CN1875095B

CN1875095B - 重组微生物

Info

Publication number: CN1875095B
Application number: CN2004800316920A
Authority: CN
Inventors: 东畑正敏; 泽田和久; 尾崎克也; 关口顺一
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2003-11-07
Filing date: 2004-11-05
Publication date: 2011-04-06
Anticipated expiration: 2024-11-05
Also published as: WO2005045045A3; EP1680502B1; US7563611B2; CN1875095A; EP1680502A2; WO2005045045A2; DE602004031354D1; DK1680502T3; US20080081352A1

Abstract

本发明提供一种通过将编码蛋白质或多肽的基因转移到能够以提高的生产率生产蛋白质或多肽并且由本发明人鉴别的宿主微生物上而获得的重组微生物，以及使用该重组微生物生产蛋白质或多肽的方法。该重组微生物通过将编码异性蛋白质或多肽的基因转移到至少一种参与麦芽糖的膜渗透的基因缺失或被剔除的微生物的突变株上而制备。

Description

重组微生物

技术领域

本发明涉及可用于生产有用蛋白质或多肽的重组微生物，以及涉及该蛋白质和多肽。

背景技术

微生物广泛用于工业生产大量有用物质，包括酒精饮料、例如味噌和酱油之类的某些类型的食品、氨基酸、有机酸、核酸相关物质、抗生素、糖、脂质和蛋白质。这些物质还发现具有多种用途，包括食品、医药品、洗涤剂、例如化妆品之类的日用品和各种化工原料。

在利用微生物工业生产有用物质时，生产率的提高是一个主要关注点，因此一种方法是通过诱变或其它基因手段进行微生物育种。最近，特别是随着微生物遗传学和生物技术的进步，通过基因重组技术进行更有效的有用微生物育种，并与其相关地是正在开发用于获得重组基因的宿主微生物。例如，已经进一步改进了枯草杆菌Marburg No.168，其作为宿主微生物已经被证实是安全且具有优异特性的。

然而，微生物本身拥有各种基因使其能够应对自然界中的环境变化，因此，它们在只采用有限的生产媒介的工业生产中不一定表现出蛋白质和类似物质的高生产效率。

发明内容

本发明提供一种重组微生物，其通过将编码异性蛋白质或多肽的基因转移到至少一种参与麦芽糖的膜渗透的基因(特别是glvR或glvC)或一个或多个与该基因功能相当的基因缺失或被剔除的微生物的突变株上而制备。

附图说明

图1示意性地显示了通过SOE-PCR(SOE：重叠延伸拼接法)(参见Gene，77，61(1989))缺失基因以制备DNA片段的方法，和使用该DNA缺失目标基因的方法(用抗药性基因取代目标基因)。

具体实施方式

本发明针对一种通过将编码蛋白质或多肽的基因转移到能够以提高的生产率生产蛋白质或多肽并且由本发明人鉴别的宿主微生物上而获得的重组微生物，以及针对使用该重组微生物生产蛋白质或多肽的方法。

本发明人在微生物基因组上编码的许多不同基因中对有用蛋白质或多肽的生产中不需要或有害的基因进行了广泛的研究，并意外地发现，当参与用作培养基的主要碳源的麦芽糖的膜渗透的特异性基因或与该基因功能相当的基因从微生物的基因组中缺失或剔除之后，编码目标蛋白质或多肽的基因转移到微生物上，与缺失或剔除之前的情况相比，目标蛋白质或多肽的生产率提高。

使用本发明的重组微生物，可以以高效率大规模地生产目标蛋白质或多肽。

在本发明中，氨基酸序列之间的同源性和核酸序列之间的同源性都使用Lipman-Pearson法(Science，227，1435(1985))测定。具体而言，将ktup参数(相匹配的单元大小)设定为2，使用Genetyx-Win(Software Development Co.，Ltd.)的遗传信息处理软件开发的同源性分析程序(Search Homology)进行计算。

对构成本发明的微生物的母体微生物没有特别的限制，只要其含有参与麦芽糖膜渗透的基因。具体而言，可以使用如表1所示的任何枯草杆菌基因或与其功能相当的基因。当使用含有麦芽糖或麦芽低聚糖作为主要碳源的培养基进行培养时，该微生物优选为另一种具有不同麦芽糖渗透体系的上述基因不参与其中的类型。基因可以是野生型或突变体。具体例子包括枯草杆菌和属于芽孢杆菌属的类似微生物、属于梭状芽孢杆菌属的微生物和酵母。其中，优选属于芽孢杆菌属的微生物。特别是从已经获得该微生物的完全基因组信息、并由此确立了基因工程技术和基因组工程技术、并且该微生物具有细胞外分泌所得蛋白质的能力的角度考虑，优选枯草杆菌。

使用本发明的微生物生产的目标蛋白质或多肽的例子包括酶、生理活性物质，和其它发现在食品、医药品、化妆品、洗涤剂、纤维处理剂、临床化验剂等有用的蛋白质和多肽。

在本发明中，要缺失或剔除的基因是那些参与麦芽糖的膜渗透的基因。这些基因是表1所示的任一枯草杆菌基因，或者选自与其功能相当的基因。

此处所含表中的各个基因的名称、数量和功能与Nature，390，249-256(1997)中报道并由JAFAN(Japan Functional Analysis Networkfor Bacillus subtilis；BSORF DB)在互联网上公开(http://bacillus.genome.ad.jp/，2003年6月17日更新)的枯草杆菌基因组数据相符。

表1

基因名称	基因编号	该基因的功能或其它信息
			glvC	BG11848	PTS麦芽糖-特异酶IICB
glvR	BG11847	GlvARC操纵子的正调节因子

来源于其它微生物的基因，优选来源于属于芽孢杆菌属的细菌的基因，其具有与表1所示的任一枯草杆菌相同的功能，或具有与表1所示任一基因的核苷酸序列70％或更高的同源性，优选80％或更高的同源性，更优选90％或更高，进一步优选95％或更高，仍然更优选98％或更高的同源性的，应该被认为与表1所示的基因功能相当，并因此构成根据本发明要缺失或剔除的基因。

