一个末端及两个末端的氨基酸或核苷酸的附加。

本说明书中，与基因有关的“上游”及“下游”是指该基因的转录方向的上游及下游。例如，“配置于启动子的下游的基因”是指在DNA正义链中基因存在启动子的3'侧，基因的上游是指DNA正义链中的该基因的5'侧的区域。

本说明书中，控制区域与基因的“可工作地连结”是指基因与控制区域以该基因在该控制区域的控制下可表达的方式进行连结。基因与控制区域的“可工作地连结”的步骤为本领域技术人员所公知的。

本说明书中，对于细胞的功能或性状、表型所使用的用语“本来”是为了表示该功能或性状、表型存在于该细胞的野生型而使用的。对照而言，用语“外来”是为了表示原来并不存在于该细胞中，是从外部导入的功能或性状、表型而使用的。例如，“外来”基因或多核苷酸为从外部导入至细胞的基因或多核苷酸。外来基因或多核苷酸可以源自与导入其的细胞同种的生物，也可以源自异种的生物(即，异种基因或多核苷酸)。

本说明书中，细胞的“C4二羧酸生产能力”是作为该细胞的培养基中的C4二羧酸的收率(％)来表示，更详细而言，用相对于该细胞的培养基中碳源的消耗量的该细胞的C4二羧酸的生产量的质量(％)来表示。细胞的C4二羧酸的生产量可以作为从该细胞的培养物中除去了细胞的培养上清液中的C4二羧酸的量算出。培养基中碳源的消耗量可以通过从该培养基中的碳源的初始浓度中减去该培养上清液中的碳源量而算出。培养上清液中的C4二羧酸及碳源的量可以利用高效液相色谱法(HPLC)等进行测定。更具体的测定步骤例示于后述的参考例1。

本说明书中，转化细胞中的“C4二羧酸生产能力的提高”是指该转化细胞的C4二羧酸生产能力与宿主细胞或对照细胞相比有所提高。转化细胞中的C4二羧酸生产能力的提高率用以下的式子进行计算。

提高率(％)

＝(转化细胞的C4二羧酸生产能力/宿主细胞或对照细胞的C4二羧酸生产能力)×100-100

在此，转化细胞是指强化了本发明的多肽的表达的细胞、例如导入了编码本发明的多肽的多核苷酸或含有其的载体的细胞，宿主细胞是指上述转化细胞的宿主细胞(亲细胞)。另外，对照细胞是指导入了不含有编码本发明的多肽的多核苷酸的载体的细胞。优选该C4二羧酸生产能力的提高率基于该转化细胞的培养上清液中(不含有细胞)的C4二羧酸浓度成为最大的时刻的各细胞的C4二羧酸生产能力而进行计算。因此，本说明书中，“C4二羧酸生产能力提高X％以上的转化细胞”是指用上述式计算的C4二羧酸生产能力的提高率为X％以上的转化细胞，另外，细胞中的“C4二羧酸生产能力的X％以上的提高”是指用上述式计算的该细胞的C4二羧酸生产能力的提高率为X％以上。

作为通过本发明而制造的C4二羧酸的实例，可举出富马酸、苹果酸、及琥珀酸，优选为富马酸。

本说明书中，“多次穿膜多肽(Multiple transmembrane polypeptide)”是指：通过使用细胞穿膜区域预测程序的分析，从而预测为具有多个穿膜螺旋结构的穿膜的多肽。作为细胞穿膜区域预测程序的实例，可举出使用有TMHMM Server,v.2.0(Journal ofMolecular Biology,2001,305:567-580)、DAS-TMfilter(Protein Eng.,2002,Volume15,Issue9:745-752)、PRED-TMR2(Protein Eng.,1999,Volume12,Issue8:631-634)等预测方法的分析程序。

(2.提高了C4二羧酸生产能力的转化细胞)

本发明人等发现：导入有编码由序列号2或序列号22所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸的细胞使其C4二羧酸生产能力提高。因此，推定：由序列号2或序列号22所示的氨基酸序列构成的多肽、或与这些多肽具有同等的功能的多肽(在以下的本说明书中，有时将它们汇总称为“本发明的多肽”)具有C4二羧酸生产能力提高功能。

因此，在一实施方式中，本发明提供一种提高了C4二羧酸生产能力的转化细胞。在优选的实施方式中，本发明的转化细胞为含有编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽、由序列号22所示的氨基酸序列构成的多肽、或与这些多肽具有同等的功能的多肽的外来多核苷酸的细胞。在其它的实施方式中，本发明的转化细胞为相对于将编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽、由序列号22所示的氨基酸序列构成的多肽、或与这些多肽具有同等的功能的多肽的多核苷酸作为基因组上的基因而含有的宿主细胞，以该基因的转录量提高的方式改变了该基因的控制区域的细胞。

由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽为源自戴尔根霉(Rhizopus delemar)RA99-880株的功能未知蛋白质(accession number：RO3G＿02798)。使用作为细胞穿膜区域预测程序的TMHMM Server,v.2.0进行分析的结果，预测由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽分别在其氨基酸序列的53位至75位区域、90位至112位区域、119位至141位区域、145位至167位区域、180位至198位区域、208位至230位区域、243位至265位区域、275位至294位区域、315位至337位区域、347位至369位区域、376位至398位区域、408位至430位区域、443位至465位区域、及511位至533位区域中具有穿膜螺旋结构，为14次穿膜型的多肽。因此，推定由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽为多次穿膜型多肽。另外，一般而言，根据具有对细胞膜内外的物质的输送活性的转运体多肽具有多次穿膜型结构，推定该多肽为转运体状多肽(transporter-like polypeptide)。

作为与由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽具有同等的功能的多肽，可举出由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的多肽。在优选的实施方式中，该多肽为与由序列号2所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成、且具有14个穿膜螺旋结构的多次穿膜型多肽。在更优选的实施方式中，该多肽为由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成、且在分别相当于序列号2所示的氨基酸序列的53位至75位区域、90位至112位区域、119位至141位区域、145位至167位区域、180位至198位区域、208位至230位区域、243位至265位区域、275位至294位区域、315位至337位区域、347位至369位区域、376位至398位区域、408位至430位区域、443位至465位区域、及511位至533位区域的区域中具有穿膜螺旋结构的多次穿膜型多肽。

作为与序列号2所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列的实例，可举出相对于序列号2所示的氨基酸序列，1个或多个氨基酸被缺失、取代、附加、或插入的氨基酸序列。

由序列号22所示的氨基酸序列构成的多肽为源自戴尔根霉(Rhizopus delemar)RA99-880株的功能未知蛋白质(accession number：RO3G＿06858)。使用作为细胞穿膜区域预测程序的TMHMM Server,v.2.0进行分析的结果，预测由序列号22所示的氨基酸序列构成的多肽分别在其氨基酸序列的13位至32位区域、42位至64位区域、71位至93位区域、97位至119位区域、131位至153位区域、163位至182位区域、189位至206位区域、及212位至234位区域中具有穿膜螺旋结构，为8次穿膜型的多肽。因此，推定由序列号22所示的氨基酸序列构成的多肽为多次穿膜型多肽。另外，一般而言，根据具有对细胞膜内外的物质的输送活性的转运体多肽具有多次穿膜型结构，推定该多肽为转运体状多肽。

作为与由序列号22所示的氨基酸序列构成的多肽具有同等的功能的多肽，可举出由与序列号22所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的多肽。在优选的实施方式中，该多肽为由与序列号22所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成、且具有8个穿膜螺旋结构的多次穿膜型多肽。在更优选的实施方式中，该多肽为由与序列号22所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成、且在分别相当于序列号22所示的氨基酸序列的13位至32位区域、42位至64位区域、71位至93位区域、97位至119位区域、131位至153位区域、163位至182位区域、189位至206位区域、及212位至234位区域的区域中具有穿膜螺旋结构的多次穿膜型多肽。

作为与序列号22所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列的实例，可举出相对于序列号22所示的氨基酸序列，1个或多个氨基酸被缺失、取代、附加、或插入的氨基酸序列。

作为相对于氨基酸序列，导入氨基酸的缺失、取代、附加、或插入等变异的方法，可举出例如相对于编码该氨基酸序列的核苷酸序列，导入核苷酸的缺失、取代、附加、或插入等变异的方法。作为向核苷酸序列的变异导入的方法，可举出例如：甲磺酸乙酯、N-甲基-N-亚硝基胍、亚硝酸等化学诱变剂或紫外线、X射线、γ射线、离子束等物理诱变剂导致的突变诱发、部位特异性变异导入法、Dieffenbach等(Cold Spring Harbar Laboratory Press,New York,581-621,1995)中记载的方法等。作为部位特异性变异导入的方法，可举出利用了Splicing overlap extension(SOE)PCR(Horton et al.,Gene 77,61-68,1989)的方法、ODA法(Hashimoto-Gotoh et al.,Gene,152,271-276,1995)、Kunkel法(Kunkel,T.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1985,82,488)等。或者，也可以利用Site-DirectedMutagenesis System Mutan-Super Express Km试剂盒(Takara Bio公司)、Transformer^TMSite-Directed Mutagenesis试剂盒(Clontech公司)、KOD-Plus-Mutagenesis Kit(东洋纺公司)等市售的部位特异性变异导入用试剂盒。

