CN1930289B - 变异芽孢杆菌属细菌 - Google Patents
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- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
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Abstract
本发明提供使蛋白质或多肽的生产率提高成为可能的变异芽孢杆菌属细菌，此外还提供在该变异芽孢杆菌属细菌内导入了编码异种蛋白质或多肽的基因的重组微生物，以及，使用该重组微生物的蛋白质或多肽的制造方法。在基因组上或质粒上具有在孢子形成期被特异识别、转录的启动子序列连接在sigA基因或与该基因相当的基因的上游而成的DNA的变异芽孢杆菌属细菌，在该变异芽孢杆菌属细菌内导入有编码异种蛋白质或多肽的基因的重组微生物，以及使用该重组微生物的蛋白质或多肽的制造方法。
Description
技术领域
本发明涉及用于生产有用的蛋白质或多肽的宿主微生物、重组微生物、以及蛋白质或多肽的生产方法。
背景技术
利用微生物的有用物质的工业生产，以酒精饮料和味噌、酱油等的食品类为代表，还有氨基酸、有机酸、核酸相关物质、抗菌素、糖、脂质和蛋白质等，其种类跨越多方面，而且关于其用途也扩展到广泛的领域直至食品、医药和洗涤剂、化妆品等的日用品或各种化学合成品原料。
在这样的利用微生物的有用物质的工业生产中，其生产率的提高是重要的课题之一，作为其手段，可以进行利用突变等的遗传学手段的生产菌的育种。另一方面，由于微生物遗传学、生物技术的发展，特别是最近，进行了使用基因重组技术等的更有效的生产菌的育种，推动了用于基因重组的宿主微生物的开发。作为使用基因重组技术的生产菌育种的方法，已知的有增强调节基因的表达的转录因子、特别是RNA聚合酶的σ因子的例子，例如，有报告例如下：在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中，通过在营养增殖期中增加编码参与生育所必需的基因的转录的主要σ因子(管家σ因子，housekeepingsigma factor)的rpoD基因的复制数，从而增加藤黄绿脓菌素(pyoluteorin)和2，4-二乙酰间苯三酚(2，4-diacetylphloroglucinol)等的抗菌素的生产量(例如，参照非专利文献1)以及，还有报告例如下：在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicus)中，通过使管家的sigA基因过量表达，从而增加L-赖氨酸的发酵生产量(例如，参照专利文献1)。
但是，这些都是在营养增值期中增强管家σ因子基因的表达。此外，在以枯草杆菌(Bacillus subtilis)为代表的芽孢杆菌属细菌中，通过增强σ因子来增加有用物质的生产量这样的报告到目前为止还没有。
[专利文献1]国际公开第2003/054179号小册子
[非专利文献1]J.Bacteriol.，177，5387，(1995)
发明内容
本发明提供一种变异芽孢杆菌属细菌，其基因组或质粒上具有在sigA基因或与该基因相当的基因的上游连接有在孢子形成期被特异地识别、转录的启动子序列而形成的DNA。
此外，本发明提供一种在该变异芽孢杆菌属细菌中导入编码异种蛋白质或多肽的基因的重组微生物，以及，利用该重组微生物的蛋白质或多肽的制造方法。
此外，本发明提供一种变异芽孢杆菌属细菌的构建方法，其特征在于，在芽孢杆菌属细菌的基因组上或质粒上具有在sigA基因或与该基因相当的基因的上游连接有在孢子形成期被特异识别、转录的启动子序列而形成的DNA。
附图说明
[图1]是表示在孢子形成过程中的依次的σ因子的活化的示意图；
[图2]是表示本发明sigA基因的构建例的概念图。
具体实施方式
本发明涉及提供一种使蛋白质或多肽的生产率提高可能的变异芽孢杆菌属细菌，在该变异芽孢杆菌属细菌中导入了编码异种蛋白质或多肽的基因的重组微生物，以及，利用该重组微生物的蛋白质或多肽的制造方法。
芽孢杆菌属细菌具有多个作为RNA聚合酶的亚单位、参与启动子序列的识别的σ因子。识别不同的启动子的σ因子，被认为与由除了σ因子以外的多个亚单位构成的RNA聚合酶轴心复合体(core complex)结合，从而转录不同的基因，由此，对于在基因组上存在数千个的基因，根据状况进行基因的表达控制。例如，已知：在芽孢杆菌属细菌中，在枯草杆菌中鉴定有17个σ因子，以在营养增殖期中参与生长所必需的基因的转录的主要σ因子(管家σ因子)SigA为代表，还存在着控制孢子形成过程的σ因子SigH、SigF、SigE、SigG、SigK、控制鞭毛形成和细胞壁溶解的σ因子SigD、控制某种氨基酸和糖的代谢的σ因子SigL、控制对环境变化的响应的σ因子SigB或称为ECFσ的σ因子等(Bacillus subtilisand Its Closest Relatives：From Genes to Cells，Edited by A.L.Sonenshein，American Society for Microbiology，pp289，(2002))。
