CN102575253A - 经过修饰的启动子 - Google Patents

经过修饰的启动子 Download PDF

Info

Publication number
CN102575253A
CN102575253A CN2010800465672A CN201080046567A CN102575253A CN 102575253 A CN102575253 A CN 102575253A CN 2010800465672 A CN2010800465672 A CN 2010800465672A CN 201080046567 A CN201080046567 A CN 201080046567A CN 102575253 A CN102575253 A CN 102575253A
Authority
CN
China
Prior art keywords
promotor
nucleotide sequence
seq
sequence
modifying
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800465672A
Other languages
English (en)
Inventor
川原彰人
儿玉裕司
荒胜俊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kao Corp
Original Assignee
Kao Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kao Corp filed Critical Kao Corp
Publication of CN102575253A publication Critical patent/CN102575253A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Abstract

本发明提供经过修饰的启动子、各自含有该启动子的表达载体和转化体、以及使用该转化体制备目标基因产物的方法。本发明提供一种经过修饰的启动子，其包含来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子的核苷酸序列，其中至少一个选自如下的核苷酸序列被修饰：SEQ IDNO：1所表示的核苷酸序列；与SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列相当的核苷酸序列，只是其中一个或多个碱基被取代、缺失、添加或插入；以及相对于SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列具有70％或更高的序列一致性的核苷酸序列。