作为本发明的转化细胞中所含的编码本发明的多肽的外来多核苷酸，可举出由序列号1所示的核苷酸序列或与该序列具有至少80％的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸。在优选的实施方式中，该多核苷酸编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽、或由与该序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的、具有14个穿膜螺旋结构的多次穿膜型多肽。在更优选的实施方式中，该多核苷酸编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽、或由与该序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成、且在分别相当于序列号2所示的氨基酸序列的53位至75位区域、90位至112位区域、119位至141位区域、145位至167位区域、180位至198位区域、208位至230位区域、243位至265位区域、275位至294位区域、315位至337位区域、347位至369位区域、376位至398位区域、408位至430位区域、443位至465位区域、及511位至533位区域的区域中具有穿膜螺旋结构的多次穿膜型多肽。

或者，作为本发明的转化细胞中所含的编码本发明的多肽的外来多核苷酸，可举出由序列号21所示的核苷酸序列或与该序列具有至少80％的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸。在优选的实施方式中，该多核苷酸编码由序列号22所示的氨基酸序列构成的多肽、或由与该序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的、具有8个穿膜螺旋结构的多次穿膜型多肽。在更优选的实施方式中，该多核苷酸编码由序列号22所示的氨基酸序列构成的多肽、或由与该序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成、且在分别相当于序列号22所示的氨基酸序列的13位至32位区域、42位至64位区域、71位至93位区域、97位至119位区域、131位至153位区域、163位至182位区域、189位至206位区域、及212位至234位区域的区域中具有穿膜螺旋结构的多次穿膜型多肽。

作为与序列号1所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性的核苷酸序列的实例，可举出相对于序列号1所示的核苷酸序列，1个或多个核苷酸被缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列。作为与序列号21所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性的核苷酸序列的实例，可举出相对于序列号21所示的核苷酸序列，1个或多个核苷酸被缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列。在核苷酸序列中导入核苷酸的缺失、取代、附加、或插入等变异的方法如上所述。本发明的转化细胞中所含的多核苷酸可以为1条链或2条链的形态，或可以为DNA，也可以为RNA。该DNA可以为cDNA、化学合成DNA等人工DNA。

在本发明的转化细胞中，编码上述本发明的多肽的多核苷酸可以被重组至载体。优选含有上述多核苷酸的载体为表达载体。另外，优选该载体为可以将上述多核苷酸导入至宿主细胞、且可以在宿主细胞内表达该多核苷酸的表达载体。优选该载体包含编码上述本发明的多肽的多核苷酸、及与其可工作地连结的控制区域。该载体可以为在质粒等染色体外可独立增殖及复制的载体，或也可以为被重组至染色体内的载体。

作为具体的载体的实例，可举出例如：pBluescript II SK(-)(Stratagene)、pUC18等pUC系载体(Takara Bio)、pET系载体(Takara Bio)、pGEX系载体(GE Healthcare)、pCold系载体(Takara Bio)、pHY300PLK(Takara Bio)、pUB110(Mckenzie,T.et al.,1986,Plasmid 15(2):93-103)、pBR322(Takara Bio)、pRS403(Stratagene)、pMW218/219(NIPPONGENE)、pRI系载体(Takara Bio)、pBI系载体(Clontech)、IN3系载体(INPLANTAINNOVATIONS)等。

或者，在本发明的转化细胞中，编码上述本发明的多肽的多核苷酸可以为被重组至基因组DNA的DNA。该情况下，只要构建含有编码上述本发明的多肽的多核苷酸的DNA片段，将其导入至宿主细胞即可。作为该DNA片段，可举出例如PCR扩增DNA片段及限制性内切酶切断DNA片段。优选该DNA片段可以为包含编码上述本发明的多肽的多核苷酸、及与其可工作地连结的控制区域的表达盒。

上述载体或DNA片段中所含的控制区域为用于在导入有该载体或DNA片段的宿主细胞内使编码本发明的多肽的多核苷酸表达的序列，可举出例如启动子或终止子等的表达调节区域、复制起始点等。该控制区域的种类可以根据导入载体或DNA片段的宿主细胞的种类而适当选择。根据需要，该载体或DNA片段可以进一步具有抗生素抗性基因、氨基酸合成相关基因等选择标记。

通过将含有编码上述本发明的多肽的多核苷酸的载体或DNA片段导入至宿主细胞，可以得到本发明的转化细胞。其为含有包含编码本发明的多肽的多核苷酸的载体或外来DNA片段的转化细胞。或者，宿主细胞在其基因组上具有编码本发明的多肽的多核苷酸作为基因的情况下，通过以宿主内的该基因的转录量提高的方式改变该基因的控制区域，可以得到本发明的转化细胞。在该本发明的转化细胞中，与其宿主细胞(亲细胞)相比，编码上述本发明的多肽的基因的转录量提高。基因的转录量可以通过利用定量PCR的mRNA量测定、使用有新一代测序仪的RNA-Seq分析、DNA微阵列分析等而进行测定。

作为上述转化细胞的宿主细胞，可以使用微生物细胞、植物细胞、及动物细胞的任意种。从C4二羧酸的制造效率的观点出发，宿主细胞优选为微生物细胞。该微生物可以为原核生物及真核生物的任意种。其中，从C4二羧酸生产率的观点出发，该微生物优选为丝状菌或酵母，更优选为丝状菌。作为该丝状菌，包含属于细区分真菌类(Eumycota)及卵菌(Oomycota)的全部的丝状形的菌(以根据Hawksworth et al.,In,Ainsworth and Bisby'sDictionary of The Fungi,8th edition,1995,CAB International,University,Press,Cambridge,UK进行定义的方式)。丝状菌一般而言利用由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖及其它复合多糖构成的菌丝体壁来赋予特征。营养生长是利用菌丝扩张，而且碳代谢为绝对有氧。

作为用作本发明的转化细胞的宿主细胞的丝状菌的优选的实例，可举出：枝顶孢(Acremonium)属、曲霉(Aspergillus)属、短梗霉(Aureobasidium)属、烟管霉(Bjerkandera)属、拟蜡菌(Ceriporiopsis)属、金孢子菌(Chrysosporium)属、鬼伞(Coprinus)属、云芝(Coriolus)属、隐球菌(Cryptococcus)属、线黑粉酵母(Filibasidium)属、镰刀菌(Fusarium)属、腐质霉(Humicola)属、梨孢菌(Magnaporthe)属、毛霉(Mucor)属、毁丝霉(Myceliophthora)属、新美鞭菌(Neocallimastix)属、脉孢菌(Neurospora)属、拟青霉(Paecilomyces)属、青霉菌(Penicillium)属、平革菌(Phanerochaete)属、脉射菌(Phlebia)属、瘤胃壶菌(Piromyces)属、侧耳(Pleurotus)属、根霉(Rhizopus)属、裂褶菌(Schizophyllum)属、踝节菌(Talaromyces)属、嗜热子囊菌(Thermoascus)属、梭孢壳霉(Thielavia)属、弯颈霉(Tolypocladium)属、栓菌(Trametes)属、和木霉(Trichoderma)属的丝状菌。其中，从C4二羧酸的生产率的观点出发，优选戴尔根霉(Rhizopus delemar)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、华根霉(Rhizopus chinensis)、黑根霉(Rhizopusnigricans)、东京根霉(Rhizopus tonkinensis)、小麦曲根霉(Rhizopus tritici)、米根霉(Rhizopus oryzae)等根霉(Rhizopus)属菌，更优选戴尔根霉(Rhizopus delemar)及米根霉(Rhizopus oryzae)，进一步优选戴尔根霉(Rhizopus delemar)。

向上述宿主细胞的载体或DNA片段的导入中，可以使用一般的转化法，例如电穿孔法、转化法、转染法、接合法、原生质体法、颗粒枪法、农杆菌注射法等。

导入有目标载体或DNA片段的转化细胞可以利用选择标记而进行选择。例如，选择标记为抗生素抗性基因时，通过在该抗生素添加培养基中培养细胞，可以选择导入有目标载体或DNA片段的转化细胞。另外，例如选择标记为氨基酸合成相关基因时，在该氨基酸要求性的宿主细胞中导入基因之后，可以将该氨基酸要求性的有无作为指标，选择导入有目标载体或DNA片段的转化细胞。或者，通过利用PCR等研究转化细胞的DNA序列，也可以确认目标载体或DNA片段的导入。

就上述本发明的转化细胞而言，编码上述本发明的多肽的多核苷酸的转录量提高，本发明的多肽的表达被强化。由此，该转化细胞的C4二羧酸生产能力提高。上述转化细胞与其宿主细胞(亲细胞)相比，C4二羧酸生产能力提高优选10％以上、更优选15％以上、进一步优选20％以上。

(3.C4二羧酸的制造)

本发明的转化细胞的C4二羧酸生产能力提高。因此，本发明还提供一种包含将上述本发明的转化细胞进行培养的C4二羧酸的制造方法。作为通过该本发明的制造方法而制造的C4二羧酸，可举出富马酸、苹果酸、及琥珀酸，优选为富马酸。

本发明的制造方法中的转化细胞的培养包含将含有该转化细胞的微生物、植物体、动物体、或它们的细胞或组织进行培养。用于将该转化细胞进行培养的培养基及培养条件可以根据该转化细胞的宿主的种类而适当选择。一般而言，可以采用相对于该转化细胞的宿主通常使用的培养基及培养条件。

例如，转化细胞为丝状菌时，培养温度只要为例如10℃～50℃、优选25℃～45℃即可，另外，培养期间只要是充分地产生目标C4二羧酸的期间，就没有特别限定，可以为例如1～240小时、优选12～120小时、优选24～72小时。优选在搅拌或通气下进行培养。

