CN107849557B - 新型启动子 - Google Patents

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Abstract

本发明在于提供一种适于目的基因的高表达的启动子。由选自下述(a)~(d)中的DNA构成的启动子:(a)由序列编号1~3中任一项所示的碱基序列构成的DNA;(b)由与序列编号1~3中任一项所示的碱基序列具有至少70%的同一性的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA;(c)由在序列编号1~3中任一项所示的碱基序列中缺失、取代或添加了1个或多个的碱基的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA;和(d)与由与序列编号1~3中任一项所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、并且具有启动子活性的DNA。

Description

新型启动子
技术领域
本发明涉及新型启动子、含有该启动子的表达载体和转化体、以及使用了该转化体的目的物质的制造方法。
背景技术
近年来,不仅化学合成法,也在工业水平上进行着使用生物、酶的物质合成法。利用生物、酶的物质合成与化学合成法相比,能够降低合成时的能量,并且能够特异合成具有光学异构体的化合物中特定的结构。另一方面,在利用微生物的有用物质的工业生产中,其生产率的提高是重要的课题之一。以往,作为用于提高微生物的物质生产率的方法,进行了利用突变等的遗传学方法的生产菌的育种。特别是最近,由于微生物遗传学和生物工序的发展,使用了基因重组技术等的更高效的微生物学有用物质生产备受关注。
作为丝状菌的根霉属(Rhizopus),至今作为能够用于乳酸生产的微生物被公开(专利文献1~3)。但是,根霉属菌的遗传学的背景仍不清楚,分子遗传学方法的导入慢,预想其为多核细胞因而单克隆系统的分离、维持困难,因此,基因重组技术等相关的研究例少。作为根霉属菌中基因的转录必要的启动子,报道了ldhA启动子(专利文献1、非专利文献1)、pgk1启动子(专利文献2、非专利文献2)、pgk2启动子(专利文献3)、pdcA和amyA启动子(非专利文献2)、tef和18SrRNA启动子(专利文献4)等,为了不必全面地研究这些启动子的表达强度、并且降低工业生产时的生产成本,要求能够实现更高的生产率的启动子和微生物。
(专利文献1)美国专利第6268189号说明书
(专利文献2)国际公开第2001/73083号
(专利文献3)国际公开第2001/72967号
(专利文献4)美国专利申请公开第2010/112651号说明书
(非专利文献1)Applied Microbiology and Biotechnology(2004)vol.64:237-242
(非专利文献2)Archives of Microbiology(2006)vol.186:41-50
发明内容
在一个方式中,本发明提供由选自下述(a)~(d)中的DNA构成的启动子:
(a)由序列编号1~3中任一项所示的碱基序列构成的DNA;
(b)由与序列编号1~3中任一项所示的碱基序列具有至少70%的同一性的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA;
(c)由在序列编号1~3中任一项所示的碱基序列中缺失、取代或添加了1个或多个的碱基的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA;和
(d)与由与序列编号1~3中任一项所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、并且具有启动子活性的DNA。
在另外的一个方式中,本发明提供含有上述启动子的表达载体。
在另外的一个方式中,本发明提供包含编码目的物质或与其合成相关的酶的基因和连接于该基因的上游的上述启动子的DNA片段。
在另外的一个方式中,本发明提供含有上述表达载体或DNA片段的转化体。
在另外的一个方式中,本发明提供目的物质的制造方法,其包括:培养上述转化体;和从通过该培养得到的培养物回收目的物质。
具体实施方式
在本说明书中,碱基序列的同一性是指根据需要在进行比较的两个碱基序列插入间隙并进行比对(alignment)而得到的最大的碱基序列的同一性(%)。在本发明中,碱基序列和氨基酸序列的序列同一性通过Lipman-Pearson法(Science,1985,227:1435-1441)进行计算。具体而言,使用遗传信息处理软件Genetyx-Win的同源性分析(Search homology)程序,使Unit size to compare(ktup)为2进行分析,由此算出。
在本说明书中,“启动子活性”是指促进DNA(基因)向mRNA的转录的活性。启动子活性能够通过使用适当的报告基因进行确认。例如,在启动子的下游连接编码能够检测的蛋白质的DNA、即、报告基因,通过测定该报告基因的基因产物的生产量,能够确认启动子活性。作为报告基因的例子,可以列举β-半乳糖苷酶(LacZ)基因、β-葡糖苷酸酶(GUS)基因、荧光素酶基因、β-内酰胺酶基因、GFP(绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein))基因等的荧光蛋白质的基因等。或者,启动子活性也能够通过以定量RT-PCR等测定从报告基因转录的mRNA的表达量来确认。
在本说明书中,对于微生物的机能、性状、形质所使用的用语“本来”是用于表示该机能、性状、形质在该微生物的野生型中存在而使用。相对照而言,用语“外来”是用于表示原来在该微生物中不存在、从外部导入的机能、性状、形质而使用。例如,对某微生物从外部导入的基因为外来基因。外来基因可以为与其所导入的微生物同种的微生物由来的基因,也可以为异种的生物由来的基因(异种基因)。
在本说明书中,基因相关的“上游”和“下游”是指该基因的转录方向的上游和下游。例如,“配置于启动子的下游的基因”是指在DNA正义链中基因存在于启动子的3'侧,基因的上游是指DNA正义链中该基因的5'侧的区域。另外,在本说明书中,启动子与基因的“能够工作地连接”是指以该启动子能够诱导该基因的转录的方式连接。启动子与基因的“能够工作地连接”的方法对于本领域技术人员来说是公知的。
本发明涉及提供新型启动子、含有该启动子的表达载体和转化体、以及使用了该转化体的目的物质的制造方法。
本发明的发明人对丝状菌由来的启动子进行了研究,结果发现了具有高的转录活性的新型启动子。
本发明的启动子的转录活性高,能够显著提高作为控制对象的基因的转录量。采用本发明的启动子,能够提高目的物质的微生物学的制造的效率。
在一个实施方式中,本发明的启动子为由序列编号1~3中任一项所示的碱基序列构成的DNA。在另外的一个实施方式中,本发明的启动子包含由与由序列编号1~3中任一项所示的碱基序列构成的DNA实质上同一的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA。优选本发明的启动子相对于由序列编号1~3中任一项所示的碱基序列构成的DNA的启动子活性,具有10%以上、优选15%以上、更优选50%以上、更优选70%以上、更优选80%以上、更优选90%以上的启动子活性。
作为本发明的启动子的例子,可以列举由以下的(a)~(d)所规定的DNA构成的启动子。
(a)由序列编号1~3中任一项所示的碱基序列构成的DNA
(b)由与序列编号1~3中任一项所示的碱基序列具有至少70%的同一性的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA
(c)由在序列编号1~3中任一项所示的碱基序列中缺失、取代或添加了1个或多个的碱基的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA
(d)与由与序列编号1~3中任一项所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、并且具有启动子活性的DNA上述(a)的由序列编号1~3所示的碱基序列构成的DNA为根霉(Rhizopus)属由来的启动子。由序列编号1所示的碱基序列构成的DNA为戴尔根霉(Rhizopus delemar)由来的作为编码醇脱氢酶(ADH1)的基因的adh1的启动子。由序列编号2所示的碱基序列构成的DNA为戴尔根霉(Rhizopus delemar)由来的作为编码刀豆素应答酶(CIPC)的基因的cipC的启动子。由序列编号3所示的碱基序列构成的DNA为戴尔根霉(Rhizopus delemar)由来的作为编码硫胺素合成酶(NMT1)的基因的nmt1的启动子。
