JP6970101B2 - 変異糸状菌、及びそれを用いたc4ジカルボン酸の製造方法 - Google Patents
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Description
(特許文献2)中国特許第101255405号公報
(非特許文献1)Metabolic Engineering,2012,14:512−520
(非特許文献2)Biotech.Bioeng.,2001,74:89−95
配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
配列番号2で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド;ならびに、
配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド、
からなる群より選択される少なくとも1種のポリペプチドの発現が強化された、変異糸状菌を提供する。
配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
配列番号2で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド;ならびに、
配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド、
からなる群より選択される少なくとも1種のポリペプチドの発現を強化することを含む、変異糸状菌の製造方法を提供する。
配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
配列番号2で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド;ならびに、
配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド、
からなる群より選択される少なくとも1種のポリペプチドの発現を強化することを含む、糸状菌におけるC4ジカルボン酸生産能の向上方法を提供する。
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Lipman−Pearson法(Science,1985,227:1435−1441)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGENETY Ver.12のホモロジー解析プログラムを用いて、Unit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出される。
向上率(%)
=(変異体のC4ジカルボン酸生産能/宿主又はコントロールのC4ジカルボン酸生産能)×100−100
ここで、変異体とは、宿主細胞に対して所与の形質が変化するような改変を加えた細胞をいい、宿主とは、該変異体の宿主(親細胞又は親生物体)をいう。コントロールとしては、該変異体と同じ改変を加えた宿主細胞と異なる種の細胞又は生物体、あるいは該改変を加えなかった宿主細胞又は生物体(例えば、空ベクターもしくはコントロール配列を導入した宿主細胞や生物体など)が挙げられる。好ましくは、変異体におけるC4ジカルボン酸生産能の向上率は、該変異体によるC4ジカルボン酸の生産速度が最大となる時点における、各細胞又は生物体のC4ジカルボン酸生産能に基づいて計算される。本明細書において、「C4ジカルボン酸生産能がX%以上向上した変異体」とは、上記式で計算されるC4ジカルボン酸生産能の向上率がX%以上である変異体をいい、また変異体における「C4ジカルボン酸生産能のX%以上の向上」とは、上記式で計算される該変異体のC4ジカルボン酸生産能の向上率がX%以上であることを意味する。
L-malate + NAD(P)+ ⇔ pyruvate + CO2 + NAD(P)H
リンゴ酸酵素活性は、公知の方法(例えば、W.Tang et al.,Mol.Biotechnol.,2010,45:121−128に記載の方法)により測定することができる。
(2.1.変異糸状菌)
一態様において、本発明は、リンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドの発現が強化された変異糸状菌を提供する。
(a)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド;ならびに、
(c)配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド。