其中，已知：控制孢子形成过程的σ因子，如图1所示地伴随孢子形成过程的进行而依次表达、活化。即，当枯草杆菌陷于营养饥饿状态时，首先经过在称为磷酸中继系统(phospho-relay system)的多个蛋白质间的多级磷酸传递系统，而引起孢子形成起始控制因子Spo0A的磷酸化(Cell，64，545，(1991))。伴随着磷酸化Spo0A(Spo0A～P)的浓度上升，抑制SigH的结构基因(sigH)的表达的抑制剂AbrB的诱导被抑制，结果，sigH的转录依赖于SigA而被诱导(J.Bacteriol.，173，521，(1991))。SigH被活化后，由于形成非对象隔膜，枯草杆菌的细胞质分割为母细胞侧和子细胞侧，随后在子细胞侧Spo0A～P与SigH共轭以诱导含有SigF的结构基因(sigF)的操纵子(spoIIAA-spoIIAB-sigF)的转录(Gene，101，113，(1991))，在母细胞侧Spo0A～P和SigA共轭以诱导含有SigE前体的结构基因(sigE)的操纵子(spoIIGA-sigE)的转录(J.Bacteriol.，169，3329，(1987))。SigF通过抗-σ因子spoIIAB和抗-抗-σ因子spoIIAA、进而通过SpoIIAA的脱磷酸化酶SpoIIE控制活化(Genes Cells，1，881(1996))，活化了的SigF诱导信号传递蛋白SpoIIR的结构基因(spoIIR)的转录。有研究认为，从子细胞侧分泌的SpoIIR将局限在母细胞侧的非对象隔膜处的SigE前体活化蛋白酶SpoIIGA活化，由此，引发SigE的活化(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，92，2012，(1995)。
而且，虽然在子细胞侧，SigF诱导SigG的结构基因(sigG)的转录，在母细胞侧，SigE诱导SigK的结构基因(sigK)的转录，但是在子细胞侧的SigG的活化发生在母细胞侧的SigE的活化之后，在母细胞侧SigK的活化在其后引发(Mol.Microbiol.，31，1285，(1999))。
有报告称，在营养增殖期内，主要是SigA与RNA聚合酶轴心复合体会合，并诱导具有SigA识别的启动子的基因或操纵子的转录，但是由于如上所述的结构，当进入孢子形成期而其它σ因子被活化时，引发与RNA聚合酶轴心复合体会合的σ因子的置换，与SigA会合的RNA聚合酶的量相对下降(J.Bacteriol.，179，4969，(1999))。因此，认为在孢子形成期以后，来自由SigA识别的启动子的转录量相对下降。
这种状况之下，本发明者们发现：通过将在孢子形成期中被特异识别、表达的启动子与主要在营养增殖期内参与生殖所必需的基因的转录的主要σ因子SigA的基因连接，可以在营养增殖期后的孢子形成期内增强SigA的基因的表达，使该σ因子与RNA聚合酶轴心复合体的结合量增加，由此，实现孢子形成期以后的异种蛋白质或多肽的生产率的提高。
根据本发明的微生物，能够有效生产该异种蛋白质或多肽。
在本发明中，氨基酸序列和碱基序列的同一性(identity)，通过Lipman-Pearson法(Science，227，1435，(1985))计算。具体地说，通过使用遗传信息处理软件Genetyx-Win(软件开发)的同源性解析(Searchhomology)程序，将参数Unit size to compare(ktup)设为2进行分析而算出。
本发明的变异芽孢杆菌属细菌是如下构建的：在其基因组上或者质粒上具有在sigA基因或与该基因相当的基因的上游处连接有在孢子形成期内特异识别、转录的启动子序列而形成的DNA。
作为用于构建该变异芽孢杆菌属细菌的亲本微生物，如果是以进行孢子形成为特征的芽孢杆菌，则其来源没有限定，可以是野生型的也可以是实施了变异的。其中，在本发明中使用的芽孢杆菌属细菌的优选例，可以举出全基因组信息明确的、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、仙人掌杆菌(Bacillus cereus)、halodulans杆菌(Bacillus halodulans)等，特别是从基因工程学、基因组工程学技术已确立的观点、或者具有在细菌体外分泌生产蛋白质的能力的观点出发，优选枯草杆菌。
枯草杆菌的sigA基因是指编码序列号1所示的氨基酸序列的基因，与该基因相当的基因表示编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选98％以上的同源性的氨基酸序列的基因。
虽然在该sigA基因或与该基因相当的基因的上游处连接有在孢子形成期被特异识别、转录的启动子序列，但是作为在孢子形成期被特异识别、转录的启动子序列，可以是天然来源的，也可以是对天然来源进行了改变的，或者也可以是化学合成的。
例如，在枯草杆菌中，可以举出具有以下(1)～(6)的任意一项特征的启动子序列。
(1)伴随Spo0A～P浓度的上升，通过AbrB的转录抑制被解除，并且通过SigA识别、转录的启动子序列