Description

经过修饰的启动子
技术领域
本发明涉及经过修饰的启动子、各自包含该启动子的表达载体和转化体、以及使用该转化体制备目标基因产物的方法。
背景技术
通过微生物的使用，已经在以工业规模生产很多有用物质，包括食品，例如酒精饮料、味增、和酱油(大豆来源)；以及其他物质，例如氨基酸、有机酸、与核酸相关的物质、抗生素、糖、脂质、和蛋白质。这些物质可用于宽范围的领域，例如食品、医药、诸如洗涤剂和化妆品的日用品、以及化学品的原材料。
在通过微生物的介导来工业生产有用物质时，产率的加强是一个重要议题。被用来加强产率的一个手段是通过例如突变的遗传技术来对产生目标物质的细菌进行育种。近年来，随着微生物遗传学和生物技术的发展，人们聚焦于更多基于重组技术等的有效方法，以用来生产有用物质。
已经对基因转录所需的启动子进行了大量研究。就枯草杆菌而言，来源于芽孢杆菌KSM-64菌株(FERM BP-2886)的碱性纤维素酶基因的启动子域(参见，例如非专利文献1)、来源于芽孢杆菌KSM-S237菌株(FERM BP-7875)的碱性纤维素酶基因上游所存在的启动子域(参见，例如专利文献1和非专利文献2)、以及其他启动子域被用作使编码外源蛋白质或多肽的基因活跃转录的启动子域。
然而，为在工业生产中减少生产成本，需要实现更高产率的启动子或微生物。
通常来说，启动子域具有多个与转录调控相关的位点。通过外部信号的介导，这些位点在促进或抑制基因表达中发挥作用。例如，当微生物的培养基包含大量例如葡萄糖的降解物时，微生物主要将该降解物作为碳源进行利用，且用于降解高分子糖的酶的表达被抑制。这种现象被称为“降解物阻遏”，其曾在大肠杆菌、芽孢杆菌等中被观察到。已知枯草杆菌中的降解物阻遏发生在转录水平。芽孢杆菌中涉及降解物阻遏的区域被称为“降解物应答元件(cre)”。
非专利文献3已经公开，可以通过在来源于枯草杆菌的α-淀粉酶基因的降解物阻遏操纵基因域上进行点突变来增加或减少降解物阻遏。同时，在来源于枯草杆菌的内切葡聚糖酶的启动子中，有一段与α-淀粉酶的降解物阻遏域相似的核苷酸序列，其被称为“降解物阻遏操纵基因类似序列”(非专利文献2)。然而，该序列的真正作用还没有被阐明。
[专利文献1]JP-A-2000-210081
[非专利文献1]Sumitomo et al.，Biosci.Biotech.Biochem.，59：2172-2175，1995
[非专利文献2]Hakamada et al.，Biosci.Biotech.Biochem.64：2281-2289，2000
[非专利文献3]Weickert & Chambliss，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，87：6238-6242，1990
发明内容
本发明涉及经过修饰的启动子，其包含来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子的核苷酸序列，其中至少一个选自如下的核苷酸序列被修饰：SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列；与SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列相当的核苷酸序列，只是其中一个或多个碱基被取代、缺失、添加或插入；以及相对于SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列具有70％或更高的序列一致性的核苷酸序列。
本发明也涉及用于制备经过修饰的启动子的方法，该方法包括在来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子中修饰至少一个选自如下的核苷酸序列：SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列；与SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列相当的核苷酸序列，只是其中一个或多个碱基被取代、缺失、添加或插入；以及相对于SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列具有70％或更高的序列一致性的核苷酸序列。
本发明也涉及上述经过修饰的启动子或通过上述方法制备的经过修饰的启动子，其中一个或多个碱基被进一步取代、缺失、添加或插入。
本发明也涉及表达载体，其包含上述经过修饰的启动子或通过上述方法制备的经过修饰的启动子。
本发明也涉及转化体，其包含上述经过修饰的启动子或通过上述方法制备的经过修饰的启动子。
本发明也涉及制备目标基因产物的方法，该方法包括采用转化体。
在一个实施方式中，包含相对于SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列具有70％或更高的序列一致性的核苷酸序列是SEQ ID NO：2所表示的核苷酸序列。
在另一个实施方式中，来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子是来自枯草杆菌或枯草杆菌突变菌株的启动子。
在另一个实施方式中，来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子是：来自芽孢杆菌KSM-64菌株(FERM BP-2886)中碱性纤维素酶基因的启动子；来自芽孢杆菌KSM-S237菌株(FERM BP-7875)中碱性纤维素酶基因的启动子；或含有相对于任意上述启动子的核苷酸序列具有70％或更高的序列一致性的核苷酸序列、并具有cre类似序列的启动子。
在另一个实施方式中，核苷酸序列的修饰是核苷酸序列中碱基的缺失、取代或添加。
在另一个实施方式中，经过修饰的启动子被可操作性地(operably)连接至编码目标基因产物的基因的上游。
附图说明
[图1]通过SOE-PCR法制备具有缺失的突变启动子的流程。
[图2]制备pDL2-S237质粒的流程。
[图3]本发明中转化体以及野生型的β-半乳糖苷酶活性。A：在含有葡萄糖的培养基中的活性。B：在含有麦芽糖的培养基中的活性。C：在含有山梨醇的培养基中的活性。D：在含有模型糖化液的培养基中的活性。
具体实施方式
本发明涉及提供加强基因转录的经过修饰的启动子、各自含有该启动子的表达载体和转化体、以及通过使用该转化体制备目标基因产物的方法。
本发明者已经在属于芽孢杆菌属微生物中的纤维素酶基因的启动子域上发现了多个与降解物阻遏序列相似的序列。本发明者也已经发现，当这些发现的序列被突变时，由该启动子调控的基因表达显著增加，且由该基因编码的基因产物的产率增加。
本发明的经过修饰的启动子显著增加了与启动子下游相连的基因的转录量。因此，根据本发明，可更加有效地获得目标基因产物。
在本发明中，氨基酸序列之间的序列一致性以及核苷酸序列之间的序列一致性都是通过Lipman-Pearson法(Science，227，1435(1985))确定的。具体而言，序列一致性是通过使用遗传信息处理软件Genetyx-Win(Software Development Co.，Ltd.)的同源性分析(同源性检索)程序来分析计算，其中参数ktup(Unit size to compare)设为2。
除非另外指出，用在本说明书中的枯草杆菌DNA的核苷酸序列和碱基号都是基于枯草杆菌转录因子检索网站(http://dbtbs.hgc.jp)。