关于上述(b)的、与序列编号1~3中任一项所示的碱基序列具有至少70%的同一性的碱基序列是指与序列编号1、序列编号2或序列编号3所示的碱基序列具有70%以上、优选80%以上、更优选90%以上、更加优选95%以上、更进一步优选98%以上、特别优选99%以上的同一性的碱基序列。作为上述(b)的DNA的例子,可以列举由与序列编号1所示的碱基序列具有91%的同一性的序列编号24所示的碱基序列构成的、米根霉(Rhizopus oryzae)的adh1启动子DNA。
关于上述(c)的、在序列编号1~3中任一项所示的碱基序列中缺失、取代或添加了1个或多个的碱基的碱基序列是相对于序列编号1、序列编号2或序列编号3所示的碱基序列具有1个或多个的碱基的缺失、取代、或添加的碱基序列。在本说明书中,“1个或多个的碱基”是指1个以上10个以下、优选1个以上5个以下、更优选1个以上3个以下、更加优选1个以上2个以下的碱基。另外,上述“碱基的缺失”是指序列中的碱基的缺欠或消失,上述“碱基的取代”是指序列中的碱基被其它的碱基取代,上述“碱基的添加”是指在序列中增加碱基。“添加”中包括向序列的一端或两端的碱基的添加、和在序列中的碱基之间插入其它的碱基。
作为上述(d)中的“严格的条件”,可以列举Molecular Cloning-A LABORATORYMANUAL THIRD EDITION(Joseph Sambrook,David W.Russell.,Cold Spring HarborLaboratory Press,2001)所述的Southern杂交(Southern hybridization)法的条件、例如在含有6×SSC(1×SSC的组成:0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)、0.5%SDS、5×邓哈特溶液和100mg/mL鲱鱼精DNA的溶液中与探针一起在42℃恒温8~16小时而使其杂交的条件。
作为本发明的启动子的获得方法,没有特别限制,能够通过通常的化学合成法或基因工学的方法得到。例如,能够基于序列编号1~3所示的碱基序列,人工合成本发明的启动子DNA。DNA的人工合成时,例如,能够利用Invitrogen公司等的服务。或者,能够从戴尔根霉(Rhizopus delemar)等的微生物,例如,根据Molecular Cloning-A LABORATORY MANUALTHIRD EDITION(Joseph Sambrook,David W.Russell,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2001)所述的方法,克隆序列编号1~3所示的启动子序列。
本发明的启动子DNA还可以是在序列编号1~3所示的碱基序列的DNA导入突变得到的。作为导入突变的方法,例如,可以列举紫外线照射和部位特异性的变异导入法。作为部位特异性的变异导入法,可以列举利用Splicing overlap extension(SOE)PCR(Hortonet al.,Gene 77,61-68,1989)的方法、ODA法(Hashimoto-Gotoh et al.,Gene,152,271-276,1995)、Kunkel法(Kunkel,T.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1985,82,488)等。或者,也能够利用Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Km试剂盒(Takara-Bio公司)、TransformerTM Site-Directed Mutagenesis试剂盒(Clonetech公司)、KOD-Plus-Mutagenesis Kit(东洋纺公司)等的市售的部位特异性变异导入用试剂盒。通过从突变导入后的DNA选择具有所期望的启动子活性的DNA,能够获得本发明的启动子DNA。例如,通过在变异导入后的DNA的下游能够工作地连接目的基因,进行该目的基因的表达量分析,能够确认具有启动子活性的DNA。
对于碱基序列的碱基的取代、缺失或添加的方法例如在Dieffenbach等(ColdSpring Harbar Laboratory Press,New York,581-621,1995)中有记载。通过使用该方法,能够获得对序列编号1~3所示的碱基序列取代、缺失或添加了1个或或多个的碱基的碱基序列。
本发明的启动子具有控制配置于其下游的基因的表达的功能。通过利用本发明的启动子,能够获得转录活性优异的具有表达控制区域的DNA片段。例如,能够构建包含目的基因和在其上游能够工作地连接的本发明的启动子的DNA片段。该DNA片段中,除了本发明的启动子和目的基因以外,也可以含有使该启动子的转录活性提高的顺式作用元件。另外,该DNA片段能够构建为在两末端具有限制性内切酶识别序列。使用该限制性内切酶识别序列,能够将启动子导入载体。即,用限制性内切酶切断公知的载体,在此添加含有本发明的启动子且在端部具有限制性内切酶切断序列的DNA片段,由此,能够将本发明的启动子导入载体(限制性内切酶法)。
或者,通过将本发明的启动子重组到能够表达目的基因的的表达载体中,得到能够在转录水平上提高该目的基因的表达的表达载体。在该表达载体中,本发明的启动子可以在编码目的基因的DNA的上游能够工作地连接。具有本发明的启动子的表达载体可以是导入宿主细胞的染色体的形态或者保持染色体外的形态的任一种。另外,或者,也可以构建具有目的基因和在其上游能够工作地连接的本发明的启动子的DNA片段,将其直接导入宿主细胞的基因组。此外,丝状菌已知有仅通过将不具有复制起点的线状DNA或环状DNA导入细胞中,就能够将该DNA保持于细胞的例子(Skory et al.,Current Genetics,45,302-310,2004)。因此,在宿主细胞为丝状菌时,在导入的表达载体或DNA片段中不一定需要有复制起点。
作为表达载体,只要能够在宿主细胞内中稳定保持并复制即可,没有特别限定,例如,可以列举pUC18/19、pUC118/119、pBR322、pMW218/219、pPTR1/2(TaKaRa)、pRI909/910(TaKaRa)、pDJB2(D.J.Ballance et al.,Gene,36,321-331,1985)、pAB4-1(vanHartingsveldt W et al.,Mol Gen Genet,206,71-75,1987)、pLeu4(M.I.G.Roncero etal.,Gene,84,335-343,1989)、pPyr225(C.D.Skory et al.,Mol Genet Genomics,268,397-406,2002)、pFG1(Gruber,F.et al.,Curr Genet,18,447-451,1990)等。
在上述表达载体、DNA片段中,配置于本发明的启动子的下游的目的基因没有特别限定。例如,目的基因为编码目的物质或与其合成相关的酶的基因。目的基因可以是编码异种表达产物的异种基因,也可以是编码宿主细胞本来所具有的表达产物的基因,也可以是编码其它的任意的蛋白质、肽、核酸等的基因。作为目的基因所编码的物质的例子,可以列举酶、激素、细胞因子、其它的生理活性肽、转运体、非编码RNA等。作为酶的例子,可以列举氧化还原酶(Oxidoreductase)、转移酶(Transferase)、水解酶(Hydrolase)、裂解酶(Lyase)、异构酶(Isomerase)、合成酶(Ligase或Synthetase)、糖酵解系的酶、乳酸合成酶(LDH等)、TCA通路的酶等。作为目的基因的优选例子,可以列举编码宿主细胞本来所具有的表达产物、例如糖酵解系的酶、乳酸合成酶(LDH等)、TCA通路的酶、转运体、非编码RNA等的基因,更优选列举乳酸合成酶、富马酸合成酶、琥珀酸合成酶、苹果酸合成酶、α-酮戊二酸合成酶、有机酸原料摄入转运体、糖酵解系的酶、有机酸排出转运体等的、与宿主细胞的有机酸合成相关的酶。