(2)通过SigH识别、转录的启动子序列
(3)通过SigF识别、转录的启动子序列
(4)通过SigE识别、转录的启动子序列
(5)通过SigG识别、转录的启动子序列
(6)通过SigK识别、转录的启动子序列
通常，σ因子识别并结合存在于转录起始点的上游10碱基和35碱基附近的数个碱基的序列，分别称为-10区域、-35区域。两区域的序列、两区域间隔的距离，已知每个σ因子各自具有共通的特征，称为共有序列。因此，在上述(1)～(6)的启动子序列中，可以示例，(1’)伴随Spo0A～P浓度的上升而通过AbrB的转录抑制被解除，且含有SigA的共有序列的序列；(2’)含有SigH的共有序列的序列；(3’)含有SigF的共有序列的序列；(4’)含有SigE的共有序列的序列；(5’)含有SigG的共有序列的序列；(6’)含有SigK的共有序列的序列等。
在表1中示出到此为止所报告的枯草杆菌的各个σ因子的共有序列。
表1
(Bacillus Subtilisand Its Closest Relatives：From Genes to Cells，Editedby A.L.Sonenshein，American Society for Microbiology，pp289，(2002))
序列中，R表示A或G，W表示A或T，N表示任意的碱基。此外，大写字母表示保存性高，小写字母表示保存性低。
此外，到此为止报告的AbrB的识别结合序列用WaWWtttWCAAaaaaW表示(W表示A或T。此外，大写字母表示保存性高，小写字母表示保存性低)(J.Bacteriol.，177，6999，(1995))。
如上所述，在本发明中的在孢子形成期中被特异识别、转录的启动子序列是具有上述(1)～(6)或(1’)～(6’)的任意一种特征的启动子序列。
具有(1)或(1’)的任意一种的特征的启动子序列中，作为天然来源的启动子序列，可以举出在表2中示出的枯草杆菌的基因或操纵子的启动子；具有(2)或(2’)的任意一种的特征的启动子序列中，作为天然来源的启动子序列，可以举出在表3中示出的枯草杆菌的基因或操纵子的启动子；具有(3)或(3’)的任意一种的特征的启动子序列中，作为天然来源的启动子序列，可以举出在表4中示出的枯草杆菌的基因或操纵子的启动子；具有(4)或(4’)的任意一种的特征的启动子序列中，作为天然来源的启动子序列，可以举出在表5中示出的枯草杆菌的基因或操纵子的启动子；具有(5)或(5’)的任意一种的特征的启动子序列中，作为天然来源的启动子序列，可以举出在表6中示出的枯草杆菌的基因或操纵子的启动子；具有(6)或(6’)的任意一种的特征的启动子序列中，作为天然来源的启动子序列，可以举出在表7中示出的枯草杆菌的基因或操纵子的启动子。
此外，表中的各个基因的名称、编号和功能等基于Nature，390，249-256，(1997)所报告、且由JAFAN：Japan Functional Analysis Networkfor Bacillus Subtilis(BSORF DB)因特网公开(http://bacillus.genome.ad.jp/，2003年6月17日更新)的枯草杆菌基因组数据而记载。
表2
(Bacillus Subtilisand other gram-positive bacteria；biochemistry，physiology，and molecular genetics，Edited by A.L.Sonenshein，AmericanSociety for Microbiology，pp757，(1993)；J.Bacteriol.，177，6999，(1995))
表中，关于操纵子，示出了转录单位的前端的基因名称。
表3
(Bacillus subtilisand Its Closest Relatives：From Genes to Cells，Editedby A.L.Sonenshein，American Society for Microbiology，pp289，(2002))
表中，关于操纵子，示出了转录单位的前端的基因名。
表4
(Bacillus subtilisand Its Closest Relatives：From Genes to Cells，Editedby A.L.Sonenshein，American Society for Microbiology，pp 289，(2002))
表中，关于操纵子，示出了转录单位的前端的基因名。
表5
(Bacillus subtilisand Its Closest Relatives：From Genes to Cells，Editedby A.L.Sonenshein，American Society for Microbiology，pp289，(2002))
表中，关于操纵子，示出了转录单位的前端的基因名。
表6
(Bacillus subtilis and Its Closest Relatives：From Genes to Cells，Editedby A.L.Sonenshein，American Society for Microbiology，pp289，(2002))
