CN109689871B

CN109689871B - 突变丝状菌和使用其制造c4二羧酸的方法

Info

Publication number: CN109689871B
Application number: CN201780055565.1A
Authority: CN
Inventors: 野中镜士朗
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2016-09-15
Filing date: 2017-09-05
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2037-09-05
Also published as: JP6970101B2; CN109689871A; US20190194700A1; WO2018051837A1; JPWO2018051837A1

Abstract

本发明提供一种C4二羧酸生产能力提高的突变丝状菌和使用该突变丝状菌生产C4二羧酸的方法。一种突变丝状菌，其中，选自以下的至少一种多肽的表达增强：由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽；由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽；以及由相对于序列号2所示的氨基酸序列缺失、取代、添加或插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽。

Description

突变丝状菌和使用其制造C4二羧酸的方法

技术领域

本发明涉及突变丝状菌以及使用其制造C4二羧酸的方法。

背景技术

C4二羧酸除了作为酸化剂、抗菌剂、pH调节剂用于食品工业中的各种用途之外，也可用作合成树脂和可生物降解聚合物的原料，是一种具有高工业价值的物质。C4二羧酸在工业上通过衍生自石化原料的化学合成或通过微生物发酵生产。过去，化学合成因其成本较低而是主流，但近年来，从原料价格上升、环境负担等观点出发，以再生资源作为原料的微生物发酵的制造方法受到关注。

已知富马酸是C4二羧酸之一，可以使用根霉属菌(Rhizopus)等发酵菌制造。根霉属菌用葡萄糖作为碳源生产富马酸，并将其排出菌体外。迄今为止，关于使根霉属菌的富马酸高产化的方法，已知有通过改良培养方法和诱变育种来生产高产菌株等。然而，由于根霉属菌的遗传学背景还没有得到充分的研究，通过基因重组开发根霉属菌的富马酸高产技术并不容易，报告也很少。有少量报告，通过将源自酿酒酵母的编码丙酮酸羧化酶的基因导入戴尔根霉(Rhizopus Delemar)的方法(专利文献1)、以及将源自大肠杆菌的编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因导入米根霉(Rhizopus oryzae)的方法(非专利文献1)以提高富马酸生产能力。

苹果酸酶(malic enzyme，ME)是通过与NAD⁺或NADP⁺的还原共轭而使苹果酸氧化脱羧，生成丙酮酸和二氧化碳的酶。ME除了存在于大肠杆菌的细胞质中之外，还发现存在于链球菌(Streptococcus)属、念珠菌(Candida)属、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)属，棒状杆菌(Corynebacterium)属、以及含油酵母、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)属和高山被孢霉(Mortierella alpine)属等脂质生产菌中，有报告其参与光合作用、脂质合成、能量代谢等各种代谢通路。在非专利文献2中报告了在导入苹果酸酶基因sfcA的大肠杆菌中，琥珀酸的产生量增加。专利文献2中报告了在敲除了fum基因而使苹果酸酶基因过表达的大肠杆菌中，苹果酸产量增加。另一方面，ME在根霉属菌等丝状菌的代谢通路中的作用仍然未知。

现有技术文献：

专利文献1：中国专利申请公开第103013843号说明书

专利文献2：中国专利第101255405号公报

非专利文献1：Metabolic Engineering,2012,14:512-520

非专利文献2：Biotech.Bioeng.,2001,74:89-95

发明内容

在一个实施方式中，本发明提供了一种突变丝状菌，其中，选自以下的至少一种多肽的表达增强：

由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽；

由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽；以及

由相对于序列号2所示的氨基酸序列缺失、取代、添加或插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽。

在另一个实施方式中，本发明提供一种C4二羧酸的制造方法，其中，包括培养上述突变丝状菌的步骤。

在另一个实施方式中，本发明提供一种突变丝状菌的制造方法，其中，包括在宿主丝状菌中增强选自以下的至少一种多肽的表达的步骤：

由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽；

在另一个实施方式中，本发明提供一种提高丝状菌中C4二羧酸生产能力的方法，其中，包括在丝状菌中增强中选自以下的至少一种多肽的表达的步骤：

由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽；

具体实施方式

本发明涉及C4二羧酸生产能力提高的突变丝状菌和使用该突变丝状菌生产C4二羧酸的方法。

本发明的发明人经过深入研究发现，由给定的氨基酸序列构成且具有苹果酸酶活性的多肽的表达得到增强的丝状菌，其C4二羧酸的生产能力得到提高。

本发明提供C4二羧酸生产能力提高的突变丝状菌和使用该突变丝状菌生产C4二羧酸的方法。本发明的突变丝状菌可用于C4二羧酸的生物学生产。根据使用本发明的突变丝状菌生产C4二羧酸的方法，可以高效地生产C4二羧酸。根据以下说明书的描述，本发明的上述及其他特征和优点可以更加明确。

(1.定义)

本说明书中，通过Lipman-Pearson方法(Science,1985,227：1435-1441)计算氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。具体而言，使用遗传信息处理软件GENETYX Ver.12的同源性分析程序，通过将Unit size to compare(ktup)作为2进行解析并算出。

本说明书中，关于氨基酸序列或核苷酸序列的“至少90％同一性”，是指为90％以上，优选为95％以上，更优选为96％以上，进一步优选为97％以上，更进一步优选为98％以上，更加优选为99％以上的同一性。

本说明书中的“缺失、取代、添加或插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列”，是指1个以上30个以下、优选1以上10个以下、更优选1个以上5个以下、进一步优选1个以上3个以下的氨基酸缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列。此外，本说明书中的“缺失、取代、添加或插入了一个或多个核苷酸的核苷酸序列”，是指1个以上90个以下、优选1以上30个以下、更优选1个以上15个以下、进一步优选1个以上9个以下的核苷酸缺失、取代、添加或插入的核苷酸序列。本说明书中，氨基酸或核苷酸的“添加”包括向序列的一个末端和两个末端添加氨基酸或核苷酸。

本说明书中，关于基因的“上游”和“下游”，是指基因转录方向的上游和下游。例如：“位于启动子下游的基因”是指基因存在于DNA有义链的启动子的3’侧，基因的上游是指DNA有义链中该基因的5’侧的区域。

本说明书中，调控区域和基因之间的“可操作连接”是指基因和调控区域连接，使得基因可以在该调控区域的调控下表达。基因和调控区域的“可操作连接”的步骤是本领域技术人员公知的。

本说明书中，用于微生物的功能、性质和性状的术语“内源”用于表示该功能、性质或性状存在于该微生物的野生型中。相反，术语“外源”表示不是最初存在于微生物中，而是从外部导入的功能、性质和性状。例如，“外源”基因或多核苷酸是指从微生物的外部导入的基因或多核苷酸。外源基因或多核苷酸可以来自与其所导入的微生物同种的生物，也可以来自异源生物(即异源基因或多核苷酸)。

本说明书中，微生物的“C4二羧酸生产能力”表示该微生物的培养基中C4二羧酸的生成速度，更具体而言，表示该微生物培养开始后经过一定时间后，将由微生物产生的C4二羧酸的每单位体积培养基的质量除以培养时间而得到的值(g/L/h)。微生物的C4二羧酸的产生量可以作为从该微生物的培养物中除去细胞而得到的培养上清液中的C4二羧酸的量而算出。培养上清液中的C4二羧酸的量可以通过高效液相色谱(HPLC)等测定。在后述的参考例1中例示了更具体的测定步骤。

本说明书中，突变体中“C4二羧酸的产生能力提高”意味着与宿主或对照相比，该突变体产生C4二羧酸的能力得到提高。通过下式计算突变体中C4二羧酸生产能力的提高率。

提高率(％)

＝(突变体的C4二羧酸生产能力/宿主或对照的C4二羧酸生产能力)×100－100

这里，所谓突变体，是指经过改变使得给定性状相对于宿主细胞发生变化的细胞，所述宿主是指该突变体的宿主(亲本细胞或亲代生物体)。作为对照，可以列举施加了与该突变体相同改变的与宿主细胞不同物种的细胞或生物体，或者不施加该改变的宿主细胞或生物体(例如，用空质粒或调控序列转染的宿主细胞或生物体等)。优选突变体中C4二羧酸生产能力的提高率基于由所述突变体产生的C4二羧酸的生产速度最大化时各细胞或生物体的C4二羧酸产生能力来计算。本说明书中，“C4二羧酸产生能力提高X％以上的突变体”是指由上述公式计算出的C4二羧酸产生能力的提高率为X％以上，此外，突变体中“C4二羧酸产生能力提高X％以上”是指由上述公式计算出的突变体的C4二羧酸产生能力的提高率为X％以上。

作为通过本发明生产的C4二羧酸的例子，可以列举富马酸，苹果酸和琥珀酸，优选富马酸和苹果酸，更优选富马酸。

本说明书中，“苹果酸酶活性”是指使苹果酸脱羧生成丙酮酸和CO²的活性，优选如下所示与NAD⁺或NADP⁺的还原共轭而催化苹果酸的氧化脱羧，生成丙酮酸和CO₂以及NADH或NADPH的催化反应的活性。

苹果酸酶活性可通过已知方法测量(例如，W.Tang et al.,Mol.Biotechnol.,2010,45:121-128中记载的方法)。

本说明书中，“苹果酸酶(malic enzyme，ME)”是指具有上述苹果酸酶活性的酶，作为其例子，被分类为EC 1.1.1.38(仅能使用NAD⁺的NAD-ME)、EC 1.1.1.39(可以使用NAD⁺和NADP⁺两者的NAD(P)-ME)或EC 1.1.1.40(仅使用NADP⁺的NADP-ME)，可列举NAD-苹果酸酶和NADP-苹果酸酶。

(2.突变丝状菌及其生产方法)

(2.1.突变丝状菌)

在一个实施方式中，本发明提供一种突变丝状菌，其中，具有苹果酸酶活性的多肽的表达被增强。

在一个实施方式中，作为在本发明的突变丝状菌中被增强的具有苹果酸酶活性的多肽的例子，可以列举如下多肽：

(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽；

(b)由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽；以及

(c)由相对于序列号2所示的氨基酸序列缺失、取代、添加或插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽。

由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽，是源自根霉属菌的苹果酸酶。由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽登记为RO3G_04512，并由序列号1所示的核苷酸序列组成的基因所编码。

作为本发明的突变丝状菌中表达被增强的具有苹果酸酶活性的多肽，可以列举选自上述所列举的多肽(a)～(c)中的任一种或两种以上。

(2.2.突变丝状菌的生产)

本发明的突变丝状菌可以通过改变丝状菌，并增强具有苹果酸酶活性的多肽的表达来生产。从而，在进一步的实施方式中，本发明提供一种突变丝状菌的生产方法，其中，包括在宿主丝状菌中增强上述具有苹果酸酶活性的多肽的表达的步骤。

作为本发明的突变丝状菌的宿主丝状菌，包括属于细分为真菌类(Eumycota)和卵菌(Oomycota)的所有丝状的菌(根据Hawksworth et al.,In,Ainsworth and Bisby'sDictionary of The Fungi,8th edition,1995,CAB International,bUniversity,Press,Cambridge,UK定义)。

作为本发明的突变丝状菌的宿主丝状菌的优选的例子，可以列举枝顶孢(Acremonium)属、曲霉(Aspergillus)属、短梗霉(Aureobasidium)属、烟管霉(Bjerkandera)属、拟蜡菌(Ceriporiopsis)属、金孢子菌(Chrysosporium)属、鬼伞(Coprinus)属、云芝(Coriolus)属、隐球菌(Cryptococcus)属、线黑粉酵母(Filibasidium)属、镰刀菌(Fusarium)属、腐质霉(Humicola)属、梨孢菌(Magnaporthe)属、毛霉(Mucor)属、毁丝霉(Myceliophthora)属、新考玛脂霉(Neocallimastix)属、链孢霉(Neurospora)属、拟青霉(Paecilomyces)属、Parasitella属、青霉(Penicillium)属、显革菌(Phanerochaete)属、脉射菌(Phlebia)属、瘤胃壶菌(Piromyces)属、侧耳(Pleurotus)属、根霉(Rhizopus)属、裂褶菌(Schizophyllum)属、篮状菌(Talaromyces)属、嗜热子囊菌(Thermoascus)属、梭孢壳(Thielavia)属、弯颈霉(Tolypocladium)属、栓菌(Trametes)属以及木霉(Trichoderma)属。其中，从C4二羧酸的生产能力的观点出发，优选戴尔根霉(Rhizopusdelemar)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、华根霉(Rhizopus chinensis)、黑根霉(Rhizopus nigricans)、东京根霉(Rhizopus tonkinensis)、小麦曲根霉(Rhizopustritici)和米根霉(Rhizopus oryzae)，更优选戴尔根霉(Rhizopus delemar)和米根霉(Rhizopus oryzae)，更加优选戴尔根霉(Rhizopus delemar)。