本发明的启动子是对在微生物中在有机酸代谢通路上不存在的酶的基因的启动子,因此,与微生物中本来存在的有机酸的合成相关的启动子不会发生竞争。因此,本发明的启动子在微生物学的有机酸生产中能够在作为编码与该有机酸的合成相关的酶的基因的启动子合适地使用。作为有机酸,优选列举乳酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸和α-酮戊二酸。
通过将包含本发明的启动子的表达载体或DNA片段使用一般的转化法、例如电穿孔法、转化法、转染法、接合法、原生质体法、颗粒枪法、农杆菌注射法等导入宿主细胞中,能够得到本发明的转化体。
作为导入上述载体、DNA片段的宿主细胞,只要是在该细胞内本发明的启动子能够作为启动子发挥功能的宿主细胞即可,没有特别限定,通常可以列举真核生物、优选真菌、更优选丝状菌。作为优选的丝状菌,例如,可以列举枝顶孢(Acremonium)属、曲霉(Aspergillus)属、短梗霉(Aureobasidium)属、烟管霉(Bjerkandera)属、拟蜡菌(Ceriporiopsis)属、金孢子菌(Chrysosporium)属、鬼伞(Coprinus)属、云芝(Coriolus)属、隐球菌(Cryptococcus)属、线黑粉酵母(Filibasidium)属、镰刀菌(Fusarium)属、腐质霉(Humicola)属、梨孢菌(Magnaporthe)属、毛霉(Mucor)属、毁丝霉(Myceliophthora)属、新美鞭菌(Neocallimastix)属、脉孢菌(Neurospora)属、拟青霉(Paecilomyces)属、青霉菌(Penicillium)属、平革菌(Phanerochaete)属、脉射菌(Phlebia)属、瘤胃壶菌(Piromyces)属、侧耳(Pleurotus)属、根霉(Rhizopus)属、裂褶菌(Schizophyllum)属、踝节菌(Talaromyces)属、嗜热子囊菌(Thermoascus)属、梭孢壳霉(Thielavia)属、弯颈霉(Tolypocladium)属、栓菌(Trametes)属、和木霉(Trichoderma)属的丝状菌,其中,优选米根霉(Rhizopus oryzae)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、华根霉(Rhizopus chinensis)、黑根霉(Rhizopus nigricans)、东京根霉(Rhizopus tonkinensis)、小麦曲根霉(Rhizopustritici)、戴尔根霉(Rhizopus delemar)等的根霉(Rhizopus)属丝状菌,更优选米根霉(Rhizopus oryzae)和戴尔根霉(Rhizopus delemar),更加优选戴尔根霉(Rhizopusdelemar)。
上述转化体能够用于目的物质的制造。例如,将用具有编码目的物质或与其合成相关的酶的基因和能够工作地连接于该基因的上游的本发明的启动子的表达载体或DNA片段进行了转化的宿主细胞用适当的培养基进行培养,在本发明的启动子的控制下表达该基因,生产目的物质。该宿主细胞的培养条件只要是该宿主细胞能够增殖和能够生产目的物质的条件即可,没有特别限定。培养结束后,从培养物回收目的物质,由此,获得目的物质。作为目的物质,可以列举上述目的基因编码的物质、和通过该物质的作用合成生成物、例如由上述的有机酸生产相关的酶生成的有机酸等。作为有机酸,优选列举乳酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸和α-酮戊二酸。
以丝状菌为宿主的目的物质的生产能够通过将丝状菌按照通常的培养方法进行培养,从培养基回收目的物质来进行。例如,将通过具有编码与有机酸合成相关的酶的基因和连接于其上游的本发明的启动子的表达载体进行转化得到的丝状菌的孢子或菌丝体或其混合物用适当的培养基以10℃~50℃、优选以25℃~35℃培养数日,由此,能够生产有机酸。培养天数只要是能够充分生产目的的有机酸的期间即可。例如,目的的有机酸为乳酸时,通过以上述的温度培养1~168小时、优选2~72小时、特别优选4~24小时,依赖于导入的基因,产生L-乳酸或D-乳酸。培养基只要是丝状菌能够健全地生育、并且生产目的的有机酸的培养基即可,没有特别限定。例如,能够使用以葡萄糖等的单糖、低聚糖、淀粉等的多糖为基质的固体培养基、液体培养基、市售的PDB培养基(Becton,Dickinson and Company)、PDA培养基(Becton,Dickinson and Company)等。
为了更高效地使用以丝状菌为宿主的转化体来生产有机酸,可以以如下所示的工序来进行生产。即,通过制备转化体的孢子悬浊液(工序A);将其用培养液进行培养,使孢子萌发,制备菌丝体(工序B1);适当地使该菌丝体进一步增殖(工序B2);接着对制备得到的菌丝体进行培养来生产有机酸(工序C),能够高效地制备有机酸。
<工序A:孢子悬浊液的制备>
将转化得到的丝状菌的孢子接种于例如无机琼脂培养基(组成例:2%葡萄糖、0.1%硫酸铵、0.06%磷酸二氢钾、0.025%硫酸镁七水合物、0.009%硫酸锌七水合物、1.5%琼脂,浓度均为%(w/v))、PDA培养基等的培养基,以10~40℃、优选27~30℃,进行7~10天静置培养,由此形成孢子,悬浊于生理盐水等,由此,能够进行孢子悬浊液的制备。孢子悬浊液中可以含有也可以不含有菌丝体。
<工序B1:菌丝体的制备>
将上述得到的孢子悬浊液接种于培养液,进行培养,使孢子萌发,得到菌丝体。接种于培养液的丝状菌的孢子数为1×102~1×108个-孢子/mL-培养液、优选为1×102~5×104个-孢子/mL-培养液、更优选为5×102~1×104个-孢子/mL-培养液、更加优选为1×103~1×104个-孢子/mL-培养液。
本工序中使用的孢子萌发用的培养液有市售的培养基,例如,能够利用马铃薯葡萄糖培养基(以下,有时也称为PDB培养基。例如有Becton,Dickinson and Company制的培养基。)、Luria-Bertani培养基(以下,有时也称为LB培养基。LB培养基能够作为商标名“Daigo”由日本制药公司购入。)、Nutrient Broth(以下,有时也称为NB培养基。例如有Becton,Dickinson and Company制的培养基。)、Sabouraud培养基(以下,有时也称为SB培养基,例如有OXOID公司制的培养基)等。另外,该培养液中,从萌发率和菌体生育的观点考虑,作为碳源,能够适当添加葡萄糖、木糖等的单糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖等的低聚糖、或淀粉等的多糖;甘油、柠檬酸等的生物体成分;作为氮源,能够适当添加硫酸铵、尿素等、氨基酸等;作为其它无机物,能够适当添加钠、钾、镁、锌、铁、磷酸等的各种盐类。单糖、低聚糖、多糖和甘油的优选浓度为0.1~30%(w/v),柠檬酸的优选浓度为0.01~10%(w/v),硫酸铵、尿素和氨基酸的优选浓度为0.01~1%(w/v),无机物的优选浓度为0.0001~0.5%(w/v)。
工序B1中,使用上述培养液,培养上述转化体的丝状菌。培养按照通常的步骤进行即可。例如,在含有培养液的培养容器中接种丝状菌孢子,边以优选80~250rpm、更优选100~170rpm进行搅拌,边在25~42.5℃的培养温度控制下培养优选24~120小时、更优选48~72小时。供于培养的培养液的量根据培养容器适当调整即可,例如,在200mL容量带有导流管的烧瓶时为50~100mL左右即可,在500mL容量带有导流管的烧瓶时为100~300mL左右即可。通过该培养,丝状菌孢子萌发,向菌丝体生长。
<工序B2:菌丝体的增殖>
从提高有机酸生产能的观点考虑,优选进行将工序B1中得到的菌丝体进一步进行培养使其增殖的工序(工序B2)。工序B2中使用的增殖用的培养液没有特别限定,只要是通常使用的含有葡萄糖的无机培养液即可,例如,可以列举含有7.5~30%葡萄糖、0.001~2%硫酸铵、0.001~0.6%磷酸二氢钾、0.01~0.1%硫酸镁七水合物、0.005~0.05%硫酸锌七水合物、和3.75~20%碳酸钙(浓度均为%(w/v))的培养液等,优选列举含有10%葡萄糖、0.1%硫酸铵、0.06%磷酸二氢钾、0.025%硫酸镁七水合物、0.009%硫酸锌七水合物、和5.0%碳酸钙(浓度均为%(w/v))的培养液。该培养液的量根据培养容器适当调整即可,例如,为500mL容量三角烧瓶时为50~300mL、优选100~200mL即可。在该培养液中,将在工序B1中培养的菌体接种为以湿重量计为1~20g-菌体/100mL-培养基、优选3~10g-菌体/100mL-培养基,边以100~300rpm、优选170~230rpm搅拌,边在25~42.5℃的培养温度控制下培养12~120小时、优选24~72小时。