上述基因在其并入细胞的过程中参与麦芽糖的膜渗透；即，磷酸烯醇丙酮酸依赖的糖磷酸转移酶系统(PTS，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.，4，37，2002)。具体而言，这些基因包括包含在PTS中的编码麦芽糖-特异性通透酶IICB的glvC基因；编码用于含有glvC基因的glv操纵子的正调节因子的glvR基因；以及与其功能相当的基因。如果缺失或剔除任意上述基因，就可以想象得到细胞的麦芽糖膜渗透性降低。然而，本发明人意外地发现现在使用其中任意基因通过采用含有麦芽糖作为主要碳源的培养基的酶生产培养物以缺失或剔除的宿主微生物，与使用传统宿主微生物相比，实现蛋白质生产率的显著提高。

顺便提及，ptsH基因(BG10200)和ptsI基因(BG10201)也已知通过PTS参与了细胞中麦芽糖的摄取。因此，预测缺失或剔除ptsH和ptsI的任一种可以有效提高蛋白质的生产率。因此，如果缺失或剔除表达包括上述两种基因的pts操纵子所需的调节基因glcT基因(BG12593)，可以提高蛋白质的生产率。

另一种实现本发明的方法是通过将另一来源的DNA片段插入目标基因或将突变体引入该基因的转录/转译起始区域以使目标基因失活或剔除。然而，优选物理缺失目标基因。要缺失或剔除的基因数是一个或更多，并可以缺失两个或更多基因。当构筑本发明的微生物时，可以缺失或失活除了参与麦芽糖膜渗透的基因以外的一个或多个基因。在这种情况下，预计会有更改进的效果。

在缺失或剔除基因的示例性的方法中，根据之前提出的方案缺失或剔除表1所示的任一目标基因。或者，进行基因的随机缺失或通过剔除进行突变，然后对蛋白质生产率进行评测并进行基因分析。

目标基因可以通过同源重组而缺失或剔除。也就是，用合适的质粒载体克隆含有部分目标基因的DNA片段从而获得环形重组质粒，并将所得质粒转移到母体微生物的细胞中。此后，通过在目标基因的部分区域中进行同源重组，使母体微生物基因组上的目标基因裂解，从而完成目标基因的失活。或者，通过碱基的取代或插入来使目标基因突变(剔除)，或者通过PCR或类似方法构成含有目标基因序列外的区域但不含目标基因的线型DNA片段，并将由此制成的基因或片段转移到母体微生物的细胞中。在母体微生物基因组的目标基因中突变点外部的两个位点上，或在目标基因序列外的两个区域上，发生双交换同源重组，从而替换成基因组上的目标基因缺失或剔除的基因片段。

特别是当用于构筑本发明的微生物的母体微生物是枯草杆菌时，由于一些文献已经描述了缺失或剔除目标基因的方法(参见，例如，Mol.Gen.Genet.，223，268 1990)，可以根据这些方法的任何一种重复，从而生产本发明的宿主微生物。

基因随机缺失或失活可以通过使用与上述通过使用随机克隆的DNA片段诱发同源重组的方法类似的方法，或通过用γ射线或类似射线辐射母体微生物而进行。

接下来将更详细地描述通过使用为缺失目的而设计的DNA片段采用双交换的缺失方法，该DNA片段是通过SOE-PCR制备的(Gene，77，61，1989)。然而，在本发明中，缺失基因的方法不仅仅限于下述方法。

用于缺失目的的DNA片段是如下构成的片段：抗药标记基因在ca.0.2至3kb上游序列的侧面之间插入并且处于要缺失的基因的上游，以及抗药标记基因在ca.0.2至3kb下游序列的侧面之间插入并且处于相同基因的下游。在PCR的第一次循环中，制备下列三个片段：要缺失的上游片段和下游片段，和抗药标记基因。例如，要在该步骤中使用的引物可以是专门设计的引物，以便将抗药性基因的上游10-30碱基对序列加入到上游片段的下端，以及将抗药性标记基因的下游10-30碱基对序列加入到下游片段的上端(图1)。

接下来，使用在第一次循环中制备的三个PCR片段作为模板，使用上游片段的上部引物和下游片段的下部引物(外部引物)进行PCR的第二次循环。该步骤导致与如上制成的抗药性基因序列中的抗药性标记基因片段退火接合，并通过PCR扩增，可以获得在上游片段和下游片段之间插有抗药性标记基因的DNA片段(图1)。

当采用抗氯霉素基因作为抗药性标记基因时，可以使用合适的DNA模板和如表2所示的引物组和传统的PCR酶试剂盒(例如PyrobestDNA聚合酶(Takara Shuzo的产品)在文献中描述的典型条件下(参见，例如，PCR Protocols.Current Methods and Applications，Edited by B.A.White，Humana Press，pp.251(1993)，Gene，77，61，1989)通过SOE-PCR获得用于缺失基因的DNA片段。

当由此获得的用于实现基因缺失的DNA片段通过转化方法(competent method)或类似方法引入细胞中时，在要缺失的基因上游和下游存在的同源区域中发生细胞内基因重组。因此，其中的目标基因已经被抗药性基因取代的细胞可以通过使用抗药性标记物而选择性地分离(图1)。具体而言，当在细胞中引入通过表2所列的引物组而制备的用于基因缺失的DNA片段时，分离出在含有氯霉素的琼脂培养基上生长的菌落，并通过例如使用基因组作模板的PCR之类的合适方法来证实通过被抗氯霉素基因取代而缺失了目标基因。

随后，当将编码目标蛋白质或多肽的基因转移到表1所示的任一枯草杆菌基因或一个或多个选自与其相对应的基因的基因从中缺失或剔除的宿主突变微生物菌株上时，可以获得本发明的微生物。

对编码目标蛋白质或多肽的基因没有特别的限制。蛋白质和多肽的例子包括用于工业用途的例如洗涤剂、食品、纤维、饲料、化学品、药品和诊断用药之类的生理活性多肽和酶。工业酶从功能上可以分成氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶/合成酶。优选地，可以使用例如纤维素酶、α-淀粉酶和蛋白质酶之类的水解酶。具体例子包括属于水解酶分类中的族5的纤维素酶(Bioche M.J.，280，309，1991)；特别是源自微生物的纤维素酶，更特别是源自芽孢杆菌属的纤维素酶。这些类型的工业酶的其它具体例子包括源自芽孢杆菌属并含有氨基酸序列号：2或4的碱性纤维素酶、氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被缺失、取代或添加的碱性纤维素酶，以及含有与所述氨基酸序列具有70％同源性，优选80％同源性，更优选90％同源性，进一步优选95％同源性，特别优选98％或更高同源性的另一氨基酸序列的纤维素酶。