本発明の変異糸状菌は、糸状菌を改変し、上記リンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドの発現を強化することによって製造することができる。したがって、さらなる態様において、本発明は、宿主糸状菌において、上記リンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドの発現を強化することを含む、変異糸状菌の製造方法を提供する。
(a')配列番号1で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b')配列番号1で示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;ならびに、
(c')配列番号1で示されるヌクレオチド配列に対して1個又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
本発明の変異糸状菌は、その宿主と比較して、C4ジカルボン酸生産能が向上している。好ましくは、本発明の変異糸状菌のC4ジカルボン酸生産能は、宿主に対して10%以上、より好ましくは20%以上、さらに好ましくは30%以上向上している。
本発明の変異糸状菌は、C4ジカルボン酸生産能が向上している。したがって、さらなる態様において、本発明は、上記本発明の変異糸状菌を培養することを含むC4ジカルボン酸の製造方法を提供する。該本発明の製造方法により製造されるC4ジカルボン酸としては、フマル酸、リンゴ酸、及びコハク酸が挙げられ、好ましくはフマル酸及びリンゴ酸、より好ましくはフマル酸が挙げられる。
変異糸状菌の胞子を、例えば、無機寒天培地(組成例:2%グルコース、0.1%硫酸アンモニウム、0.06%リン酸2水素カリウム、0.025%硫酸マグネシウム・7水和物、0.009%硫酸亜鉛・7水和物、1.5%寒天、いずれも濃度は%(w/v))、PDA培地、等の培地に接種し、10〜40℃、好ましくは27〜30℃にて、7〜10日間静置培養を行なうことにより胞子を形成させ、次いで生理食塩水などに懸濁することで、胞子懸濁液を調製することができる。胞子懸濁液には菌糸体が含まれていても、含まれていなくてもよい。
工程Aで得られた胞子懸濁液を、培養液に接種して培養し、胞子を発芽させて菌糸体を得る。培養液に接種する糸状菌の胞子数は、1×102〜1×108個−胞子/mL−培養液、好ましくは1×102〜5×104個−胞子/mL−培養液、より好ましくは5×102〜1×104個−胞子/mL−培養液、さらに好ましくは1×103〜1×104個−胞子/mL−培養液である。培養液には、市販の培地、例えば、PDB培地、LB培地、NB培地、SB培地、SD培地等が利用できる。該培養液には、発芽率と菌体生育の観点から、炭素源としてグルコース、キシロースなどの単糖、シュークロース、ラクトース、マルトースなどのオリゴ糖、又はデンプン等の多糖;グリセリン、クエン酸などの生体成分;窒素源として硫酸アンモニウム、尿素、アミノ酸等;その他無機物としてナトリウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、リン酸等の各種塩類、を適宜添加することができる。単糖、オリゴ糖、多糖及びグリセリンの好ましい濃度は0.1〜30%(w/v)、クエン酸の好ましい濃度は0.01〜10%(w/v)、硫酸アンモニウム、尿素及びアミノ酸の好ましい濃度は0.01〜1%(w/v)、無機物の好ましい濃度は0.0001〜0.5%(w/v)である。当該培養液に胞子懸濁液を接種し、好ましくは80〜250rpm、より好ましくは100〜170rpmで攪拌しながら、25〜42.5℃の培養温度制御下で、好ましくは24〜120時間、より好ましくは48〜72時間培養する。培養に供する培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、200mL容バッフル付フラスコの場合は50〜100mL程度、500mL容バッフル付フラスコの場合は100〜300mL程度であればよい。この培養により、接種した胞子は発芽し、菌糸体へと成長する。
C4ジカルボン酸生産能向上の観点から、工程B1で得られた菌糸体をさらに培養して増殖させる工程(工程B2)を行うことが好ましい。工程B2で使用する増殖用の培養液は特に限定されないが、通常使用されるグルコースを含む無機培養液であればよく、例えば、7.5〜30%グルコース、0.001〜0.2%硫酸アンモニウム、0.01〜0.6%リン酸2水素カリウム、0.01〜0.1%硫酸マグネシウム・7水和物、0.005〜0.05%硫酸亜鉛・7水和物、及び3.75〜20%炭酸カルシウム(いずれも濃度は%(w/v))を含有する培養液等が挙げられる。当該培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、500mL容三角フラスコの場合は50〜300mL、好ましくは100〜200mLであればよい。この培養液に、工程B1で培養した菌体を、湿重量として1〜6g−菌体/100mL−培養液、好ましくは3〜4g−菌体/100mL−培養液となるよう接種し、100〜300rpm、好ましくは170〜230rpmで攪拌しながら、25〜42.5℃の培養温度制御下で、12〜120時間、好ましくは24〜72時間培養する。