<工序C:有机酸生产>
对通过上述的步骤(B1或B1和B2)得到的丝状菌的菌丝体进行培养,使该菌中生产有机酸,此后能够回收生产的有机酸。
工序(C)中使用的有机酸生产用培养液只要含有葡萄糖等的碳源、硫酸铵等的氮源和各种金属盐等、能够生产有机酸的培养液即可。作为在该工序(C)中使用的培养液,例如,可以列举含有7.5~30%葡萄糖、0.001~2%硫酸铵、0.001~0.6%磷酸二氢钾、0.01~0.1%硫酸镁七水合物、0.005~0.05%硫酸锌七水合物、和3.75~20%碳酸钙(浓度均为%(w/v))的培养液等,优选列举含有12.5%葡萄糖、0.1%硫酸铵、0.06%磷酸二氢钾、0.025%硫酸镁七水合物、0.009%硫酸锌七水合物、和5.0%碳酸钙(浓度均为%(w/v))的培养液。
工序(C)中使用的培养液的量根据培养容器适当调整即可,例如,在200mL容量三角烧瓶时为20~80mL左右、在500mL容量三角烧瓶时为50~200mL左右即可。在该培养液中,将上述的菌体接种为以湿重量计为5g~90g-菌体/100mL-培养液、优选5g~50g-菌体/100mL-培养液的量,边以100~300rpm、优选170~230rpm搅拌,边在25~45℃的培养温度控制下,培养2小时~72小时、优选4小时~36小时。
通过从上述培养液回收培养上清,能够得到有机酸。根据需要,通过倾斜法、膜分离、离心分离、电透析法、利用离子交换树脂、蒸馏、盐析等的方法、或这些的组合,可以在将该培养液中的有机酸作为有机酸盐回收之后,从回收的有机酸盐分离或精制有机酸。
作为本发明的例示的实施方式,在本说明书中还公开了以下的物质、制造方法、用途或方法。但是,本发明不受这些实施方式限定。
<1>一种启动子,其中,所述启动子由选自下述(a)~(d)中的DNA构成:
(a)由序列编号1~3中任一项所示的碱基序列构成的DNA;
(b)由与序列编号1~3中任一项所示的碱基序列具有至少70%的同一性的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA;
(c)由在序列编号1~3中任一项所示的碱基序列中缺失、取代或添加了1个或多个的碱基的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA;和
(d)与由与序列编号1~3中任一项所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、并且具有启动子活性的DNA。
<2>如<1>所述的启动子,其中,上述(b)所示的DNA为由与序列编号1~3中任一项所示的碱基序列具有优选80%以上、更优选90%以上、更加优选95%以上、更加优选98%以上、更优选99%以上的同一性的碱基序列构成的DNA。
<3>如<1>所述的启动子,其中,上述(c)所示的DNA为由相对于序列编号1~3中任一项所示的碱基序列具有优选1个以上10个以下、更优选1个以上5个以下、更加优选1个以上3个以下、更进一步优选1个以上2个以下的碱基的缺失、取代、或添加的碱基序列构成的DNA。
<4>一种表达载体,其中,所述表达载体包含<1>~<3>中任一项所述的启动子。
<5>如<4>所述的表达载体,其中,优选所述表达载体含有编码目的物质或与其合成相关的酶的基因和能够工作地与该基因连接的<1>~<3>中任一项所述的启动子。
<6>如<4>所述的表达载体,其中,优选上述启动子连接于编码目的物质或与其合成相关的酶的基因的上游。
<7>如<5>或<6>所述的表达载体,其中,优选上述基因为编码与有机酸合成相关的酶的基因。
<8>一种DNA片段,其中,所述DNA片段包含编码目的物质或与其合成相关的酶的基因和连接于该基因的上游的<1>~<3>中任一项所述的启动子。
<9>如<8>所述的DNA片段,其中,优选上述基因为编码与有机酸合成相关的酶的基因。
<10>一种转化体,其中,所述转化体含有<4>~<7>中任一项所述的表达载体、或者<8>或<9>所述的DNA片段。
<11>如<10>所述的转化体,其中,优选所述转化体为丝状菌。
<12>如<11>所述的转化体,其中,上述丝状菌优选为枝顶孢(Acremonium)属、曲霉(Aspergillus)属、短梗霉(Aureobasidium)属、烟管霉(Bjerkandera)属、拟蜡菌(Ceriporiopsis)属、金孢子菌(Chrysosporium)属、鬼伞(Coprinus)属、云芝(Coriolus)属、隐球菌(Cryptococcus)属、线黑粉酵母(Filibasidium)属、镰刀菌(Fusarium)属、腐质霉(Humicola)属、梨孢菌(Magnaporthe)属、毛霉(Mucor)属、毁丝霉(Myceliophthora)属、新美鞭菌(Neocallimastix)属、脉孢菌(Neurospora)属、拟青霉(Paecilomyces)属、青霉菌(Penicillium)属、平革菌(Phanerochaete)属、脉射菌(Phlebia)属、瘤胃壶菌(Piromyces)属、侧耳(Pleurotus)属、根霉(Rhizopus)属、裂褶菌(Schizophyllum)属、踝节菌(Talaromyces)属、嗜热子囊菌(Thermoascus)属、梭孢壳霉(Thielavia)属、弯颈霉(Tolypocladium)属、栓菌(Trametes)属、或木霉(Trichoderma)属的丝状菌,
更优选为根霉(Rhizopus)属菌,
更加优选为米根霉(Rhizopus oryzae)或戴尔根霉(Rhizopus delemar),
更优选戴尔根霉(Rhizopus delemar)。
<13>一种目的物质的制造方法,其中,所述目的物质的制造方法包括:
培养含有包含编码目的物质或与其合成相关的酶的基因和连接于该基因的上游的<1>~<3>中任一项所述的启动子的表达载体或DNA片段的转化体;和
从通过该培养得到的培养物回收目的物质。
<14>如<13>所述的制造方法,其中,上述目的物质为有机酸,并且上述基因为编码与有机酸合成相关的酶的基因。
<15>如<14>所述的制造方法,其中,上述有机酸为富马酸、乳酸、琥珀酸、苹果酸或α-酮戊二酸。
实施例
以下,基于实施例,进一步详细地说明本发明,但是本发明不受其限定。
实施例1启动子的鉴定
(1)基因组提取
在PDA培养基接种戴尔根霉(Rhizopus delemar)JCM(Japan Collection ofMicroorganisms/理研)5557株(以下,记为5557株)的孢子之后,在30℃进行5天培养。培养后,将菌体与3mL用金属锥(Metal Cone)(安井器械)一起加入3mL破碎用管中,直接在液氮中冻结10分钟以上。此后,使用多珠振荡器(Multibeads shocker)(安井器械),以1700rpm进行10秒菌体的破碎。在破碎后的容器中添加TE缓冲液(TE Buffer)(pH8.0)(NIPPONGENE)400μL,颠倒混合,将250μL移至1.5mL管。从该菌体溶液,使用“GenTLE(酵母用)”(Takara-Bio),根据操作说明进行基因组提取。对所得到的基因组溶液50μL,添加RNaseA(Roche)1μL,在37℃使其反应1小时。反应后,添加等量的苯酚/氯仿,利用轻敲(tapping)混合后,在4℃、14500rpm离心5分钟,将上清移至新的1.5mL管。再度重复进行苯酚/氯仿处理,接着进行乙醇沉淀,得到5557株的精制基因组溶液。
(2)基因组序列分析
基因组序列分析使用MiSeq测序仪(Illumina)进行。即,将上述(1)中得到的5557株的精制基因组溶液用Nextera XT DNA Sample Preparation Kit(Illumina)进行处理,将得到的样品供于MiSeq。操作根据推荐的操作说明进行。用MiSeq分析后,用CLC GenomicsWorkbench(CLC bio)分析输出的序列信息。参照序列使用由Broad Institute(www.broadinstitute.org/scientific-community/science/projects/fungal-ge nome-initiative/mucorales-genomes)获得的戴尔根霉(Rhizopus delemar)RA 99-880株的基因组序列。