在一个实施方式中，本发明的突变丝状菌的宿主丝状菌可以是根霉(Rhizopus)属菌的突变菌株，作为该突变菌株的例子，可以列举醇脱氢酶基因缺失(Δadh)菌株(日本专利特愿2016-000184，其全部内容通过引用并入本说明书)、丙酮酸脱羧酶基因缺失(Δpdc)菌株(PCT/JP 2017/003647，其全部内容通过引用并入本说明书)。

作为在宿主丝状菌中增强具有苹果酸酶活性的多肽表达的方法，可以列举从宿主细胞外部导入编码该多肽的基因，或通过改变宿主基因组中编码该多肽的基因的调控区域来提高宿主中该基因转录量的方法。

在一个优选的实施方式中，根据本发明的具有苹果酸酶活性的多肽的表达增强是通过将含有编码该多肽的基因的DNA片段或质粒导入宿主丝状菌中而进行的。通过表达该DNA片段或质粒中包含的编码具有苹果酸酶活性的多肽的基因，增加具有苹果酸酶活性的目标多肽的表达量。

在一个优选的实施方式中，表达增强的编码具有苹果酸酶活性的多肽的基因，可以列举以下：

(a')由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；

(b')由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列构成、并且编码具有苹果酸酶活性的多肽的多核苷酸；以及

(c')由相对于序列号1所示的核苷酸序列缺失、取代、添加或插入了一个或多个核苷酸的核苷酸序列构成、并且编码具有苹果酸酶活性的多肽的多核苷酸。

在根据本发明的突变丝状菌的生产方法中，可以使用上述列举的多核苷酸(a')～(c')中的任何一种或两种以上的组合。

上述列举的多核苷酸可以是单链或双链的形式，或者可以是DNA或RNA。该DNA可以是cDNA、化学合成的DNA等人工DNA。

该多核苷酸(a')～(c')可以通过基因工程或化学方法合成。例如，序列号1所示的多核苷酸可以通过从根霉属，如戴尔根霉(Rhizopus delemar)、米根霉(Rhizopus oryzae)中分离来制作。或者，可以基于序列号1所示的核苷酸序列进行化学合成。由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％同一性，或由相对于序列号1所示的核苷酸序列缺失、取代、添加或插入了一个或多个核苷酸的核苷酸序列构成的多核苷酸，例如，可以通过对于由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸进行UV照射或者定点诱变导入等公知的诱变方法导入突变来制作。

作为向核苷酸序列中导入核苷酸的缺失、取代、添加或插入等突变的方法，可以列举例如通过甲磺酸乙酯、N-甲基-N-亚硝基胍、亚硝酸等化学诱变剂；或者紫外线、X射线、伽马射线、离子束等物理诱变剂进行诱变、定点诱变导入；Dieffenbach等人在(Cold SpringHarbar Laboratory Press,New York,581-621,1995)中公开的方法等。作为定点诱变导入方法，可以列举利用重叠延伸剪接(Splicing overlap extension(SOE))PCR(Horton等人，Gene 77,61-68,1989)的方法、ODA法(Hashimoto-Gotoh等人，Gene,152,271-276,1995)，Kunkel法(Kunkel,T.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1985,82,488)。或者，也可以使用定点诱变系统的Mutan-SuperExpress Km试剂盒(Takara Bio公司)、Transformer^TM Site-Directed Mutagenesis试剂盒(Clonetech公司)、KOD-Plus-Mutagenesis Kit(东洋纺织)等市售的定点诱变试剂盒。

优选含有待导入宿主真菌的多核苷酸的载体是表达载体。更优选该载体是能够将本发明的多核苷酸导入宿主并在宿主中表达多核苷酸的表达载体。优选该载体包含该多核苷酸和与其可操作地连接的调控区域。该载体可以是质粒等能够在染色体外部自主增殖和复制的载体，或者可以是重组入染色体内的载体。

作为具体载体的例子，例如，可以列举pBluescript II SK(－)(Stratagene)、pUC18、pUC18/19、pUC118/119等pUC系载体(Takara bio)、pET系载体(Takara bio)、pGEX系载体(GE healthcare)、pCold系载体(Takara bio)、pHY300 PLK(Takara Bio)、pUB 110(Mckenzie,T.et al.,1986,Plasmid 15(2):93-103)、pBR322(Takara Bio)、pRS 403(Stratagene)、pMW 218/219(Nippon Gene)、pRI 909/910等pRI系载体(Takara Bio)、pPTR1/2(Takara Bio)、pBI系载体(Clontech)、IN3系载体(Implanta Innovations)、pDJB2(D.J.Ballance et al.,Gene,36,321-331,1985)、pAB4-1(van Hartingsveldt W et al.,Mol Gen Genet,206,71-75,1987)、pLeu4(M.I.G.Roncero et al.,Gene,84,335-343,1989)、pPyr 225(C.D.Skory et al.,Mol Genet Genomics,268,397-406,2002)、pFG1(Gruber,F.et al.,Curr Genet,18,447-451,1990)等。

作为含有待导入宿主丝状菌的多核苷酸的DNA片段的例子，可以列举PCR扩增的DNA片段和限制酶切割的DNA片段。优选该DNA片段可以是包含多核苷酸和与其可操作地连接的调控区域的表达盒。

该载体或DNA片段中含有的调控区域是用于在导入了该载体或DNA片段的宿主中表达所导入的多核苷酸的序列，例如，可以列举启动子和终止子等表达调控区域、复制的起点等。可以根据导入载体或DNA片段的宿主的类型适当选择该调控区域的类型。根据需要，载体或DNA片段可以进一步具有抗生素抗性基因、氨基酸合成相关基因等选择标记。

优选该质粒或DNA片段中包含的调控区域是与宿主基因组中固有的多核苷酸(a')～(c')的调控区域相比具有更高转录活性的调控区域(所谓的强调控区域)。作为根霉属的该强调控区的例子，可以列举ldhA启动子(美国专利第6268189号)、pgk1启动子(国际公开第2001/73083号)、pgk2启动子(国际公开第2001/72967号)、pdcA启动子和amyA启动子(Archives of Microbiology,2006,186：41-50)、tef和18S rRNA启动子(美国专利申请公开第2010/112651号)、adh1启动子(国际公开第2017/022583号)等(本段所引用的文献，其整体在本说明书中作为参考而被引用)，但不限于这些。作为强调控区域的其他例子，可以列举rRNA操纵子的调控区域、编码核糖体蛋白的基因的调控区域等，但不限于这些。

该质粒或DNA片段中包含的目的多核苷酸与调控区域可以导入宿主的细胞核中，也可导入宿主基因组中。或者，可以将质粒或DNA片段中所包含的目的多核苷酸直接导入宿主基因组中，与该基因组上的高表达启动子可操作地连接。作为将多核苷酸导入基因组的方法，可以列举同源重组法。

将质粒或DNA片段导入宿主丝状菌中能够使用一般的转化方法，例如电穿孔法、转化法、转染法、接合法、原生质体法、基因枪法、农杆菌法等。

作为将质粒或DNA片段导入宿主基因组的方法的例子，可以列举使用人工DNA切割酶(artificial DNA nucleases或programmable nuclease)的基因组编辑，但不限于此。作为基因组编辑技术，可以列举TALEN(transcription activator-like effectornuclease)、ZFN(zinc-finger nuclease)、或CRISPR(Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeat)-Cas9系统、CRISPR-Cpf1、Homing endonuclease、compactdesigner TALEN等。基于这些技术进行基因组编辑的试剂盒是商业上可得到的，可以从例如Life technologies公司、Cellectis公司、Transposagen Biopharmaceuticals公司等购买。

导入了目的载体或DNA片段的突变体可以使用选择标记进行选择。例如，当选择标记是抗生素抗性基因时，通过用含抗生素的培养基培养细胞，可以选择导入了目的载体或DNA片段的突变体。另外，例如当选择标记是氨基酸合成相关基因、碱基合成相关基因等营养缺陷相关基因时，将该基因导入营养缺陷型宿主中，然后使用营养缺陷型的有无作为指示剂，可以选择导入了载体或DNA片段的突变体。或者，可以通过PCR等检查突变体的DNA序列来确认目的载体或DNA片段的导入。

在另一个优选的实施方式中，通过改变宿主丝状菌基因组上编码该多肽的基因的调控区域，提高该基因的转录水平，增强本发明的具有苹果酸酶活性的多肽的表达。作为在本实施方案中提高转录量的目标基因，可以列举上述多核苷酸(a')～(c')中的任何一种或两种以上。

作为用于提高目的基因的转录量的基因组改变的步骤，可以列举例如将上述强调控区域置换或插入宿主基因组中的目的基因的调控区域，可操作地将该调控区域与目的基因连接。作为基因组区域的取代或插入方法，可以列举同源重组方法，此外，可以组合上述基因组编辑技术。

通过上述顺序得到的本发明的突变丝状菌与其宿主(亲本丝状菌)相比具有提高的苹果酸酶活性。优选本发明的突变丝状菌的苹果酸酶活性相对于宿主为1.1倍以上，更优选1.5倍以上，进一步优选2倍以上。

(2.3.C4二羧酸生产能力的提高)

本发明的突变丝状菌与其宿主相比，具有提高的C4二羧酸生产能力。优选本发明的突变丝状菌的C4二羧酸生产能力相对于宿主提高10％以上，更优选20％以上，进一步优选30％以上。

(3.C4二羧酸的生产)

本发明的突变丝状菌具有提高的C4二羧酸生产能力。因此，在另一个实施方式中，本发明提供一种C4二羧酸的生产方法，其包括培养上述本发明的突变丝状菌的步骤。作为通过本发明的生产方法生产的C4二羧酸，可以列举富马酸、苹果酸和琥珀酸，优选富马酸和苹果酸，更优选富马酸。

用于培养突变丝状菌的培养基和培养条件可根据突变丝状菌宿主的类型适当选择。一般而言，可以采用通常用于该突变丝状菌的宿主的培养基和培养条件。

例如，培养温度可以是10℃～50℃，优选25℃～45℃。培养时间没有特别限制，只要可以充分产生目标C4二羧酸即可，但可以是例如1～240小时，优选12～120小时，更优选24～72小时。优选在搅拌或通气条件下培养。

作为培养丝状菌的培养基，可以使用常用的培养基。优选该培养基是液体培养基，可以是合成培养基、天然培养基、和将天然成分添加到合成培养基中的半合成培养基中的任何一种。可以使用可商购的PDB培养基(马铃薯葡萄糖肉汤培养基；Becton Dickinson&Company制造)、PDA培养基(Becton Dickinson&Company制造)、LB培养基(Luria-Bertani培养基；日本制药株式会社(商标名“Daigo”)等制造)、NB培养基(营养肉汤(NutrientBroth)；Becton Dickinson&Company制造)、SB培养基(Sabouraud培养基；OXOID制造)、SD培养基(合成缺陷型肉汤(Synthetic Dropout Broth)；例如Clontech)等。该培养基通常含有碳源、氮源、无机盐等，但可以适当选择各组分的组成。

下文将详细描述用于丝状菌培养的优选的培养基组合物。下文中记载的培养基中各组分的浓度表示(制备培养基或培养开始时)的初始浓度。

作为该培养基中的碳源的例子，可以列举葡萄糖、麦芽糖、淀粉水解物、果糖、木糖、蔗糖等，其中优选葡萄糖和果糖。这些糖类可以单独使用，也可以两种以上组合使用。所述培养基的碳源的浓度优选为1％(w/v)以上，更优选为5％(w/v)以上，进一步优选为7.5％(w/v)以上，且优选为40％(w/v)以下，更优选为30％(w/v)以下。或者，该培养基中的碳源浓度优选为1～40％(w/v)，更优选为5～30％(w/v)，进一步优选为7.5～30％(w/v)。

作为该培养基中的氮源的例子，可以列举硫酸铵、尿素、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠等含氮化合物。该培养基中的氮源的浓度优选为0.001～0.5％(w/v)，更优选为0.001～0.2％(w/v)。