表中，关于操纵子，示出了转录单位的前端的基因名。
表7
(Bacillus subtilisand Its Closest Relatives：From Genes to Cells，Editedby A.L.Sonenshein，American Society for Microbiology，pp289，(2002))
表中，关于操纵子，示出了转录单位的前端的基因名。
如上所述，作为在本发明中所使用的在孢子形成期被特异识别、转录的启动子序列的适合的例子，可以举出具有上述(1)～(6)或(1’)～(6’)的任意一种的特征的启动子。另一方面，由于也有报告例：在枯草杆菌中，SigE对RNA聚合酶显示比SigA更高的亲和性(J.Bacteriol.，179，4969，(1999))，因此更适合地，优选利用在SigE活化以前转录活化的启动子。作为更优选的该启动子序列，可以举出，伴随Spo0A～P浓度的上升通过AbrB的转录抑制被解除、并且通过SigA识别、转录的启动子序列(与上述(1)或(1’)相当)、或者通过SigH识别、转录的启动子序列(与上述(2)或(2’)相当)。
具有上述(1)或(1’)的任意一种的特征的启动子序列中，作为天然来源的启动子序列，可以举出表1中所示的枯草杆菌的基因或操纵子的启动子序列，其中作为特别适合的例子，可以举出枯草杆菌的sigH的启动子序列。枯草杆菌的sigH的启动子序列为含有序列号2所示的碱基序列中的碱基号987～1027的碱基序列、优选碱基号987～1047的碱基序列、更优选碱基号1～1047的碱基序列的、碱基长度在5000个碱基对以内、优选在2000个碱基对以内、更优选在1047个碱基对以内的碱基序列，并且其具有与该基因的启动子同源的启动子功能。
此外，具有上述(2)或(2’)的任意一种的特征的启动子序列中，作为天然来源的启动子序列，可以举出表2中所示的枯草杆菌的基因或操纵子的启动子，其中作为特别适合的例子，可以举出枯草杆菌的spoIIAA-spoIIAB-sigF操纵子(spoIIA操纵子)的启动子序列。枯草杆菌的spoIIA操纵子的启动子序列，是含有序列号3所示的碱基序列中的碱基号为1081～1110的碱基序列、优选碱基号为1081～1118的碱基序列、更优选碱基号为1～1143个的碱基序列的、碱基长度在5000个碱基对以内、优选在2000个碱基对以内、更优选在1143个碱基对以内的碱基序列，并且是具有与该基因的启动子同源的启动子功能的碱基序列。
此外，作为在本发明中使用的孢子形成期内被特异识别、转录的启动子序列，含有与表1～表6记载的枯草杆菌的各基因或各操纵子的启动子序列相当的序列。例如，作为与枯草杆菌的sigH基因的启动子序列相当的序列，是含有对序列号2所示的碱基序列中的碱基号为987～1027的碱基序列、优选碱基号为1081～1118的碱基序列、更优选碱基号为1～1143的碱基序列，1个或多个碱基被置换、缺失或插入的碱基序列的、碱基长度在5000个碱基对以内、优选在2000个碱基对以内、更优选在1047个碱基对以内的碱基序列，并且可以举出具有与该基因的启动子同源的启动子功能的DNA片段。
此外，作为与spoIIA操纵子的启动子序列相当的序列，是对含有序列号3所示的碱基序列中的碱基号为1081～1110的碱基序列、优选碱基号为1081～1118的碱基序列、更优选碱基号为1～1143的碱基序列，1个或多个碱基被置换、缺失或插入的碱基序列的、碱基长度在5000个碱基对以内、优选在2000个碱基对以内、更优选在1118个碱基对以内的碱基序列，并且可以举出具有与该操纵子的启动子同源的启动子功能的DNA片段。
而且，通过在本发明中使用的特异性地参与孢子形成期的转录的σ因子而识别的启动子序列中，也可以含有构成表2或表3记载的枯草杆菌的基因或枯草杆菌的操纵子的基因的直向同源(ortholog)基因的启动子序列，优选芽孢杆菌属细菌来源的该直向同源基因的启动子序列。直向同源基因可以通过使用在因特网上公开的微生物基因组数据库(Microbial Genome Database，MBGD，http://mbgd.genome.ad.jp/)的Create/view Orthologous gene table程序而发现。作为枯草杆菌sigH基因的直向同源基因的例子，可以举出halodulans杆菌的sigH(BH0115)基因以及仙人掌杆菌的BC0114基因等。此外，作为构成枯草杆菌的spoIIA操纵子的各基因的直向同源基因，可以举出，halodulans杆菌的sigF(BH1538)基因、spoIIAB(BH1537)基因、或spoIIAA(BH1536)，以及仙人掌杆菌的BC4072基因、BC4073基因以及BC4074基因等。
通过特异性参与在该孢子形成期中的转录的σ因子而识别的启动子序列，除了单独使用上述启动子序列，还可以组合多种而使用。