作为用于丝状菌培养的培养基，只要使用通常使用的培养基即可。优选该培养基为液体培养基，另外，也可以为合成培养基、天然培养基、及合成培养基中添加了天然成分的半合成培养基中的任意种。也可以使用市售的PDB培养基(马铃薯葡萄糖培养基；Becton,Dickinson and Company制等)、PDA培养基(Becton,Dickinson and Company制等)、LB培养基(Luria-Bertani培养基；日本制药公司制(商标名“DaiGo”)等)、NB培养基(NutrientBroth；Becton,Dickinson and Company制等)、SB培养基(Sabouraud培养基；OXOID公司制等)、SD培养基(Synthetic Dropout Broth；例如Clontech)等。一般在该培养基中含有碳源、氮源、无机盐等，但各成分组成可以适当选择。

以下，对用于丝状菌培养的优选的培养基组成进行详述。以下所记载的培养基中的各成分的浓度表示初始(培养基制备时或培养开始时)的浓度。

作为上述培养基中的碳源的实例，可举出葡萄糖、麦芽糖、淀粉水解物、果糖、木糖、蔗糖等，其中，优选葡萄糖及果糖。这些糖类可以单独或组合2种以上而使用。该培养基中的碳源的浓度优选为1％(w/v)以上、更优选为5％(w/v)以上，且优选为40％(w/v)以下，更优选为30％(w/v)以下。或者，上述培养基中的碳源的浓度优选为1～40％(w/v)，更优选为5～30％(w/v)。

作为上述培养基中的氮源的实例，可举出：硫酸铵、尿素、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠等含氮化合物。该培养基中的氮源的浓度优选为0.001～0.5％(w/v)，更优选为0.001～0.2％(w/v)。

在上述培养基中，可以含有硫酸盐、镁盐、锌盐等。作为硫酸盐的实例，可举出硫酸镁、硫酸锌、硫酸钾、硫酸钠、硫酸铵等。作为镁盐的实例，可举出硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等。作为锌盐的实例，可举出硫酸锌、硝酸锌、氯化锌等。该培养基中的硫酸盐的浓度优选为0.01～0.5％(w/v)，更优选为0.02～0.2％(w/v)。该培养基中的镁盐的浓度优选为0.001～0.5％(w/v)，更优选为0.01～0.1％(w/v)。该培养基中的锌盐的浓度优选为0.001～0.05％(w/v)，更优选为0.005～0.05％(w/v)。

上述培养基的pH(25℃)优选为3～7，更优选为3.5～6。培养基的pH可以使用氢氧化钙、氢氧化钠、碳酸钙、氨等碱；或硫酸、盐酸等酸进行调节。

作为上述培养基的优选的实例，可举出：含有7.5～30％碳源、0.001～0.2％硫酸铵、0.001～0.6％磷酸二氢钾、0.01～0.1％硫酸镁·七水合物、0.005～0.05％硫酸锌·七水合物、及3.75～20％碳酸钙(浓度均为％(w/v))的液体培养基。

为了使用以丝状菌为宿主的转化体更有效地生产C4二羧酸，可以在以下所示的工序中进行生产。即，可以通过制备转化细胞的孢子悬浮液(工序A)，将其在培养液中进行培养使孢子发芽而制备菌丝体(工序B1)、优选进一步使该菌丝体增殖(工序B2)、接着将制备的菌丝体进行培养而生产C4二羧酸(工序C)，从而有效地制造C4二羧酸。但是，本发明中的转化细胞的培养工序并不限定于以下的工序。

＜工序A：孢子悬浮液的制备＞

将转化的丝状菌的孢子接种于例如无机琼脂培养基(组成例：2％葡萄糖、0.1％硫酸铵、0.06％磷酸二氢钾、0.025％硫酸镁·七水合物、0.009％硫酸锌·七水合物、1.5％琼脂、浓度均为％(w/v))、PDA培养基等培养基，通过在10～40℃、优选27～30℃下进行7～10天静置培养而形成孢子，接着悬浮于生理盐水等，由此可以制备孢子悬浮液。在孢子悬浮液中可以含有菌丝体，也可以不含有。

＜工序B1：菌丝体的制备＞

将工序A中得到的孢子悬浮液接种于培养液而进行培养，使孢子发芽而得到菌丝体。接种于培养液的丝状菌的孢子数为1×10²～1×10⁸个-孢子/mL-培养液、优选1×10²～5×10⁴个-孢子/mL-培养液、更优选5×10²～1×10⁴个-孢子/mL-培养液、进一步优选1×10³～1×10⁴个-孢子/mL-培养液。在培养液中，可以利用市售的培养基、例如PDB培养基、LB培养基、NB培养基、SB培养基、SD培养基等。从发芽率和菌体生长的观点出发，在该培养液中，可以适当添加作为碳源的葡萄糖、木糖等单糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖等低聚糖、或淀粉等多糖；甘油、柠檬酸等生物体成分；作为氮源的硫酸铵、尿素、氨基酸等；作为其他无机物的钠、钾、镁、锌、铁、磷酸等各种盐类。单糖、低聚糖、多糖及甘油的优选的浓度为0.1～30％(w/v)，柠檬酸的优选的浓度为0.01～10％(w/v)，硫酸铵、尿素及氨基酸的优选的浓度为0.01～1％(w/v)，无机物的优选的浓度为0.0001～0.5％(w/v)。在上述培养液中接种孢子悬浮液，一边以优选80～250rpm、更优选100～170rpm进行搅拌，一边在25～42.5℃的培养温度控制下培养优选24～120小时、更优选48～72小时。供于培养的培养液的量只要与培养容器相符而适当调整即可，例如200mL容积带挡板的烧瓶的情况下为50～100mL左右、500mL容积带挡板的烧瓶的情况下为100～300mL左右即可。通过该培养，接种的孢子进行发芽，成长为菌丝体。

＜工序B2：菌丝体的增殖＞

从C4二羧酸生产能力提高的观点出发，优选进行将工序B1中得到的菌丝体进一步培养并使其增殖的工序(工序B2)。工序B2中使用的增殖用的培养液没有特别限定，只要是通常使用的含有葡萄糖的无机培养液即可，可举出例如含有7.5～30％葡萄糖、0.05～0.2％硫酸铵、0.03～0.6％磷酸二氢钾、0.01～0.1％硫酸镁·七水合物、0.005～0.05％硫酸锌·七水合物、及3.75～20％碳酸钙(浓度均为％(w/v))的培养液等。该培养液的量只要与培养容器相符而适当调整即可，例如500mL容积三角烧瓶的情况下为50～300mL、优选为100～200mL即可。在该培养液中，将工序B1中培养的菌体以作为湿重量成为1～6g-菌体/100mL-培养液、优选3～4g-菌体/100mL-培养液的方式接种，一边以100～300rpm、优选170～230rpm进行搅拌，一边在25～42.5℃的培养温度控制下培养12～120小时、优选24～72小时。

＜工序C：C4二羧酸生产＞

将上述的步骤(工序B1或B2)中得到的丝状菌的菌丝体进行培养，在该菌中生产C4二羧酸。该培养的条件只要按照上述的通常的丝状菌的培养条件即可。就培养基的量而言，200mL容积三角烧瓶的情况下可以设为20～80mL左右，500mL容积三角烧瓶的情况下可以设为50～200mL左右，30L发酵缸的情况下可以设为10L～15L左右，但只要与培养容器相符适当调整即可。相对于培养基的工序B1或B2中得到的菌体的接种量优选作为湿重量可以为5g～90g-菌体/100mL-培养基，更优选5g～50g-菌体/100mL-培养基。优选一边以100～300rpm、优选150～230rpm进行搅拌、一边在25～45℃的温度下进行2小时～240小时、优选12小时～120小时进行培养。使用发酵缸的情况下，以优选0.05～2vvm、更优选0.1～1.5vvm进行通气。

通过以上的步骤将本发明的转化细胞进行培养，生产C4二羧酸。培养后，从培养物中回收C4二羧酸。根据需要，可以将回收的C4二羧酸进一步进行精制。从培养物中将C4二羧酸进行回收或精制的方法没有特别限定，只要按照公知的回收或精制方法进行即可。例如通过倾斜法、过滤、离心分离等从培养物中除去细胞等，将剩余的培养物根据需要进行浓缩之后，附加晶析法、离子交换法、溶剂提取法等方法、或这些方法的组合，由此可以将该培养物中的C4二羧酸进行回收或精制。

从培养物中分离的本发明的转化细胞可以在C4二羧酸生产中再利用。例如可以在从培养物中分离的本发明的转化细胞中新加入上述的培养基，再在上述条件下进行培养而生产C4二羧酸，接着从培养基中回收生产的C4二羧酸。可以进一步重复该过程。在本发明的制造方法中，转化细胞的培养及C4二羧酸的回收可以通过间歇式、半间歇式及连续式的任意种方法进行。

(4.例示的实施方式)

作为本发明的例示的实施方式，将以下的物质、制造方法、用途、或者方法进一步公开于本说明书。但是，本发明并不限定于这些实施方式。

[1]一种转化细胞，其中，包含编码由序列号2所示的氨基酸序列、序列号22所示的氨基酸序列、或与该序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的多肽的外来多核苷酸。

[2]一种转化细胞，其中，相对于将编码由序列号2所示的氨基酸序列、序列号22所示的氨基酸序列、或与该序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸作为基因组上的基因而含有的宿主细胞，以该基因的转录量提高的方式改变该基因的控制区域。