该培养基可含有硫酸盐、镁盐、锌盐等。作为硫酸盐的例子，可以列举硫酸镁、硫酸锌、硫酸钾、硫酸钠、硫酸铵等。作为镁盐的例子，可以列举硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等。作为锌盐的例子，可以列举硫酸锌、硝酸锌、氯化锌等。该培养基中的硫酸盐的浓度优选为0.001～0.5％(w/v)，更优选为0.001～0.2％(w/v)。该培养基中的镁盐的浓度优选为0.001～0.5％(w/v)，更优选0.01～0.1％(w/v)。该培养基中锌盐的浓度优选为0.001～0.05％(w/v)，更优选为0.005～0.05％(w/v)。

该培养基的pH(25℃)优选为3～7，更优选为3.5～6。培养基的pH可以通过使用氢氧化钙、氢氧化钠、碳酸钙、氨等碱或者硫酸、盐酸等酸来调节。

作为该培养基的优选的例子，可以列举含有7.5～30％的碳源、0.001～0.2％的硫酸铵、0.01～0.6％的磷酸二氢钾、0.01～0.1％的七水硫酸镁、0.005～0.05％七水硫酸锌、以及3.75～20％的碳酸钙(浓度均为％(w/v))的液体培养基等。

为了使用丝状菌更有效地生产C4二羧酸，可以通过如下所示的工序进行生产。即，制备丝状菌的孢子悬浮液(工序A)、将其在培养基中培养使孢子萌发以制备菌丝体(工序B1)、优选进一步增殖菌丝体(工序B2)、接着培养制备的菌丝体以生产C4二羧酸(工序C)，由此能够高效地制造C4二羧酸。但是本发明的突变丝状菌的培养工序不限于以下工序。

<工序A：孢子悬浮液的制备>

将突变丝状菌的孢子接种到例如无机琼脂培养基(组成例：2％葡萄糖、0.1％硫酸铵、0.06％磷酸二氢钾、0.025％七水硫酸镁、0.009％七水硫酸锌、1.5％琼脂、浓度均为％(w/v))、PDA培养基等的培养基中，并在10～40℃，优选27～30℃静置培养7～10天以形成孢子，然后悬浮在生理盐水等中，由此可以制备孢子悬浮液。孢子悬浮液可含有或不含有菌丝体。

<工序B1：菌丝体的制备>

将工序A中得到的孢子悬浮液接种到培养液中进行培养，使孢子萌发以获得菌丝体。接种到培养液中的丝状菌的孢子数为1×10²～1×10⁸个-孢子/mL-培养液，优选为1×10²～5×10⁴个-孢子/mL-的培养液，更优选为5×10²～1×10⁴个-孢子/mL-培养液，进一步优选为1×10³～1×10⁴个-孢子/mL-培养液。可以使用市售的培养基，如PDB培养基、LB培养基、NB培养基、SB培养基、SD培养基等作为培养液。该培养液中，从发芽率和细胞生长的观点考虑，可以适当添加葡萄糖和木糖等单糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖等寡糖和淀粉等多糖作为碳源；甘油、柠檬酸等生物成分；硫酸铵、尿素、氨基酸等作为氮源；钠、钾、镁、锌、铁和磷酸等各种盐类作为其他无机物质。单糖、寡糖、多糖和甘油的浓度优选为0.1～30％(w/v)，柠檬酸的浓度优选为0.01～10％(w/v)，硫酸铵、尿素和氨基酸的浓度优选为0.01～1％(w/v)，无机物质的浓度优选为0.0001～0.5％(w/v)。在该培养液中接种孢子悬浮液，优选以80～250rpm、更优选以100～170rpm进行搅拌的同时，在25～42.5℃的培养温度调控下优选培养24～120小时，更优选48～82小时。用于培养的培养液的量可以根据培养容器适当调节，例如，对于200mL容量的挡板烧瓶，可以是50～100mL左右，对于500mL容量的挡板烧瓶，可以是100～300mL左右。通过这种培养，接种的孢子萌发并生长成菌丝体。

<工序B2：菌丝体的增殖>

从提高C4二羧酸的生产能力的观点出发，优选进行将工序B1中得到的菌丝体进行进一步培养使其增殖的工序(工序B2)。工序B2中使用的培养液没有特别限制，可以是通常使用的任何含有葡萄糖的无机培养基，可以列举含有例如7.5～30％的葡萄糖、0.001～0.2％的硫酸铵、0.01～0.6％的磷酸二氢钾、0.01～0.1％的七水硫酸镁、0.005～0.05％的七水硫酸锌和3.75％～20％的碳酸钙(浓度均为％(w/v))的培养液。该培养液的量可以根据培养容器适当调整，例如，对于500mL容量的锥形瓶，可以为50～300mL，优选为100～200mL。将工序B1中培养得到的菌体以湿重计为1～6g-菌体/100mL-培养液，优选3～4g-菌体/100mL-培养液接种到该培养液中，优选以100～300rpm、更优选以170～230rpm进行搅拌的同时，在25～42.5℃的培养温度调控下培养12～120小时，优选24～72小时。

<工序C：C4二羧酸的生产>

对上述步骤(工序B1或B2)中得到的丝状菌菌丝体进行培养，由该菌产生C4二羧酸。该培养条件遵循上述通常的丝状菌的培养条件即可。对于200mL容量的锥形瓶，培养基的量可以设定为20～80mL左右，对于500mL容量的锥形瓶，培养基的量可以设定为约50～200mL左右，对于30L的罐式发酵罐，培养基的量可以设定为10～15L左右，根据培养容器适当调整即可。工序B1或B2中得到的菌体相对于培养基的接种量以湿重计优选为5g～90g-菌体/100mL-培养基，更优选为5g～50g-菌体/100mL-培养基。优选为，培养以100～300rpm、优选150～230rpm进行搅拌的同时，在25～45℃的温度下进行2～240小时，优选12～120小时。当使用罐式发酵罐时，优选在0.05～2vvm、更优选在0.1～1.5vvm下进行通气。

通过上述步骤培养本发明的突变丝状菌以生产C4二羧酸。培养后，从培养物中回收C4二羧酸。根据需要，可以进一步纯化回收的C4二羧酸。从培养物中回收或纯化C4二羧酸的方法没有特别限制，可以根据已知的回收或纯化方法进行。例如，通过倾斜法、过滤、离心分离等从培养物中除去细胞等，根据需要浓缩剩余的培养物，然后通过结晶法、离子交换法、溶剂萃取法等方法或者这些方法的组合，能够回收或纯化该培养物中的C4二羧酸。

从培养物中分离的本发明的突变丝状菌可以重新用于C4二羧酸的生产。例如，将上述培养基新添加到从培养物中分离的本发明的突变丝状菌中，在上述条件下再次培养以生产C4二羧酸，然后可以从培养基中回收生产的C4二羧酸。进一步地，这个过程可以重复进行。在本发明的制备方法中，突变丝状菌的培养和C4二羧酸的回收可以通过间歇式、半间歇式和连续式中的任何一种方法进行。

(4.实施方式的例子)

作为本发明的实施方式的例子，本说明书进一步公开了以下的物质、制造方法、应用、方法等。但本发明不限于这些实施方式。

[1]一种突变丝状菌，其中，选自以下的至少一种多肽的表达增强：

(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽；

[2]根据[1]所述的突变丝状菌，优选导入了含有选自以下的至少一种多核苷酸的DNA片段或载体：

(a')由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；

[3]根据[2]所述的突变丝状菌，优选所述DNA片段或载体还包含与所述多核苷酸可操作连接的调控区域。

[4]根据[2]或[3]所述的突变丝状菌，优选所述DNA片段或载体导入细胞核内或基因组中。

[5]根据[1]所述的突变丝状菌，优选基因组上编码所述多肽的基因的调控区域被改变以提高该基因的转录量，该基因选自以下基因中的至少1种：

(a')由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；

[6]根据[5]所述的突变丝状菌，优选将强调控区域替换或插入到所述调控区域。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的突变丝状菌，优选所述丝状菌为根霉属菌。

[8]根据[7]所述的突变丝状菌，其中，所述根霉属菌优选为戴尔根霉(Rhizopusdelemar)或米根霉(Rhizopus oryzae)，更优选为戴尔根霉(Rhizopus delemar)。

[9]根据[7]或[8]所述的突变丝状菌，优选所述根霉属菌为Δadh或Δpdc菌株。

[10]根据[1]～[9]中任一项所述的突变丝状菌，其C4二羧酸的生产能力优选提高10％以上，更优选提高20％以上，进一步优选提高30％以上。

[11]根据[10]所述的突变丝状菌，所述C4二羧酸优选为富马酸、苹果酸或琥珀酸，更优选为富马酸或苹果酸，进一步优选为富马酸。

[12]一种C4二羧酸的制造方法，其中，包括培养[1]～[11]中任一项所述的突变丝状菌的步骤。

[13]根据[12]所述的制造方法，其中，还包括从所述培养物中回收C4二羧酸的步骤。

[14]根据[12]或[13]所述的制造方法，其中，所述C4二羧酸优选为富马酸、苹果酸或琥珀酸，更优选为富马酸或苹果酸，进一步优选为富马酸。

[15]一种突变丝状菌的制造方法，其中，包括在宿主丝状菌中增强选自以下的至少一种多肽的表达的步骤：

(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽；

[16]一种提高丝状菌中C4二羧酸生产能力的方法，其中，包括在丝状菌中增强选自以下的至少一种多肽的表达的步骤：

(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽；

[17]根据[15]或[16]所述的方法，优选所述表达的增强包括导入含有选自以下的至少一种多核苷酸的DNA片段或载体的步骤：

(a')由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；

[18]根据[17]所述的方法，优选所述DNA片段或载体还包含与所述多核苷酸可操作连接的调控区域。

[19]根据[17]或[18]所述的方法，优选所述DNA片段或载体的导入包括将该DNA片段或载体导入细胞核内或基因组中的步骤。

[20]根据[15]或[16]所述的方法，优选包括改变基因组上的编码所述多肽的基因的调控区域以提高该基因的转录量的步骤，其中，该基因选自以下基因中的至少1种：

(a')由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；

[21]根据[20]所述的方法，优选所述调控区域的改变包括将强调控区域替换或插入到该调控区域的步骤。

[22]根据[15]～[21]中任一项的所述方法，优选所述丝状菌为根霉属菌。

[23]根据[22]所述的方法，其中，所述根霉属菌优选为戴尔根霉(Rhizopusdelemar)或米根霉(Rhizopus oryzae)，更优选为戴尔根霉(Rhizopus delemar)。

[24]根据[22]或[23]所述的方法，优选所述根霉属菌为Δadh或Δpdc菌株。

[25]根据[15]～[24]中任一项所述的方法，其中，前述多肽表达增强的丝状菌的C4二羧酸生产能力优选提高10％以上，更优选提高20％以上，进一步优选提高30％以上。

[26]根据[25]所述的方法，其中，所述C4二羧酸优选为富马酸、苹果酸或琥珀酸，更优选为富马酸或苹果酸，进一步优选为富马酸。

实施例

在下文中，基于实施例对本发明进行更详细地说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1突变丝状菌的制备

本实施例中使用的PCR引物如表1-1和表1-2所示。

[表1-1]

[表1-2]

(p)：5’末端磷酸化

(1)基因组提取

将戴尔根霉(Rhizopus delemar)JCM(Japan Collection of Microorganisms)/理研)5557株(之后表示为5557株)的孢子接种到PDA培养基中之后在30℃下培养5天。培养后，将菌体细胞与3mL金属锥(安井器械)一起置于3mL破碎管中，并立即在液氮中冷冻10分钟以上。此后，使用多珠冲击器(安井器械)以1700rpm将菌体破碎10秒。将400μL的TE缓冲液(pH8.0)(Nippon Gene)加入到破碎处理后的容器中并倒置混合，将250μL转移至1.5mL管中。使用“Gen-toru-kun(用于酵母)”(Takara bio)，根据实验手册从该菌体溶液进行基因组提取。向所得的50μL基因组溶液中加入1μL的RNaseA(Roche)，并在37℃下反应1小时。反应后，加入等量的苯酚/氯仿并通过轻敲混合，然后在4℃、14500rpm离心5分钟，将上清液转移到新的1.5mL管中。再次重复苯酚/氯仿处理，然后进行乙醇沉淀，得到了5557菌株的纯化基因组溶液。