本发明的经过修饰的启动子是通过修饰与降解物应答元件(下文中称为“cre类似序列”)相似的核苷酸序列而制备的，其中该降解物应答元件存在于编码启动子的多核苷酸上，该启动子来源于含有cre类似序列的属于芽孢杆菌属微生物的基因。cre类似序列的例子包括SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列；以及与SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列相当的核苷酸序列，只是其中一个或多个碱基被取代、缺失、添加或插入。cre类似序列的例子还包括相对于SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列具有70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高的序列一致性的核苷酸序列。再次，“多个”是指1～6个，优选为1～3个。
取代、缺失、添加或插入碱基的方法在例如Dieffenbach et al.(ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York，581-621，1995)中有过公开。通过采用该技术，一个或多个碱基可以被取代、缺失、添加、或插入。对于确认目标序列是否为cre类似序列，例如，可以通过以类似于下述实施例的方式，在将突变引入序列中时，观察目标基因在例如葡萄糖的降解物的存在下加强表达来进行。相对于SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列具有70％或更高序列一致性的核苷酸序列的例子包括SEQID NO：2所表示的核苷酸序列。SEQ ID NO：2所表示的核苷酸序列与SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列相当，只是其中三个碱基被取代。因此，SEQ ID NO：2所表示的核苷酸序列相对于SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列，具有76.9％的同源性。
对于来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子，而且本发明的经过修饰的启动子是由该启动子制备而得到的，即，该启动子是对应于本发明的经过修饰的启动子的亲本启动子，则没有特别的限制，只要该亲本启动子来源于属于芽孢杆菌属细菌且含有cre类似序列。优选该亲本启动子来源于枯草杆菌或枯草杆菌的突变菌株。优选的亲本启动子的例子包括来源于芽孢杆菌KSM-64菌株(FERM BP-2886)的碱性纤维素酶基因的启动子(SEQ ID NO：3中的1～609号碱基)、和来源于芽孢杆菌KSM-S237菌株(FERM BP-7875)的碱性纤维素酶基因的启动子(SEQ ID NO：4中的1～572号碱基)。SEQ ID NO：1和2所表示的核苷酸序列，分别对应于来自SEQ ID NO：3中1～609号碱基所表示的KSM-64菌株的碱性纤维素酶基因的启动子中的399～412号以及264～276号碱基的核苷酸序列，并且分别对应于来自SEQ ID NO：4中1～572号碱基所表示的KSM-S237菌株的碱性纤维素酶基因的启动子中的359～372号以及223～235号碱基的核苷酸序列。
本发明中亲本启动子的其他例子包括来源于属于芽孢杆菌属细菌且具有cre类似序列的启动子，其具有：与SEQ ID NO：3或4表示的碱性纤维素酶基因的启动子的核苷酸序列相当的核苷酸序列，只是其中一个或多个碱基被取代、缺失、添加或插入；或相对于SEQ ID NO：3或4所表示的碱性纤维素酶基因的启动子的核苷酸序列，具有70％或更高、优选为80％或更高、更优选为90％或更高、甚至更优选为95％或更高、更优选为98％或更高的序列一致性的核苷酸序列。对于启动子是否具有cre类似序列的证实，可以通过测序来确认cre类似序列在启动子的核苷酸序列中的存在；或者通过比较启动子的序列与SEQ IDNO：3或4所表示的碱性纤维素酶基因的启动子的序列来识别与cre类似序列对应的区域来进行。取代、缺失、添加或插入碱基的方法在例如Dieffenbach et al.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，581-621，1995)中公开。通过采用这个技术，一个或多个碱基可以被取代、缺失、添加或插入。对于鉴定启动子序列，例如通过以类似于下述实施例的方式，在引入LacZ基因时观察β-半乳糖苷酶的表达来进行。
在亲本启动子包含两种或更多种cre类似序列的情况下，至少一种存在于亲本启动子中的cre类似序列的核苷酸序列可以被修饰。换言之，一种、两种或更多种、或全部存在于亲本启动子中的cre类似序列可以被修饰。例如，当亲本启动子具有两种由SEQ ID NO：1和2表示的cre类似序列时，仅有由SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列或由SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列可以被修饰，或者由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2表示的两种核苷酸序列可以被修饰。优选由SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2表示的两种核苷酸序列均被修饰。
在一个实施方式中，本发明中经过修饰的启动子是通过修饰至少一种存在于来自枯草杆菌或枯草杆菌突变菌株的启动子中的cre类似序列而制备的。
在另一个实施方式中，本发明中经过修饰的启动子是通过在来源于KSM-64菌株(FERM BP-2886)的碱性纤维素酶基因的启动子(SEQID NO：3中1～609号碱基)中修饰由264～276号碱基表示的cre类似序列和由399～412号碱基表示的cre类似序列中的至少一种而制备的。优选地，由264～276号碱基表示的cre类似序列和由399～412号碱基表示的cre类似序列都被修饰。
在另一个实施方式中，本发明中经过修饰的启动子是通过在来源于KSM-S237菌株(FERM BP-7875)的碱性纤维素酶基因的启动子(SEQ ID NO：4中1～572号碱基)中修饰由223～235号碱基表示的cre类似序列和由359～372号碱基表示的cre类似序列中的至少一种而制备的。优选地，由223～235号碱基表示的cre类似序列和由359～372号碱基表示的cre类似序列都被修饰。
cre类似序列的核苷酸序列的修饰的例子包括核苷酸序列中部分或全部碱基的缺失、核苷酸序列中部分或全部碱基的取代、以及在核苷酸序列中任意位点上碱基的添加。用于本文中的术语“部分碱基”是指1个或更多个碱基，优选为3个或更多个碱基，更优选为6个或更多个碱基，甚至更优选为10个或更多个碱基。碱基的缺失、取代、或添加可以通过技术领域内常用的方法来进行，例如定点突变(site-directed mutagenesis)。定点突变可以通过Kunkel法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，82，488，1985)、PCR等来进行。
或者，本发明中经过修饰的启动子可以通过SOE(重叠延伸剪切)-PCR法(Gene，77，51，1989)来制备，其中在存在于启动子中的cre类似序列的核苷酸序列上，碱基被缺失、取代、或添加。
根据SOE-PCR法，在下游端含有核苷酸序列修饰位点的上游DNA片段、以及在上游端具有核苷酸序列修饰位点的下游DNA片段都通过第一PCR来制备。在制备出cre类似序列缺失的片段的情况下，设计引物，从而使得上游DNA片段的下游侧以及下游DNA片段的上游侧相互地退火，并得到cre类似序列缺失的核苷酸序列(图1)。