[3]根据[1]或[2]所述的转化细胞，其中，优选与上述序列号2所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列为与序列号2所示的氨基酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、进一步更优选96％以上、另外优选97％以上、另外优选98％以上、另外优选99％以上的同一性的氨基酸序列；或

为相对于序列号2所示的氨基酸序列，1个以上10个以下、优选1个以上8个以下、更优选1个以上5个以下、进一步优选1个以上3个以下的氨基酸被缺失、取代、附加、或插入的氨基酸序列。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的转化细胞，其中，由上述序列号2所示的氨基酸序列或与该序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的多肽优选为具有14个穿膜螺旋结构的多次穿膜型多肽，

更优选为分别相当于在序列号2所示的氨基酸序列的53位至75位区域、90位至112位区域、119位至141位区域、145位至167位区域、180位至198位区域、208位至230位区域、243位至265位区域、275位至294位区域、315位至337位区域、347位至369位区域、376位至398位区域、408位至430位区域、443位至465位区域、及511位至533位区域的区域中具有穿膜螺旋结构的多次穿膜型多肽。

[5]根据[1]或[2]所述的转化细胞，其中，优选上述与序列号22所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列为与序列号22所示的氨基酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、进一步更优选96％以上、另外优选97％以上、另外优选98％以上、另外优选99％以上的同一性的氨基酸序列；或

为相对于序列号22所示的氨基酸序列，1个以上10个以下、优选1个以上8个以下、更优选1个以上5个以下、进一步优选1个以上3个以下的氨基酸被缺失、取代、附加、或插入的氨基酸序列。

[6]根据[1]、[2]及[5]中任一项所述的转化细胞，其中，由上述序列号22所示的氨基酸序列或与该序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的多肽优选为具有8个穿膜螺旋结构的多次穿膜型多肽，

更优选为在分别相当于序列号22所示的氨基酸序列的13位至32位区域、42位至64位区域、71位至93位区域、97位至119位区域、131位至153位区域、163位至182位区域、189位至206位区域、及212位至234位区域的区域中具有穿膜螺旋结构的多次穿膜型多肽。

[7]根据[1]～[4]中任一项所述的转化细胞，其中，优选上述多核苷酸为由序列号1所示的核苷酸序列或与该序列具有至少80％的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸。

[8]根据[7]所述的转化细胞，其中，优选上述与序列号1所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性的核苷酸序列为与序列号1所示的核苷酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、进一步更优选96％以上、另外优选97％以上、另外优选98％以上、另外优选99％以上的同一性的核苷酸序列；或

为相对于序列号1所示的核苷酸序列，1个以上30个以下、优选1个以上24个以下、更优选1个以上15个以下、进一步优选1个以上9个以下的核苷酸被缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列。

[9]根据[1]、[2]、[5]及[6]中任一项所述的转化细胞，其中，优选上述多核苷酸为由序列号21所示的核苷酸序列或与该序列具有至少80％的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸。

[10]根据[9]所述的转化细胞，其中，优选与上述序列号21所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性的核苷酸序列为与序列号21所示的核苷酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、进一步更优选96％以上、另外优选97％以上、另外优选98％以上、另外优选99％以上的同一性的核苷酸序列；或

为相对于序列号21所示的核苷酸序列，1个以上30个以下、优选1个以上24个以下、更优选1个以上15个以下、进一步优选1个以上9个以下的核苷酸被缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列。

[11]根据[1]、[3]～[10]中任一项所述的转化细胞，其中，优选包含含有上述多核苷酸的载体、或将上述多核苷酸重组至基因组DNA。

[12]根据[11]所述的转化细胞，其中，优选还含有上述载体与上述多核苷酸可工作地连结的控制区域。

[13]根据[12]所述的转化细胞，其中，优选上述多核苷酸是和与该多核苷酸可工作地连结的控制区域一起被重组至基因组DNA。

[14]根据[1]～[13]中任一项所述的转化细胞，其中，优选上述细胞为微生物细胞。

[15]根据[14]所述的转化细胞，其中，优选上述微生物为丝状菌。

[16]根据[15]所述的转化细胞，其中，优选上述丝状菌为根霉属(Rhizopus)。

[17]根据[16]所述的转化细胞，其中，上述根霉属优选为戴尔根霉(Rhizopusdelemar)或米根霉(Rhizopus oryzae)，更优选为戴尔根霉(Rhizopus delemar)。

[18]根据[1]～[17]中任一项所述的转化细胞，其中，优选C4二羧酸生产能力提高。

[19]根据[18]所述的转化细胞，其中，上述C4二羧酸生产能力提高优选10％以上、更优选15％以上、进一步优选20％以上。

[20]根据[18]或[19]所述的转化细胞，其中，优选上述C4二羧酸为富马酸、苹果酸或琥珀酸。

[21]一种C4二羧酸的制造方法，其中，包含将[1]～[20]中任一项所述的转化细胞进行培养。

[22]根据[21]所述的制造方法，其中，还包含从上述培养物中回收C4二羧酸。

[23]根据[21]或[22]所述的制造方法，其中，上述C4二羧酸为富马酸、苹果酸或琥珀酸。

[24]一种转化细胞的制造方法，其中，包含：

将编码由序列号2所示的氨基酸序列、序列号22所示的氨基酸序列、或与该序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸、或含有其的载体导入至宿主细胞。

[25]一种转化细胞的制造方法，其中，包含：

相对于将编码由序列号2所示的氨基酸序列、序列号22所示的氨基酸序列、或与该序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸作为基因组上的基因而含有的宿主细胞，以该基因的转录量提高的方式改变该基因的控制区域。

[26]一种宿主细胞中的C4二羧酸生产能力的提高方法，其中，包含：

[27]一种宿主细胞中的C4二羧酸生产能力的提高方法，其中，包含：

[28]根据[26]或[27]所述的方法，其中，上述宿主细胞中的C4二羧酸生产能力提高优选10％以上、更优选15％以上、进一步优选20％以上。

[29]根据[26]～[28]中任一项所述的方法，其中，优选上述C4二羧酸为富马酸、苹果酸或琥珀酸。

[30]根据[24]～[29]中任一项所述的方法，其中，优选与上述序列号2所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列为与序列号2所示的氨基酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、进一步更优选96％以上、另外优选97％以上、另外优选98％以上、另外优选99％以上的同一性的氨基酸序列；或

[31]根据[24]～[30]中任一项所述的方法，其中，由上述序列号2所示的氨基酸序列或与该序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的多肽优选为具有14个穿膜螺旋结构的多次穿膜型多肽，

更优选为在分别相当于序列号2所示的氨基酸序列的53位至75位区域、90位至112位区域、119位至141位区域、145位至167位区域、180位至198位区域、208位至230位区域、243位至265位区域、275位至294位区域、315位至337位区域、347位至369位区域、376位至398位区域、408位至430位区域、443位至465位区域、及511位至533位区域的区域中具有穿膜螺旋结构的多次穿膜型多肽。

[32]根据[24]～[29]中任一项所述的方法，其中，优选上述与序列号22所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列为与序列号22所示的氨基酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、进一步更优选96％以上、另外优选97％以上、另外优选98％以上、另外优选99％以上的同一性的氨基酸序列；或

[33]根据[24]～[29]及[32]中任一项所述的方法，其中，由上述序列号22所示的氨基酸序列或与该序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的多肽优选为具有8个穿膜螺旋结构的多次穿膜型多肽，

[34]根据[24]～[31]中任一项所述的方法，其中，优选上述多核苷酸为由序列号1所示的核苷酸序列或与该序列具有至少80％的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸。

[35]根据[34]所述的方法，其中，优选上述与序列号1所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性的核苷酸序列为与序列号1所示的核苷酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、进一步更优选96％以上、另外优选97％以上、另外优选98％以上、另外优选99％以上的同一性的核苷酸序列；或

[36]根据[24]～[29]及[32]～[33]中任一项所述的方法，其中，优选上述多核苷酸为由序列号21所示的核苷酸序列或与该序列具有至少80％的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸。

[37]根据[36]所述的方法，其中，优选与上述序列号21所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性的核苷酸序列为与序列号21所示的核苷酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、进一步更优选96％以上、另外优选97％以上、另外优选98％以上、另外优选99％以上的同一性的核苷酸序列；或

相对于序列号21所示的核苷酸序列，1个以上30个以下、优选1个以上24个以下、更优选1个以上15个以下、进一步优选1个以上9个以下的核苷酸被缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列。

[38]根据[24]～[37]中任一项所述的方法，其中，优选上述宿主细胞为微生物细胞。

[39]根据[38]所述的方法，其中，优选上述微生物为丝状菌。

[40]根据[39]所述的方法，其中，优选上述丝状菌为根霉属(Rhizopus)。

[41]根据[40]所述的方法，其中，上述根霉属优选为戴尔根霉(Rhizopusdelemar)或米根霉(Rhizopus oryzae)，更优选为戴尔根霉(Rhizopus delemar)。

实施例

以下，基于实施例，进一步详细地说明本发明，但本发明并不限定于此。

实施例1转化细胞的制作

(1)基因组提取

在PDA培养基中植菌戴尔根霉(Rhizopus delemar)JCM(Japan Collection ofMicroorganisms/理研)5557株(以下，记为5557株)的孢子后，在30℃下进行5天培养。培养后，将菌体与3mL用金属锥(Metal Cone)(安井器械)一起放入3mL破碎管中，立即在液氮中使其冻结10分钟以上。其后，使用多珠振荡器(Multibeads shocker)(安井器械)，以1700rpm进行10秒菌体的破碎。在破碎后的容器中加入TE缓冲液(TE Buffer)(pH8.0)(NIPPON GENE)400μL并颠倒混合，将250μL移至1.5mL管。从该菌体溶液，使用“GenTLE(酵母用)”(Takara Bio)，根据操作说明进行基因组提取。相对于得到的基因组溶液50μL，添加RNaseA(Roche)1μL，在37℃下使其反应1小时。反应后，加入等量的苯酚/氯仿，通过轻敲(tapping)进行混合之后，在4℃下以14500rpm离心5分钟，将上清液移至新的1.5mL管。再次重复苯酚/氯仿处理，接着进行乙醇沉淀，得到5557株的精制基因组溶液。