上記の手順(工程B1又はB2)で得られた糸状菌の菌糸体を培養して、当該菌にC4ジカルボン酸を生産させる。該培養の条件は、上述した通常の糸状菌の培養条件に従えばよい。培地の量は、200mL容三角フラスコの場合は20〜80mL程度、500mL容三角フラスコの場合は50〜200mL程度、30Lジャーファーメンターの場合は10L〜15L程度とすることができるが、培養容器にあわせて適宜調整すればよい。培地に対する工程B1又はB2で得られた菌体の接種量は、好ましくは湿重量として5g〜90g−菌体/100mL−培地、より好ましくは5g〜50g−菌体/100mL−培地であり得る。好適には、培養は、100〜300rpm、好ましくは150〜230rpmで攪拌しながら、25〜45℃の温度下で、2時間〜240時間、好ましくは12時間〜120時間行われる。ジャーファーメンターを用いる場合は、通気は好ましくは0.05〜2vvm、より好ましくは0.1〜1.5vvmにて行う。
本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法等をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
(a)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド;ならびに、
(c)配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド。
(a')配列番号1で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b')配列番号1で示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;ならびに、
(c')配列番号1で示されるヌクレオチド配列に対して1個又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
(a')配列番号1で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b')配列番号1で示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;ならびに、
(c')配列番号1で示されるヌクレオチド配列に対して1個又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
好ましくは、リゾプス・デレマー又はリゾプス・オリゼであり、
より好ましくはリゾプス・デレマーである、
〔7〕記載の変異糸状菌。
好ましくは、フマル酸、リンゴ酸又はコハク酸であり、
より好ましくはフマル酸又はリンゴ酸であり、
さらに好ましくはフマル酸である、
〔10〕記載の変異糸状菌。
好ましくは、フマル酸、リンゴ酸又はコハク酸であり、
より好ましくはフマル酸又はリンゴ酸であり、
さらに好ましくはフマル酸である、
〔12〕又は〔13〕記載の製造方法。
(a)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド;ならびに、
(c)配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド。
(a)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド;ならびに、
(c)配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド。
(a')配列番号1で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b')配列番号1で示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;ならびに、
(c')配列番号1で示されるヌクレオチド配列に対して1個又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