接下来，通过使用由第一PCR制备的两个DNA片段作为模板、上游DNA片段的上游引物、和DNA片段的下游引物来进行第二PCR。结果，在上游DNA片段的下游端与下游DNA片段的上游端之间发生退火，从而两个DNA片段互相连接。因此，制备出含有cre类似序列缺失的启动子序列的DNA片段(图1)。在这种情况下，当PCR中采用的引物被设计成具有限制性内切酶识别序列(restriction sequence)时，制备出在末端包含限制性内切酶识别序列的启动子DNA片段，并通过限制性内切酶法引入到载体中。
相似地，当设计出引物从而使得上游DNA片段的下游侧和下游DNA片段的上游侧相互退火并制备出包含至少一个碱基被取代或添加的cre类似序列的核苷酸序列时，可以制备出包含至少一个cre类似序列的碱基已经被取代或添加的启动子序列的DNA片段。
在本发明的经过修饰的启动子中，一个或多个碱基可以被进一步取代、缺失、添加或插入，只要能保持启动子的功能和增强目标基因表达的效果。取代、缺失、添加、或插入碱基的方法在例如Dieffenbachet al.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，581-621，1995)中公开。通过采用这个技术，一个或多个碱基可以被取代、缺失、添加或插入。对于确认进一步被修饰的修饰启动子是否具有启动子功能且表现出加强目标基因表达的作用，例如，可以通过以类似于下述实施例的方式在例如葡萄糖的降解物的存在下观察加强目标基因表达的效果。
通过将本发明的由此制备的经过修饰的启动子引入至合适的载体中，可以制备本发明的表达载体。对于引入经过修饰的启动子的载体没有具体的限制，且优选例如pDL2和pMUTIN的载体。将经过修饰的启动子引入至载体中可以根据任何本领域常用的方法进行。例如，通过限制性内切酶的方式切割载体，并结合在末端含有上述限制性内切酶识别序列的启动子，从而将启动子引入到载体中(限制性内切酶法)。
在本发明的表达载体中，本发明中经过修饰的启动子被可操作性地连接至编码目标基因产物的基因的上游。目标基因产物的例子包括蛋白质、多肽和非编码RNA。对于蛋白质和多肽的种类没有具体限制，且蛋白质或多肽包括用于例如洗涤剂、食品、纤维、饲料、化学品、医疗、和诊断的工业用酶；以及生理活性肽。工业用酶的例子包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、和连接酶/合成酶。优选例如纤维素酶、α-淀粉酶和蛋白酶的水解酶基因。水解酶的具体例子包括由多糖水解酶分类所定义的属于第5族的纤维素酶(Biochem.J.，280，309，1991)。其中，优选来源于微生物，例如属于芽孢杆菌属的微生物的纤维素酶。更具体的例子包括：来源于芽孢杆菌KSM-64菌株(FERM BP-2886)的由SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列构成的碱性纤维素酶；来源于芽孢杆菌KSM-S237菌株(FERM BP-7875)的由SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列构成的碱性纤维素酶；和相对于由SEQ ID NO：3或4表示的氨基酸序列，具有70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高、更优选98％或更高的序列一致性的氨基酸序列构成的纤维素酶。
α-淀粉酶的具体例子包括来源于微生物的α-淀粉酶。优选来源于属于芽孢杆菌属微生物的液化α-淀粉酶。更具体的例子包括：来源于芽孢杆菌KSM-K38菌株(FERM BP-6946)的由SEQ ID NO：5表示的氨基酸序列构成的碱性淀粉酶；和相对于由SEQ ID NO：5表示的氨基酸序列，具有70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高、更优选98％或更高的序列一致性的氨基酸序列构成的淀粉酶。蛋白酶的具体例子包括来源于属于例如芽孢杆菌属微生物等微生物的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。
优选地，上述蛋白质基因或多肽基因被可操作性地连接到本发明经过修饰的启动子区域以及分泌信号肽区域。例如，目标蛋白质或多肽的结构基因可以被可操作性地连接到来源于KSM-64菌株(FERMBP-2886)或KSM-S237菌株(FERM BP-7875)的纤维素酶基因中的分泌信号肽区域。更加具体地，目标蛋白质或多肽的结构基因可以可操作性地连接至由SEQ ID NO：3的610～696号碱基表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO：4的573～659号碱基表示的核苷酸序列；相对于任意上述核苷酸序列，具有70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高、更优选98％或更高的序列一致性的核苷酸序列构成的DNA片段；或与任意核苷酸序列相当的DNA片段，只是部分碱基缺失。
非编码RNA是指在相应DNA的转录之后不翻译为蛋白质的RNA。非编码RNA的例子包括含有调控序列的非翻译区域、tRNA、rRNA、mRNA型ncRNA(mRNA类似非编码RNA)、snRNA(核内小RNA)、snoRNA(核内小RNA)、miRNA(微小RNA)、stRNA(时序小RNA)、和siRNA(短干扰RNA)。这些非编码RNA涉及多个生物活性的机制，例如细胞表达、发育、分化和其他的调控，且可以在研究、医疗护理、诊断、药物开发、农业(例如饲养或杀虫剂生产)、渔业、畜牧业、和化学制备中加以利用。
本发明中经过修饰的启动子和编码目标基因产物或分泌信号肽区域的基因可以在将其引入载体前进行连接。或者，可以将本发明中经过修饰的启动子引入至已经含有编码目标基因产物的基因的载体或者还另外含有分泌信号肽区域的载体中。
本文中使用的在启动子和基因之间；或启动子、基因和分泌信号之间的术语“可操作性地连接”，是指启动子可以诱发基因的转录的连接、或者是通过分泌信号来分泌基因所编码的蛋白质的连接。启动子和基因之间；或启动子、基因和分泌信号之间的“可操作性地连接”的过程是本领域技术人员所知的。
通过将本发明所制备的表达载体通过普通转化方法引入至宿主微生物中，得到本发明的转化体。或者，本发明的转化体也可以制备如下：构建DNA片段，其中，与宿主微生物的基因组同源的合适区域、与以下片段相结合，该片段是通过使本发明中经过修饰的启动子与编码目标基因产物的基因、以及任选地分泌信号肽区域连接而制备的；并通过同源重组，直接将该DNA片段引入至宿主微生物的基因组。
也可以使用普通重组技术，通过将本发明的表达载体引入至宿主微生物中来提供本发明的转化体。
目标基因产物可以使用本发明的转化体并通过以下过程而制备：将转化菌株接种到含有可同化碳源、氮源、和其他必要成分的培养基中；通过普通培养方法培养转化体；以及接下来收集或纯化目标基因产物。如下文中实施例所述，与cre类似序列未被修饰的微生物相比，本发明的转化体表现出更高的目标基因产物的产率。
实施例
本发明将通过实施例的方式做更加具体的描述。
实施例1：制备来源于碱性纤维素酶基因的经过修饰的启动子