(2)cDNA的制备

(i)总RNA提取

将菌体6g-湿重量的5557菌株接种于40ml液体培养基(0.1g/L硫酸铵、0.6g/L磷酸二氢钾、0.25g/L七水硫酸镁、0.09g/L七水硫酸锌、50g/L碳酸钙，100g/L葡萄糖)，并在35℃、170rpm下培养8小时。从培养液中过滤并回收菌体，并用100mL 0.85％生理盐水清洗两次。清洗后，通过抽吸过滤除过量水分后，称量0.3g，与3mL金属锥一起置于3mL破碎管中，立即放入液氮中冷冻。将得到的冷冻菌体用多珠冲击器(安井器械)以1700rpm破碎10秒。破碎后的菌体中加入500μL的RLT缓冲液，倒置混合后，取450μL用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)进行总RNA提取。将1μL的DNaseI(TaKaRa)和5μL的10×DNase I缓冲液(USBCorporation)加入到40μL所得的RNA溶液中，用无RNase水将混合物调至50μL后，使混合物在37℃反应30分钟以上，除去残留的DNA。再加入1μL的DNaseI，在37℃下反应30分钟，然后进行苯酚/氯仿提取，接着进行乙醇沉淀。将沉淀物溶于50μL的无菌水中，并使用Qubit(Life Technologies)测量RNA溶液的浓度和纯度。此外，适当稀释该RNA溶液，使用Agilent2100 Bioanalyzer(Agilent)和RNA 6000 Pico Kit(Agilent)测定所提取的RNA。确认作为RNA的降解程度的指标的“RNA完整性数值(RNA Integrity Number)(RIN值)”为6.0以上，将得到的RNA溶液作为总RNA。

(ii)cDNA合成

cDNA合成使用SuperScript III First-Strand Synthesis Super Mix for qRT-PCR(Invitrogen)进行。即，将1μg在(i)中得到的RNA溶液用DEPC水调至8μL，然后添加10μL的2×RT Reaxtion Mix和2μL的RT Enzyme Mix，轻轻混合并在25℃下反应10分钟，在50℃下反应30分钟，在85℃下反应5分钟。向反应后的溶液中加入1μL的RNaseH，在37℃下反应20分钟，将其作为cDNA溶液。

(3)含有苹果酸酶RdME1基因的质粒载体的制备(i)将trpC基因区域导入pUC18

使用上述(1)中得到的5557菌株的基因组DNA作为模板，使用引物oJK162(序列编号12)和oJK163(序列编号13)通过PCR合成含有trpC基因(序列编号3)的DNA片段。接着，用质粒pUC18作为模板，使用引物oJK 164(序列编号14)和oJK 165(序列编号15)通过PCR扩增DNA片段。使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech)连接这两个片段，构建了质粒pUC18-trpC。

(ii)ADH1启动子、终止子的克隆

使用上述(1)中得到的5557菌株基因组DNA作为模板，分别使用引物oJK202(序列编号16)和oJK204(序列编号17)，以及oJK205(序列编号18)和oJK216(序列编号19)对含有ADH1启动子序列(序列编号4)的DNA片段和含有终止子序列(序列编号5)的DNA片段通过PCR进行扩增。接着，将(i)中得到的质粒pUC18-trpC作为模板，使用引物oJK210(序列编号20)和oJK211(序列编号21)通过PCR扩增DNA片段。以与(i)中相同的步骤连接上述三个片段，构建了质粒pUC18-trpC-Padh-Tadh。在得到的质粒中，ADH1启动子和终止子依次排列在trpC基因区域的下游。另外，Not I限制酶识别序列排列在ADH1终止子的下游。

进而，通过从pUC18-trpC-Padh-Tadh中去除trpC基因区域而制备了质粒载体。即，使用上述构建的pUC18-trpC-Padh-Tadh作为模板，使用引物trpC-lost-F(序列编号22)和trpC-lost-R(序列编号23)通过PCR扩增DNA片段。用与(i)相同的方法连接该片段，构建了质粒pUC18-Padh-Tadh。

(iii)质粒载体的制备

使用引物NK-141(序列编号24)和NK-163(序列编号25)，通过PCR从(2)中制备得到cDNA文库中扩增编码苹果酸酶的基因(下文称为RdME1，序列编号1)。接下来，使用引物NK-011(序列编号26)和NK-012(序列编号27)，将(ii)中得到的质粒pUC18-trpC-Padh-Tadh作为模板，通过PCR扩增DNA片段。通过以与(i)中相同的步骤连接上述两个片段，构建了质粒pUC18-trpC-Padh-RdME1-Tadh。在得到的质粒中，RdME1基因被插入到ADH启动子和终止子之间。

(4)用于trpC敲入(knock-in)的质粒的制备

通过用pdc1基因座去除pdc1基因ORF，制备用于trpC基因区域敲入(knock-in)的质粒ptrpC-knock-in。即，将以pUC18作为模板并使用引物pUC18-Pae1-F3(序列编号28)以及pUC18-Hind3-R3(序列编号29)扩增的pUC18载体片段、以JCM5557菌株的基因组作为模板并使用引物PDC1-upstr-F(序列编号30)以及PDC1-uptr-R(序列编号31)扩增的pdc基因的启动子片段、以JCM5557菌株的基因组作为模板并使用引物trpCpro-R(序列编号32)以及trpCter-F(序列编号33)扩增得到的trpC基因区域片段、和以JCM5557菌株的基因组作为模板并使用引物PDC1-downstr-F(序列编号34)以及PDC1-downstr-R(序列编号35)扩增的pdc基因的终止子部位片段采用In-Fusion HD Cloning试剂盒(Clontech)连接，构建了ptrpC-knock-in质粒。

(5)用于RdME1基因导入的构建体的制备

(i)用于trpC敲入(knock-in)的质粒的连接

以在(4)中制备的质粒ptrpC-knock-in作为模板，使用引物oJK899(序列编号36)以及oJK900(序列编号37)通过PCR扩增DNA片段。接着，以在(3)(ⅲ)中得到的质粒pUC18-trpC-Padh-RdME1-Tadh作为模板，使用引物oJK901(序列编号38)和NK-195(序列编号39)，通过PCR扩增DNA片段。通过以与(i)中相同的步骤连接上述两个片段，构建了质粒pUC18-Ppdc-trpC-Padh-RdME1-Tpdc。获得的质粒含有用于trpC敲入(knock-in)的序列，并且序列编号1所示的RdME1基因插入在ADH启动子和PDC终止子之间。

(ii)单链DNA的调制

以(i)中制备的质粒pUC18-Ppdc-trpC-Padh-RdME1-Tpdc为模板，使用引物oJK902(序列编号40)以及oJK903(序列编号41，5’末端磷酸化)对DNA片段进行PCR扩增，并以质粒ptrpC-knock-in为模板，使用引物PDC1-upstr-F2(序列编号42)以及PDC1-downstr-R-P(序列编号43，5’末端磷酸化)对DNA片段进行PCR扩增，用Dpn1(TOYOBO)处理分解模板后，通过苯酚/氯仿/异戊醇处理和乙醇沉淀处理对产物进行了纯化。用λ核酸外切酶(LambdaExonuclease，NEW ENGAND BioLabs)进一步处理纯化的产物，然后以与上述相同的方式纯化，得到单链DNA。λ核酸外切酶处理在37℃下过夜进行。

(6)用于pdc1基因破坏的TALEN的制备

(i)TALEN表达载体的制备

向Transposagen Biopharmaceuticals公司定制，生产了Custom XTN TALEN(Transposagen Biopharmaceuticals提供的TALEN的商品名)。这是针对编码丙酮酸脱羧酶(PDC)的基因(pdc基因，序列编号6)的用于TALEN的试剂盒，包括两个多核苷酸LeftTALEN-pdc(序列编号7)和RightTALEN-pdc(序列编号8)，其与含有pdc基因的区域(序列编号9)结合。LeftTALEN-pdc编码的TALEN，其靶向pdc基因的有义链中的5'-TGCCTGCTATTAAAATCG-3'(序列编号10)的序列。RightTALEN-pdc编码的TALEN，其靶向反义链中的5'-TTGATTTCCTTAAGACGG-3'(序列编号11)的序列。

将编码上述LeftTALEN-pdc的多核苷酸插入上述(3)中制备的表达载体pUC18-Padh-Tadh中，在adh启动子和adh终止子的调控下，制备表达TALEN的载体。即，以pUC18-Padh-Tadh为模板，使用引物adhpro-R(序列编号44)以及adhter-F(序列编号45)通过PCR扩增载体片段。接着以LeftTALEN-pdc为模板，使用引物adhpro-TALEN-F(序列编号46)以及TALEN-adhter-R(序列编号47)通过PCR扩增LeftTALEN-pdc片段。在上述2个片段中存在15个碱基重叠的区域。将这两个片段通过In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech)连接，得到含有Left TALEN-pdc的载体padh-Left TALEN-pdc。

同样地，将编码上述RightTALEN-pdc的多核苷酸插入pUC18-Padh-Tadh中，在adh启动子和adh终止子的调控下，制备表达TALEN的载体padh-RightTALEN-pdc。使用引物adhpro-R(序列编号44)和adhter-F(序列编号45)扩增pUC18-Padh-Tadh片段。使用引物adhpro-TALEN-F(序列编号46)和TALEN-adhter-R(序列编号47)扩增RightTALEN-pdc片段。

(ii)核酸外切酶表达载体的制备

通过在细胞中表达核酸外切酶和TALEN，可以促进TALEN对靶DNA的破坏(Scientific Reports,2013,3：1253，DOI：10.1038/srep 01253,Nat Methods,2012,9：973-975)，因此制备了与TALEN表达载体一起导入的核酸外切酶表达载体。

核酸外切酶基因片段是使用米根霉(Rhizopus oryzae)NRBC 5384菌株的纯化基因组溶液作为模板，用引物adhpro-exo 1-F(序列编号48)和exo 1-adhter-R(序列编号49)和pUC 18-Padh-Tadh通过PCR扩增，此外，载体片段时使用pUC18-Padh-Tadh作为模板，用引物adhpro-R(序列编号44)和adhter-F(序列编号45)通过PCR扩增。将扩增的两个片段使用In-Fusion HD cloning kit(Clontech)连接，制备了质粒padh-exo1。

(7)基因导入宿主

(i)色氨酸营养缺陷型菌株的制备

用作基因导入的宿主细胞的色氨酸营养缺陷型菌株是通过用离子束照射5557菌株而导入突变的菌株中选择的。离子束照射在独立行政法人日本原子力研究开发机构-高崎量子应用研究所的离子照射设备(TIARA)进行。使用AVF回旋加速器加速¹²C⁵⁺，在220MeV的能量下照射100～1250戈瑞(Gray)。从照射过的菌体中回收孢子，从中获得显示色氨酸营养缺陷型的戴尔根霉(Rhizopus delemar)02T6菌株(以下标记为02T6株)。02T6菌株在总长为2298bp的trpC基因编码区(序列编号3)的第2093位缺少一个碱基。

(ii)DNA-金颗粒混合物溶液的制备

将上述(6)中制备的padh-LeftTALEN-pdc、padh-RightTALEN-pdc、padh-exo1以及上述(5)中制备的单链DNA混合后的DNA溶液(1μg/μL)10μL加入100μL金颗粒溶液(60mg/mL，INBIO GOLD公司，粒径1μm)中。此外，加入40μL 0.1M的亚精胺，并用涡旋仪充分搅拌。加入100μL 2.5M的CaCl₂并用涡旋仪搅拌1分钟，然后以6000rpm离心30秒以除去上清液。向得到的沉淀中加入200μL 70％EtOH，使用涡旋仪搅拌30秒后，以6000rpm离心30秒，除去上清。将得到的沉淀用100μL的100％EtOH重新悬浮。

(iii)基因导入

接着，使用(ii)中制备的DNA-金颗粒溶液通过GDS-80(Neppa Gene)向(i)中制备的02T6菌株的孢子导入基因。导入基因后的孢子在无机琼脂培养基(20g/L葡萄糖、1g/L硫酸铵、0.6g/L磷酸二氢钾、0.25g/L七水硫酸镁、0.09g/L七水硫酸锌、15g/L琼脂)上，30℃下静置培养1周左右。