(2)cDNA的制作

(i)总RNA提取

将5557株的菌体6g-湿重量植菌于液体培养基40mL(1g/L(NH₄)₂SO₄、0.6g/LKH₂PO₄、0.25g/LMgSO₄·7H₂O、0.09g/LZnSO₄·7H₂O、50g/L碳酸钙、100g/L葡萄糖)，在35℃下以170rpm培养8小时。从培养液中将菌体进行过滤、回收，用0.85％生理盐水100mL进行2次清洗。清洗后，通过吸滤而除去多余的水分之后，量取0.3g，与3mL用金属锥(安井器械)一起放入3mL破碎管中，立即投入于液氮并使其冻结。使用多珠振荡器(安井器械)将得到的冻结菌体以1700rpm破碎10秒。在破碎后的菌体中添加RLT缓冲液(RLT buffer)500μL并颠倒混合后，将450μL供给RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)，进行总RNA提取。在得到的RNA溶液40μL中添加1μL的DNaseI(TaKaRa)及5μL的10×DNaseI缓冲液(DNaseI buffer)(USBCorporation)，用无RNA酶水(RNase free water)补充到50μL之后，在37℃下使其反应30分钟以上而除去溶液中的残存DNA。进一步追加1μL DNaseI，在37℃下使其反应30分钟后，进行苯酚/氯仿提取，接着进行乙醇沉淀。将沉淀溶解于50μL的灭菌水，使用Qubit(LifeTechnologies)测定RNA溶液的浓度及纯度。另外，将该RNA溶液适当稀释，使用Agilent2100 Bioanalyzer(Agilent)及RNA6000 Pico Kit(Agilent)进行提取的RNA的检测。确认作为RNA的分解度指标的“RNA完整性数(RNA Integrity Number)(RIN值)”为6.0以上，将得到的RNA溶液作为总RNA取得。

(ii)cDNA合成

cDNA合成使用SuperScriptIII First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR(Invitrogen)而进行。即，将(i)中得到的RNA溶液1μg用DEPC水补充到8μL之后，添加10μL的2×RT Reaxtion Mix和2μL的RT Enzyme Mix，平稳地混合，在25℃下使其反应10分钟，在50℃下使其反应30分钟，在85℃下使其反应5分钟。在反应后的溶液中加入1μL的RNaseH，在37℃下使其反应20分钟，将其设为cDNA溶液。

(3)质粒载体的制作

(i)向pUC18的trpC基因区域的导入

以上述(1)中得到的5557株的基因组DNA为模板，通过使用有引物oJK162(序列号4)及oJK163(序列号5)的PCR来合成含有trpC基因(序列号3)的DNA片段。接着，以质粒pUC18为模板，通过使用有引物oJK164(序列号6)及oJK165(序列号7)的PCR来将DNA片段进行扩增。将以上的2片段使用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)连结，构建质粒pUC18-trpC。

(ii)ADH1启动子、终止子的克隆

以上述(1)中得到的5557株的基因组DNA为模板，将含有ADH1的启动子序列(序列号8)的DNA片段和含有终止子序列(序列号9)的DNA片段分别通过使用有引物oJK202(序列号10)及oJK204(序列号11)、以及oJK205(序列号12)及oJK216(序列号13)的PCR来进行扩增。接着，以(i)中得到的质粒pUC18-trpC为模板，通过使用有引物oJK210(序列号14)及oJK211(序列号15)的PCR来将DNA片段进行扩增。将以上的3片段用与(i)同样的步骤连结，构建质粒pUC18-trpC-Padh-Tadh。在得到的质粒中，在trpC基因区域的下游依次配置有ADH1启动子及终止子。进一步在ADH1终止子的下游配置有Not I限制性内切酶识别序列。。

(iii)质粒载体制作

以上述(2)中得到的5557株的cDNA为模板，将含有序列号1表示的基因(以下，称为rdt5)的DNA片段通过使用有引物oJK513(序列号16)及oJK514(序列号17)的PCR来进行扩增。接着，以(ii)中得到的质粒pUC18-trpC-Padh-Tadh为模板，通过使用有引物oJK204(序列号11)及oJK269-4(序列号18)的PCR来将DNA片段进行扩增。将上述2片段用与(i)同样的步骤连结，构建质粒pUC18-trpC-Padh-rdt5-Tadh。就得到的质粒而言，在ADH启动子和终止子之间插入有序列号1表示的rdt5基因。

接着，以上述(2)中得到的5557株的cDNA为模板，将含有序列号21表示的基因(以下，称为rdt6)的DNA片段通过使用有引物oJK515(序列号23)及oJK516(序列号24)的PCR来进行扩增。接着，以(ii)中得到的质粒pUC18-trpC-Padh-Tadh为模板，通过使用有引物oJK204(序列号11)及oJK269-4(序列号18)的PCR来将DNA片段进行扩增。将上述2片段用与(i)同样的步骤连结，构建质粒pUC18-trpC-Padh-rdt6-Tadh。就得到的质粒而言，在ADH启动子和终止子之间插入有序列号1表示的rdt6基因。

将质粒载体pUC18-trpC-Padh-rdt5-Tadh和pUC18-trpC-Padh-rdt6-Tadh的制作中所使用的PCR引物示于表1。

[表1]

(4)向宿主细胞的基因导入

(i)色氨酸营养缺陷型株的制作

用作基因导入的宿主细胞的色氨酸营养缺陷型株是从向5557株的离子束照射形成的变异导入株中选拔而取得。离子束照射在独立行政法人日本原子力研究开发机构·高崎量子应用研究所的离子照射设施(TIARA)中进行。就照射而言，使用AVF回旋加速器将¹²C⁵ ⁺进行加速，以220MeV的能量进行100～1250Gray照射。从照射过的菌体中回收孢子，从其中取得显示色氨酸营养缺陷型的戴尔根霉(Rhizopus delemar)02T6株(以下，记为02T6株)。02T6株的trpC基因编码区域(序列号3)全长2298bp中的第2093号缺损一个碱基。

(ii)质粒载体的扩增

分别使用上述(3)中制作的质粒载体pUC18-trpC-Padh-Tadh、pUC18-trpC-Padh-rdt5-Tadh及pUC18-trpC-Padh-rdt6-Tadh，将大肠杆菌DH5α株(NIPPON GENE)利用感受态细胞转化法进行转化。将得到的转化细胞在37℃下静置一夜，将得到的菌落接种于LBamp液体培养基(Bacto Trypton 1％、酵母提取物(Yeast Extract)0.5％、NaCl 1％，氨苄西林钠50μg/mL)2mL，在37℃下培养一夜。由该培养液使用高纯度质粒分离试剂盒(Roche LifeScience)进行各质粒载体的精制。

(iii)质粒载体向宿主细胞的导入

将(ii)中得到的质粒载体pUC18-trpC-Padh-Tadh、pUC18-trpC-Padh-rdt5-Tadh及pUC18-trpC-Padh-rdt6-Tadh的各DNA溶液(1μg/μL)10μL加入至金颗粒溶液(60mg/mL)100μL并混合之后，加入0.1M亚精胺40μL，用涡旋振荡器(Vortex)充分搅拌。进一步加入2.5M CaCl₂100μL，用涡旋振荡器搅拌1分钟，接着以6000rpm离心30秒，除去上清液。在得到的沉淀中加入70％EtOH 200μL，用涡旋振荡器搅拌30秒之后，以6000rpm离心30秒，除去上清液。将得到的沉淀用100μL的100％EtOH进行再悬浮。

接着，对(i)中制作的02T6株的孢子，使用上述的DNA-金颗粒溶液，用GDS-80(NepaGene)进行基因导入。基因导入后的孢子在无机琼脂培养基(20g/L葡萄糖、1g/L硫酸铵、0.6g/L磷酸二氢钾、0.25g/L硫酸镁·七水合物、0.09g/L硫酸锌·七水合物、15g/L琼脂)上、在30℃的条件下静置培养1周左右。用植菌环搔取生长的菌体的一部分，悬浮于TE(pH8.0)(NIPPON GENE)。将悬浮溶液在95℃下处理15分钟，由转化株提取核酸。以该核酸为模板，进行使用有引物oJK438(序列号19)及oJK439(序列号20)的PCR反应，将确认有目的DNA片段的导入的菌株作为转化株进行选拔。将PCR引物示于表2。将导入有含有在ADH1启动子下游连结有rdt5基因的DNA的pUC18-trpC-Padh-rdt5-Tadh的株设为RDT5株，将导入有含有在ADH1启动子下游连结有rdt6基因的DNA的pUC18-trpC-Padh-rdt6-Tadh的株设为RDT6株，另一方面，将导入有含有没有插入rdt5基因或rdt6基因的DNA的质粒载体pUC18-trpC-Padh-Tadh的株作为负对照株(以下，NC株)取得。用植菌环搔取剩余的菌体，在孢子回收溶液(8.5g/L氯化钠、0.5g/L聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)中激烈地进行混合。将混合后的孢子悬浮液用3GP100圆筒漏斗型玻璃过滤器(柴田化学)进行过滤，将其设为孢子液。孢子液中的孢子数使用血球计(Hemocytometer)(血球计数板、D＝1/50mm·1/400mm²)进行测定。