(a')配列番号1で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b')配列番号1で示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;ならびに、
(c')配列番号1で示されるヌクレオチド配列に対して1個又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
好ましくは、リゾプス・デレマー又はリゾプス・オリゼであり、
より好ましくはリゾプス・デレマーである、
〔22〕記載の方法。
好ましくは、フマル酸、リンゴ酸又はコハク酸であり、
より好ましくはフマル酸又はリンゴ酸であり、
さらに好ましくはフマル酸である、
〔25〕記載の方法。
本実施例で用いたPCRプライマーを表1−1及び表1−2に示す。
PDA培地にRhizopus delemar JCM(Japan Collection of Microorganisms/理研)5557株(以降、5557株と表記)の胞子を植菌後、30℃で5日間培養を行った。培養後、菌体を3mL用メタルコーン(安井器械)とともに3mL破砕チューブに入れ、直ちに液体窒素中で10分間以上凍結させた。その後、マルチビーズショッカー(安井器械)を用いて1700rpmで10秒間菌体の破砕を行った。破砕後の容器にTE Buffer(pH8.0)(ニッポンジーン)を400μL加え転倒混和し、250μLを1.5mLチューブに移した。該菌体溶液から、“Genとるくん(酵母用)”(タカラバイオ)を用いて、プロトコールに従いゲノム抽出を行った。得られたゲノム溶液50μLに対し、RNaseA(ロシュ)を1μL添加し、37℃で1時間反応させた。反応後、等量のフェノール/クロロホルムを加え、タッピングにより混和した後、4℃、14500rpmで5分間遠心し、上清を新しい1.5mLチューブに移した。再度フェノール/クロロホルム処理を繰り返し、次いでエタノール沈殿を行い、5557株の精製ゲノム溶液を得た。
(i)total RNA抽出
5557株の菌体6g−湿重量を、液体培地40mL(0.1g/L(NH4)2SO4、0.6g/L KH2PO4、0.25g/L MgSO4・7H2O、0.09g/L ZnSO4・7H2O、50g/L 炭酸カルシウム、100g/Lグルコース)に植菌し、35℃、170rpmで8時間培養した。培養液中から菌体をろ過、回収し、0.85%生理食塩水100mLで2回洗浄を行った。洗浄後、吸引濾過により余分な水分を取り除いた後、0.3gを量りとり3mL用メタルコーン(安井器械)とともに3mL破砕チューブに入れ、直ちに液体窒素に投入し、凍結させた。得られた凍結菌体を、マルチビーズショッカー(安井器械)を用いて1700rpmで10秒間破砕した。破砕後の菌体にRLT bufferを500μL添加し、転倒混和後、450μLをRNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)に供し、total RNA抽出を行った。得られたRNA溶液40μLに1μLのDNaseI(TaKaRa)及び5μLの10×DNaseI buffer(USB Corporation)を添加し、RNase free waterで50μLにフィルアップした後、37℃で30分以上反応させて溶液中の残存DNAを除去した。DNaseIをさらに1μL追加し、37℃で30分間反応させた後にフェノール/クロロホルム抽出を行い、次いでエタノール沈殿を行った。沈殿を50μLの滅菌水に溶解し、Qubit(Life Technologies)を用いてRNA溶液の濃度及び純度を測定した。また、該RNA溶液を適宜希釈し、Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent)及びRNA6000 Pico Kit(Agilent)を用いて抽出したRNAの検定を行った。RNAの分解度指標である「RNA Integrity Number(RIN値)」が6.0以上であることを確認し、得られたRNA溶液をtotal RNAとして取得した。
cDNA合成は、SuperScriptIII First−Strand Synthesis SuperMix for qRT−PCR(Invitrogen)を用いて行った。すなわち、(i)で得られたRNA溶液1μgをDEPC水で8μLにフィルアップした後、10μLの2×RT Reaxtion Mixと、2μLのRT Enzyme Mixを添加し、穏やかに混ぜ、25℃で10分間、50℃で30分間、85℃で5分間反応させた。反応後の溶液に1μLのRNaseHを加え37℃で20分間反応させ、これをcDNA溶液とした。
(i)pUC18へのtrpC遺伝子領域の導入