(iv)转基因菌株的筛选

从培养的菌体中回收孢子，使用配制为pH3的无机琼脂培养基(20g/L葡萄糖、1g/L硫酸铵、0.6g/L磷酸二氢钾、0.25g/L七水硫酸镁、0.09g/L七水硫酸锌、15g/L琼脂)分离菌株。用牙签挑取一部分生长的菌株的菌丝，悬浮于10mM Tris-HCl(pH8.5)，95℃下孵育10分钟。之后在10mM Tris-HCl(pH8.5)进行适当稀释，制成菌落PCR用的基因组模板溶液。菌落PCR使用上述基因组模板溶液、引物NK-069(序列编号50)和NK-118(序列编号51)、以及KODFX Neo(TOYOBO)进行。进行上述引物进行菌落PCR时，如果在pdc1基因座中如果发生trpC基因片段的敲入，则会扩增DNA片段。将通过菌落PCR得到了DNA扩增片段的菌株作为pdc1基因缺陷株Δpdc菌株。将使用质粒pUC18-Ppdc-trpC-Padh-RdME1-Tpdc导入基因的菌株命名为Δpdc::ME1菌株，将使用质粒ptrpC-knock-in导入基因的菌株命名为Δpdc::trpC菌株。用接种耳刮下剩余的菌体，在孢子回收溶液(8.5g/L氯化钠、0.5g/L聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)中剧烈混合。将混合后的孢子悬浮液用3GP100圆柱形漏斗型玻璃过滤器(柴田化学)过滤，将其用作孢子液。使用TC20Automated Cell Counter(Bio-Rad)测量孢子液中的孢子数。

实施例2：突变菌株的苹果酸酶活性的测量

(1)菌株培养

(i)制备菌丝体

将最终浓度为0.5％(v/v)的脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Rheodol SP-L10(花王))的200mL的SD/-Trp培养基(Clontech)加入500mL容量的带挡板锥形瓶(旭硝子)中，将实施例1中制备的Δpdc::ME1菌株和Δpdc::trpC菌株的孢子液分别以1×10³个孢子/mL-培养基接种后，在27℃下以170rpm搅拌培养3天。将得到的培养物用预先灭菌的无菌筛网250μm不锈钢筛(AS ONE)过滤，并在过滤器上回收菌体。

(ii)菌丝体的增殖

将(i)中回收的5.0～8.0克湿菌种接种到100mL已加入于500mL容量的锥形瓶的无机培养液(0.1g/L硫酸铵、0.6g/L磷酸二氢钾、0.25g/L七水硫酸镁、0.09g/L七水硫酸锌、50g/L碳酸钙、100g/L葡萄糖)中，在27℃下以220rpm搅拌培养约40小时。将得到的培养物用预先灭菌的不锈钢滤网架(MILLIPORE)过滤，并在过滤器上回收菌体。此外，在过滤器支架上，用200mL生理盐水清洗菌体。通过抽滤除去用于清洗的生理盐水。

(2)菌体裂解液的制备

将上述(1)中得到的6.0g湿菌体接种到40mL已加入于200mL容量的锥形瓶的无机培养液(0.0175g/L硫酸铵、0.06g/L磷酸二氢钾、0.375g/L七水硫酸镁、0.135g/L七水硫酸锌、50g/L碳酸钙、100g/L葡萄糖)中，在35℃下以170rpm搅拌培养24小时。将得到的培养物用预先灭菌的不锈钢滤网架(MILLIPORE)过滤，并在过滤器上回收菌体。此外，在过滤器架上用200mL生理盐水清洗菌体，并将1.0g菌体在-80℃下冷冻。用多珠冲击器和金属锥(安井器械)破碎冷冻的菌体，向其中加入1mL 50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)并再次粉碎，以15000rpm在4℃下离心5分钟后，用Amicon Ultra-0.5(3kDa，Millipore)浓缩上清液并洗净。得到菌体裂解液。

(3)苹果酸酶活性的测量

将185μL反应溶液(终浓度50mM Tris-HCl pH 8.0、2.5mM MnCl₂、0.2mM NAD⁺、10mMNaCl、pH 7.0)加入到96孔测定板(Iwaki)中，向其中加入5μL上述(2)中得到的菌体裂解液，通过加入10μL 200mM的苹果酸开始反应。在30℃下基于340nm的吸光度变化的斜率(NADH＝6200M^-1cm^-1的消光系数)算出活性值(mU/菌体湿重g)。此时，活性单位(U)定义为1分钟消耗的苹果酸的量(μmol/min)。测量结果如表2所示。与参考菌株Δpdc::trpC菌株相比，Δpdc::ME1菌株中苹果酸酶活性提高约3倍。

[表2]

实施例3Δpdc::ME1菌株的C4二羧酸生产能力

(1)菌株的培养

在与实施例2(1)相同的条件下制备菌丝体并使其增殖。

(2)转化株的C4二羧酸生产能力评价

将上述(1)中得到的Δpdc::ME1菌株和Δpdc::trpC菌株的湿菌体6.0克接种到40mL已加入于200mL容量的锥形瓶的无机培养液(0.0175g/L硫酸铵、0.06g/L磷酸二氢钾、0.375g/L七水硫酸镁、0.135g/L七水硫酸锌、50g/L碳酸钙、100g/L葡萄糖)中，在35℃下以170rpm搅拌培养。培养8小时后，回收不含有菌体的培养上清液，通过后述的参考例1中记载的步骤进行了C4二羧酸(富马酸)的定量。基于所得的C4二羧酸的量，根据下式计算Δpdc::ME1菌株中C4二羧酸生产能力的提高率。

提高率(％)

＝(Δpdc::ME1菌株的生产能力/Δpdc::trpC菌株的生产能力)×100－100

结果如表3所示。与未引入RdME1基因的Δpdc::trpC菌株相比，在Δpdc::ME1菌株中，观察到富马酸生产能力提高了40％。

[表3]

菌株名	生产速度(g/L/h)	生产能力提高率(％)
			⊿pdc::trpC株	1.5	－
⊿pdc::ME1株	2.1	40

参考例1 C4二羧酸的定量

培养上清液中C4二羧酸的定量通过HPLC进行。将用于HPLC分析的培养上清液预先用37mM硫酸适当稀释后，用DISMIC-13cp(0.20μm醋酸纤维素膜，ADVANTEC)或Acroprep 96孔过滤板(0.2μm GHP膜，Nippon Pole)除去不溶物。

HPLC装置使用LaChrom Elite(Hitachi High-Technologies)。分析柱使用与ICSep ICE-ION-300 Guard Column Cartridge(4.0mm I.D.×2.0cm,TRANSGENOMIC)接续的有机酸分析用聚合物柱ICSep ICE-ION-300(7.8mm I.D.×30cm，TRANSGENOMIC)，在洗脱液为10mM硫酸，流速为0.5mL/分钟，柱温度为50℃的条件下进行洗脱。使用UV检测器(检测波长210nm)检测C4二羧酸。使用标准样品[富马酸(销售代码063-00655，和光纯药工业)]制备浓度标准曲线，并基于浓度标准曲线对培养基上清液中C4二羧酸进行定量。

将由所定量的培养基中的C4二羧酸的量减去培养基中的初始C4二羧酸的量而得到的值作为C4二羧酸的生成量。将培养开始后8小时的时刻中每种培养基的C4二羧酸量除以培养时间得到的值作为该细胞的C4二羧酸的生成率。

序列表

<110> 花王株式会社

<120> 突变丝状菌和使用其制造C4二羧酸的方法

<130> KS1511

<150> JP 2016-180627

<151> 2016-09-15

<160> 51

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1836

<212> DNA

<213> 戴尔根霉

<400> 1

atgttatatt caaaagcatt tcaatcttct ttaaagaatg caattaaaca aggtggtcgc 60

cgtcattatg gcttgccatc ctctgctatt catttaggca cagatccaag aaaagacaag 120

acagttcaat tgactcctct aagaggtgtt aatattattc atgatcctct tctttcaaaa 180

ggtactgcat ttagtctttc agaaagagaa agattgtcta ttcgtggttt agtaccacct 240

cgttgtcaag aaatggacaa acaattactt cgtatcaaaa gaaacttgga tgcattagat 300

acacccatag ccaaatttgt ctttttaact gcacttcaag atagaaatga gactttattc 360

tacaagttat taattacata tcttgaagaa ttagcaagta tcatttatac acctactgtg 420

ggccaagctt gtttattgtc tcactctatc tatcgtcgtt ctcgtggcat gtacttttct 480

tcacaggaca gaggtgccat gtcagctatg gttcataact ggcctcatga tgaagtagac 540

gtcattgttg tcactgatgg ctctcgtgtc ttgggcttgg gtgatttagg tgccaatggt 600

atgcaaattc cgatcggtaa actcagcttg tacgtcgccg cgggtggtat ccgaccacgt 660

tccgtcttgc ctgtcgtttt agacgttggc acaaacaatg aatctttgtt acatgatcct 720

ctttatctcg gtatgggtca tcctagattg gatggtgaag aatattattc atttgtagat 780

gagtgggtaa ctgctgttca aagcagatgg ccaaatgcgc ttattcaatt cgaagatttc 840

aaatatcctc acgcatataa tttattaaac aaataccaaa acaaggtgac ctgtttcaat 900

gatgacattc agtctacttc tgccatcact ttagctggtc ttcttgcatc cttaaaagct 960

cgtggtcgtc ctcaagaatg tctttcagag gaacgcatca tctgtgtcgg tgctggttca 1020

gccggtgtcg gtgtctgtga aggtatcatt gatgccatgg tctctcaggg taaggtagcc 1080

tctcgtgaag aagcctattc ccgtatttgg atgttggatc agtgcggtct cctcggtaac 1140

ccttccttaa ccgatgatgc tacagtcaat ggcgaaagaa caactgaact agatgaacgt 1200

caacgctgtt acgtcaaatc cgacttgccg gatcgtctca ccttggaggc cttgattgag 1260

cgtgtcaagc caaccgctat ccttggcttg accggtgttc ctggtgtctt taccgaacaa 1320

gccatccgta ctatggccaa ataccaagaa aaacccgtcg tattccctct ttctaaccct 1380

gatacgcgtg ctgaatgtac cgctgaagaa gcattcaaat ggacagaagg acgtgctatt 1440

tttgcttctg gcagtccctt tgctgatgtt caacttccca atggaaagat cggtagaacc 1500

aaccaatgta ataactctta cagtttccct ggtcttggtc ttggtatcac tgtctctaga 1560

gctacacgcg tgacacccaa catgtttttg gaaaccgcca agactattgc caacatggca 1620

agtccctctc aactcaagga gggcatctta ttcccaggtg tcactcacct tcgtgatgtt 1680

gccaaggccg ttggtactcg tgtttgtgaa gtagcttatg atgaaaatgt agctactgcc 1740

gttttgaaag aaggtgaatt gttgagtgaa gtcgtacaaa gctcgatgtt tgaacctgaa 1800

tatgttcctt tggtccatgt tcccaacatg cattag 1836

<210> 2

<211> 611

<212> PRT

<213> 戴尔根霉

<400> 2

Met Leu Tyr Ser Lys Ala Phe Gln Ser Ser Leu Lys Asn Ala Ile Lys

1 5 10 15

Gln Gly Gly Arg Arg His Tyr Gly Leu Pro Ser Ser Ala Ile His Leu

20 25 30

Gly Thr Asp Pro Arg Lys Asp Lys Thr Val Gln Leu Thr Pro Leu Arg

35 40 45

Gly Val Asn Ile Ile His Asp Pro Leu Leu Ser Lys Gly Thr Ala Phe

50 55 60

Ser Leu Ser Glu Arg Glu Arg Leu Ser Ile Arg Gly Leu Val Pro Pro

65 70 75 80

Arg Cys Gln Glu Met Asp Lys Gln Leu Leu Arg Ile Lys Arg Asn Leu

85 90 95

Asp Ala Leu Asp Thr Pro Ile Ala Lys Phe Val Phe Leu Thr Ala Leu

100 105 110

Gln Asp Arg Asn Glu Thr Leu Phe Tyr Lys Leu Leu Ile Thr Tyr Leu

115 120 125

Glu Glu Leu Ala Ser Ile Ile Tyr Thr Pro Thr Val Gly Gln Ala Cys

130 135 140

Leu Leu Ser His Ser Ile Tyr Arg Arg Ser Arg Gly Met Tyr Phe Ser

145 150 155 160

Ser Gln Asp Arg Gly Ala Met Ser Ala Met Val His Asn Trp Pro His

165 170 175

Asp Glu Val Asp Val Ile Val Val Thr Asp Gly Ser Arg Val Leu Gly

180 185 190

Leu Gly Asp Leu Gly Ala Asn Gly Met Gln Ile Pro Ile Gly Lys Leu

195 200 205

Ser Leu Tyr Val Ala Ala Gly Gly Ile Arg Pro Arg Ser Val Leu Pro

210 215 220

Val Val Leu Asp Val Gly Thr Asn Asn Glu Ser Leu Leu His Asp Pro

225 230 235 240

Leu Tyr Leu Gly Met Gly His Pro Arg Leu Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr

245 250 255

Ser Phe Val Asp Glu Trp Val Thr Ala Val Gln Ser Arg Trp Pro Asn

260 265 270

Ala Leu Ile Gln Phe Glu Asp Phe Lys Tyr Pro His Ala Tyr Asn Leu

275 280 285

Leu Asn Lys Tyr Gln Asn Lys Val Thr Cys Phe Asn Asp Asp Ile Gln

290 295 300

Ser Thr Ser Ala Ile Thr Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser Leu Lys Ala

305 310 315 320

Arg Gly Arg Pro Gln Glu Cys Leu Ser Glu Glu Arg Ile Ile Cys Val

325 330 335

Gly Ala Gly Ser Ala Gly Val Gly Val Cys Glu Gly Ile Ile Asp Ala

340 345 350

Met Val Ser Gln Gly Lys Val Ala Ser Arg Glu Glu Ala Tyr Ser Arg

355 360 365

Ile Trp Met Leu Asp Gln Cys Gly Leu Leu Gly Asn Pro Ser Leu Thr

370 375 380

Asp Asp Ala Thr Val Asn Gly Glu Arg Thr Thr Glu Leu Asp Glu Arg

385 390 395 400

Gln Arg Cys Tyr Val Lys Ser Asp Leu Pro Asp Arg Leu Thr Leu Glu

405 410 415

Ala Leu Ile Glu Arg Val Lys Pro Thr Ala Ile Leu Gly Leu Thr Gly

420 425 430

Val Pro Gly Val Phe Thr Glu Gln Ala Ile Arg Thr Met Ala Lys Tyr

435 440 445

Gln Glu Lys Pro Val Val Phe Pro Leu Ser Asn Pro Asp Thr Arg Ala

450 455 460

Glu Cys Thr Ala Glu Glu Ala Phe Lys Trp Thr Glu Gly Arg Ala Ile

465 470 475 480

Phe Ala Ser Gly Ser Pro Phe Ala Asp Val Gln Leu Pro Asn Gly Lys

485 490 495

Ile Gly Arg Thr Asn Gln Cys Asn Asn Ser Tyr Ser Phe Pro Gly Leu

500 505 510

Gly Leu Gly Ile Thr Val Ser Arg Ala Thr Arg Val Thr Pro Asn Met

515 520 525

Phe Leu Glu Thr Ala Lys Thr Ile Ala Asn Met Ala Ser Pro Ser Gln

530 535 540

Leu Lys Glu Gly Ile Leu Phe Pro Gly Val Thr His Leu Arg Asp Val

545 550 555 560

Ala Lys Ala Val Gly Thr Arg Val Cys Glu Val Ala Tyr Asp Glu Asn

565 570 575

Val Ala Thr Ala Val Leu Lys Glu Gly Glu Leu Leu Ser Glu Val Val

580 585 590

Gln Ser Ser Met Phe Glu Pro Glu Tyr Val Pro Leu Val His Val Pro

595 600 605

Asn Met His

610

<210> 3

<211> 2298

<212> DNA

<213> 戴尔根霉

<220>

<223> trpC

<400> 3

atgaccactt tacttattga caactacgac agttttactt ataatgtcta tcaatacttg 60

agctgccaag gcgccaatgt agttgtctac agaaacgaca aaatcaccat ttccgaaatt 120

gagcaattgg ctcctcgcaa tattgtcatc tcacctggcc ctggccaccc ttccaccgat 180

gccggtgtct ctcgagaggc cattcgagct tttgcaggaa agattcccat cttgggtatt 240

tgtatgggtc agcaatgtat gtatgaagtg tacggtggta aagtgtcata tgcaggtgat 300

attgtgcatg gcaaggcatc cagcatcaag catgacagtc gaggtatctt caagggcgtt 360

cctcaaaaca acatggtcac tcgttaccat tcccttgctg gcatgccttc tactttacct 420

gaaacattag aagtcactgc gactaccgac gatggtatca tcatgggcat tcgacacaag 480

gaatacactg tcgaaggtgt tcagttccat cctgaaagta tcctttgtga acacggacat 540

acgatgatca acaacttctt aagcttgcgt ggtggcacct gggaagagaa tcctgcagcc 600

ggtgttgtct ttaagaaagc tcgttccgaa acacccaaaa tcagtgctag tgaatcccaa 660

ctcgatctct ctcagcaaca acctgccgca gcaccttcca tcttgacccg catttactct 720

caacgactca aggatgttca ggcagccaag gagattcccg gccagacatt tgaagattta 780

gaaaaacttt taaagttgca cgtcgcccca cctcttcaag acgtcgtcgc tcgcgtgcgt 840

caaagcaagc ccgccttgat ggccgaagtc aagcgtgcct ctccctcgaa aggaaacatt 900

gatgtttcgg ccaacgcggc tgagcaggca cttcaatatg ctttagcagg tgcaagcgtc 960

gtctctgttc tgactgaacc caaatggttc cgcggtacga ttcatgatat gcatcaggtc 1020

cgagaggcct tgagccatct gcccaaccgt ccttgtgtgt tgagaaagga ttttattgtc 1080

gatcgctatc aaatcttgga aggttgtctg tacggtgctg atactatctt gttgatcgtg 1140

gccatgctga atgatgaaca actgcacgaa ttgtatcact atgcgaaatc attaggtatg 1200

gaacccttgg tcgaagtcaa taatacggaa gagatggccc gtgccaatgc tttgggcgca 1260

cgtctggtgg gtgttaataa tcgcaacttg cacagctttg atgttgatat ggaaaccacg 1320

agtcgattgg tagagatggt gcctgaagga acgatcttgt gtgcactttc tggtattact 1380

ggacgagctg atgttgaaat gtacgtcaaa cagggtgtgc acgctgtctt ggtgggtgaa 1440

gccctgatgc gtgcttggaa tttgaaggag tttgtgtctg atttgttggg tcatgaaaag 1500

aaggatcctg tgcctgtgtc caaggaatca aaatcttcac tagtcaaggt atgtggtatc 1560

tctagtgtgg atgcagcagt tgaagcagcc aagtcagggg ctgacttgat tggtcttatc 1620

tttgctgaaa agtccaaacg aaaagtgtct ttggaaagag ctcaagaaat cgtgtcctca 1680

gtgcgtgcgt tggatattca agtcaaacga acgttatcaa atgatgattc tcaactggat 1740

tggttccaga tgcacaagcg tctcttggaa aagcgagcaa gaaaaccttt ggtagttggc 1800

gtgtttgtga atcaatcgat tgaatacatg actgaggtgg caacgacagt cggactggac 1860

cttattcagc tgcatggaac cgaatcaacg gagcttgcac gctatttacc cgtgcctgtc 1920

atcaaagctt tccatatcga cagtggtgag ttcaatgaag ctcagatacc aaacctaaat 1980

caaccaggct cttatcatta tgtcttactg gacgctaaag tgcccagctt accatcggat 2040

caacaaggtg gacgtggtgt caagtttgat tggtcaattg ctaccaaaat cgtgaaacat 2100

aggcactttg agtttttggg taatcaagat ttccctgtca tcttggctgg tgggttggat 2160

cctaccaatg tggcatctgc cattcaacag gtgaaaccct ggattgtgga tgtgtcgagt 2220

ggtgttgaaa cagatggagt gaaggattta gaaaagattc gtgcctttgt taaaactgtc 2280

cagtcaacac aattttaa 2298

<210> 4

<211> 1000

<212> DNA

<213> 戴尔根霉

<220>

<223> ADH promoter

<400> 4

tagagggaaa aagagagaat tgaaatagga gaggatgagt caaaatatag tttacataaa 60

atttctcttt tttgtgttaa atataatcta atagcagggg ttttcttagt ttacgtttat 120

atcaaagtta tcaagcatac acttttttat gatttttcat actttaatcc cttttagtat 180

tctattgttt gaaaggagag aaaaaacagc tgagggtacg gtgcacacga gatcttacga 240

taattttcct gcccaacagg aaagaagtaa ttgatcttga ttgacgctcg gagtttgcac 300

gttcggagtt tgcacttcac attgagttat actcttactt attttgaagg aagggacgag 360

aaaagatgta aatataataa taacagtagt aaatagtatg cgcatcaaga acagctacca 420

acaaaagaga gaaatatgag cttaataatg aacaatgtaa atggcagaat gaaatttaat 480

tatcaaagcg gcatctttca gaccttccgt tacttccgat agagtttttt atgcaaagta 540

ataacaactg tatatataaa aaaaagaagg ttatcaagca aaagccacaa tgtcatatct 600

ggaataatca agagtaacta ttgaatgttg gtagccaaaa gaggcacgta attttatgac 660

gaaatatcac acaaaaagat tattttgaca attcatgaat aggacagaga tacaccctaa 720

acatgaaatg taagctatat ttaaacacct caagttaatt ttgaagcttc atttgtatta 780

ttgtaaccat ttagacaagc taaatccttt ttattattgt ccttattgat tttatccaga 840

ttaccgtatc taaagagcga tcaacagaaa aacggctgat tttagaccaa agtttcacaa 900

actacatttg catgaacgtc atatatatat aaaccttgac ttttcttttt tttttttttt 960

tttttttttc attatcaatt aatacaatta aataacaaaa 1000

<210> 5

<211> 634

<212> DNA

<213> 戴尔根霉

<220>

<223> ADH terminator

<400> 5

tcattttaat tacgcatttt catttactaa tttgttacat tttgataacg tcaataaatc 60

ttctaatttc ttttgttctc aaacagttta cagttctatc ttttttttta ccacaatcaa 120

ttctcaatat acaacatagc aaatgtgctt cagtaaattc attaaattct tttaaaaaaa 180

ggtaatttgt agcataaaat tcgactttat tgacgttttt tttatgatca tatacaaata 240

aaatagttgc gaatgagaac taaatttttc attgttttta gtcatatcat ctggctgttg 300

cacgatgatc gcagcatatt tttcttcaca acactcatcc tataagcacc tttcaggact 360

ttcgtctgca ctttccatat ttgatttcat caattgattt gaatttttat ccagtacaat 420

ggtttgaatc tatacaataa attagtcaca gtataaaatt atgtctcatc ttgaacacac 480

acctgcttaa caaagaaatg aagcactcta tcaatagtaa atacaatata tgcatcgatg 540

ccaaatatat atcgtacatt ctcttcaaac gtagcttgat ctaaatcgcc atcaataaac 600

ctttcaatca tcctcactag tgcattataa tggc 634

<210> 6

<211> 1735

<212> DNA

<213> 戴尔根霉

<220>

<223> pdc

<400> 6

atgcctgcta ttaaaatcgg tcaacatctc cttaaccgtc ttaaggaaat caacattgat 60

gttgtctttg gtgttcctgg tgatttcaac atggtaagca gacaattgaa ttgaacgaga 120

gcctataaac ttattatttc tatagccctt gttggatatc attgaagatg acccagaact 180

tacctggggt aacaatgcca acgaattgaa tgcatcttat gcagctgatg gttatgctcg 240

tattcgtggt gcaggtgctg ttgtcactac ctttggtgta ggtgagctgt ctgctgtcaa 300

cggtattgct ggttcatact ctgagatgct tcccgtgatt cacatcgtcg gtactccttc 360

tactaaatcc caagctgccg gtgccatgct tcaccactct ttgggtgacg gtaactttga 420

tgtgttcttc aacatgtcct ccatgattgc ctgtgcctct gctcacctca agaaacaaac 480

ggccattgca gaaattgacc gtgtgatctc ccaagctgtt ctctccaagc gtacaggtta 540

cattggtatc cctatcgatc tgatcaagac tgaggttgaa gtacctgagc ccattcctgc 600

cctcaagacc gaattaccca aaaacccagc tgatgtccaa gcgattgcct tgagagtggt 660

cacggatgcg atcgccaaag cccaattccc tgtgattgtt gtcgatggct gtgtgcttcg 720

ccagagatgc caaaaggcag tacaagcctt tatcgaacgt actggtttcc ctacttatgt 780

tgctcctatg ggtaagggtg ccgttgacga atcctctgtg agttaccgtg gctgctactc 840

gggtaatgtc acattggaag cagtgaatga agagatcaag caagccgatt tgatcatcga 900

agtgggctcc atcaagtctg atttcaacac gggtaacttt tcatactctc tcgaccgttc 960

caagacgatc accttgcact cctttgccac catcgtgttt tgtgctgaat accaaaaggt 1020

ctccatgctc gaattcattc ctctcttgac ccaagccctt cccgaacaac cccgtcaatt 1080

caacctgggt ccccgcccaa gacccgtacc tatccaaccc ggtaccgaaa tcacccacaa 1140

ctacttttgg cacaaggtac ccgaattcat ggatgagaac gccattgtct gtgccgagac 1200

cggtacagct gaatttgctt cactcaacat ggacggaccc aagggaacga cttatatcac 1260

ccaattcctc tggggctcta tcggtttctc agtaggtgcc gctgtgggtg ctgcgatcgc 1320

cgctcgtgat cgtcgtgtgt atctctttgt cggtgatggt tccttccaat tgacctgtca 1380

agaaatctct ggcttccttc gccatggttt gacacctgtg atcttcttgc tgaacaatga 1440

cggttacttg atcgaaaaac tcattcacgg tcccgaacgt gcctataata actttcaaat 1500

gtgggaatac agcaagacgc ttgattattt cggtgctcat cttgaacaca acaagtccat 1560

gggtgttcct cccgttggct tcgaaggcaa ggtagccaca cgcgatgaat ttgaatccgc 1620

catgagacag gttcaagcca atcctgacaa gattcatttc cttgaagtca ttatgcctca 1680

atttgactct cctcgtgaac ttgaactctt ggttgccaac tctgaaaacc gttaa 1735

<210> 7