通过PCR制备来源于KSM-S237纤维素酶的启动子DNA片段(Hakamada et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.64，2281-2289，2000)。将已经被引入至大肠杆菌-枯草杆菌用的穿梭载体pHY300PLK中且为来源于芽孢杆菌KSM-S237碱性纤维素酶基因DNA(SEQ ID NO：4的1～572号碱基)中的启动子区域的片段用作模板。将表1所示的EcoRI_PS237FW(SEQ ID NO：6)和BamHI_PS237RV(SEQ ID NO：7)用作引物。使用上述模板和引物，通过PCR来制备上游侧具有EcoRI识别位点且下游侧具有BamHI识别位点的启动子DNA片段。之后，为制备启动子DNA片段中目标序列被缺失的突变启动子DNA片段，使用通过上述PCR制备的片段作为模板、以及各自在表1所示的Δcre1FW(SEQ ID NO：8)和BamHI_PS237RV的引物组或者EcoRI_PS237FW和Δcre1RV(SEQ ID NO：9)的引物组来进行PCR，从而制备出分别在上游侧和下游侧含有目标序列缺失的区域的片段。将这样得到的两个片段相结合来用作混合模板。使用混合模板和EcoRI_PS237FW引物以及BamHI_PS237RV引物来进行PCR，以制备在SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列中223～235碱基残基被缺失的启动子序列DNA片段(Δcre1)(图1)。以相似的方式，通过使用Δcre2FW(SEQ ID NO：10)来替代Δcre1FW，并用Δcre2RV(SEQ ID NO：11)来替代Δcre1RV以制备在SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列中359～372碱基残基被缺失的启动子域序列DNA片段(Δcre2)。进而，使用Δcre1作为模板、以及Δcre2FW和BamHI_PS237RV引物组或EcoRI_PS237FW和Δcre2RV引物组来进行PCR。使用由此得到的这两个片段作为混合模板，使用EcoRI_PS237FW和BamHI_PS237RV引物来进行PCR，从而制备出在SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列中223～235以及359～372碱基残基被缺失的启动子序列DNA片段(Δcre1.2)。
为扩增DNA片段，通过GeneAmp PCR系统(Applied Biosystems的产品)的方式以及Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio的产品)和其附带试剂的使用来进行PCR。制备PCR液(50μL)，以便将适当稀释模板DNA片段(1μL)、正义链引物和反义链引物中的每一个(每个10pmol)、和Pyrobest DNA聚合酶(2.5U)进行组合。PCR包括30个循环的3步热处理(98℃，10sec；55℃，30sec；和72℃，1～5min(约1min/kb，根据目标产物调节))，并在72℃反应5min。
[表1]
  引物   核苷酸序列5′→3′  SEQ ID NO：
  EcoRI_PS237FW   AAAGAATTCGCTTATATTTAGAGGAAATTTC   6
  BamHI_PS237RV   TTTGGATCCATTACCTCCTAAATATTTTTAAAG   7
  Δcre1FW   GAAAATACTGTTTACTATAAAACCTTATATTC   8
  Δcre1RV   GAATATAAGGTTTTATAGTAAACAGTATTTTC   9
  Δcre2FW   CTTTTTTTACGATATACCTTGTGCTATATG   10
  Δcre2RV   CATATAGCACAAGGTATATCGTAAAAAAAG   11
实施例2：制备表达载体
将实施例1中制备的每一启动子序列DNA片段通过限制性内切酶EcoRI和BamHI进行切割，并连接到已经用EcoRI和BamHI切割出来的pDL2质粒(Fukuchi et al.，Microbiology，146，1573-1583，2000)上。使用这样得到的质粒通过常规方法转化至大肠杆菌细胞，并从得到的转化细胞中回收该质粒(参见图2)。通过3100DNA测序仪(AppliedBiosystems)对插入至所得质粒中的启动子进行测序。回收含有每一种在实施例1中制备的启动子序列DNA片段的质粒以作为表达载体。
实施例3：制备转化体
用限制性内切酶ScaI切割实施例2中制备的表达载体，以形成片段，并通过适当的转化方法引入到枯草杆菌168菌株细胞中。将由此得到的细胞在含有氨苄西林(1μg/mL)的LB琼脂培养基中进行培养。从成熟菌落中回收转化体，在该转化体中，启动子区域和LacZ基因被引入至amyE基因中。
实施例4：确定β-半乳糖苷酶的活性
将每一种在实施例3得到的转化体在含有多种碳源的培养基中培养。通过将β-半乳糖苷酶作为指标来评测每一启动子的转录效果。作为碳源，使用葡萄糖、麦芽糖、山梨醇、或模型糖化液(模仿来源于生物质碳源的碳水化合物溶液：4％葡萄糖、0.5％木糖、和0.5％纤维二糖)。每一转化体于30℃在LB培养基(1mL)中培养12小时，且将得到的培养液接种到碳源最终浓度为0.5％的LB培养基(1mL)中，从而将最终细胞浓度调整到1％。细胞于37℃培养8小时，并测定OD(600)。将OD(600)为1的培养液进行离心，以回收细胞。将细胞再悬浮于25mM Tris-HCl(pH：7.4)(0.5mL)来完全除去培养基，并通过离心再次收集细胞。将这样得到的细胞悬浮于Z缓冲液(60mMNa2HPO4、40mM NaH2PO4、10mM KCl、1mM MgSO4/7H2O、和2mMDTT)(0.64mL)，并将溶于Z缓冲液的2.5mg/mL裂解酶溶液(0.16mL)加入到悬浮液中。将混合物于37℃孵育5分钟以除去细胞壁，从而制备出原生质体细胞。将10％的Triton-X100(8μL)加入到原生质体细胞中，并将如此得到的混合物用作裂解细胞溶液。通过相似的步骤从结合有LacZ的野生型菌株中制备作为对照的裂解细胞溶液。
通过ONPG法确定每一得到的裂解细胞溶液的β-半乳糖苷酶活性。具体而言，将裂解细胞溶液首先于30℃孵育3分钟，并向其中加入溶于Z缓冲液的4mg/mL ONPG溶液(0.2mL)。从开始加入ONPG溶液(0sec)时开始，当溶液因为β-半乳糖苷酶活性变黄，通过对溶液加入1M的Na2CO3(0.4mL)来终止反应。通过离心除去不溶的部分，并测定每一反应混合物的OD(420)，以及通过以下等式计算β-半乳糖苷酶活性：
β-半乳糖苷酶活性(单位)
＝1000×OD(420)/反应时间(min)
结果显示在表2和图3A～3D中。在含有葡萄糖的培养基中进行培养时，含有Δcre1启动子的转化体表现出约为野生型细胞1.9倍的β-半乳糖苷酶活性，含有Δcre2启动子的转化体表现出约为野生型细胞6.2倍的β-半乳糖苷酶活性。含有Δcre1.2启动子(其中Δcre1和Δcre2都缺失)的转化体表现出约为野生型细胞7.8倍的β-半乳糖苷酶活性，而这是最高的转录效率。
在使用麦芽糖或山梨醇作为碳源进行的相同实验中，与野生型细胞相比，每一启动子在相应转化体中的转录效率显著增强。在使用含有碳源的培养基的实验中，其中碳源模仿例如植物等生物质的碳水化合物溶液(模型糖化液)，也观察到显著增强的转录效率。
[表2]
Figure BDA0000153591870000131
Figure IDA0000153591960000011
Figure IDA0000153591960000031
Figure IDA0000153591960000051
Figure IDA0000153591960000061
Figure IDA0000153591960000071
Figure IDA0000153591960000081
Figure IDA0000153591960000091
Figure IDA0000153591960000101
Figure IDA0000153591960000111
Figure IDA0000153591960000121
Figure IDA0000153591960000131
Figure IDA0000153591960000141
Figure IDA0000153591960000151