上記(1)で得られた5557株のゲノムDNAを鋳型に、trpC遺伝子(配列番号3)を含むDNA断片を、プライマーoJK162(配列番号12)及びoJK163(配列番号13)を用いたPCRにて合成した。次に、プラスミドpUC18を鋳型に、プライマーoJK164(配列番号14)及びoJK165(配列番号15)を用いたPCRにてDNA断片を増幅した。以上の2断片をIn−Fusion HD Cloning Kit(Clontech)を用いて連結しプラスミドpUC18−trpCを構築した。
上記(1)で得られた5557株のゲノムDNAを鋳型に、ADH1のプロモーター配列(配列番号4)を含むDNA断片とターミネーター配列(配列番号5)を含むDNA断片とを、それぞれプライマーoJK202(配列番号16)及びoJK204(配列番号17)、ならびにoJK205(配列番号18)及びoJK216(配列番号19)を用いたPCRにて増幅した。次に、(i)で得られたプラスミドpUC18−trpCを鋳型に、プライマーoJK210(配列番号20)及びoJK211(配列番号21)を用いたPCRにてDNA断片を増幅した。以上の3断片を(i)と同様の手順で連結してプラスミドpUC18−trpC−Padh−Tadhを構築した。得られたプラスミドには、trpC遺伝子領域の下流にADH1プロモーター及びターミネーターが順に配置されている。さらにADH1ターミネーターの下流にはNot I制限酵素認識配列が配置されている。
リンゴ酸酵素をコードする遺伝子(以下、RdME1と称する、配列番号1)を、プライマーNK−141(配列番号24)及びNK−163(配列番号25)を用いたPCRにて、(2)で作製したcDNAライブラリーから増幅した。次に、(ii)で得られたプラスミドpUC18−trpC−Padh−Tadhを鋳型に、プライマーNK−011(配列番号26)及びNK−012(配列番号27)を用いたPCRにてDNA断片を増幅した。上記2断片を(i)と同様の手順で連結してプラスミドpUC18−trpC−Padh−RdME1−Tadhを構築した。得られたプラスミドには、ADHプロモーターとターミネーターの間にRdME1遺伝子が挿入されている。
pdc1遺伝子ローカスにてpdc1遺伝子ORFを除き、trpC遺伝子領域をknock−inするためのプラスミドptrpC−knock−inを作製した。すなわち、pUC18を鋳型にプライマーpUC18−Pae1−F3(配列番号28)及びpUC18−Hind3−R3(配列番号29)にて増幅したpUC18ベクター断片と、JCM5557株のゲノムを鋳型にプライマーPDC1−upstr−F(配列番号30)及びPDC1−upstr−R(配列番号31)にて増幅したpdc遺伝子のプロモーター部位断片と、JCM5557株のゲノムを鋳型にプライマーtrpCpro−R(配列番号32)及びtrpCter−F(配列番号33)にて増幅したtrpC遺伝子領域断片と、JCM5557株のゲノムを鋳型にプライマーPDC1−downstr−F(配列番号34)及びPDC1−downstr−R(配列番号35)にて増幅したpdc遺伝子のターミネーター部位断片を、In−Fusion HD Cloning Kit(Clontech)を用いて連結し、プラスミドptrpC−knock−inを構築した。
(i)trpC knock−in用プラスミドとの連結
(4)で作製したプラスミドptrpC−knock−inを鋳型に、プライマーoJK899(配列番号36)及びoJK900(配列番号37)を用いたPCRにてDNA断片を増幅した。次に、(3)(iii)で得られたプラスミドpUC18−trpC−Padh−RdME1−Tadhを鋳型に、プライマーoJK901(配列番号38)及びNK−195(配列番号39)を用いたPCRにてDNA断片を増幅した。上記2断片を(i)と同様の手順で連結してプラスミドpUC18−Ppdc−trpC−Padh−RdME1−Tpdcを構築した。得られたプラスミドは、trpC knock−in用配列を含み、またADHプロモーターとPDCターミネーターの間に配列番号1で示されるRdME1遺伝子が挿入されている。
(i)で作製したプラスミドpUC18−Ppdc−trpC−Padh−RdME1−Tpdcを鋳型にプライマーoJK902(配列番号40)及びoJK903(配列番号41、5’末端がリン酸化されている)を用いてDNA断片をPCR増幅し、またプラスミドptrpC−knock−inを鋳型にプライマーPDC1−upstr−F2(配列番号42)及びPDC1−downstr−R−P(配列番号43、5’末端がリン酸化されている)を用いてDNA断片をPCR増幅し、鋳型をDpn1(TOYOBO)処理にて分解した後、生成物をフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール処理、及びエタノール沈殿処理にて精製した。精製物を、さらにLambda Exonuclease(NEW ENGLAND BioLabs)を用いて処理した後、上記と同様に精製し、一本鎖DNAを得た。Lambda Exonuclease処理は、37℃、オーバーナイトで行った。