[表2]

实施例2 RDT5株及RDT6株的C4二羧酸生产能力

(1)转化株的培养

(i)菌丝体的制备

将以最终浓度0.5％(v/v)添加有山梨糖醇酐单月桂酸酯(RHEODOL SP-L10(花王))的200mL的SD/-Trp培养基(Clontech)供给500mL用带挡板的三角烧瓶(旭硝子)，以成为1×10³个-孢子/mL-培养基的方式接种实施例1中制备的RDT5株、RDT6株及NC株的各孢子液之后，在27℃下以170rpm搅拌培养3天。使用预先进行了灭菌处理的网眼筛目250μm的不锈钢筛(AS ONE)将得到的培养物进行过滤，在过滤器上回收菌体。

(ii)菌丝体的增殖

在供给500mL容积三角烧瓶的无机培养液100mL(1g/L(NH₄)₂SO₄、0.6g/L KH₂PO₄、0.25g/L MgSO₄·7H₂O、0.09g/L ZnSO₄·7H₂O、50g/L碳酸钙、100g/L葡萄糖)中接种(i)中回收的湿菌体5.0～8.0g，在27℃下以220rpm搅拌培养约40小时。使用预先进行了灭菌处理的不锈钢滤网支架(MILLIPORE)将得到的培养物进行过滤，在过滤器上回收菌体。进一步在该过滤器支架上用200mL的生理盐水清洗菌体。用于清洗的生理盐水进行吸滤而除去。

(2)转化株的C4二羧酸生产率评价

将上述(1)中得到的RDT5株、RDT6株及NC株的各湿菌体6.0g植菌于供给200mL容积三角烧瓶的生产率评价用无机培养液40mL(0.175g/L(NH₄)₂SO₄、0.06g/L KH₂PO₄、0.375g/LMgSO₄·7H₂O、0.135g/L ZnSO₄·7H₂O、50g/L碳酸钙、100g/L葡萄糖)，在35℃下以170rpm进行搅拌培养。培养56小时后，将不含有菌体的培养上清液进行回收，通过后述的参考例1中记载的步骤进行富马酸、苹果酸、琥珀酸及葡萄糖的定量，算出从葡萄糖的各C4二羧酸的变换率(收率)。基于求出的RDT5株、RDT6株及NC株中的变换率，按照下述式算出RDT5株、RDT6株中的各C4二羧酸的生产能力提高率。

提高率(％)

＝(RDT5株或RDT6株中的变换率/NC株中的变换率)×100-100

将结果示于表3。与没有导入rdt5基因或rdt6基因的NC株相比，在RDT5株中，分别观察到苹果酸生产能力提高73.6％，富马酸生产能力提高24.3％，琥珀酸生产能力提高32.1％。另外，与NC株相比，在RDT6株中，分别观察到苹果酸生产能力提高49.5％，富马酸生产能力提高21.1％，琥珀酸生产能力提高28.6％。

[表3]

来自葡萄糖的变换率(％)

株名	苹果酸	富马酸变换率	琥珀酸变换率
				RDT5株	4.2	28.3	1.5
RDT6株	3.6	27.6	1.4
				NC株	2.4	22.8	1.1

生产能力提高率(％)

株名	苹果酸	富马酸	琥珀酸
				RDT5株	73.6	24.3	32.1
RDT6株	49.5	21.1	28.6

参考例1C4二羧酸及葡萄糖的定量

培养上清液中的C4二羧酸(富马酸、苹果酸及琥珀酸)以及葡萄糖的定量通过HPLC而进行。

供给HPLC分析的培养上清液预先用37mM硫酸适当稀释之后，使用DISMIC-13cp(0.20μm醋酸纤维素膜、ADVANTEC)或AcroPrep96孔过滤板(0.2μmGHP膜、PALL)进行不溶物的除去。

HPLC的装置使用LaChrom Elite(Hitachi High-Technologies Corporation)。在分析柱中，使用连接有ICSep ICE-ION-300Guard Column Cartride(4.0mm I.D.×2.0cm、TRANSGENOMIC)的有机酸分析用聚合物柱ICSep ICE-ION-300(7.8mm I.D.×30cm、TRANSGENOMIC)，洗提液为10mM硫酸，以流速0.5mL/分钟在柱温度50℃的条件下进行溶出。各C4二羧酸及葡萄糖的检测中使用UV检测器(检测波长210nm)及示差折光检测器(RI检测器)。浓度标准曲线使用标准试样[富马酸(销售代理商代码063-00655、和光纯药工业)、苹果酸(销售代理商代码135-00562、和光纯药工业)、琥珀酸(销售代理商代码194-04335、和光纯药工业)、葡萄糖(销售代理商代码045-31162、和光纯药工业)]而制成。基于各自的浓度标准曲线进行各成分的定量。

将从该培养基的初始葡萄糖量中减去定量的培养基中的葡萄糖量所得的值设为葡萄糖消耗量。将相对于该葡萄糖消耗量的进行了定量的各C4二羧酸量的比例(％)作为各C4二羧酸的变换率(收率)来算出。