α-淀粉酶的具体例子包括源自微生物的α-淀粉酶，优选源自芽孢杆菌属的液化淀粉酶。更具体的例子包括源自芽孢杆菌属并含有序列号：22的氨基酸序列的碱性淀粉酶，以及含有与所述氨基酸序列具有70％同源性，优选80％同源性，更优选90％同源性，进一步优选95％同源性，特别优选98％或更高同源性的另一氨基酸序列的淀粉酶。氨基酸序列的同源性通过Lipman-Pearson法(Science，227，1435(1985))计算。蛋白酶的具体例子包括源自微生物，特别是源自属于芽孢杆菌属的微生物的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。

蛋白酶的具体例子包括源自微生物，优选源自属于芽孢杆菌属的微生物的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。

优选地，编码目标蛋白或多肽的基因在其上游区域具有一个或多个适当地接合到其上的与基因的转录、转译或分泌有关的调节区域(具体而言，一个或多个选自包含启动子和转录起始位点的转录起始调节区域；包含核蛋白体结合位点和起始密码子的转译起始区域；和分泌信号肽区域的区域)。优选将由转录起始调节区域、转译起始调节区域和分泌信号区域构成的三个区域接合到目标基因上。更优选分泌信号肽区域是源自属于芽孢杆菌属的微生物的纤维素酶基因，且转录起始区域和转译起始区域是该纤维素酶基因上游的0.6至1kb区域。在一个优选例子中，在例如日本专利申请(公开)第2000-210081号和第190793/1990号中公开的源自属于芽孢杆菌属的微生物的纤维素酶基因；即，源自KSM-S237菌株(FERM BP-7875)或KSM-64菌株(FERMBP-2886)的纤维素酶基因的转录起始调节区域、转译起始区域、和分泌信号肽区域，适当地接合到目标蛋白或多肽的结构基因上。更具体地，要接合的优选DNA片段包括序列号：1的碱基数量为1至659的核苷酸序列；序列号：3的纤维素酶基因的碱基数量为1至696的核苷酸序列；含有与所述任意一种核苷酸序列具有70％同源性，优选80％同源性，更优选90％同源性，进一步优选95％同源性，特别优选98％或更高同源性的核苷酸序列的DNA片段；或含有缺失了所述任意一种核苷酸序列的一部分的核苷酸序列的DNA片段。优选将这些DNA片段的一种适当地接合到目标蛋白质或多肽的结构基因上。正如此处所用，含有缺失上述任意一种核苷酸序列的一部分的核苷酸序列的DNA片段是指不含上述任意一种核苷酸序列的一部分并具有与该基因的转录、转译和分泌有关的功能的DNA片段。

本发明的重组微生物可以通过传统的转化技术获得，其中将含有包括编码目标蛋白质或多肽的基因并接合到适当的质粒载体上的DNA片段的重组质粒转移到宿主微生物细胞中。或者，重组微生物可以利用通过将上述DNA片段接合到与宿主微生物基因组的某一部分同源的一个合适区域上而制备的DNA片段，并直接插入宿主微生物基因组中而获得。

使用本发明的重组微生物获得的目标蛋白质或多肽可以按照如下方式生产：将相应的细胞株植入含有可同化的碳源和氮源以及其它主要组分的培养基上；通过传统的微生物培养法培养细胞株；随后，收集并提纯蛋白质或多肽。对培养基的成分和组成没有特别的限制，并且培养基优选含有麦芽糖或麦芽低聚糖作为碳源以进行令人满意的培养。

通过前述方法，可以生产宿主突变微生物株，其中表1所示的任一枯草杆菌基因或一个或多个选自与其功能相当的基因的基因已经缺失或剔除。此外，通过使用这种突变株，可以生产重组微生物。由此，通过使用突变株或重组微生物可以有效地生产有用的蛋白质或多肽。

下面将详细描述属于枯草杆菌的已经从中缺失了枯草杆菌的glvC基因(BG11848)或glvR基因(BG11847)的重组菌株的构筑方法，以及使用该重组微生物生产纤维素酶和α-淀粉酶的方法的实施例。

实施例

实施例1

使用从枯草杆菌168菌株中提取的用作模板的基因组DNA样品和表2所示的两个引物组(glvC-AF和glvC-A/CmR；和glvC-B/CmF和glvC-BR)制备在该基因组上的glvC基因上游侧侧面的0.5kb片段(A)和在glvC基因下游侧侧面的0.5kb片段(B)。使用用作模板的重组质粒pC194(J.Bacteriol.150(2)，815(1982))和由表2所示的glvC-A/CmF和glvC-B/CmR构成的引物组制备含有抗氯霉素基因的0.9kb片段(C)。随后，使用表2所示的引物glvC-AF和glvC-BR进行SOE-PCR，并结合使用由此制成的三个片段(A)、(B)和(C)作为模板，制备1.9kbDNA片段，其中在该序列中接合了片段(A)、(B)和(C)(参见图1)。使用由此制成的DNA片段，通过转化方法转化枯草杆菌168菌株。收集在含氯霉素的LB琼脂培养基中生长的菌落作为转化体。提取上述得到的转化体的基因组，在其上进行的PCR证实glvC基因已经被缺失并被抗氯霉素基因取代。

表2

引物	核苷酸序列	序列号：
			glvC-AF	AAATGCGCAAAAGATATGCGC	5
glvC-A/CmR	CTAATGGGTGCTTTAGTTGCTGATACCGACGATAATGCC	6
			glvC-B/CmF	CTGCCCCGTTAGTTGAAGAGACTGCCCTCCTTTTCGG	7
glvC-BR	CGCAAACTCATAAAAATCATATTT	8
			glvC-A/CmF	CAACTAAAGCACCCATTAGTTCAACA	9
glvC-B/CmR	CTTCAACTAACGGGGCAGGTTAGTGAC	10
			glvR-AF	CAGATGATATGGTGAAAAAATCAAATCCG	11
glvR-A/CmR	GTTATCCGCTCACAATTCCGAGCTGCATATCAGATCCC	12
			glvR-B/CmF	CGTCGTGACTGGGAAAACTGTTGATTACAAAGAGGCAG	13
glvR-BR	CCATCGGCCAAATATAAGACACAGCCAACGC	14
			glvR-A/CmF	GAATTGTGAGCGGATAAC	15
glvR-B/CmR	GTTTTCCCAGTCACGACG	16
			glcT-AF	ATAATGCCCGCTTCCCAACC	17
glcT-A/CmR	GTTATCCGCTCACAATTCCGATCCTCAGCTCCTTTGTC	18
			glcT-B/CmF	CGTCGTGACTGGGAAAACTCATCTGATACCGATTAACC	19
glcT-BR	CAACTGAATCCGAAGGAATG	20