(i)TALEN発現ベクターの作製
Transposagen Biopharmaceuticals社に依頼し、Custom XTN TALEN(Transposagen Biopharmaceuticals社が提供するTALENの商品名)を作製した。これは、ピルビン酸デカルボキシラーゼ(PDC)をコードする遺伝子(pdc遺伝子;配列番号6)を標的とするTALENのためのキットであり、2つのポリヌクレオチドLeftTALEN−pdc(配列番号7)及びRightTALEN−pdc(配列番号8)を含み、これらはpdc遺伝子を含む領域(配列番号9)に結合する。LeftTALEN−pdcは、pdc遺伝子のセンス鎖中の5’−TGCCTGCTATTAAAATCG−3’(配列番号10)の配列を標的とするTALENをコードし、RightTALEN−pdcは、アンチセンス鎖中の5’−TTGATTTCCTTAAGACGG−3’(配列番号11)の配列を標的とするTALENをコードする。
細胞内でTALENとともにエキソヌクレアーゼを発現させることにより、TALENによる標的DNAの破壊が促進される(Scientific Reports,2013,3:1253,DOI:10.1038/srep01253、Nat Methods,2012,9:973−975)ため、TALEN発現ベクターと共に導入するエキソヌクレアーゼ発現ベクターを作製した。
(i)トリプトファン栄養要求性株の作製
遺伝子導入の宿主細胞として用いたトリプトファン栄養要求性株は、5557株へのイオンビーム照射による変異導入株の中から選抜し取得した。イオンビーム照射は、独立行政法人日本原子力研究開発機構・高崎量子応用研究所のイオン照射施設(TIARA)において行った。照射は、AVFサイクロトロンを用いて12C5+を加速し、220MeVのエネルギーで100〜1250Gray照射した。照射した菌体より胞子を回収し、その中から、トリプトファン栄養要求性を示すRhizopus delemar 02T6株(以降、02T6株と表記)を取得した。02T6株は、trpC遺伝子コーディング領域(配列番号3)全長2298bp中の2093番目が一塩基欠損している。
上記(6)で作製したpadh−LeftTALEN−pdc、padh−RightTALEN−pdc、padh−exo1、及び上記(5)で作製した一本鎖DNAを混合したDNA溶液(1μg/μL)10μLを、金粒子溶液(60mg/mL、INBIO GOLD社、粒子径1μm)100μLに加えた。さらに0.1Mスペルミジンを40μL加え、ボルテックスでよく攪拌した。2.5MのCaCl2を100μL加え、ボルテックスで1分間攪拌した後、6000rpmで30秒間遠心し、上清を除いた。得られた沈殿に70%EtOHを200μL加え、30秒間ボルテックスで攪拌した後、6000rpmで30秒間遠心し、上清を除いた。得られた沈殿を100μLの100%EtOHで再懸濁した。
次に、(i)で作製した02T6株の胞子に対し、(ii)で作製したDNA−金粒子溶液を用い、GDS−80(ネッパジーン)にて遺伝子導入を行った。遺伝子導入後の胞子は、無機寒天培地(20g/Lグルコース、1g/L硫酸アンモニウム、0.6g/Lリン酸2水素カリウム、0.25g/L硫酸マグネシウム・7水和物、0.09g/L硫酸亜鉛・7水和物、15g/L寒天)上で、30℃の条件で1週間程静置培養した。
培養した菌体から胞子を回収し、pH3に調製した無機寒天培地(20g/Lグルコース、1g/L硫酸アンモニウム、0.6g/Lリン酸2水素カリウム、0.25g/L硫酸マグネシウム・7水和物、0.09g/L硫酸亜鉛・7水和物、15g/L寒天)を用いて菌株を単離した。生育した菌株の菌糸を爪楊枝にて一部かき取り、10mM Tris−HCl(pH8.5)に懸濁し、95℃で10分間インキュベートした。その後、10mM Tris−HCl(pH8.5)で適宜希釈し、コロニーPCR用のゲノムテンプレート溶液とした。コロニーPCRは、上記ゲノムテンプレート溶液、プライマーNK−069(配列番号50)とNK−118(配列番号51)、及びKOD FX Neo(TOYOBO)を用いて行った。上記プライマーでコロニーPCRを行った場合、pdc1遺伝子ローカスにtrpC遺伝子断片のknock−inが起こっていれば、DNA断片が増幅する。