在孢子形成期中被特异识别、转录的启动子序列结合在枯草杆菌的sigA基因或与该基因相当的基因的上游而形成的DNA，例如，可以在原始枯草杆菌基因组上存在的sigA基因的上游存在的SigA识别的启动子序列的上游或下游，通过插入含有在孢子形成期被特异识别、转录的启动子序列的DNA片段，而在基因组上构建。并且，插入含有在孢子形成期被特异识别、转录的启动子序列的DNA片段的部位可以为sigA基因或与该基因相当的基因的上游，但是优选在sigA结构基因的上游侧邻接的2000个碱基对以内的区域、更优选1000个碱基对以内的区域、进一步优选500个碱基对以内的区域、特别优选1～198个碱基对以内的区域。但是，在含有在孢子形成期被特异识别、转录的启动子序列的DNA片段不含有适当的核糖体结合部位的序列的情况下，优选将该DNA片段插入自sigA结构基因15个碱基对以上的上游处。
此外，将在孢子形成期被特异识别、转录的启动子序列的连接到sigA基因或与该基因相当的基因的上游侧的DNA可以通过PCR等方法构建。并且，来源于从连接部位到sigA结构基因之间的、原始枯草杆菌基因组上存在的sigA基因的上游序列的序列，优选为0～2000个碱基对，更优选0～1000个碱基对、进一步优选0～500个碱基对、特别优选0～198个碱基对。但是，在含有在孢子形成期被特异识别、转录的启动子序列的DNA片段不含有适当的核糖体结合部位的序列的情况下，优选来源于从连接部位到sigA结构基因之间的、在原始枯草杆菌基因组上存在的sigA基因的上游序列的序列为15个碱基对以上。为了构建本发明的变异芽孢杆菌属细菌，可以将由此构建的DNA重新导入亲本芽孢杆菌属细菌中。
例如，可以采用的方法如下：通过PCR等方法制备连接了含有在孢子形成期被特异识别、转录的启动子序列的DNA片段和含有sigA基因等的DNA片段的DNA片段，并将其克隆而摄入至可在亲本芽孢杆菌属细菌内复制的质粒载体上。特别地，在作为用于构建本发明的变异芽孢杆菌属细菌的亲本芽胞杆菌属细菌而使用枯草杆菌的情况下，作为可以复制的质粒载体，可以采用以pUB110(Plasmid，15，93，(1986))、pC194(J.Bacteriol.，150，815，(1982))、pTX14-3(Plasmid，30，119，(1993))为代表而已报告的许多质粒载体，。
或者，可以将含有在孢子形成期被特异识别、转录的启动子序列的DNA片段连接至含有sigA基因等的DNA片段的上游的DNA片段，通过同源重组等方法导入基因组上。关于利用同源重组将DNA片段导入基因组上的方法，已经有若干报告(Mol.Gen.Genet.，223，268(1990)等)，根据报告中的方法，可以得到本发明的变异芽孢杆菌属细菌。
以下，更具体地说明，制备连接有通过SOE(重叠延伸拼接法，splicing by overlap extension)-PCR法(Gene，77，51，1989)制备的含有在孢子形成期被特异地识别、转录的启动子序列的DNA片段和含有sigA基因的DNA片段的DNA片段，通过利用同源重组将该DNA片段导入基因组上的方法，但是在本发明中的该DNA片段的导入方法并不限于下述内容。
在本发明中，首先，通过第一次的PCR制备，含有在孢子形成期被特异识别、转录的启动子序列的DNA片段、管家σ因子的结构基因片段、以及耐药标记基因片段3个片段，但是，此时例如使用，按照在含有该启动子序列的DNA片段的下游末端添加管家σ因子的结构基因片段的上游侧10～30个碱基对序列，在耐药标记基因片段的上游末端逆向添加管家σ因子的结构基因片段的下游侧10～30个碱基对序列的方式设计的引物(图2)。
随后，将第一次制备的3种PCR片段作为模板，通过使用含有该启动子序列的片断的上游侧引物和耐药标记基因片段的下游侧引物进行第二次PCR，在含有该启动子序列的片段的下游末端和耐药标记基因片段的上游末端添加的sigA基因片段序列中，发生与sigA基因片段的复性，PCR扩增的结果，可以得到，在sigA基因的上游连接有通过特异性参与孢子形成期的转录的σ因子而识别的启动子序列、并且在其下游连接有耐药标记基因的DNA片段。
作为在孢子形成期内被特异识别、转录的启动子序列，使用枯草杆菌的sigH基因或spoIIA操纵子的启动子，作为耐药标记基因，使用耐氯霉素基因的情况下，例如，可以通过使用表8中所示的引物组，使用Pyrobest DNA聚合酶(宝酒造)等通常的PCR用酶试剂盒等，根据出版物(PCR Protocols.Current Methods and Applications.，Edited byB.A.White，Humana Press，pp 251(1993)、Gene，77，61，(1989)等)所示的通常的条件进行SOE-PCR，而得到希望的DNA片段。
将由此得到的DNA片段导入例如枯草杆菌基因组上的情况下，克隆至在枯草杆菌细胞内不能够复制的质粒载体例如pMW219(JapanGene)，通过细胞感受态法(competent法)摄入至细胞内时，在质粒上的管家σ因子的基因区域和基因组上的sigA基因区域之间发生同源重组，通过根据耐药标记基因的选择，可以分离含有结合有在孢子形成期内被特异地识别、转录的启动子序列的sigA基因的DNA片段被和质粒载体一起共同导入在基因组上的细胞(图2)。即，将克隆用表3所示的引物组制备的DNA片段至pMW219上的质粒摄入枯草杆菌细胞内时，分离在含有氯霉素的琼脂培养基上生长的菌落，可以通过将基因组作为模板的PCR法等确认，连接有sigH基因或spoIIA操纵子的启动子区域和sigA基因的DNA片段被导入到基因组上。