序列表

<110> 花王株式会社

<120> C4二羧酸的制造方法

<130> KS1455

<150> JP2015-211884

<151> 2015-10-28

<150> JP2015-211885

<151> 2015-10-28

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1776

<212> DNA

<213> 戴尔根霉(Rhizopus delemar）

<400> 1

atggaaacga cgaattcatc caataccaat atctctgatt caacagtgga tcaatcaata 60

tctacaccgg cacctgtaac cgaaaaaacg gaaacagtaa acgaagataa aaaactatcc 120

actgtagaag aatacaagaa taagaaaact aatcgtttat taacttttat tggtcttcaa 180

gtagccctct ttttgtctgc tctcgacagt actattatat caacagcatt gcctagaatt 240

gggtctgatt tcaaccaaat gacaattgtt tcatgggttg ctacagctta catcttgacg 300

tttgatgcat ttcaaccatt gtttgctaaa ttttctgata tttttggtcg taaatggatt 360

ctcatgtttg gcattggatt gtttttattt ggatccgtgt tatgtggtgc tgcaacaact 420

atgattatgc tgatcgttgc aagagccatt gctggtattg gtgctgcagg tataaattct 480

atggttttta ttattatttc agatattgta ccattggaaa agagaggaag ttatcaaggc 540

ataattaatg ctgtgtttgc tttggcaagt gtctttggtc cattgatcgg tggttcattt 600

actgattatg ttacatggag atggaacttt tatatcaatc ttcctattgg tgccgtagct 660

gttgcagttc ttttatattt cctgagatta cctacaccta aatccaagct ttccgagaaa 720

ttaaagcgtg tggactacat aggtactgtg atcgtactgg ccttttctac cttgttctta 780

ttggccctta actttggggg acaaacattc ccttggaagt cagctgctgt cattgtaccc 840

ttggttctct cagttctttt ggtaggcctg ctgatggttg tcgaaaaaaa atttgccaaa 900

gagcctttga tgccaccaag gctatttaga aatcgatctg tggtaagcgt cttgtttgtg 960

aattggttct ttggcatgtc cttcttttct gctgtttatt atcttccagt ctatttccag 1020

gttgtccgta acgatagtgc catgtggtcc ggtattcgtt taattcccat gcaacttgtg 1080

ctttgtttta tttctacttt ggcaggtctt actatatcaa agacaggtgt ttacagacca 1140

atgatttgta ttggtatggg tctaatgaca ctgtggattg gactcactac tttatatgat 1200

caaacaatac cattttccca gatttatggt atcactattc ttggctctgg atcacttgga 1260

tgtctctttt catctactat tatcgctctt caagcctctg tggaaataaa agatattgct 1320

gttgtcactg gtctaggtaa cttttctcgt atccttggtg gcgccttagg tgttgccata 1380

tcctctgctg ttttgaattc acatttaaat caagagcttc ctaatctttt acctattgat 1440

gaagctacta aagtcattca atcctcagaa tatgtcaacc acggtttacc agagcaatat 1500

aaggtgctag ctattgaagt ctatgttcat ggacttcaaa tgatttggta tgtcttgata 1560

gctatgtctg gattaggctt tattgcttcg ttctttgtca aacatcattc tgtacgtcgc 1620

catgtcaaag ctgctgcagc tgctaaacaa ggaaatgaag ccgataaagt tgatgacgta 1680

gttgttgaaa tagcttcttc aatagaagaa gaaattaaag atggctccgt attatcaaag 1740

actgagcgta aagtaaatgc ctcctctcca gaatag 1776

<210> 2

<211> 591

<212> PRT

<213> 戴尔根霉(Rhizopus delemar）

<400> 2

Met Glu Thr Thr Asn Ser Ser Asn Thr Asn Ile Ser Asp Ser Thr Val

1 5 10 15

Asp Gln Ser Ile Ser Thr Pro Ala Pro Val Thr Glu Lys Thr Glu Thr

20 25 30

Val Asn Glu Asp Lys Lys Leu Ser Thr Val Glu Glu Tyr Lys Asn Lys

35 40 45

Lys Thr Asn Arg Leu Leu Thr Phe Ile Gly Leu Gln Val Ala Leu Phe

50 55 60

Leu Ser Ala Leu Asp Ser Thr Ile Ile Ser Thr Ala Leu Pro Arg Ile

65 70 75 80

Gly Ser Asp Phe Asn Gln Met Thr Ile Val Ser Trp Val Ala Thr Ala

85 90 95

Tyr Ile Leu Thr Phe Asp Ala Phe Gln Pro Leu Phe Ala Lys Phe Ser

100 105 110

Asp Ile Phe Gly Arg Lys Trp Ile Leu Met Phe Gly Ile Gly Leu Phe

115 120 125

Leu Phe Gly Ser Val Leu Cys Gly Ala Ala Thr Thr Met Ile Met Leu

130 135 140

Ile Val Ala Arg Ala Ile Ala Gly Ile Gly Ala Ala Gly Ile Asn Ser

145 150 155 160

Met Val Phe Ile Ile Ile Ser Asp Ile Val Pro Leu Glu Lys Arg Gly

165 170 175

Ser Tyr Gln Gly Ile Ile Asn Ala Val Phe Ala Leu Ala Ser Val Phe

180 185 190

Gly Pro Leu Ile Gly Gly Ser Phe Thr Asp Tyr Val Thr Trp Arg Trp

195 200 205

Asn Phe Tyr Ile Asn Leu Pro Ile Gly Ala Val Ala Val Ala Val Leu

210 215 220

Leu Tyr Phe Leu Arg Leu Pro Thr Pro Lys Ser Lys Leu Ser Glu Lys

225 230 235 240

Leu Lys Arg Val Asp Tyr Ile Gly Thr Val Ile Val Leu Ala Phe Ser

245 250 255

Thr Leu Phe Leu Leu Ala Leu Asn Phe Gly Gly Gln Thr Phe Pro Trp

260 265 270

Lys Ser Ala Ala Val Ile Val Pro Leu Val Leu Ser Val Leu Leu Val

275 280 285

Gly Leu Leu Met Val Val Glu Lys Lys Phe Ala Lys Glu Pro Leu Met

290 295 300

Pro Pro Arg Leu Phe Arg Asn Arg Ser Val Val Ser Val Leu Phe Val

305 310 315 320

Asn Trp Phe Phe Gly Met Ser Phe Phe Ser Ala Val Tyr Tyr Leu Pro

325 330 335

Val Tyr Phe Gln Val Val Arg Asn Asp Ser Ala Met Trp Ser Gly Ile

340 345 350

Arg Leu Ile Pro Met Gln Leu Val Leu Cys Phe Ile Ser Thr Leu Ala

355 360 365

Gly Leu Thr Ile Ser Lys Thr Gly Val Tyr Arg Pro Met Ile Cys Ile

370 375 380

Gly Met Gly Leu Met Thr Leu Trp Ile Gly Leu Thr Thr Leu Tyr Asp

385 390 395 400

Gln Thr Ile Pro Phe Ser Gln Ile Tyr Gly Ile Thr Ile Leu Gly Ser

405 410 415

Gly Ser Leu Gly Cys Leu Phe Ser Ser Thr Ile Ile Ala Leu Gln Ala

420 425 430

Ser Val Glu Ile Lys Asp Ile Ala Val Val Thr Gly Leu Gly Asn Phe

435 440 445

Ser Arg Ile Leu Gly Gly Ala Leu Gly Val Ala Ile Ser Ser Ala Val

450 455 460

Leu Asn Ser His Leu Asn Gln Glu Leu Pro Asn Leu Leu Pro Ile Asp

465 470 475 480

Glu Ala Thr Lys Val Ile Gln Ser Ser Glu Tyr Val Asn His Gly Leu

485 490 495

Pro Glu Gln Tyr Lys Val Leu Ala Ile Glu Val Tyr Val His Gly Leu

500 505 510

Gln Met Ile Trp Tyr Val Leu Ile Ala Met Ser Gly Leu Gly Phe Ile

515 520 525

Ala Ser Phe Phe Val Lys His His Ser Val Arg Arg His Val Lys Ala

530 535 540

Ala Ala Ala Ala Lys Gln Gly Asn Glu Ala Asp Lys Val Asp Asp Val

545 550 555 560

Val Val Glu Ile Ala Ser Ser Ile Glu Glu Glu Ile Lys Asp Gly Ser

565 570 575

Val Leu Ser Lys Thr Glu Arg Lys Val Asn Ala Ser Ser Pro Glu

580 585 590

<210> 3

<211> 2298

<212> DNA

<213> 戴尔根霉(Rhizopus delemar)

<400> 3

atgaccactt tacttattga caactacgac agttttactt ataatgtcta tcaatacttg 60

agctgccaag gcgccaatgt agttgtctac agaaacgaca aaatcaccat ttccgaaatt 120

gagcaattgg ctcctcgcaa tattgtcatc tcacctggcc ctggccaccc ttccaccgat 180

gccggtgtct ctcgagaggc cattcgagct tttgcaggaa agattcccat cttgggtatt 240

tgtatgggtc agcaatgtat gtatgaagtg tacggtggta aagtgtcata tgcaggtgat 300

attgtgcatg gcaaggcatc cagcatcaag catgacagtc gaggtatctt caagggcgtt 360

cctcaaaaca acatggtcac tcgttaccat tcccttgctg gcatgccttc tactttacct 420

gaaacattag aagtcactgc gactaccgac gatggtatca tcatgggcat tcgacacaag 480

gaatacactg tcgaaggtgt tcagttccat cctgaaagta tcctttgtga acacggacat 540

acgatgatca acaacttctt aagcttgcgt ggtggcacct gggaagagaa tcctgcagcc 600

ggtgttgtct ttaagaaagc tcgttccgaa acacccaaaa tcagtgctag tgaatcccaa 660

ctcgatctct ctcagcaaca acctgccgca gcaccttcca tcttgacccg catttactct 720

caacgactca aggatgttca ggcagccaag gagattcccg gccagacatt tgaagattta 780

gaaaaacttt taaagttgca cgtcgcccca cctcttcaag acgtcgtcgc tcgcgtgcgt 840

caaagcaagc ccgccttgat ggccgaagtc aagcgtgcct ctccctcgaa aggaaacatt 900

gatgtttcgg ccaacgcggc tgagcaggca cttcaatatg ctttagcagg tgcaagcgtc 960

gtctctgttc tgactgaacc caaatggttc cgcggtacga ttcatgatat gcatcaggtc 1020

cgagaggcct tgagccatct gcccaaccgt ccttgtgtgt tgagaaagga ttttattgtc 1080

gatcgctatc aaatcttgga aggttgtctg tacggtgctg atactatctt gttgatcgtg 1140

gccatgctga atgatgaaca actgcacgaa ttgtatcact atgcgaaatc attaggtatg 1200

gaacccttgg tcgaagtcaa taatacggaa gagatggccc gtgccaatgc tttgggcgca 1260

cgtctggtgg gtgttaataa tcgcaacttg cacagctttg atgttgatat ggaaaccacg 1320

agtcgattgg tagagatggt gcctgaagga acgatcttgt gtgcactttc tggtattact 1380

ggacgagctg atgttgaaat gtacgtcaaa cagggtgtgc acgctgtctt ggtgggtgaa 1440

gccctgatgc gtgcttggaa tttgaaggag tttgtgtctg atttgttggg tcatgaaaag 1500

aaggatcctg tgcctgtgtc caaggaatca aaatcttcac tagtcaaggt atgtggtatc 1560

tctagtgtgg atgcagcagt tgaagcagcc aagtcagggg ctgacttgat tggtcttatc 1620

tttgctgaaa agtccaaacg aaaagtgtct ttggaaagag ctcaagaaat cgtgtcctca 1680

gtgcgtgcgt tggatattca agtcaaacga acgttatcaa atgatgattc tcaactggat 1740

tggttccaga tgcacaagcg tctcttggaa aagcgagcaa gaaaaccttt ggtagttggc 1800

gtgtttgtga atcaatcgat tgaatacatg actgaggtgg caacgacagt cggactggac 1860

cttattcagc tgcatggaac cgaatcaacg gagcttgcac gctatttacc cgtgcctgtc 1920

atcaaagctt tccatatcga cagtggtgag ttcaatgaag ctcagatacc aaacctaaat 1980

caaccaggct cttatcatta tgtcttactg gacgctaaag tgcccagctt accatcggat 2040

caacaaggtg gacgtggtgt caagtttgat tggtcaattg ctaccaaaat cgtgaaacat 2100

aggcactttg agtttttggg taatcaagat ttccctgtca tcttggctgg tgggttggat 2160

cctaccaatg tggcatctgc cattcaacag gtgaaaccct ggattgtgga tgtgtcgagt 2220

ggtgttgaaa cagatggagt gaaggattta gaaaagattc gtgcctttgt taaaactgtc 2280

cagtcaacac aattttaa 2298

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 4

cgagctcgaa ttatttaaat gaacagcaag ttaataatct agaggg 46

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 5

tatgaccatg attacgatga gaggcaaaat gaagcgtac 39

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 6

atttaaataa ttcgagctcg gtacccgggg 30

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 7

cgtaatcatg gtcatagctg 20

<210> 8

<211> 1000

<212> DNA

<213> 戴尔根霉(Rhizopus delemar)