(3)总RNA提取
将5557株的菌体6g-湿重量接种于液体培养基40mL(0.1g/L(NH4)2SO4、0.6g/LKH2PO4、0.25g/L MgSO4·7H2O、0.09g/L ZnSO4·7H2O、50g/L碳酸钙、100g/L葡萄糖),以35℃、170rpm培养8小时。从培养液中过滤、回收菌体,以0.85%生理盐水100mL进行2次清洗。清洗后,利用吸滤除去多余的水分之后,量取0.3g,与3mL用金属锥(安井器械)一起加入3mL破碎用管中,直接投入液氮中冻结。将所得到的冻结菌体使用多珠振荡器(安井器械)以1700rpm进行10秒破碎。在破碎后的菌体添加RLT缓冲液(RLT buffer)500μL,颠倒混合之后,将450μL供于RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen),进行总RNA提取。在所得到的RNA溶液40μL中添加1μL的DNaseI(TaKaRa)和5μL的10×DNaseI缓冲液(DNaseI buffer)(USBCorporation),用无RNA酶水(RNase free water)补充到50μL后,在37℃使其反应30分钟以上,除去溶液中的残存DNA。再追加DNaseI 1μL,在37℃使其反应30分钟后,进行苯酚/氯仿提取,接着进行乙醇沉淀。将沉淀溶解于50μL的灭菌水,使用Qubit(Life Technologies)测定RNA溶液的浓度和纯度。另外,适当稀释该RNA溶液,使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent)和RNA6000 Pico Kit(Agilent)进行提取的RNA的检测。
(4)网络性转录量分析
网络性转录量分析使用MiSeq测序仪(Illumina)进行。从上述(3)中提取的总RNA溶液,使用TruSeq RNA sample Prep v2 LS Kit(Illumina)制备样品。此时,制备为RNA的片段长度为150碱基。将制得的样品供于MiSeq,进行转录量分析。输出数据的分析使用CLCGenomics Workbench(CLC bio)进行contig(重叠群)的形成,转录量用RPKM值(Reads PerKilobase of exon per Million mapped fragments)算出。RPKM值是相对于各RNA序列将比对得到的比对读序数以每个样品的总读序数和RNA序列的长度标准化得到的值,由以下的式子求出。
RPKM=C/NL
C:相对于一个RNA序列比对得到的读序的总数
N:相对于全部RNA序列比对得到的总读序数(million)
L:重叠群的序列长度(kbase)
(5)高表达启动子序列的鉴定
对所得到的RNA序列进行查询,将由Broad Institute获得的戴尔根霉(R.delemar)RA 99-880株的基因序列和由NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的基因序列作为数据库进行BLAST分析,由此,进行5557株基因组的标注。从得到的注释信息和上述(4)的转录量分析的结果,鉴定转录量高的基因组区域。
其结果表明,标注为adh1基因、cipC基因、和nmt1基因的5557株基因组区域的转录量特别高。在表1中,表示各基因的RPKM值和编码具有作为参考已知的启动子之中启动子活性最高的启动子的PDCA的基因(pdcA)的RPKM值。获得5557株基因组的adh1、cipC和nmt1的上游1000bp、729bp、和1000bp区域(分别为序列编号1~3)作为各基因的启动子序列。
[表1]
基因 RPKM值
adh1 10633.56
cipC 10462.90
nmt1 14265.42
pdcA(参考) 3766.45
实施例2转化体的制作
(1)色氨酸营养缺陷型株的制作
作为基因导入的宿主株使用的色氨酸营养缺陷型株从利用对5557株照射离子束得到的变异导入株中筛选得到。离子束照射在独立行政法人日本原子力研究开发机构·高崎量子应用研究所的离子照射设施(TIARA)中进行。照射使用AVF回旋加速器使12C5+加速,以220MeV的能量照射100~1250Gray。从照射后的菌体回收孢子,从其中得到在trpC基因区域具有缺少1个碱基的变异、显示色氨酸营养缺陷型的戴尔根霉(Rhizopus delemar)02T6株。
(2)质粒载体制作
(i)向pUC18导入trpC基因区域
以5557株的基因组DNA为模板,使用引物oJK162(序列编号4)和oJK163(序列编号5),用PCR合成trpC基因的DNA片段。接着,以质粒pUC18为模板,使用引物oJK164(序列编号6)和oJK165(序列编号7),用PCR扩增DNA片段。将以上的2片段使用In-Fusion HD CloningKit(Clontech)连接,构建质粒pUC18-trpC。
(ii)adh1启动子和终止子的克隆
以5557株的基因组DNA为模板,分别使用引物oJK202(序列编号8)和oJK204(序列编号9)、以及oJK205(序列编号10)和oJK216(序列编号11),用PCR扩增adh1的启动子片段和终止子片段。接着,以(i)中得到的质粒pUC18-trpC为模板,使用引物oJK210(序列编号12)和oJK211(序列编号13),用PCR扩增DNA片段。对以上的3片段用与(i)同样的步骤连接,构建质粒pUC18-trpC-Padh-Tadh。在得到的质粒中,在trpC基因区域的下游依次配置有adh1启动子和终止子。另外,在adh1终止子的下游配置有Not I限制性内切酶识别序列。
(iii)β葡糖苷酸酶基因(以下,记为GUS)的克隆
以pBI121(TaKaRa)为模板,使用引物oUT1(序列编号14)和oUT2(序列编号15),用PCR扩增β葡糖苷酸酶(以下、GUS)基因的DNA片段。接着,以(ii)中得到的质粒pUC18-trpC-Padh-Tadh为模板,使用引物oJK268-1(序列编号16)和oJK269-4(序列编号17)扩增DNA片段。将以上的2片段用与(i)同样的步骤连接,构建质粒载体pUC18-trpC-Padh-GUS-Tadh。在得到的质粒中,在adh1启动子和终止子之间插入有GUS基因。
(iv)cipC启动子的克隆
以5557株的基因组DNA为模板,使用引物oJK838(序列编号18)和oJK839(序列编号19),用PCR扩增cipC的启动子片段。接着,以实施例2(2)中制作的质粒载体pUC18-trpC-Padh-GUS-Tadh为模板,使用引物oJK842(序列编号20)和oJK843(序列编号21),用PCR扩增DNA片段。将以上的2片段用与(i)同样的步骤连接,构建质粒载体pUC18-trpC-PcipC-GUS-Tadh。在pUC18-trpC-PcipC-GUS-Tadh中,在cipC启动子和adh1终止子之间插入有GUS基因。
在表2表示质粒载体pUC18-trpC-Padh-GUS-Tadh和pUC18-trpC-PcipC-GUS-Tadh的制作中使用的PCR引物。
[表2]
Figure GDA0002812353770000181
(3)向宿主株导入基因
分别用Not I限制性内切酶处理上述(2)中制得的质粒载体pUC18-trpC-Padh-GUS-Tadh和pUC18-trpC-PcipC-GUS-Tadh。将所得到的各DNA溶液(1μg/μL)10μL计入金颗粒溶液(60mg/mL)100μL中并混合之后,添加0.1M亚精胺40μL,用涡旋振荡器(Vortex)充分搅拌。再添加2.5M CaCl2 100μL,用涡旋振荡器搅拌1分钟,接着以6000rpm离心30秒,除去上清。在所得到的沉淀中添加70%EtOH 200μL,用涡旋振荡器搅拌30秒后,以6000rpm离心30秒,除去上清。将所得到的沉淀用100μL的100%EtOH重悬。
接着,对上述(1)中制得的02T6株的孢子,使用上述的各DNA-金颗粒溶液,用GDS-80(NEPA GENE)进行基因导入。基因导入后的孢子在无机琼脂培养基(20g/L葡萄糖、1g/L硫酸铵、0.6g/L磷酸二氢钾、0.25g/L硫酸镁七水合物、0.09g/L硫酸锌七水合物、15g/L琼脂)上以30℃的条件静置培养一周左右。作为导入了在adh1启动子下游连接有GUS基因的DNA序列的Padh1-GUS株、和导入了在cipC启动子下游连接有GUS基因的DNA序列的PcipC-GUS株,分别获得生育的菌体。