以上主要表示了使用枯草杆菌作为亲本芽孢杆菌属细菌的情况，但是对于其它芽孢杆菌属细菌，也同样可以得到本发明的变异芽孢杆菌属细菌。
通过使用由此得到的芽孢杆菌属细菌，在异种蛋白质或多肽的生产中，由于进行编码异种蛋白质或多肽的基因的转录以及参与蛋白质生产的各种基因的转录的SigA在孢子形成期被表达增强，所以可以达到生产率的提高。
即，在通过SigA识别的启动子的下游结合了编码作为目标的蛋白质或多肽的基因后，通过将其导入根据本发明得到的变异芽孢杆菌属细菌中，由于不仅在营养增殖期而且在孢子形成期目标蛋白质或多肽的生产连续，所以与亲本芽胞杆菌属细菌相比，生产大量的目标蛋白质或多肽。
目标蛋白质或多肽的基因，没有特别限制，包括洗剂、食品、纤维、饲料、化学品、医疗、诊断等各种工业用酶以及生物活性肽等。此外，按照工业用酶的功能种类，包括氧化还原酶(Oxidoreductase)、转移酶(Transferase)、水解酶(Hydrolase)、裂合酶(Lyase)、异构酶(Isomerase)、合成酶(Ligase/Synthetase)等，但是优选的可以举出纤维素酶、α-淀粉酶、蛋白酶等水解酶的基因。具体地说，可以举出属于多糖水解酶的分类(Biochem.J.，280，309(1991))中第5族的纤维素酶，可以举出其中微生物来源、特别是芽孢杆菌属细菌来源的纤维素酶。作为更具体的例子，可以举出由序列号4或序列号6所表示的氨基酸序列所组成的、芽孢杆菌sp(Bacillus sp.)KSM-S237株(FERMBP-7875)或芽胞杆菌sp(Bacillus sp.)KSM-64株(FERM BP-2886)来源的碱性纤维素酶，或者由与该氨基酸序列具有70％、优选80％、更优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选98％以上的同一性的氨基酸序列构成的纤维素酶。
此外，作为α-淀粉酶的具体例子，可以举出微生物来源的α-淀粉酶，特别优选芽胞杆菌属细菌来源的液化型淀粉酶。作为更具体的例子，可以举出由序列号19所表示的氨基酸序列构成的芽胞杆菌属sp(Bacillus sp.)KSM-K38株(FERM BP-6946)来源的碱性淀粉酶，或者与该氨基酸序列具有70％、优选80％、更优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选98％以上的同一性的氨基酸序列所构成的淀粉酶。而且，氨基酸序列的同一性通过Lipman-Pearson法(Science，227，1435，(1985))计算。此外，作为蛋白酶的具体例子，可以举出微生物来源的、特别是芽胞杆菌属细菌来源的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。作为更具体的例子，可以举出由序列号21所表示的氨基酸序列组成的克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16株(FERM BP-3376)来源的碱性蛋白酶，或者由与该氨基酸序列具有70％、优选80％、更优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选98％以上的同一性的氨基酸序列所组成的蛋白酶。
另一方面，如前所述的目标蛋白质或多肽基因，需要在其上游结合通过SigA等的管家σ因子识别的启动子序列，而且，还希望适当结合与翻译、分泌有关的控制区域，即，含有核糖体结合部位和起始密码子的翻译起始区域和分泌用信号肽区域。例如，希望含有由日本特开2000-210081号公报和日本特开平4-190793号公报等中记载的芽孢杆菌属细菌、即KSM-S237株(FERM BP-7875)、KSM-64株(FERMBP-2886)来源的纤维素酶基因的管家σ因子转录的启动子的转录起始控制区域、翻译起始区域、分泌用信号肽区域，更具体地说，由序列号5所表示的碱基序列的碱基号为1～659的碱基序列、序列号7所表示的碱基序列所组成的纤维素酶基因的碱基号为1～696的碱基序列，或者对该碱基序列具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选98％以上的同一性的碱基序列所构成的DNA片段，或者由上述任意碱基序列的一部分缺失的碱基序列组成的DNA片段，与目标蛋白质或多肽的结构基因适当地结合。
可以通过将结合了含有上述目标蛋白质或多肽基因的DNA片段和适当的质粒载体的重组质粒，按照一般的转化法摄入到本发明的变异芽孢杆菌属细菌中，从而使目标蛋白质或多肽的生产率提高。此外，通过使用在该DNA片段上将与本发明的变异芽孢杆菌属细菌基因组的适当的同源区域相结合的DNA片段，直接编入本发明的变异芽孢杆菌属细菌基因组中，从而使目标蛋白质或多肽的生产率提高。