实施例2

按照与实施例1所述相似的方式，使用表2所示的两个引物组(glvR-AF和glvR-MCmR；和glvR-B/CmF和glvR-BR)制备在该基因组上的glvR基因上游侧侧面的0.6kb片段(A)和在glvR基因下游侧侧面的0.6kb片段(B)。在质粒pUC18的XbaI-BamHI裂解位点插入质粒pC194的抗氯霉素基因(J.Bacteriol.150(2)，815(1982))，由此制备重组质粒pCBB 31。将用作模板的重组质粒pCBB31和由表2所示的glvR-A/CmF和glvR-B/CmR构成的引物组制备含有抗氯霉素基因的0.9kb片段(C)。随后，使用表2所示的引物glvR-AF和glvR-BR进行SOE-OCR，并结合使用由此制成的三个片段(A)、(B)和(C)作为模板，制备2.2kb DNA片段，其中在该序列中接合了片段(A)、(B)和(C)(参见图1)。使用由此制成的DNA片段，通过转化方法转化枯草杆菌168菌株。收集在含氯霉素的LB琼脂培养基中生长的菌落作为转化体。提取上述转化体的基因组，在其上进行的PCR证实glvR基因已经被缺失并被抗氯霉素基因取代。按照类似方法，使用两个引物组(glcT-AF和glcT-A/CmR；和glcT-B/CmF和glcT-BR)分离glcT基因已经被缺失并被抗氯霉素基因取代的转化体。

实施例3

在实施例1和2获得的每种基因缺失的菌株中和在用作对照物的枯草杆菌168菌株中，通过原生质体转化法引入重组质粒pHY-S237。重组质粒pHY-S237的制备如下：将源自芽孢杆菌KSM-S237菌株的编码碱性纤维素酶的DNA片段(3.1kb)(序列号：1，日本专利申请(公开)第2000-210081号)插入穿梭载体pHY300PLK的限制性内切酶BamHI裂解位点。将由此制成的每种细胞株在LB培养基(5毫升)中以30℃2震荡培养过夜。将培养液(0.03毫升)注入2×L-麦芽糖培养基(2％胰胨、1％酵母提取物、1％NaCl、7.5％麦芽糖、7.5ppm4-5水合硫酸锰和15ppm四环素)中，然后在30℃震荡培养三天。在培养完成后，通过离心去除细胞，并测定由培养物获得的上层清液的碱性纤维素酶活性，由此计算细胞在培养过程中分泌出的碱性纤维素酶的量；即，在细胞外生成的碱性纤维素酶的量。从表3中清楚看出，与对照物168菌株(野生型菌株)相比，在使用基因缺失的可形成孢子的菌株作为宿主的所有情况下，碱性纤维素酶的生产或分泌都被证实更为有效。

表3

缺失基因的名称	基因编号	基因大小(bp)	缺失片段的大小(bp)	制得的(分泌的)碱性纤维素酶的量(相对值)
					glvC	BG11848	1584	1498	161
glvR	BG11847	715	765	140
					glcT	BG12593	858	811	110
无(野生型)	-	-	-	100

实施例4

在实施例1至3获得的每种基因缺失的菌株中和在用作对照物的枯草杆菌168菌株中，通过原生质体转化法引入重组质粒pHSP-K38。重组质粒pHSP-K38的制备如下：在穿梭载体pHY300PLK的限制性内切酶BagII-XbaI裂解位点插入如下制成的2.1kb片段(序列号：21)：将包含碱性纤维素酶基因的启动子区域和信号序列区域部分的上游0.6kb片段(序列号：3)与编码源自芽孢杆菌KSM-K38菌株的碱性淀粉酶基因的成熟酶区域(Asp1-Gln480)的DNA片段(1.5kb)的上游侧接合(日本专利申请(公开)第2000-184882号，Eur.J.Biochem.，268，2974(2001))。将由此获得的每种细胞株在LB培养基(5毫升)中以30℃震荡培养过夜。将培养液(0.03毫升)注入2×L-麦芽糖培养基(2％胰胨、1％酵母提取物、1％NaCl、7.5％麦芽糖、7.5ppm4-5水合硫酸锰和15ppm四环素)中，然后在30℃震荡培养三至六天。在培养完成后，通过离心去除细胞，并测定由培养物获得的上层清液的碱性淀粉酶的活性，由此计算在培养过程中细胞分泌出的碱性淀粉酶的量；即，在细胞外生成的碱性淀粉酶的量。从表4中清楚看出，与对照物168菌株(野生型菌株)相比，在使用基因缺失的菌株作为宿主的情况下，碱性淀粉酶的生产或分泌被证实更为有效。

表4

缺失基因的名称	基因编号	基因大小(bp)	缺失片段的大小(bp)	制得的(分泌的)碱性淀粉酶的量(相对值)
					glvC	BG11848	1584	1498	202
glvR	BG11847	715	765	153
					无(野生型)	-	-	-	100

序列表

<110>花王株式会社

<120>Host microorganisms

<130>KS0796

<150>JP 2003-379114

<151>2003.11.7

<160>20

<170>PatentIn Ver.3.1

<210>1

<211>3150

<212>DNA

<213>芽孢杆菌KSM-S237

<220>

<221>CDS

<222>(573)..(3044)

<223>

<220>

<221>sig_peptide

<222>(573)..(659)

<223>

<220>

<221>mat_peptide

<222>(660)..()