Claims (15)

1.一种经过修饰的启动子，其包含来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子的核苷酸序列，其中至少一个选自如下的核苷酸序列被修饰：
SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列；与SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列相当的核苷酸序列，只是其中一个或多个碱基被取代、缺失、添加或插入；以及相对于SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列具有70％或更高的序列一致性的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的经过修饰的启动子，其中，
所述相对于SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列具有70％或更高的序列一致性的核苷酸序列是SEQ ID NO：2所表示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的经过修饰的启动子，其中，
所述来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子是来自枯草杆菌或枯草杆菌的突变菌株的启动子。
4.根据权利要求3所述的经过修饰的启动子，其中，
所述来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子是：来自芽孢杆菌KSM-64菌株(FERM BP-2886)中碱性纤维素酶基因的启动子；来自芽孢杆菌KSM-S237菌株(FERM BP-7875)中碱性纤维素酶基因的启动子；或含有相对于任意所述启动子的核苷酸序列具有70％或更高序列一致性的核苷酸序列、并具有cre类似序列的启动子。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的经过修饰的启动子，其中，
所述核苷酸序列的修饰是在所述核苷酸序列中碱基的缺失、取代、或添加。
6.一种用于制备经过修饰的启动子的方法，其包括：
在来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子中修饰至少一个选自如下的核苷酸序列：
SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列；与SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列相当的核苷酸序列，只是其中一个或多个碱基被取代、缺失、添加或插入；以及相对于SEQ ID NO：1所表示的第一核苷酸序列具有70％或更高的序列一致性的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，
所述相对于SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列具有70％或更高的序列一致性的核苷酸序列是SEQ ID NO：2所表示的核苷酸序列。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，
所述来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子是来自枯草杆菌或枯草杆菌突变菌株的启动子。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，
所述来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子是：来自芽孢杆菌KSM-64菌株(FERM BP-2886)中碱性纤维素酶基因的启动子；来自芽孢杆菌KSM-S237菌株(FERM BP-7875)中碱性纤维素酶基因的启动子；或含有相对于任意所述启动子的核苷酸序列具有70％或更高序列一致性的核苷酸序列、并具有cre类似序列的启动子。
10.根据权利要求6～9中任一项所述的方法，其中，
所述核苷酸序列的修饰是所述核苷酸序列中碱基的缺失、取代或添加。
11.根据权利要求1～5中任一项所述的经过修饰的启动子、或通过权利要求6～10中任一项所述的方法而制备的经过修饰的启动子，其中，
所述经过修饰的启动子中的一个或多个碱基被进一步取代、缺失、添加或插入。
12.一种表达载体，其包含权利要求1～5和11中任一项所述的经过修饰的启动子、或通过权利要求6～10中任一项所述的方法而制备的经过修饰的启动子。
13.根据权利要求12所述的表达载体，其中，
所述经过修饰的启动子被可操作性地连接到编码目标基因产物的基因的上游。
14.一种转化体，其包含权利要求1～5和11中任一项所述的经过修饰的启动子或通过权利要求6～10中任一项所述的方法而制备的经过修饰的启动子，其中，
所述经过修饰的启动子被可操作性地连接到编码目标基因产物的基因的上游。
15.一种用于制备目标基因产物的方法，所述方法包括采用权利要求14所述的转化体。
CN2010800465672A 2009-10-21 2010-10-18 经过修饰的启动子 Pending CN102575253A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009242178 2009-10-21
JP2009-242178 2009-10-21
JP2010224065A JP5735775B2 (ja) 2009-10-21 2010-10-01 改変プロモーター
JP2010-224065 2010-10-01
PCT/JP2010/068783 WO2011049227A1 (en) 2009-10-21 2010-10-18 Modified promoter