<211> 3006

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LeftTALEN-pdc

<400> 7

atggactaca aagaccatga cggtgattat aaagatcatg acatcgatta caaggatgac 60

gatgacaaga tggcccccaa gaagaagagg aaggtgggca ttcaccgcgg ggtacctatg 120

gtggacttga ggacactcgg ttattcgcaa cagcaacagg agaaaatcaa gcctaaggtc 180

aggagcaccg tcgcgcaaca ccacgaggcg cttgtggggc atggcttcac tcatgcgcat 240

attgtcgcgc tttcacagca ccctgcggcg cttgggacgg tggctgtcaa ataccaagat 300

atgattgcgg ccctgcccga agccacgcac gaggcaattg taggggtcgg taaacagtgg 360

tcgggagcgc gagcacttga ggcgctgctg actgtggcgg gtgagcttag ggggcctccg 420

ctccagctcg acaccgggca gctgctgaag atcgcgaaga gagggggagt aacagcggta 480

gaggcagtgc acgcctggcg caatgcgctc accggggccc ccttgaactt gaccccagac 540

caggtagtcg caatcgcgaa caataatggg ggaaagcaag ccctggaaac cgtgcaaagg 600

ttgttgccgg tcctttgtca agaccacggc ctgactcccg atcaagttgt agcgattgcg 660

tcgcatgacg gagggaaaca agcattggag actgtccaac ggctccttcc cgtgttgtgt 720

caagcccacg gtttgacgcc tgcacaagtg gtcgccatcg ccagccatga tggcggtaag 780

caggcgctgg aaacagtaca gcgcctgctg cctgtactgt gccaggatca tggactgacc 840

ccagaccagg tagtcgcaat cgcgtcaaac ggagggggaa agcaagccct ggaaaccgtg 900

caaaggttgt tgccggtcct ttgtcaagac cacggcctga ccccagacca ggtagtcgca 960

atcgcgaaca ataatggggg aaagcaagcc ctggaaaccg tgcaaaggtt gttgccggtc 1020

ctttgtcaag accatggcct gactcccgat caagttgtag cgattgcgtc gcatgacgga 1080

gggaaacaag cattggagac tgtccaacgg ctccttcccg tgttgtgtca agcccacggt 1140

ttgacgcctg cacaagtggt cgccatcgcc agcaatggcg gcggtaagca ggcgctggaa 1200

acagtacagc gcctgctgcc tgtactgtgc caggatcatg gactgacccc agaccaggta 1260

gtcgcaatcg cgtcgaacat tgggggaaag caagccctgg aaaccgtgca aaggttgttg 1320

ccggtccttt gtcaagacca cggcctgacc ccagaccagg tagtcgcaat cgcgtcaaac 1380

ggagggggaa agcaagccct ggaaaccgtg caaaggttgt tgccggtcct ttgtcaagac 1440

cacggcctga ctcccgatca agttgtagcg attgcgtcca acggtggagg gaaacaagca 1500

ttggagactg tccaacggct ccttcccgtg ttgtgtcaag cccatggatt gaccccagac 1560

caggtagtcg caatcgcgtc aaacattggg ggaaagcaag ccctggaaac cgtgcaaagg 1620

ttgttgccgg tcctttgtca agaccacggc ctgactcccg atcaagttgt agcgattgcg 1680

tcgaacattg gagggaaaca agcattggag actgtccaac ggctccttcc cgtgttgtgt 1740

caagcccacg gtttgacgcc tgcacaagtg gtcgccatcg ccagcaatat tggcggtaag 1800

caggcgctgg aaacagtaca gcgcctgctg cctgtactgt gccaggatca tggactgacc 1860

ccagaccagg tagtcgcaat cgcgtcaaac attgggggaa agcaagccct ggaaaccgtg 1920

caaaggttgt tgccggtcct ttgtcaagac cacggcctga ccccagacca ggtagtcgca 1980

atcgcgtcaa acggaggggg aaagcaagcc ctggaaaccg tgcaaaggtt gttgccggtc 2040

ctttgtcaag accacggcct gactcccgat caagttgtag cgattgcgtc gcatgacgga 2100

gggaaacaag cattggagac tgtccaacgg ctccttcccg tgttgtgtca agcccacggt 2160

ctgacacccg aacaggtggt cgccattgct aataataacg gaggacggcc agccttggag 2220

tccatcgtag cccaattgtc caggcccgat cccgcgttgg ctgcgttaac gaatgaccat 2280

ctggtggcgt tggcatgtct tggtggacga cccgcgctcg atgcagtcaa aaagggtctg 2340

cctcatgctc ccgcattgat caaaagaacc aaccggcgga ttcccgagag aacttcccat 2400

cgagtcgcgg gatcccaact agtcaaaagt gaactggagg agaagaaatc tgaacttcgt 2460

cataaattga aatatgtgcc tcatgaatat attgaattaa ttgaaattgc cagaaattcc 2520

actcaggata gaattcttga aatgaaggta atggaatttt ttatgaaagt ttatggatat 2580

agaggtaaac atttgggtgg atcaaggaaa ccggacggag caatttatac tgtcggatct 2640

cctattgatt acggtgtgat cgtggatact aaagcttata gcggaggtta taatctgcca 2700

attggccaag cagatgaaat gcaacgatat gtcgaagaaa atcaaacacg aaacaaacat 2760

atcaacccta atgaatggtg gaaagtctat ccatcttctg taacggaatt taagttttta 2820

tttgtgagtg gtcactttaa aggaaactac aaagctcagc ttacacgatt aaatcatatc 2880

actaattgta atggagctgt tcttagtgta gaagagcttt taattggtgg agaaatgatt 2940

aaagccggca cattaacctt agaggaagtc agacggaaat ttaataacgg cgagataaac 3000

ttttaa 3006

<210> 8

<211> 3006

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RightTALEN-pdc

<400> 8

atggactaca aagaccatga cggtgattat aaagatcatg acatcgatta caaggatgac 60

gatgacaaga tggcccccaa gaagaagagg aaggtgggca ttcaccgcgg ggtacctatg 120

gtggacttga ggacactcgg ttattcgcaa cagcaacagg agaaaatcaa gcctaaggtc 180

aggagcaccg tcgcgcaaca ccacgaggcg cttgtggggc atggcttcac tcatgcgcat 240

attgtcgcgc tttcacagca ccctgcggcg cttgggacgg tggctgtcaa ataccaagat 300

atgattgcgg ccctgcccga agccacgcac gaggcaattg taggggtcgg taaacagtgg 360

tcgggagcgc gagcacttga ggcgctgctg actgtggcgg gtgagcttag ggggcctccg 420

ctccagctcg acaccgggca gctgctgaag atcgcgaaga gagggggagt aacagcggta 480

gaggcagtgc acgcctggcg caatgcgctc accggggccc ccttgaactt gaccccagac 540

caggtagtcg caatcgcgtc aaacggaggg ggaaagcaag ccctggaaac cgtgcaaagg 600

ttgttgccgg tcctttgtca agaccacggc ctgactcccg atcaagttgt agcgattgcg 660

aataacaatg gagggaaaca agcattggag actgtccaac ggctccttcc cgtgttgtgt 720

caagcccacg gtttgacgcc tgcacaagtg gtcgccatcg ccagcaatat tggcggtaag 780

caggcgctgg aaacagtaca gcgcctgctg cctgtactgt gccaggatca tggactgacc 840

ccagaccagg tagtcgcaat cgcgtcaaac ggagggggaa agcaagccct ggaaaccgtg 900

caaaggttgt tgccggtcct ttgtcaagac cacggcctga ccccagacca ggtagtcgca 960

atcgcgtcaa acggaggggg aaagcaagcc ctggaaaccg tgcaaaggtt gttgccggtc 1020

ctttgtcaag accacggcct gactcccgat caagttgtag cgattgcgtc gaacggtgga 1080

gggaaacaag cattggagac tgtccaacgg ctccttcccg tgttgtgtca agcccacggt 1140

ttgacgcctg cacaagtggt cgccatcgcc agccatgatg gcggtaagca ggcgctggaa 1200

acagtacagc gcctgctgcc tgtactgtgc caggatcatg gactgacccc agaccaggta 1260

gtcgcaatcg cgtcacatga cgggggaaag caagccctgg aaaccgtgca aaggttgttg 1320

ccggtccttt gtcaagacca cggcctgacc ccagaccagg tagtcgcaat cgcgtcaaac 1380

ggagggggaa agcaagccct ggaaaccgtg caaaggttgt tgccggtcct ttgtcaagac 1440

cacggcctga ctcccgatca agttgtagcg attgcgtcca acggtggagg gaaacaagca 1500

ttggagactg tccaacggct ccttcccgtg ttgtgtcaag cccatggatt gaccccagac 1560

caggtagtcg caatcgcgtc aaacattggg ggaaagcaag ccctggaaac cgtgcaaagg 1620

ttgttgccgg tcctttgtca agaccacggc ctgactcccg atcaagttgt agcgattgcg 1680

tcgaacattg gagggaaaca agcattggag actgtccaac ggctccttcc cgtgttgtgt 1740

caagcccacg gtttgacgcc tgcacaagtg gtcgccatcg ccaacaacaa cggcggtaag 1800

caggcgctgg aaacagtaca gcgcctgctg cctgtactgt gccaggatca tggactgacc 1860

ccagaccagg tagtcgcaat cgcgtcaaac attgggggaa agcaagccct ggaaaccgtg 1920

caaaggttgt tgccggtcct ttgtcaagac cacggcctga ccccagacca ggtagtcgca 1980

atcgcgtcac atgacggggg aaagcaagcc ctggaaaccg tgcaaaggtt gttgccggtc 2040

ctttgtcaag accatggcct gactcccgat caagttgtag cgattgcgaa taacaatgga 2100

gggaaacaag cattggagac tgtccaacgg ctccttcccg tgttgtgtca agcccacggt 2160

ctgacacccg aacaggtggt cgccattgct aataataacg gaggacggcc agccttggag 2220

tccatcgtag cccaattgtc caggcccgat cccgcgttgg ctgcgttaac gaatgaccat 2280

ctggtggcgt tggcatgtct tggtggacga cccgcgctcg atgcagtcaa aaagggtctg 2340

cctcatgctc ccgcattgat caaaagaacc aaccggcgga ttcccgagag aacttcccat 2400

cgagtcgcgg gatcccaact agtcaaaagt gaactggagg agaagaaatc tgaacttcgt 2460

cataaattga aatatgtgcc tcatgaatat attgaattaa ttgaaattgc cagaaattcc 2520

actcaggata gaattcttga aatgaaggta atggaatttt ttatgaaagt ttatggatat 2580

agaggtaaac atttgggtgg atcaaggaaa ccggacggag caatttatac tgtcggatct 2640

cctattgatt acggtgtgat cgtggatact aaagcttata gcggaggtta taatctgcca 2700

attggccaag cagatgaaat gcaacgatat gtcgaagaaa atcaaacacg aaacaaacat 2760

atcaacccta atgaatggtg gaaagtctat ccatcttctg taacggaatt taagttttta 2820

tttgtgagtg gtcactttaa aggaaactac aaagctcagc ttacacgatt aaatcatatc 2880

actaattgta atggagctgt tcttagtgta gaagagcttt taattggtgg agaaatgatt 2940

aaagccggca cattaacctt agaggaagtc agacggaaat ttaataacgg cgagataaac 3000

ttttaa 3006

<210> 9

<211> 3735

<212> DNA

<213> 戴尔根霉

<220>

<223> TALEN 结合区域

<400> 9

gcagacttca acagttggct tttttaagta aaaaagatag tgtttctcga taaattaatt 60

ttgataagat aaagagagag agagaatgaa acgatacttt ttgtttattt tttcgtgaat 120

aaaaaaaagt cattccactt ttagaaacca agagtagtgt tcttgacaac aacgccattt 180

ttttgcgtag tcttaaaaaa aaagtcattc gtttttgaag gaatacaacg gatctgatta 240

aggaaggcag tagattcaat ttgattggat aaagttcatc ttccgaaatc gacttttatg 300

tgtcattgta tttgggcgca taaaagtaat aacgggatgt tccactgcgt tcggttatca 360

gttttaatat cagaaatcat acatgttttt ttttatatta cttatcccga aatatctatt 420

gtctcctccg taggctgact tgctgtcaat gtcaaataag gtatggctgt agtacattct 480

atgcacgttc tataaagtaa tttactagtt taaagcaaaa aacatgagca aaagaagcct 540

gatatgcttt ggttttcatt tcatttgaac gtattctttc tttttttttt tgcagagtat 600

tttttatgcg tttttttttt tttttttttt tttttactac gatcaaagat atcttcgatt 660

acagaaacag aaagggattt gccggagtat gaatacttgt cttttaattt tattctttga 720

aagaagcata aagaataaac tgatggtacg gtgtttatct gttcacaagt actggtaagc 780

aacatacttg ttttaaggaa acattaaact ctatttgcca gctattgaaa gaaagaaaga 840

aaaaatatgc attttaattc tccgatgctt tcgggcacag tcgttattag gtatcgattt 900

gctgatatga cattgcgacg aaaatagtat aaaagaaacc cactcttttt tcgttcaaaa 960

aaaatcatta ttcaatactc tacaaaacaa atttaaaaac atgcctgcta ttaaaatcgg 1020

tcaacatctc cttaaccgtc ttaaggaaat caacattgat gttgtctttg gtgttcctgg 1080

tgatttcaac atggtaagca gacaattgaa ttgaacgaga gcctataaac ttattatttc 1140

tatagccctt gttggatatc attgaagatg acccagaact tacctggggt aacaatgcca 1200