<223>

<400>1

gatttgccga tgcaacaggc ttatatttag aggaaatttc tttttaaatt gaatacggaa 60

taaaatcagg taaacaggtc ctgattttat ttttttgagt tttttagaga actgaagatt 120

gaaataaaag tagaagacaa aggacataag aaaattgcat tagttttaat tatagaaaac 180

gcctttttat aattatttat acctagaacg aaaatactgt ttcgaaagcg gtttactata 240

aaaccttata ttccggctct tttttaaaac agggggtaaa aattcactct agtattctaa 300

tttcaacatg ctataataaa tttgtaagac gcaatatgca tctctttttt tacgatatat 360

gtaagcggtt aaccttgtgc tatatgccga tttaggaagg ggggtagatt gagtcaagta 420

gtaataatat agataactta taagttgttg agaagcagga gagcatctgg gttactcaca 480

agttttttta aaactttaac gaaagcactt tcggtaatgc ttatgaattt agctatttga 540

ttcaattact ttaaaaatat ttaggaggta at atg atg tta aga aag aaa aca 593

Met Met Leu Arg Lys Lys Thr

-25

aag cag ttg att tct tcc att ctt att tta gtt tta ctt cta tct tta 641

Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu

-20 -15 -10

ttt ccg gca gct ctt gca gca gaa gga aac act cgt gaa gac aat ttt 689

Phe Pro Ala Ala Leu Ala Ala Glu Gly Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe

-5 -1 1 5 10

aaa cat tta tta ggt aat gac aat gtt aaa cgc cct tct gag gct ggc 737

Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly

15 20 25

gca tta caa tta caa gaa gtc gat gga caa atg aca tta gta gat caa 785

Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly Gln Met Thr Leu Val Asp Gln

30 35 40

cat gga gaa aaa att caa tta cgt gga atg agt aca cac gga tta cag 833

His Gly Glu Ly sIle Gln Leu Arg Gly Met Ser Thr His Gly Leu Gln

45 50 55

tgg ttt cct gag atc ttg aat gat aac gca tac aaa gct ctt tct aac 881

Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn

60 65 70

gat tgg gat tcc aat atg att cgt ctt gct atg tat gta ggt gaa aat 929

Asp Trp Asp Ser Asn Met Ile Arg Leu Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn

75 80 85 90

ggg tac gct aca aac cct gag tta atc aaa caa aga gtg att gat gga 977

Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly

95 100 105

att gag tta gcg att gaa aat gac atg tat gtt att gtt gac tgg cat 1025

Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met Tyr Val Ile Val Asp Trp His

110 115 120

gtt cat gcg cca ggt gat cct aga gat cct gtt tat gca ggt gct aaa 1073

Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys

125 130 135

gat ttc ttt aga gaa att gca gct tta tac cct aat aat cca cac att 1121

Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile

140 145 150

att tat gag tta gcg aat gag ccg agt agt aat aat aat ggt gga gca 1169

Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala

155 160 165 170

ggg att ccg aat aac gaa gaa ggt tgg aaa gcg gta aaa gaa tat gct 1217

Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala

175 180 185

gat cca att gta gaa atg tta cgt aaa agc ggt aat gca gat gac aac 1265

Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Lys Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn

190 195 200

att atc att gtt ggt agt cca aac tgg agt cag cgt ccg gac tta gca 1313

Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala

205 210 215

gct gat aat cca att gat gat cac cat aca atg tat act gtt cac ttc 1361

Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His Thr Met Tyr Thr Val His Phe

220 225 230

tac act ggt tca cat gct gct tca act gaa agc tat ccg tct gaa act 1409

Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr

235 240 245 250

cct aac tct gaa aga gga aac gta atg agt aac act cgt tat gcg tta 1457

Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu

255 260 265

gaa aac gga gta gcg gta ttt gca aca gag tgg gga acg agt caa gct 1505

Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala

270 275 280

agt gga gac ggt ggt cct tac ttt gat gaa gca gat gta tgg att gaa 1553

Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu

285 290 295

ttt tta aat gaa aac aac att agc tgg gct aac tgg tct tta acg aat 1601

Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn

300 305 310

aaa aat gaa gta tct ggt gca ttt aca cca ttc gag tta ggt aag tct 1649

Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser

315 320 325 330

aac gca acc aat ctt gac cca ggt cca gat cat gtg tgg gca cca gaa 1697

Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro Asp His Val Trp Ala Pro Glu

335 340 345

gaa tta agt ctt tct gga gaa tat gta cgt gct cgt att aaa ggt gtg 1745

Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val

350 355 360

aac tat gag cca atc gac cgt aca aaa tac acg aaa gta ctt tgg gac 1793

Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp

365 370 375

ttt aat gat gga acg aag caa gga ttt gga gtg aat tcg gat tct cca 1841

Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro

380 385 390

aat aaa gaa ctt att gca gtt gat aat gaa aac aac act ttg aaa gtt 1889

Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val

395 400 405 410

tcg gga tta gat gta agt aac gat gtt tca gat ggc aac ttc tgg gct 1937

Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala

415 420 425

aat gct cgt ctt tct gcc aac ggt tgg gga aaa agt gtt gat att tta 1985

Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu

430 435 440

ggt gct gag aag ctt aca atg gat gtt att gtt gat gaa cca acg acg 2033

Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr

445 450 455

gta gct att gcg gcg att cca caa agt agt aaa agt gga tgg gca aat 2081

Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn

460 465 470

cca gag cgt gct gtt cga gtg aac gcg gaa gat ttt gtc cag caa acg 2129

Pro Glu Arg Ala Val Arg Val Asn Ala Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr

475 480 485 490

gac ggt aag tat aaa gct gga tta aca att aca gga gaa gat gct cct 2177

Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro

495 500 505

aac cta aaa aat atc gct ttt cat gaa gaa gat aac aat atg aac aac 2225

Asn Leu Lys Asn Ile Ala Phe His Glu Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn

510 515 520

atc att ctg ttc gtg gga act gat gca gct gac gtt att tac tta gat 2273

Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp

525 530 535

aac att aaa gta att gga aca gaa gtt gaa att cca gtt gtt cat gat 2321

Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val Glu Ile Pro Val Val His Asp