实施例3Padh1-GUS株和PcipC-GUS株中的启动子活性的评价
将Padh1-GUS株或PcipC-GUS株的菌体2.5g-湿重量接种于液体培养基40mL(0.1g/L(NH4)2SO4、0.6g/L KH2PO4、0.25g/L MgSO4·7H2O、0.09g/L ZnSO4·7H2O、50g/L碳酸钙、100g/L葡萄糖),以35℃、170rpm培养8小时。从培养液中滤取菌体,用0.85%生理盐水100mL进行2次清洗。清洗后,利用吸滤除去多余的水分,量取0.3g,加入装有金属锥的管,直接投入液氮中,冻结10分钟以上。将加入有冻结的菌体的管用多珠振荡器以1700rpm处理10秒,将菌体破碎。在破碎后样品中添加提取缓冲液(50mM NaPi(pH7.2)、10mM EDTA、0.1%Triton-X-100、0.1%N-十二烷基肌氨酸钠、1mM DTT)1mL进行悬浊,将所得到的悬浊液900μL移至1.5mL管,以4℃、1500rpm离心10分钟。将上清500μL移至新的1.5mL管,再度以4℃、1500rpm离心10分钟。将所得到的上清100μL作为粗酶液使用。用Quick StartTM BradfordProtein Assay(Bio-Rad)测定所得到的粗酶液的蛋白质量。
β葡糖苷酸酶(GUS)是将4-甲基伞形酮D-葡糖苷酸分解,生成4-甲基伞形酮。基于4-甲基伞形酮的生成量,对粗酶液的GUS酶活性进行定量。对粗酶液10μL添加GUS活性测定用缓冲液(50mM NaPi(pH7.2)、10mM EDTA、0.1%Triton-X-100、0.1%N-月桂酰肌氨酸钠、1mM DTT、1.16mM 4-甲基伞形酮D-葡糖苷酸)90μL,在37℃孵育60分钟之后,添加900μL的0.2M Na2CO3,使反应停止。利用Infinite M1000PRO(TECAN)测定反应液的吸光度(激发:365nm、测定:455nm)。代替缓冲液中的4-甲基伞形酮D-葡糖苷酸,以同样的条件测定将4-甲基伞形酮用规定的稀释系列添加的溶液的吸光度,制作校正曲线。基于该校正曲线,求出反应液中的4-甲基伞形酮量,接着,由此求出反应每1分钟在粗酶液中生成的4-甲基伞形酮(nmol)量,将其作为1Unit。将1Unit除以粗酶液中的蛋白质量得到的值作为GUS活性值(Unit/mg-protein)而算出。测定以n=3进行。在表3中表示结果。在导入有adh1启动子-GUS基因构建物的Padh1-GUS株和PcipC-GUS株中确认到作为异种蛋白质的GUS的表达。
[表3]
Figure GDA0002812353770000201
实施例4与已知启动子的对比
(1)PpdcA-GUS株的制作
以5557株的基因组DNA为模板,使用表4所述的引物oJK855(序列编号22)和oJK856(序列编号23),用PCR扩增作为已知的启动子的pdcA启动子的片段,接着,以与实施例2(2)(iv)同样的步骤构建pUC18-trpC-PpdcA-GUS-Tadh。在pUC18-trpC-PpdcA-GUS-Tadh中,在pdcA启动子和adh1终止子之间插入有GUS基因。另外,在adh1终止子的下游配置有Not I限制性内切酶识别序列。
接着,通过与实施例2(3)同样的方法,得到导入了在pdcA启动子下游连接有GUS基因的DNA序列的PpdcA-GUS株。
[表4]
Figure GDA0002812353770000202
(2)启动子活性的比较
以与实施例3同样的步骤测定PpdcA-GUS株的GUS活性值。在表5表示所得到的PpdcA-GUS株的活性值、以及实施例3中测得的Padh1-GUS株和PcipC-GUS株的活性值。与PpdcA-GUS株相比,Padh1-GUS株和PcipC-GUS株具有显著高的GUS活性,其结果,adh1启动子和cipC启动子的活性显著高于已知的启动子之中启动子活性最高的pdcA启动子。另外,实施例1中测得的转录量(RPKM值、表1)与表5所示的GUS活性值相关,因此,暗示表1中显示最大的RPKM值的nmt1启动子的启动子活性高于adh1和cipC启动子。因此,adh1启动子、cipC启动子和nmt1启动子是能够使任意的基因更高地进行表达的启动子。
[表5]
Figure GDA0002812353770000211
实施例5米根霉(Rhizopus oryzae)由来adh1启动子的活性
(1)PRoadh1-GUS株的制作
制作作为导入了米根霉(Rhizopus oryzae)由来adh1启动子的转化体的戴尔根霉(Rhizopus delemar)PRoadh1-GUS株。
以米根霉(Rhisopus oryzae)NBRC5384株(以下、5384株)的基因组DNA为模板,使用表6所述的引物oJK1165(序列编号25)和oJK1166(序列编号26),用PCR扩增米根霉(Rhizopus oryzae)由来adh1(以下、Roadh1)启动子的片段(序列编号24),接着以与实施例2(2)(iv)同样的步骤构建质粒载体pUC18-trpC-PRoadh1-GUS-Tadh。在pUC18-trpC-PRoadh1-GUS-Tadh中,在Roadh1启动子和adh1终止子之间插入有GUS基因。另外,在adh1终止子的下游配置有Not I限制性内切酶识别序列。接着,将所得到的pUC18-trpC-PRoadh1-GUS-Tadh以与实施例2(3)同样的方法导入戴尔根霉(Rhizopus delemar)02T6株中,获得导入了在Roadh1启动子下游连接有GUS基因的DNA序列的转化体PRoadh1-GUS株。
[表6]
Figure GDA0002812353770000212
(2)PRoadh1-GUS株中Roadh1启动子活性的确认
以与实施例3同样的步骤培养PRoadh1-GUS株的菌体6.0g-湿重量,从培养物制备粗酶液,测定粗酶液的蛋白质量,接着,对粗酶液的GUS活性进行定量。在表7中表示结果。在导入了Roadh1启动子-GUS基因构建物的PRoadh1-GUS株中,确认到了作为异种蛋白质的GUS的表达。该结果表示,在转化体内,米根霉(Rhizopus oryzae)由来的adh1启动子具有启动子活性。
[表7]
Figure GDA0002812353770000221
序列表
<110> 花王株式会社
<120> 新型启动子
<130> KS1447
<150> JP 2015-155759
<151> 2015-08-06
<150> JP 2015-201180
<151> 2015-10-09
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1000
<212> DNA
<213> 戴尔根霉(Rhizopus delemar)
<400> 1
tagagggaaa aagagagaat tgaaatagga gaggatgagt caaaatatag tttacataaa 60
atttctcttt tttgtgttaa atataatcta atagcagggg ttttcttagt ttacgtttat 120
atcaaagtta tcaagcatac acttttttat gatttttcat actttaatcc cttttagtat 180
tctattgttt gaaaggagag aaaaaacagc tgagggtacg gtgcacacga gatcttacga 240
taattttcct gcccaacagg aaagaagtaa ttgatcttga ttgacgctcg gagtttgcac 300
gttcggagtt tgcacttcac attgagttat actcttactt attttgaagg aagggacgag 360
aaaagatgta aatataataa taacagtagt aaatagtatg cgcatcaaga acagctacca 420
acaaaagaga gaaatatgag cttaataatg aacaatgtaa atggcagaat gaaatttaat 480
tatcaaagcg gcatctttca gaccttccgt tacttccgat agagtttttt atgcaaagta 540