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102575253A true CN102575253A (zh) 2012-07-11

Family

ID=43589658

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800465672A Pending CN102575253A (zh) 2009-10-21 2010-10-18 经过修饰的启动子

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9029519B2 (zh)
EP (1) EP2451954B1 (zh)
JP (1) JP5735775B2 (zh)
CN (1) CN102575253A (zh)
AU (1) AU2010308865B2 (zh)
BR (1) BR112012005263A2 (zh)
DK (1) DK2451954T3 (zh)
WO (1) WO2011049227A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107142259A (zh) * 2017-05-25 2017-09-08 中国科学院上海高等研究院 一种表达外源基因的启动子及其应用
CN107532148A (zh) * 2015-02-18 2018-01-02 衣阿华州立大学研究基金公司 修饰nf‑yc4启动子的转录抑制子结合位点以增加蛋白质含量和抗应力
CN107849557A (zh) * 2015-08-06 2018-03-27 花王株式会社 新型启动子

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7218090B2 (ja) 2018-01-12 2023-02-06 花王株式会社 タンパク質の製造方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1930291A (zh) * 2004-03-05 2007-03-14 花王株式会社 经过修饰的启动子
WO2009119876A1 (en) * 2008-03-25 2009-10-01 Kao Corporation Plasmid vector

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000078981A (ja) 1998-07-08 2000-03-21 Kao Corp Ｄｎａ断片
WO2001079507A2 (en) * 2000-04-13 2001-10-25 Mark Aaron Emalfarb EXPRESSION-REGULATING SEQUENCES AND EXPRESSION PRODUCTS IN THE FIELD OF FILAMENTOUS FUNGI $i(CHRYSOSPORIUM)
JP2000210081A (ja) 1999-01-21 2000-08-02 Kao Corp 耐熱性アルカリセルラ―ゼ遺伝子
JP4426716B2 (ja) * 2000-10-11 2010-03-03 花王株式会社 高生産性α−アミラーゼ