540 545 550

cca aaa gga gaa gct gtt ctt cct tct gtt ttt gaa gac ggt aca cgt 2369

Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg

555 560 565 570

caa ggt tgg gac tgg gct gga gag tct ggt gtg aaa aca gct tta aca 2417

Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr

575 580 585

att gaa gaa gca aac ggt tct aac gcg tta tca tgg gaa ttt gga tat 2465

Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr

590 595 600

cca gaa gta aaa cct agt gat aac tgg gca aca gct cca cgt tta gat 2513

Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp

605 610 615

ttc tgg aaa tct gac ttg gtt cgc ggt gag aat gat tat gta gct ttt 2561

Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe

620 625 630

gat ttc tat cta gat cca gtt cgt gca aca gaa ggc gca atg aat atc 2609

Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile

635 640 645 650

aat tta gta ttc cag cca cct act aac ggg tat tgg gta caa gca cca 2657

Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro

655 660 665

aaa acg tat acg att aac ttt gat gaa tta gag gaa gcg aat caa gta 2705

Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val

670 675 680

aat ggt tta tat cac tat gaa gtg aaa att aac gta aga gat att aca 2753

Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr

685 690 695

aac att caa gat gac acg tta cta cgt aac atg atg atc att ttt gca 2801

Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg Asn Met Met Ile Ile Phe Ala

700 705 710

gat gta gaa agt gac ttt gca ggg aga gtc ttt gta gat aat gtt cgt 2849

Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg Val Phe Val Asp Asn Val Arg

715 720 725 730

ttt gag ggg gct gct act act gag ccg gtt gaa cca gag cca gtt gat 2897

Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro Val Glu Pro Glu Pro Val Asp

735 740 745

cct ggc gaa gag acg cca cct gtc gat gag aag gaa gcg aaa aaa gaa 2945

Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu

750 755 760

caa aaa gaa gca gag aaa gaa gag aaa gaa gca gta aaa gaa gaa aag 2993

Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys

765 770 775

aaa gaa gct aaa gaa gaa aag aaa gca gtc aaa aat gag gct aag aaa 3041

Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala Val Lys Asn Glu Ala Lys Lys

780 785 790

aaa taatctatta aactagttat agggttatct aaaggtctga tgtagatctt 3094

Lys

795

ttagataacc tttttcttgc ataactggac acagagttgt tattaaagaa agtaag 3150

<210>2

<211>824

<212>PRT

<213>芽孢杆菌KSM-S237

<400>2

Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile

-25 -20 -15

Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Ala Ala Leu Ala Ala Glu Gly

-10 -5 -1 1

Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val

5 10 15

Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly

20 25 30 35

Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly

40 45 50

Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn

55 60 65

Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn Asp Trp Asp Ser Asn Met Ile Arg Leu

70 75 80

Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile

85 90 95

Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met

100 105 110 115

Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp

120 125 130

Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu

135 140 145

Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser

150 155 160

Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp

165 170 175

Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Lys

180 185 190 195

Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp

200 205 210

Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His

215 220 225

Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr

230 235 240

Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met

245 250 255

Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr

260 265 270 275

Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp

280 285 290

Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp

295 300 305

Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr

310 315 320

Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro

325 330 335

Asp His Val Trp Ala Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val

340 345 350 355

Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys

360 365 370

Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe

375 380 385

Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn

390 395 400

Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val

405 410 415

Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp

420 425 430 435

Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val

440 445 450

Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser

455 460 465

Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn Pro Glu Arg Ala Val Arg Val Asn Ala

470 475 480

Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr

485 490 495

Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro Asn Leu Lys Asn Ile Ala Phe His Glu

500 505 510 515

Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala

520 525 530

Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val

535 540 545

Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser

550 555 560

Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser

565 570 575

Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala

580 585 590 595

Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp

600 605 610

Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly

615 620 625

Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala

630 635 640

Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn

645 650 655

Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu

660 665 670 675

Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys

680 685 690

Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg

695 700 705

Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg

710 715 720

Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro

725 730 735

Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp

740 745 750 755

Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys

760 765 770

Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala

775 780 785

Val Lys Asn Glu Ala Lys Lys Lys

790 795

<210>3

<211>3332

<212>DNA

<213>芽孢杆菌KSM-64

<220>

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<222>(610)..(3075)

<223>

<220>

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<222>(610)..(696)

<223>

<220>

<221>mat_peptide

<222>(697)..()