コロニーPCRによりDNA増幅断片が得られた菌株を、pdc1遺伝子欠失株Δpdc株として取得した。プラスミドpUC18−Ppdc−trpC−Padh−RdME1−Tpdcを用いて遺伝子導入を行った菌株をΔpdc::ME1株とし、プラスミドptrpC−knock−inを用いて遺伝子導入を行った菌株をΔpdc::trpC株とした。残りの菌体を植菌耳で掻き取り、胞子回収溶液(8.5g/L塩化ナトリウム、0.5g/Lポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート)中で激しく混和した。混和後の胞子懸濁液を3GP100円筒ロート型ガラスろ過器(柴田化学)にてろ過し、これを胞子液とした。胞子液中の胞子数は、TC20 Automated Cell Counter(バイオラッド)を用いて測定した。
(1)菌株の培養
(i)菌糸体の調製
500mL用バッフル付三角フラスコ(旭硝子)に、ソルビタンモノラウレート(レオドールSP−L10(花王))を最終濃度で0.5%(v/v)添加した200mLのSD/−Trp培地(Clontech)を供し、実施例1で調製したΔpdc::ME1株及びΔpdc::trpC株の胞子液を1×103個−胞子/mL−培地となるようにそれぞれ接種後、27℃にて3日間、170rpmで攪拌培養した。得られた培養物を予め滅菌処理したメッシュ網目250μmのステンレスふるい(アズワン)を用いてろ過し、菌体をフィルター上に回収した。
500mL容三角フラスコに供した無機培養液100mL(0.1g/L(NH4)2SO4、0.6g/L KH2PO4、0.25g/L MgSO4・7H2O、0.09g/L ZnSO4・7H2O、50g/L炭酸カルシウム、100g/Lグルコース)に、(i)で回収した湿菌体5.0〜8.0gを接種し、27℃で約40時間、220rpmにて攪拌培養した。得られた培養物を、予め滅菌処理したステンレススクリーンフィルターホルダー(MILLIPORE)を用いてろ過し、フィルター上に菌体を回収した。さらにこのフィルターホルダー上で、200mLの生理食塩水で菌体を洗浄した。洗浄に用いた生理食塩水は吸引ろ過して除去した。
上記(1)で得られた湿菌体6.0gを、200mL容三角フラスコに供した無機培養液40mL(0.0175g/L(NH4)2SO4、0.06g/L KH2PO4、0.375g/L MgSO4・7H2O、0.135g/L ZnSO4・7H2O、50g/L炭酸カルシウム、100g/Lグルコース)に植菌し、35℃、170rpmで24時間攪拌培養した。得られた培養物を、予め滅菌処理したステンレススクリーンフィルターホルダー(MILLIPORE)を用いてろ過し、フィルター上に菌体を回収した。さらにこのフィルターホルダー上で、200mLの生理食塩水で菌体を洗浄し、生理食塩水を吸引ろ過して除去し、菌体を1.0gずつ−80℃にて凍結した。凍結菌体をマルチビーズショッカー及びメタルコーン(安井器械)を用いて破砕した。ここに50mM Tris−HClバッファー(pH8.0)1mLを加えて再度破砕し、15000rpm・4℃にて5分間遠心分離した後、上清をAmiconUltra−0.5(3kDa、ミリポア)を用いて濃縮及び洗浄し。菌体破砕液を得た。
上記(2)で得られた菌体破砕液を5μL添加した96穴アッセイプレート(イワキ)に、185μLの反応液(終濃度50mM Tris−HCl pH8.0、2.5mM MnCl2、0.2mM NAD+)を加え、200mM リンゴ酸を10μL添加することで反応を開始した。30℃における340nmの吸光度変化(NADHの吸光係数=6200 M-1cm-1)の傾きを基準として活性値(mU/菌体湿重量g)を算出した。このとき、活性単位(U)は1分間に消費されたリンゴ酸の量(μmol/min)と定義した。測定結果を表2に示す。参照株であるΔpdc::trpC株と比較して、Δpdc::ME1株ではリンゴ酸酵素活性が約3倍に向上した。
(1)菌株の培養
実施例2(1)と同様の条件で菌糸体を調製し増殖させた。
上記(1)で得られたΔpdc::ME1株及びΔpdc::trpC株の湿菌体6.0gを、200mL容三角フラスコに供した無機培養液40mL(0.0175g/L(NH4)2SO4、0.06g/L KH2PO4、0.375g/L MgSO4・7H2O、0.135g/L ZnSO4・7H2O、50g/L炭酸カルシウム、100g/Lグルコース)に植菌し、35℃、170rpmで攪拌培養した。培養8時間後に、菌体を含まない培養上清を回収し、後述する参考例1に記載の手順にてC4ジカルボン酸(フマル酸)の定量を行った。求めたC4ジカルボン酸の量に基づいて、下記式に従いΔpdc::ME1株におけるC4ジカルボン酸生産能向上率を算出した。