acgaattgaa tgcatcttat gcagctgatg gttatgctcg tattcgtggt gcaggtgctg 1260

ttgtcactac ctttggtgta ggtgagctgt ctgctgtcaa cggtattgct ggttcatact 1320

ctgagatgct tcccgtgatt cacatcgtcg gtactccttc tactaaatcc caagctgccg 1380

gtgccatgct tcaccactct ttgggtgacg gtaactttga tgtgttcttc aacatgtcct 1440

ccatgattgc ctgtgcctct gctcacctca agaaacaaac ggccattgca gaaattgacc 1500

gtgtgatctc ccaagctgtt ctctccaagc gtacaggtta cattggtatc cctatcgatc 1560

tgatcaagac tgaggttgaa gtacctgagc ccattcctgc cctcaagacc gaattaccca 1620

aaaacccagc tgatgtccaa gcgattgcct tgagagtggt cacggatgcg atcgccaaag 1680

cccaattccc tgtgattgtt gtcgatggct gtgtgcttcg ccagagatgc caaaaggcag 1740

tacaagcctt tatcgaacgt actggtttcc ctacttatgt tgctcctatg ggtaagggtg 1800

ccgttgacga atcctctgtg agttaccgtg gctgctactc gggtaatgtc acattggaag 1860

cagtgaatga agagatcaag caagccgatt tgatcatcga agtgggctcc atcaagtctg 1920

atttcaacac gggtaacttt tcatactctc tcgaccgttc caagacgatc accttgcact 1980

cctttgccac catcgtgttt tgtgctgaat accaaaaggt ctccatgctc gaattcattc 2040

ctctcttgac ccaagccctt cccgaacaac cccgtcaatt caacctgggt ccccgcccaa 2100

gacccgtacc tatccaaccc ggtaccgaaa tcacccacaa ctacttttgg cacaaggtac 2160

ccgaattcat ggatgagaac gccattgtct gtgccgagac cggtacagct gaatttgctt 2220

cactcaacat ggacggaccc aagggaacga cttatatcac ccaattcctc tggggctcta 2280

tcggtttctc agtaggtgcc gctgtgggtg ctgcgatcgc cgctcgtgat cgtcgtgtgt 2340

atctctttgt cggtgatggt tccttccaat tgacctgtca agaaatctct ggcttccttc 2400

gccatggttt gacacctgtg atcttcttgc tgaacaatga cggttacttg atcgaaaaac 2460

tcattcacgg tcccgaacgt gcctataata actttcaaat gtgggaatac agcaagacgc 2520

ttgattattt cggtgctcat cttgaacaca acaagtccat gggtgttcct cccgttggct 2580

tcgaaggcaa ggtagccaca cgcgatgaat ttgaatccgc catgagacag gttcaagcca 2640

atcctgacaa gattcatttc cttgaagtca ttatgcctca atttgactct cctcgtgaac 2700

ttgaactctt ggttgccaac tctgaaaacc gttaaaatct tagaattcat tttttttttg 2760

tatcattcgt tctatacttc attactacag taaattcata ataaaatcat atttttgaaa 2820

ataagctttt tttttctttt acctgtgggc cccatgatga ttggtgtaac ttttacaagc 2880

tttggattgc caagttttat cagcatgtga caagtcagca cacgctcttg aatatttcta 2940

ggcaacaagg ctttgatttc ttttagggac ttggtttata ttgaatcctt ttaaggattg 3000

tatttaaaaa tagttttatt gcaagaaatg atgtatgtat gggtgtttgt tacaatgtaa 3060

ataggcatga aaatatatac aacaagaaaa aacggtctat aaagtctata agcattcaat 3120

aaaatgaatt attattcgtc atggccacaa ggacaagatt catcgtgagt gaactgagag 3180

acatcgattc cacaaccagg acagaaggca tattcataaa gaaatgtaaa ttgaaccaag 3240

tttagtgagt ccatgttttt gattgtaaaa ggataaggaa aagaaagaga cagtttgaga 3300

agcaaccttt ttataaacat attccttcaa ccaaggtcat tcattcccta aactattttc 3360

cttgtgtggc aaaagtacgc cggcagagac ggataaatat gcttgcgctc tcttttgact 3420

tgtacaactc taatttgttt gtgctaagca tcgatggggg tccactttta gccattgttt 3480

gttataggcc ttggcattgt ctattaataa attagaaaaa gagcagacga gagagagaga 3540

gagagagtga aggggggggg accatctgat ctgtctttac aagtcacatc tatgacaatt 3600

tttatgcctt ttttgagaaa aaaaaatcta ttttttttat ccttccttct tactctttca 3660

cagcatgtcc catcttccga ccatcgtcgt cctcatttct ggatccggca ccaaccttca 3720

agctcttatt gacgc 3735

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 戴尔根霉

<220>

<223> LeftTALEN-pdc的靶标

<400> 10

tgcctgctat taaaatcg 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 戴尔根霉

<220>

<223> RightTALEN-pdc的靶标

<400> 11

ttgatttcct taagacgg 18

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 oJK162

<400> 12

cgagctcgaa ttatttaaat gaacagcaag ttaataatct agaggg 46

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 oJK163

<400> 13

tatgaccatg attacgatga gaggcaaaat gaagcgtac 39

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 oJK164

<400> 14

atttaaataa ttcgagctcg gtacccgggg 30

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 oJK165

<400> 15

cgtaatcatg gtcatagctg 20

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 oJK202

<400> 16

tagagggaaa aagagagaat tgaaatagg 29

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 oJK204

<400> 17

ttttgttatt taattgtatt aattgataat g 31

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 oJK205

<400> 18

aattaaataa caaaatcatt ttaattacgc attttc 36

<210> 19

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 oJK216

<400> 19

catgattacg cggccgcgcc attataatgc actagtg 37

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 oJK210

<400> 20

ctctttttcc ctctaatgag aggcaaaatg aagcgtac 38

<210> 21

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 oJK211

<400> 21

aattaaataa caaaaatgtc ttctatcgaa acctccaaaa tctc 44

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 trpC-lost-F

<400> 22

tttaaattag agggaaaaag agagaattga aatag 35

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 trpC-lost-R

<400> 23

tccctctaat ttaaatgaat tcgagctcgg taccc 35

<210> 24

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 NK-141

<400> 24

aattaaataa caaaaatgtt atattcaaaa gcatttc 37

<210> 25

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 NK-163

<400> 25

gcgtaattaa aatgactaat gcatgttggg aac 33

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 NK-011

<400> 26

ttttgttatt taattgtatt aattg 25

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 NK-012

<400> 27

tcattttaat tacgcatttt c 21

<210> 28

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 pUC18-Pae1-F3

<400> 28

ctgcaggtcg actctagagg atccccgggt accg 34

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 pUC18-Hind3-R3

<400> 29

gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgac 35

<210> 30

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 PDC1-upstr-F

<400> 30

cggccagtgc caagcgcaga cttcaacagt tggctttttt aagta 45

<210> 31

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 PDC1-upstr-R

<400> 31

cattttgcct ctcatgtttt taaatttgtt ttgtagagta ttgaata 47

<210> 32

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 trpCpro-R

<400> 32

gaacagcaag ttaataatct agagggcgc 29

<210> 33

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 trpCter-F

<400> 33

atgagaggca aaatgaagcg tacaaagag 29

<210> 34

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 PDC1-downstr-F

<400> 34

attaacttgc tgttcaatct tagaattcat tttttttttg tatcattcg 49

<210> 35

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 PDC1-downstr-R

<400> 35

agagtcgacc tgcaggcgtc aataagagct tgaaggttgg tgccggatc 49

<210> 36

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 oJK899

<400> 36

gaacagcaag ttaataatct agagggcgc 29

<210> 37

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 oJK900

<400> 37

aatcttagaa ttcatttttt ttttgtatc 29

<210> 38

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 oJK901

<400> 38

attaacttgc tgttctagag ggaaaaagag agaattgaaa tagg 44

<210> 39

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 NK-195

<400> 39

atgaattcta agattctaat gcatgttggg aac 33

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 oJK902

<400> 40

gcagacttca acagttggct tttttaagta 30

<210> 41

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 oJK903

<400> 41

gcgtcaataa gagcttgaag gttggtgccg gatc 34

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 PDC1-upstr-F2

<400> 42

gcagacttca acagttggct tttttaagta 30

<210> 43

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 PDC1-downstr-R-P

<400> 43

gcgtcaataa gagcttgaag gttggtgccg gatc 34

<210> 44

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 adhpro-R

<400> 44

ttttgttatt taattgtatt aattgataat g 31

<210> 45

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 adhter-F

<400> 45

tcattttaat tacgcatttt catttac 27

<210> 46

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 adhpro-TALEN-F

<400> 46

aattaaataa caaaaatgga ctacaaagac catgacggtg 40

<210> 47

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 TAELN-adhter-R

<400> 47

gcgtaattaa aatgattaaa agtttatctc gccgttatta 40

<210> 48

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 adhpro-exo1-F

<400> 48

aattaaataa caaaaatgaa aatccaagtt gcttctccta ttgac 45

<210> 49

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 exo1-adhter-R

<400> 49

gcgtaattaa aatgattatc ttctttcatg agaaacacta aacttg 46

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 NK-069

<400> 50

cagaaaaacg gctgatttta gacc 24

<210> 51

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 NK-118

<400> 51

ctgtagtaat gaagtataga acgaatg 27

Claims

1.一种突变丝状菌，其中，

由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽的表达增强，所述丝状菌是戴尔根霉(Rhizopus Delemar)。

2.如权利要求1所述的突变丝状菌，其中，

导入了含有由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸的DNA片段或载体。

3.一种C4二羧酸的制造方法，其中，

包括培养权利要求1或2所述的突变丝状菌的步骤。

4.如权利要求3所述的制造方法，其中，

还包括从所述培养物中回收C4二羧酸的步骤。

5.如权利要求3或4所述的制造方法，其中，

所述C4二羧酸是富马酸、苹果酸或琥珀酸。

6.一种突变丝状菌的制造方法，其中，

包括在宿主丝状菌中增强由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽的表达的步骤，所述丝状菌是戴尔根霉(Rhizopus Delemar)。

7.如权利要求6所述的方法，其中，

所述表达的增强包括导入含有由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸的DNA片段或载体的步骤。