<223>

<400>3

agtacttacc attttagagt caaaagatag aagccaagca ggatttgccg atgcaaccgg 60

cttatattta gagggaattt ctttttaaat tgaatacgga ataaaatcag gtaaacaggt 120

cctgatttta tttttttgaa tttttttgag aactaaagat tgaaatagaa gtagaagaca 180

acggacataa gaaaattgta ttagttttaa ttatagaaaa cgcttttcta taattattta 240

tacctagaac gaaaatactg tttcgaaagc ggtttactat aaaaccttat attccggctc 300

tttttttaaa cagggggtga aaattcactc tagtattcta atttcaacat gctataataa 360

atttgtaaga cgcaatatac atcttttttt tatgatattt gtaagcggtt aaccttgtgc 420

tatatgccga tttaggaagg gggtagattg agtcaagtag tcataattta gataacttat 480

aagttgttga gaagcaggag agaatctggg ttactcacaa gttttttaaa acattatcga 540

aagcactttc ggttatgctt atgaatttag ctatttgatt caattacttt aataatttta 600

ggaggtaat atg atg tta aga aag aaa aca aag cag ttg att tct tcc att 651

Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile

-25 -20

ctt att tta gtt tta ctt cta tct tta ttt ccg aca gct ctt gca gca 699

Leu Ile Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Thr Ala Leu Ala Ala

-15 -10 -5 -1 1

gaa gga aac act cgt gaa gac aat ttt aaa cat tta tta ggt aat gac 747

Glu Gly Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp

5 10 15

aat gtt aaa cgc cct tct gag gct ggc gca tta caa tta caa gaa gtc 795

Asn Val Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val

20 25 30

gat gga caa atg aca tta gta gat caa cat gga gaa aaa att caa tta 843

Asp Gly Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu

35 40 45

cgt gga atg agt aca cac gga tta caa tgg ttt cct gag atc ttg aat 891

Arg Gly Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn

50 55 60 65

gat aac gca tac aaa gct ctt gct aac gat tgg gaa tca aat atg att 939

Asp Asn Ala Tyr Lys Ala Leu Ala Asn Asp Trp Glu Ser Asn Met Ile

70 75 80

cgt cta gct atg tat gtc ggt gaa aat ggc tat gct tca aat cca gag 987

Arg Leu Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Ser Asn Pro Glu

85 90 95

tta att aaa agc aga gtc att aaa gga ata gat ctt gct att gaa aat 1035

Leu Ile Lys Ser Arg Val Ile Lys Gly Ile Asp Leu Ala Ile Glu Asn

100 105 110

gac atg tat gtc atc gtt gat tgg cat gta cat gca cct ggt gat cct 1083

Asp Met Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro

115 120 125

aga gat ccc gtt tac gct gga gca gaa gat ttc ttt aga gat att gca 1131

Arg Asp Pro Val Tyr Ala Gly Ala Glu Asp Phe Phe Arg Asp Ile Ala

130 135 140 145

gca tta tat cct aac aat cca cac att att tat gag tta gcg aat gag 1179

Ala Leu Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu

150 155 160

cca agt agt aac aat aat ggt gga gct ggg att cca aat aat gaa gaa 1227

Pro Ser Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu

165 170 175

ggt tgg aat gcg gta aaa gaa tac gct gat cca att gta gaa atg tta 1275

Gly Trp Asn Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu

180 185 190

cgt gat agc ggg aac gca gat gac aat att atc att gtg ggt agt cca 1323

Arg Asp Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro

195 200 205

aac tgg agt cag cgt cct gac tta gca gct gat aat cca att gat gat 1371

Asn Trp Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp

210 215 220 225

cac cat aca atg tat act gtt cac ttc tac act ggt tca cat gct gct 1419

His His Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala

230 235 240

tca act gaa agc tat ccg cct gaa act cct aac tct gaa aga gga aac 1467

Ser Thr Glu Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn

245 250 255

gta atg agt aac act cgt tat gcg tta gaa aac gga gta gca gta ttt 1515

Val Met Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe

260 265 270

gca aca gag tgg gga act agc caa gca aat gga gat ggt ggt cct tac 1563

Ala Thr Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr

275 280 285

ttt gat gaa gca gat gta tgg att gag ttt tta aat gaa aac aac att 1611

Phe Asp Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile

290 295 300 305

agc tgg gct aac tgg tct tta acg aat aaa aat gaa gta tct ggt gca 1659

Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala

310 315 320

ttt aca cca ttc gag tta ggt aag tct aac gca aca agt ctt gac cca 1707

Phe Thr Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser Leu Asp Pro

325 330 335

ggg cca gac caa gta tgg gta cca gaa gag tta agt ctt tct gga gaa 1755

Gly Pro Asp Gln Val Trp Val Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu

340 345 350

tat gta cgt gct cgt att aaa ggt gtg aac tat gag cca atc gac cgt 1803

Tyr Val Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg

355 360 365

aca aaa tac acg aaa gta ctt tgg gac ttt aat gat gga acg aag caa 1851

Thr Lys Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln

370 375 380 385

gga ttt gga gtg aat gga gat tct cca gtt gaa gat gta gtt att gag 1899

Gly Phe Gly Val Asn Gly Asp Ser Pro Val Glu Asp Val Val Ile Glu

390 395 400

aat gaa gcg ggc gct tta aaa ctt tca gga tta gat gca agt aat gat 1947

Asn Glu Ala Gly Ala Leu Lys Leu Ser Gly Leu Asp Ala Ser Asn Asp

405 410 415

gtt tct gaa ggt aat tac tgg gct aat gct cgt ctt tct gcc gac ggt 1995

Val Ser Glu Gly Asn Tyr Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asp Gly

420 425 430

tgg gga aaa agt gtt gat att tta ggt gct gaa aaa ctt act atg gat 2043

Trp Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp

435 440 445

gtg att gtt gat gag ccg acc acg gta tca att gct gca att cca caa 2091

Val Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ser Ile Ala Ala Ile Pro Gln