向上率(%)
=(Δpdc::ME1株における生産速度/Δpdc::trpC株における生産速度)×100−100
結果を表3に示す。RdME1遺伝子を導入されていないΔpdc::trpC株と比較して、Δpdc::ME1株では、40%のフマル酸生産能の向上が観察された。
培養上清中のC4ジカルボン酸の定量は、HPLCにより行った。HPLC分析に供する培養上清は、予め37mM硫酸にて適宜希釈した後、DISMIC−13cp(0.20μmセルロースアセテート膜、ADVANTEC)又はアクロプレップ96フィルタープレート(0.2μmGHP膜、日本ポール)を用いて不溶物の除去を行なった。
HPLCの装置は、LaChrom Elite(日立ハイテクノロジーズ)を用いた。分析カラムには、ICSep ICE−ION−300 Guard Column Cartride(4.0mmI.D.×2.0cm、TRANSGENOMIC)を接続した有機酸分析用ポリマーカラムICSep ICE−ION−300(7.8mm I.D.×30cm、TRANSGENOMC)を用い、溶離液は10mM硫酸、流速0.5mL/分、カラム温度50℃の条件にて溶出を行なった。C4ジカルボン酸の検出には、UV検出器(検出波長210nm)を用いた。濃度検量線は、標準試料〔フマル酸(販売元コード063−00655、和光純薬工業)〕を用いて作成し、濃度検量線に基づいて培養上清中のC4ジカルボン酸の定量を行なった。
Claims (9)
- 以下からなる群より選択される少なくとも1種のポリペプチドの発現が強化された、変異リゾプス属菌:
配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるリンゴ酸酵素;
配列番号2で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド;ならびに、
配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド。 - 以下からなる群より選択される少なくとも1種のポリヌクレオチドを含有するDNA断片又はベクターを導入された、請求項1記載の変異リゾプス属菌:
配列番号1で示されるヌクレオチド配列からなるリンゴ酸酵素をコードするポリヌクレオチド;
配列番号1で示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;ならびに、
配列番号1で示されるヌクレオチド配列に対して1個又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。 - 前記リゾプス属菌がリゾプス・デレマー又はリゾプス・オリゼである、請求項1又は2記載の変異糸状菌。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載の変異リゾプス属菌を培養することを含む、C4ジカルボン酸の製造方法。
- 前記培養物からC4ジカルボン酸を回収することをさらに含む、請求項4記載の製造方法。
- 前記C4ジカルボン酸がフマル酸、リンゴ酸又はコハク酸である、請求項4又は5記載の製造方法。
- 宿主リゾプス属菌において、以下からなる群より選択される少なくとも1種のポリペプチドの発現を強化することを含む、変異リゾプス属菌の製造方法:
配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるリンゴ酸酵素;
配列番号2で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド;ならびに、
配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド。 - 前記発現の強化が、以下からなる群より選択される少なくとも1種のポリヌクレオチドを含有するDNA断片又はベクターを導入することを含む、請求項7記載の方法:
配列番号1で示されるヌクレオチド配列からなるリンゴ酸酵素をコードするポリヌクレオチド;
配列番号1で示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;ならびに、
配列番号1で示されるヌクレオチド配列に対して1個又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。 - 前記リゾプス属菌がリゾプス・デレマー又はリゾプス・オリゼ菌である、請求項7又は8記載の方法。
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