<400> 8

tagagggaaa aagagagaat tgaaatagga gaggatgagt caaaatatag tttacataaa 60

atttctcttt tttgtgttaa atataatcta atagcagggg ttttcttagt ttacgtttat 120

atcaaagtta tcaagcatac acttttttat gatttttcat actttaatcc cttttagtat 180

tctattgttt gaaaggagag aaaaaacagc tgagggtacg gtgcacacga gatcttacga 240

taattttcct gcccaacagg aaagaagtaa ttgatcttga ttgacgctcg gagtttgcac 300

gttcggagtt tgcacttcac attgagttat actcttactt attttgaagg aagggacgag 360

aaaagatgta aatataataa taacagtagt aaatagtatg cgcatcaaga acagctacca 420

acaaaagaga gaaatatgag cttaataatg aacaatgtaa atggcagaat gaaatttaat 480

tatcaaagcg gcatctttca gaccttccgt tacttccgat agagtttttt atgcaaagta 540

ataacaactg tatatataaa aaaaagaagg ttatcaagca aaagccacaa tgtcatatct 600

ggaataatca agagtaacta ttgaatgttg gtagccaaaa gaggcacgta attttatgac 660

gaaatatcac acaaaaagat tattttgaca attcatgaat aggacagaga tacaccctaa 720

acatgaaatg taagctatat ttaaacacct caagttaatt ttgaagcttc atttgtatta 780

ttgtaaccat ttagacaagc taaatccttt ttattattgt ccttattgat tttatccaga 840

ttaccgtatc taaagagcga tcaacagaaa aacggctgat tttagaccaa agtttcacaa 900

actacatttg catgaacgtc atatatatat aaaccttgac ttttcttttt tttttttttt 960

tttttttttc attatcaatt aatacaatta aataacaaaa 1000

<210> 9

<211> 634

<212> DNA

<213> 戴尔根霉(Rhizopus delemar)

<400> 9

tcattttaat tacgcatttt catttactaa tttgttacat tttgataacg tcaataaatc 60

ttctaatttc ttttgttctc aaacagttta cagttctatc ttttttttta ccacaatcaa 120

ttctcaatat acaacatagc aaatgtgctt cagtaaattc attaaattct tttaaaaaaa 180

ggtaatttgt agcataaaat tcgactttat tgacgttttt tttatgatca tatacaaata 240

aaatagttgc gaatgagaac taaatttttc attgttttta gtcatatcat ctggctgttg 300

cacgatgatc gcagcatatt tttcttcaca acactcatcc tataagcacc tttcaggact 360

ttcgtctgca ctttccatat ttgatttcat caattgattt gaatttttat ccagtacaat 420

ggtttgaatc tatacaataa attagtcaca gtataaaatt atgtctcatc ttgaacacac 480

acctgcttaa caaagaaatg aagcactcta tcaatagtaa atacaatata tgcatcgatg 540

ccaaatatat atcgtacatt ctcttcaaac gtagcttgat ctaaatcgcc atcaataaac 600

ctttcaatca tcctcactag tgcattataa tggc 634

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 10

tagagggaaa aagagagaat tgaaatagg 29

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 11

ttttgttatt taattgtatt aattgataat g 31

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 12

aattaaataa caaaatcatt ttaattacgc attttc 36

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 13

catgattacg cggccgcgcc attataatgc actagtg 37

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 14

ctctttttcc ctctaatgag aggcaaaatg aagcgtac 38

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 15

aattaaataa caaaaatgtc ttctatcgaa acctccaaaa tctc 44

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 16

aattaaataa caaaaatgga aacgacgaat tcatccaata cc 42

<210> 17

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 17

gcgtaattaa aatgactatt ctggagagga ggcatttact ttac 44

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 18

tcattttaat tacgcatttt catttactaa tttgttacat tttgataacg 50

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 19

gttccttgct gtggatttgt g 21

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 20

gggtgtatct ctgtcctatt catg 24

<210> 21

<211> 771

<212> DNA

<213> 戴尔根霉(Rhizopus delemar)

<400> 21

atgggaaatt tggactttaa aatcaaattg gcaaatactt ttgccacttt gttcttggtt 60

agttctcaag gttttagctt ttctgggtgg ttcctgagtc attcttatga tttcggtccg 120

cgagatttcg caattatctt ggcaagtatc ttacactttt tacttattgg ctttactatc 180

tatcaatatt tgccaagctc acctaaagat gtttatgagg ctattggcta ttggtattta 240

ttaatagccg ttttgaacag tggtgtatca ttcttatggt attaccaagt taacttgttt 300

gctttcattg gacttctttg gcaagtagcg acactcgtct tcatctatca tcgttttcgt 360

gattatcctc ctcgcaatgg cacagatcat gcttttatca atgcgccctt ttccatttac 420

accgcttatt ctctttttat tgttctctgg caagtattcc aatttagcga ccatacgaag 480

catagtcaaa ttgcacacgt gtttattata ctctttattg gttttatagc tcttcatttg 540

gttgattatt cacatcgaaa ggattgggtt tattcattaa caacagcatg gattcttttg 600

ggtgctgctg tattccttga tgatgctcca cacactgttt cacttatcgt agttggcgtt 660

cttataagcg cagtagcaag aacacttatt ccaaattggt tggagcgttt caacagaaga 720

tttagtcgtt gggcaaacag aataggtgaa agaacacctt tgctttcttg a 771

<210> 22

<211> 256

<212> PRT

<213> 戴尔根霉(Rhizopus delemar)

<400> 22

Met Gly Asn Leu Asp Phe Lys Ile Lys Leu Ala Asn Thr Phe Ala Thr

1 5 10 15

Leu Phe Leu Val Ser Ser Gln Gly Phe Ser Phe Ser Gly Trp Phe Leu

20 25 30

Ser His Ser Tyr Asp Phe Gly Pro Arg Asp Phe Ala Ile Ile Leu Ala

35 40 45

Ser Ile Leu His Phe Leu Leu Ile Gly Phe Thr Ile Tyr Gln Tyr Leu

50 55 60

Pro Ser Ser Pro Lys Asp Val Tyr Glu Ala Ile Gly Tyr Trp Tyr Leu

65 70 75 80

Leu Ile Ala Val Leu Asn Ser Gly Val Ser Phe Leu Trp Tyr Tyr Gln

85 90 95

Val Asn Leu Phe Ala Phe Ile Gly Leu Leu Trp Gln Val Ala Thr Leu

100 105 110

Val Phe Ile Tyr His Arg Phe Arg Asp Tyr Pro Pro Arg Asn Gly Thr

115 120 125

Asp His Ala Phe Ile Asn Ala Pro Phe Ser Ile Tyr Thr Ala Tyr Ser

130 135 140

Leu Phe Ile Val Leu Trp Gln Val Phe Gln Phe Ser Asp His Thr Lys

145 150 155 160

His Ser Gln Ile Ala His Val Phe Ile Ile Leu Phe Ile Gly Phe Ile

165 170 175

Ala Leu His Leu Val Asp Tyr Ser His Arg Lys Asp Trp Val Tyr Ser

180 185 190

Leu Thr Thr Ala Trp Ile Leu Leu Gly Ala Ala Val Phe Leu Asp Asp

195 200 205

Ala Pro His Thr Val Ser Leu Ile Val Val Gly Val Leu Ile Ser Ala

210 215 220

Val Ala Arg Thr Leu Ile Pro Asn Trp Leu Glu Arg Phe Asn Arg Arg

225 230 235 240

Phe Ser Arg Trp Ala Asn Arg Ile Gly Glu Arg Thr Pro Leu Leu Ser

245 250 255

<210> 23

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 23

aattaaataa caaaaatggg aaatttggac tttaaaatca aattg 45

<210> 24

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 247

gcgtaattaa aatgatcaag aaagcaaagg tgttctttca c 41

Claims

1.一种转化细胞，其中，

所述转化细胞包含外来多核苷酸，

所述外来多核苷酸编码由序列号2所示的氨基酸序列、序列号22所示的氨基酸序列、或与该序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的多肽。

2.根据权利要求1所述的转化细胞，其中，

所述多核苷酸为由序列号1所示的核苷酸序列、序列号21所示的核苷酸序列、或与该序列具有至少80％的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸。

3.根据权利要求1或2所述的转化细胞，其中，

所述转化细胞包含含有所述多核苷酸的载体。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的转化细胞，其中，

所述细胞为微生物细胞。

5.根据权利要求4所述的转化细胞，其中，

所述微生物为丝状菌。

6.根据权利要求5所述的转化细胞，其中，

所述丝状菌为根霉属。

7.根据权利要求6所述的转化细胞，其中，

所述根霉属为戴尔根霉。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的转化细胞，其中，

C4二羧酸生产能力提高。

9.一种C4二羧酸的制造方法，其中，

所述方法包含将权利要求1～8中任一项所述的转化细胞进行培养。

10.根据权利要求9所述的制造方法，其中，

所述方法还包含从所述培养物中回收C4二羧酸。

11.根据权利要求9或10所述的制造方法，其中，

所述C4二羧酸为富马酸、苹果酸或琥珀酸。

12.一种转化细胞的制造方法，其中，

所述方法包含将多核苷酸、或含有其的载体导入至宿主细胞，

所述多核苷酸编码由序列号2所示的氨基酸序列、序列号22所示的氨基酸序列、或与该序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的多肽。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，

所述细胞为微生物细胞。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，

所述微生物为丝状菌。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，

所述丝状菌为根霉属。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，

所述根霉属为戴尔根霉。

17.一种宿主细胞中的C4二羧酸生产能力的提高方法，其中，

18.根据权利要求17所述的方法，其中，

所述细胞为微生物细胞。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，

所述微生物为丝状菌。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，

所述丝状菌为根霉属。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，

所述根霉属为戴尔根霉。