ataacaactg tatatataaa aaaaagaagg ttatcaagca aaagccacaa tgtcatatct 600
ggaataatca agagtaacta ttgaatgttg gtagccaaaa gaggcacgta attttatgac 660
gaaatatcac acaaaaagat tattttgaca attcatgaat aggacagaga tacaccctaa 720
acatgaaatg taagctatat ttaaacacct caagttaatt ttgaagcttc atttgtatta 780
ttgtaaccat ttagacaagc taaatccttt ttattattgt ccttattgat tttatccaga 840
ttaccgtatc taaagagcga tcaacagaaa aacggctgat tttagaccaa agtttcacaa 900
actacatttg catgaacgtc atatatatat aaaccttgac ttttcttttt tttttttttt 960
tttttttttc attatcaatt aatacaatta aataacaaaa 1000
<210> 2
<211> 729
<212> DNA
<213> 戴尔根霉(Rhizopus delemar)
<400> 2
ggttactgaa actggtgtag aaattttaac atagaagcaa taaaacttac attcttccct 60
ctctttacat ctacgcatgt ttgccaagaa taaaatgcct catttcgggt atatcttttt 120
tagataggag ttgtaacttg taatattaag caatgtaacg gacttgtata tttttaatca 180
aatacgtgtc gtgttttatt aaacgagcag aatcactttt ctatactgaa taaaagtaaa 240
aagaaccgaa tgcgttggta ataaattatt ttatcttttt tttttgtttt ttcacttgta 300
aaaaacctta aatgtttagg tttcatccgt tttcggctta gtaaaataag ctaaaagggc 360
ttgtggcgtt acacggctat taaactttac ataaagtaaa acatcatttg tccctttata 420
acaaaacgaa tgggaaaata accctccatc tttttaaaca aaatgagaaa ggtaacaata 480
acaaaaactg gaatgtgctt gggaaacttg aaaaaaagat aagcgcgtca ctcttgtttt 540
cttttttgtt tggttatgca taatattatt tgtacctcga aaaaaaatct tcggaatttg 600
tattttttat atatacggat gatagatgaa aaaaggaaaa agctgatggg gcgtatgtat 660
ttgtcaaaaa agctataaaa gagcacaagt tttcacattt cgtttttttt ttttcttcat 720
actctaacc 729
<210> 3
<211> 1000
<212> DNA
<213> 戴尔根霉(Rhizopus delemar)
<400> 3
gatcatcaca agtattacac aatgttaatt ttaattaaat gtttgtcact gcaataaaat 60
ttgttaatga acaatgcaca tataaaaaat aaagtacaaa agaacataga tcaacacttt 120
gtataaaact cggtagaccc tttccttttc tttttttttt tttttttcct ttttctcttt 180
ttctttttct ttttttgtgt atatgcttct tttacaaaag aaaagaaaaa ggattgtatg 240
ctaatcgaac gcgtaaaaaa aaaggataaa ttattcggta ttctcaataa gacaactttt 300
ttttatttta gtgaatcaat tgaatgatgt catttttact ttaagaaaaa tgagaaaaac 360
tattttcctt tctcttaaaa taagccaatg aagattaaca aagatactaa tcttgaggat 420
caaagaagat atgagtcaat tgggttcccg gtccttttta tacatacttt tatataaaat 480
attctaaaaa caatttataa tctgctttga ctacagaaca aacattcatt caattacaac 540
aagattcgct tttctctctt agaatcaagt tgttaagtaa ggatagctta cttttatgac 600
gaacctttgt tatctaaatt tttgatgact gtaccttctg agttaattat atttgagtta 660
tttattacga gtatctatct ttaacactct gagggcttta ttttctcttt ttatttatac 720
aatgtgaaat aatgtataca aaaaatcata caaaatacat atcacacgcg tgaacacaag 780
cgattactat atccttttgt gttgttgagc aaaatacaaa ttgtttatgc aaaaattcgt 840
tacactagat gccgattctc tccggtaaga gtttaagccc atctttcatc tacatctttt 900
ttttaaaaat ttttacgtac gcgtttcaat ataaaagaga gagaaataac aattgctttt 960
tcctaacttt atttttgtga taatttttta aaagcaaacc 1000
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 4
cgagctcgaa ttatttaaat gaacagcaag ttaataatct agaggg 46
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 5
tatgaccatg attacgatga gaggcaaaat gaagcgtac 39
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 6
atttaaataa ttcgagctcg gtacccgggg 30
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 7
cgtaatcatg gtcatagctg 20
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 8
tagagggaaa aagagagaat tgaaatagg 29
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 9
ttttgttatt taattgtatt aattgataat g 31
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 10
aattaaataa caaaatcatt ttaattacgc attttc 36
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 11
catgattacg cggccgcgcc attataatgc actagtg 37
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 12
ctctttttcc ctctaatgag aggcaaaatg aagcgtac 38
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 13