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1930291A (zh) * 2004-03-05 2007-03-14 花王株式会社 经过修饰的启动子
WO2009119876A1 (en) * 2008-03-25 2009-10-01 Kao Corporation Plasmid vector

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Journal of Bacteriology》 19980930 GWO-CHYUAN SHAW et al. Cloning, expression, and catabolite repression of a gene encoding beta-galactosidase of Bacillus megaterium ATCC 14581 4734-4738 1-11 第180卷, 第17期 *
GWO-CHYUAN SHAW ET AL.: "Cloning, expression, and catabolite repression of a gene encoding β-galactosidase of Bacillus megaterium ATCC 14581", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 *
HAKAMADA ET AL.: "Deduced amino acid sequence and possible catalytic residues of a thermostable, alkaline cellulase from an Alkaliphilic bacillus strain", 《BIOSCI.BIOTECH.BIOCHEM.》 *
YASUHIKO MIWA ET AL.: "Evaluation and characterization of catabolite-responsive elements (cre) of Bacillus subtilis", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107532148A (zh) * 2015-02-18 2018-01-02 衣阿华州立大学研究基金公司 修饰nf‑yc4启动子的转录抑制子结合位点以增加蛋白质含量和抗应力
CN107532148B (zh) * 2015-02-18 2022-06-24 衣阿华州立大学研究基金公司 修饰nf-yc4启动子的转录抑制子结合位点以增加蛋白质含量和抗应力
US11542520B2 (en) 2015-02-18 2023-01-03 Iowa State University Research Foundation, Inc. Modification of transcriptional repressor binding site in NF-YC4 promoter for increased protein content and resistance to stress
CN107849557A (zh) * 2015-08-06 2018-03-27 花王株式会社 新型启动子
CN107849557B (zh) * 2015-08-06 2021-11-05 花王株式会社 新型启动子
CN107142259A (zh) * 2017-05-25 2017-09-08 中国科学院上海高等研究院 一种表达外源基因的启动子及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2451954B1 (en) 2018-08-08
JP2011103875A (ja) 2011-06-02
US20120183998A1 (en) 2012-07-19
JP5735775B2 (ja) 2015-06-17
BR112012005263A2 (pt) 2020-11-03
US9029519B2 (en) 2015-05-12
WO2011049227A1 (en) 2011-04-28
AU2010308865B2 (en) 2014-08-21
AU2010308865A1 (en) 2012-05-17
EP2451954A1 (en) 2012-05-16
DK2451954T3 (en) 2018-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6937740B2 (ja) ゲノム編集システムおよび使用方法
JP4922524B2 (ja) 糸状菌の分野における新規発現調節配列および発現産物
CA2755417C (en) New fungal production system
CN107250365A (zh) 增强的蛋白质表达
CN100519753C (zh) 重组微生物
EP4092128A1 (en) Factor regulating protein expression efficiency of trichoderma reesei, and regulation method and use thereof
CN102575253A (zh) 经过修饰的启动子
WO2011161063A1 (en) Leaa from trichoderma reesei
US20230174998A1 (en) Compositions and methods for enhanced protein production in filamentous fungal cells
CN110878293B (zh) 缺失yceD基因的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用
CN1875095B (zh) 重组微生物
CN113943662A (zh) 一株异源表达木聚糖酶/纤维素酶CbXyn10c基因的里氏木霉菌株及应用
KR20220097505A (ko) 바실러스 세포에서 단백질 생산을 향상시키기 위한 조성물 및 방법
CN108251447B (zh) 一种能高效表达脂肪酶的质粒、其构建方法及其应用
CN106916814A (zh) 受柠檬酸钠诱导的启动子
CN103060341B (zh) 源于里氏木霉的转录调控因子及编码基因和应用
RU2796447C1 (ru) Штамм Komagataella phaffii T07/pPZL-4x-OA-xyl-AsOr, обладающий способностью продуцировать ксиланазу из грибов вида Aspergillus oryzae
CN106636176A (zh) 一种生产低聚木糖和抗菌肽的益生饲用酿酒酵母
KR100543470B1 (ko) 사이클로덱스트리나아제를 발현하는 재조합 바실러스 균주및 그 제조방법
Karimiabar et al. Molecular Cloning, Expression, and Enzyme Activity of Glucose Oxidase Gene from Soil Thermophilic Streptomyces
CN112654704A (zh) 包含蛋白质生产率提高表型的突变和遗传修饰的丝状真菌菌株及其方法
JP2016187319A (ja) 転写因子変異株
JP5901964B2 (ja) 組換え微生物
KR100411238B1 (ko) 외래 단백질을 안정하게 발현하는 바실러스 속 미생물
CN116445378A (zh) 一种高产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌重组菌株及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20120711