将本发明的变异芽孢杆菌属细菌作为宿主的目标蛋白质或多肽的生产，可以通过将该菌株接种到含有同化性的碳源、氮源以及其它必需成分的培养基中，按照常规的微生物培养方法培养，培养结束后，采取精制蛋白质或多肽而进行。
根据以上所述，可以构建在孢子形成期的sigA基因的转录效率提高的芽孢杆菌属细菌，如果用该变异芽孢杆菌属细菌作为重组生产的宿主细胞，可以有效生产有用的蛋白质或多肽。
以下，用实施例对本发明的变异芽孢杆菌属细菌的构建方法以及使用该变异芽孢杆菌属细菌作为宿主的纤维素酶的生产方法进行具体说明。
实施例
实施例1用于将具有在孢子形成期被特异转录的启动子的sigA基因导入到枯草杆菌基因组上的质粒的构建
与图2所示的方法同样，进行用于利用1次交叉的同源重组而向枯草杆菌基因组上导入在sigA结构基因的上游连接有sigH基因启动子或spoIIA操纵子启动子的DNA片段的质粒的构建。即，将从枯草杆菌168株提取的基因组DNA作为模板，用表8中所示的sigAf和sigAr的引物组通过PCR制备含有sigA基因的1.2kb片段(A)。同样用如表8所示的sigHUf和sigHUr-sigA的引物组，制备含有在基因组上的sigH基因的上游处邻接的sigH基因的启动子的1.0kb片段(B)。同样用如表8所示的sigFUf和sigFUr-sigA的引物组，制备含有在基因组上的spoIIA操纵子的上游处邻接、控制sigF基因的转录的spoIIA操纵子的启动子的1.1kb片段(C)。此外，将质粒pC194(J.Bacterio.150(2)，815(1982))作为模板，用表8中所示的CmFW和Cmr-sigA的引物组制备含有耐氯霉素抗基因的0.9kb片段(D)。随后，将得到的(A)(B)(D)3片段混合后作为模板，通过进行用表8中所示的sigHUf和CmFW的引物组的SOE-PCR，按照使3片段成为(B)(A)(D)的顺序结合，sigH基因的启动子连接在sigA结构基因的上游处，更进一步得到在其下游逆向结合有耐氯霉素基因的3.1kb的DNA片段(E)。同样将(A)(C)(D)3片段混合后作为模板，通过进行使用表8中所示的sigFUf和CmFW的引物组的SOE-PCR，按照成为(C)(A)(D)的顺序的方式将3片段结合，得到spoIIA操纵子启动子连接在sigA结构基因的上游，而且在其下游逆向结合有耐氯霉素基因的3.2kb的DNA片段(F)。将3.1kb的DNA片段(E)和3.2kb的DNA片段(F)分别插入不能在枯草杆菌细胞内复制的大肠杆菌用质粒载体pMW219的SmaI限制性内切酶的切断点，构建用于将具有在孢子形成期被特异转录的启动子的sigA基因导入枯草杆菌基因组上的质粒pMWPHsigA和pMWPFsigA。
此外，上述引物中，通过分别用表8中所示的sigAmf和sigFUr-sigAm取代sigAf和sigFUr-sigA而进行同样的操作，构建将pMWPFsigA中的sigA基因的起始密码子(ATG)置换为作为起始密码子不被识别的(ATA)的pMWPFsigAm。
实施例2将具有在孢子形成期被特异转录的启动子的sigA基因向枯草杆菌168株的基因组的导入
使用将具有在孢子形成期被特异转录的启动子的sigA基因或起始密码子(ATG)被置换为(ATA)的sigA基因(sigAm)导入到枯草杆菌基因组上的质粒pMWPHsigA、pMWPFsigA和pMWPFsigAm，通过细胞感受态法(competent法)，分别进行枯草杆菌168株的转化，将在含有氯霉素的LB琼脂培养基上生长的菌落作为转化体分离。通过将从所得的转化体提取的基因组作为模板进行PCR，根据基因组上的sigA基因和质粒上的sigA基因或sigAm之间的同源重组，确认，具有在孢子形成期被特异转录的启动子的sigA或sigAm，与1.2kb片段(D)一起被插入基因组内，命名为168PHsigA株、168PFsigA株和168PFsigAm株。
实施例3枯草杆菌变异株的碱性纤维素酶的分泌生产评价
在实施例2中所得的3种枯草杆菌变异株(168PHsigA株、168PFsigA株和168PFsigAm株)和作为对照的的枯草杆菌168株中，通过转化法导入在穿梭载体pHY300PLK(Yakult)的BamHI限制性内切酶的切断点处插入有编码芽孢杆菌sp(Bacillus sp.)KSM-S237株(FERM BP-7875)来源的碱性纤维素酶(日本特开2000-210081号公报)的DNA片段(3.1kb)的重组质粒pHY-S237。将由此得到的菌株在10mL的LB培养基中37℃振荡培养过夜，并将该培养液0.05mL接种到50mL的2×L-麦芽糖培养基(2％胰胨、1％酵母提取物、1％NaCl、7.5％麦芽糖、7.5ppm硫酸锰4-5水合物和15ppm四环素)中，在30℃进行振荡培养3天。培养后，测定通过离心分离除去菌体的培养液上清液的碱性纤维素酶活性，从而求得通过培养在菌体外分泌生产的碱性纤维素酶的量。其结果，如表9所示，和对照的168株(野生型)的情况相比，作为宿主使用168PHsigA株或168PFsigA株的情况可以看到高的碱性纤维素酶的分泌生产。另一方面，从作为宿主使用168PFsigAm的情况下的碱性纤维素酶的分泌量与对照的168株(野生型)相等，可以推测，在168PHsigA株或168PFsigA株中的高生产化，通过具有在基因组上新添加的sigH基因或spoIIA操纵子的启动子的sigA基因，从而生产了SigA而引起的。