atttaaatgt aatcatggtc atagctgttt c 31
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 14
aattaaataa caaaaatgtt acgtcctgta gaaacccca 39
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 15
gcgtaattaa aatgatcatt gtttgcctcc ctgctgcgg 39
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 16
ttttgttatt taattgtatt aattgataat g 31
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 17
tcattttaat tacgcatttt catttactaa tttgttacat tttgataacg 50
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 18
cattttgcct ctcatggtta ctgaaactgg tgtag 35
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 19
ctacaggacg taacatggtt agagtatgaa gaaaaaaaaa aaacg 45
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 20
atgttacgtc ctgtagaaac cccaac 26
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 21
atgagaggca aaatgaagcg tac 23
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 22
cattttgcct ctcatgcaga cttcaacagt tggc 34
<210> 23
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 23
tacaggacgt aacatgtttt taaatttgtt ttgtagag 38
<210> 24
<211> 1000
<212> DNA
<213> 米根霉(Rhizopus oryzae)
<400> 24
attattatta gagggaaaaa aaagaaagag aattggttaa tgaaatagga gaggatgagt 60
caaaatataa tttacataaa atttctcttt ttgtattaaa tataatctaa tagcaggggt 120
tttcttagtt tacatttata acaaagttat caagtataca ctcttttatg gtttttcatg 180
ctttaatccc ttttagtatt ctattgtttg aaaggaaaga aaaaacagct gagggtacgg 240
tgcacacgag atcttacgat aattttcctg cccaacagga aaaaagtaat tgatcttgat 300
tgacactcgg agtttgtatt tgacatagag ttctattctt acttatttga aggaaggggc 360
gagaaagatg taaatataat aatagcagta gtgaatagta tgtatatcaa gaacaactat 420
catcaaaaga aacaaatatg agcttaataa tgaacaatgt aaatggcaga atgaaattta 480
attatcaaag cggcatcttt cagactttcc gttacttccg atagagtttt ttatgcaaag 540
taataacaac tgtatataaa aaaaaaagaa ggttatcaag caaaattcac aatgctatat 600
ctgaattaat caagagtaac tattgaatgt tggtatccaa aagaggcacg taattttatg 660
acgaaatatc acacaaaaag attattttga caattcataa ataggacaga gatacaccct 720
aaatatgaaa tgtaagctat atttaaacac cctgagttaa tcctgaagct tcatttgtat 780
tatcgtaagc atttagacaa gctgaatccc ttttattatt gtccgtattg attttattca 840
gattaccgta tctaaagagc gatcaacaga aaaacggctg attttagacc aaagtttcac 900
aaactacatt tgcatgaacg tcatatatat ataaaccttg acttttcatt ctttactttt 960
tttttttttc attatcaatt aatacaaata aataacaaaa 1000
<210> 25
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 25
cattttgcct ctcatattat tattagaggg aaaaaaaaga aagagaattg g 51
<210> 26
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 26
tacaggacgt aacatttttg ttatttattt gtattaattg ataatg 46

Claims (13)

1.一种启动子,其中,
所述启动子由选自下述(a)~(b)中的DNA构成:
(a)由序列编号1~3中任一项所示的碱基序列构成的DNA;
(b)由与序列编号1的碱基序列具有91%以上的同一性的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA。
2.一种表达载体,其中,
所述表达载体包含权利要求1所述的启动子。
3.如权利要求2所述的表达载体,其中,
所述启动子连接于编码与目的物质相关的酶的基因的上游,或者,所述启动子连接于编码与目的物质合成相关的酶的基因的上游。
4.如权利要求3所述的表达载体,其中,
所述目的物质为有机酸,并且所述基因为编码与有机酸合成相关的酶的基因。
5.一种DNA片段,其中,
所述DNA片段包含编码目的物质或与其合成相关的酶的基因和连接于该基因的上游的权利要求1所述的启动子。
6.如权利要求5所述的DNA片段,其中,
所述目的物质为有机酸,并且所述基因为编码与有机酸合成相关的酶的基因。
7.一种转化体,其中,
所述转化体含有权利要求2~4中任一项所述的表达载体或权利要求5或6所述的DNA片段。
8.如权利要求7所述的转化体,其中,
所述转化体为丝状菌。
9.如权利要求8所述的转化体,其中,
所述丝状菌为枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、云芝属、隐球菌属、线黑粉酵母属、镰刀菌属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、脉射菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、根霉属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属的丝状菌。
10.如权利要求9所述的转化体,其中,
所述丝状菌为根霉属菌。
11.一种目的物质的制造方法,其中,
所述目的物质的制造方法包括:
培养含有表达载体或DNA片段的转化体,其中,所述表达载体或DNA片段包含编码目的物质或与其合成相关的酶的基因和连接于该基因的上游的权利要求1所述的启动子;和
从通过该培养得到的培养物回收目的物质。
12.如权利要求11所述的制造方法,其中,
所述转化体为丝状菌。
13.如权利要求11或12所述的制造方法,其中,
所述目的物质为有机酸,并且所述基因为编码与有机酸合成相关的酶的基因。
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