450 455 460 465

ggg cca tca gcc aat tgg gtt aat cca aat cgt gca att aag gtt gag 2139

Gly Pro Ser Ala Asn Trp Val Asn Pro Asn Arg Ala Ile Lys Val Glu

470 475 480

cca act aat ttc gta ccg tta gga gat aag ttt aaa gcg gaa tta act 2187

Pro Thr Asn Phe Val Pro Leu Gly Asp Lys Phe Lys Ala Glu Leu Thr

485 490 495

ata act tca gct gac tct cca tcg tta gaa gct att gcg atg cat gct 2235

Ile Thr Ser Ala Asp Ser Pro Ser Leu Glu Ala Ile Ala Met His Ala

500 505 510

gaa aat aac aac atc aac aac atc att ctt ttt gta gga act gaa ggt 2283

Glu Asn Asn Asn Ile Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Glu Gly

515 520 525

gct gat gtt atc tat tta gat aac att aaa gta att gga aca gaa gtt 2331

Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val

530 535 540 545

gaa att cca gtt gtt cat gat cca aaa gga gaa gct gtt ctt cct tct 2379

Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser

550 555 560

gtt ttt gaa gac ggt aca cgt caa ggt tgg gac tgg gct gga gag tct 2427

Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser

565 570 575

ggt gtg aaa aca gct tta aca att gaa gaa gca aac ggt tct aac gcg 2475

Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala

580 585 590

tta tca tgg gaa ttt gga tac cca gaa gta aaa cct agt gat aac tgg 2523

Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp

595 600 605

gca aca gct cca cgt tta gat ttc tgg aaa tct gac ttg gtt cgc ggt 2571

Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly

610 615 620 625

gaa aat gat tat gta act ttt gat ttc tat cta gat cca gtt cgt gca 2619

Glu Asn Asp Tyr Val Thr Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala

630 635 640

aca gaa ggc gca atg aat atc aat tta gta ttc cag cca cct act aac 2667

Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn

645 650 655

ggg tat tgg gta caa gca cca aaa acg tat acg att aac ttt gat gaa 2715

Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu

660 665 670

tta gag gaa gcg aat caa gta aat ggt tta tat cac tat gaa gtg aaa 2763

Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys

675 680 685

att aac gta aga gat att aca aac att caa gat gac acg tta cta cgt 2811

Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg

690 695 700 705

aac atg atg atc att ttt gca gat gta gaa agt gac ttt gca ggg aga 2859

Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg

710 715 720

gtc ttt gta gat aat gtt cgt ttt gag ggg gct gct act act gag ccg 2907

Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro

725 730 735

gtt gaa cca gag cca gtt gat cct ggc gaa gag acg ccg cct gtc gat 2955

Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp

740 745 750

gag aag gaa gcg aaa aaa gaa caa aaa gaa gca gag aaa gaa gag aaa 3003

Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys

755 760 765

gaa gca gta aaa gaa gaa aag aaa gaa gct aaa gaa gaa aag aaa gca 3051

Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala

770 775 780 785

atc aaa aat gag gct acg aaa aaa taatctaata aactagttat agggttatct 3105

Ile Lys Asn Glu Ala Thr Lys Lys

790

aaaggtctga tgcagatctt ttagataacc tttttttgca taactggaca tagaatggtt 3165

attaaagaaa gcaaggtgtt tatacgatat taaaaaggta gcgattttaa attgaaacct 3225

ttaataatgt cttgtgatag aatgatgaag taatttaaga gggggaaacg aagtgaaaac 3285

ggaaatttct agtagaagaa aaacagacca agaaatactg caagctt 3332

<210>4

<211>822

<212>PRT

<213>芽孢杆菌KSM-64

<400>4

Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile

-25 -20 -15

Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Thr Ala Leu Ala Ala Glu Gly

-10 -5 -1 1

Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val

5 10 15

Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly

20 25 30 35

Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly

40 45 50

Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn

55 60 65

Ala Tyr Lys Ala Leu Ala Asn Asp Trp Glu Ser Asn Met Ile Arg Leu

70 75 80

Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Ser Asn Pro Glu Leu Ile

85 90 95

Lys Ser Arg Val Ile Lys Gly Ile Asp Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met

100 105 110 115

Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp

120 125 130

Pro Val Tyr Ala Gly Ala Glu Asp Phe Phe Arg Asp Ile Ala Ala Leu

135 140 145

Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser

150 155 160

Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp

165 170 175

Asn Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Asp

180 185 190 195

Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp

200 205 210

Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His

215 220 225

Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr

230 235 240

Glu Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met

245 250 255

Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr

260 265 270 275

Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp

280 285 290

Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp

295 300 305

Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr

310 315 320

Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser Leu Asp Pro Gly Pro

325 330 335

Asp Gln Val Trp Val Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val

340 345 350 355

Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys

360 365 370

Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe

375 380 385

Gly Val Asn Gly Asp Ser Pro Val Glu Asp Val Val Ile Glu Asn Glu

390 395 400

Ala Gly Ala Leu Lys Leu Ser Gly Leu Asp Ala Ser Asn Asp Val Ser

405 410 415

Glu Gly Asn Tyr Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asp Gly Trp Gly

420 425 430 435

Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val Ile

440 445 450

Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ser Ile Ala Ala Ile Pro Gln Gly Pro

455 460 465

Ser Ala Asn Trp Val Asn Pro Asn Arg Ala Ile Lys Val Glu Pro Thr

470 475 480

Asn Phe Val Pro Leu Gly Asp Lys Phe Lys Ala Glu Leu Thr Ile Thr

485 490 495

Ser Ala Asp Ser Pro Ser Leu Glu Ala Ile Ala Met His Ala Glu Asn

500 505 510 515

Asn Asn Ile Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Glu Gly Ala Asp

520 525 530

Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val Glu Ile

535 540 545

Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser Val Phe

550 555 560

Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser Gly Val

565 570 575

Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala Leu Ser

580 585 590 595

Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp Ala Thr

600 605 610

Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly Glu Asn

615 620 625

Asp Tyr Val Thr Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala Thr Glu

630 635 640

Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn Gly Tyr

645 650 655

Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu Leu Glu

660 665 670 675

Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Ile Asn

680 685 690

Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg Asn Met

695 700 705

Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg Val Phe

710 715 720

Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro Val Glu

725 730 735

Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp Glu Lys

740 745 750 755

Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys Glu Ala

760 765 770

Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala Ile Lys

775 780 785

Asn Glu Ala Thr Lys Lys

790

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

aaatgcgcaa aagatatgcg c 21

<210>6

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ctaatgggtg ctttagttgc tgataccgac gataatgcc 39

<210>7

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ctgccccgtt agttgaagag actgccctcc ttttcgg 37

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cgcaaactca taaaaatcat attt 24

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

caactaaagc acccattagt tcaaca 26

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

cttcaactaa cggggcaggt tagtgac 27

<210>11

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

cagatgatat ggtgaaaaaa tcaaatccg 29

<210>12

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

gttatccgct cacaattccg agctgcatat cagatccc 38

<210>13

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

cgtcgtgact gggaaaactg ttgattacaa agaggcag 38

<210>14

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

ccatcggcca aatataagac acagccaacg c 31

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

gaattgtgag cggataac 18

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

gttttcccag tcacgacg 18

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

ataatgcccg cttcccaacc 20

<210>18

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

gttatccgct cacaattccg atcctcagct cctttgtc 38

<210>19

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

cgtcgtgact gggaaaactc atctgatacc gattaacc 38

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

caactgaatc cgaaggaatg 20

？？

17/29

？？

5/30

Claims

1.一种重组微生物，其通过将编码异性蛋白质或多肽的基因转移到至少一种参与麦芽糖的膜渗透的基因缺失或被剔除的微生物的突变株上而制备，

其中所述参与麦芽糖的膜渗透的基因是枯草杆菌基因glvR或glvC。

2.如权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物是枯草杆菌或属于芽孢杆菌属的另一细菌。

3.如权利要求1或2所述的重组微生物，其中，选自源自KSM-S237菌株或KSM-64菌株的纤维素酶基因的转录起始调节区域、转译起始调节区域和分泌信号区域的一个或多个区域接合到编码异性蛋白质或多肽的基因的上游区域。

4.如权利要求3所述的重组微生物，其中所述一个或多个区域是由转录起始调节区域、转译起始调节区域和分泌信号区域构成的三个区域。

5.如权利要求3所述的重组微生物，其中所述分泌信号区域来自属于芽孢杆菌属的细菌的纤维素酶基因，而所述转录起始调节区域和所述转译起始调节区域各自来自该纤维素酶基因上游的0.6至1kb区域。

6.如权利要求4所述的重组微生物，其中由所述转录起始调节区域、所述转译起始调节区域和所述分泌信号区域构成的三个区域是序列号：1的纤维素酶基因的碱基数为1至659的核苷酸序列；或者是序列号：3的纤维素酶基因的碱基数为1至696的核苷酸序列。

7.一种生产蛋白质或多肽的方法，其特征在于，包括：在含麦芽糖的培养基中培养如权利要求1至6任意一项所述的重组微生物。