表8
表9
实施例4枯草杆菌变异株的碱性蛋白酶的分泌生产的评价
为了确认在实施例3中证明了碱性纤维素酶的生产率的提高的168PHsigA株和168PFsigA株在其它蛋白质或多肽生产中的有效性，如以下那样进行芽孢杆菌属细菌来源的碱性蛋白酶的生产率的评价。
将从克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16株(FERMBP-3376)提取的基因组DNA作为模板，用表10中所示的S237pKAPpp-F和KAPter-R(BglII)的引物组进行PCR，扩增编码具有序列号21所示的氨基酸序列的碱性蛋白酶(Appl.Microbiol.Biotechnol.，43，473，(1995))的1.3kb的DNA片段(G)。此外，将从芽孢杆菌sp(Bacillus sp.)KSM-S237株(FERM BP-7875)提取的基因组DNA作为模板，用表10中所示的S237ppp-F2(BamHI)和S237pKAPpp-R的引物组进行PCR，扩增含有碱性纤维素酶基因(日本特开2000-210081号公报)的启动子区域的0.6kb的DNA片段(H)。随后，将所得的(G)(H)2个片段混合作为模板，通过进行用表10中所示的S237ppp-F2(BamHI)和KAPter-R(BglII)的引物组的SOE-PCR，得到在碱性纤维素酶基因的启动子区域的下游处连接有碱性蛋白酶基因的1.8kb的DNA片段(I)。将得到的1.8kb的DNA片段(I)插入穿梭载体pHY300PLK(Yakult)的BamHI-BglII限制性内切酶的切断点，构建碱性蛋白酶生产率评价用的质粒pHYKAP(S237p)。
将构建的质粒pHYKAP(S237p)，通过转化体细胞感受态法导入168PHsigA株、168PFsigA株和作为对照的枯草杆菌168株中。将由此得到的菌株按照与实施例3相同的条件，振荡培养3天。培养后，测定通过离心分离除去细胞体的培养液上清液的碱性蛋白酶活性，从而求得通过培养在细胞体外分泌生产的碱性蛋白酶的量。结果，如表11所示，确认和对照的168株(野生型)的情况相比较，使用作为宿主的168PHsigA株和168PFsigA株的情况下，碱性蛋白酶的分泌生产高。
表10
表11
实施例5枯草杆菌变异株的碱性淀粉酶的分泌生产的评价
在实施例3和4中证明了碱性纤维素酶和碱性蛋白酶的生产率提高，为了进一步确认168PHsigA株和168PFsigA株在生产其它蛋白质或多肽中的有效性，以下进行芽孢杆菌属细菌来源的碱性淀粉酶的生产率的评价。
将从芽孢杆菌sp(Bacillus sp.)KSM-K38株(FERM BP-6946)提取的基因组DNA作为模板，用表10中所示的K38matu-F2(ALAA)和SP64K38-R(XbaI)的引物组进行PCR，扩增为具有序列号19所示的氨基酸序列的编码碱性淀粉酶(Appl.Environ.Microbiol.，67，1744，(2001))的1.5kb的DNA片段(J)。此外，将从芽孢杆菌sp(Bacillussp.)KSM-S237株(FERM BP-7875)提取的基因组DNA作为模板，用表10中所示的S237ppp-F2(BamHI)和S237ppp-R2(ALAA)的引物组进行PCR，扩增含有碱性纤维素酶基因(日本特开2000-210081号公报)的启动子区域和编码分泌信号序列的区域的0.6kb的DNA片段(K)。随后，将所得的(J)(K)的2个片段混合后作为模板，用表10中所示的S237ppp-F2(BamHI)和SP64K38-R(XbaI)的引物组通过进行SOE-PCR，在碱性纤维素酶基因的启动子区域和编码分泌信号序列的区域的下游处连接碱性淀粉酶基因，得到2.1kb的DNA片段(L)。将得到的2.2kb的DNA片段(L)导入穿梭载体pHY300PLK(Yakult)的限制性内切酶的切断点BamHI-XbaI，从而构建用于碱性淀粉酶生产率评价的质粒pHYK38(S237ps)。
将构建的质粒pHYK38(S237ps)，通过转化体细胞感受态法导入168PHsigA株、168PFsigA株和作为对照的枯草杆菌168株中。将由此得到的菌株按照与实施例3相同的条件，振荡培养5天。培养后，测定通过离心分离除去细胞体的培养液上清液的碱性淀粉酶活性，从而求得通过培养在细胞体外分泌生产的碱性淀粉酶的量。结果，如表12所示，证明了：和对照的168株(野生型)的情况相比较，在使用作为宿主的168PHsigA株和168PFsigA株的情况下，碱性淀粉酶的分泌生产高，上述变异株显示出在各种蛋白质或多肽的生产中有效。
表12
Claims (9)
1.一种变异芽孢杆菌属细菌，其特征在于，
在基因组上或质粒上，具有通过将含有在孢子形成期被特异识别、转录的启动子序列的DNA片段插入到与sigA基因的上游侧邻接的1～198个碱基对的区域中而形成的DNA，
所述在孢子形成期被特异识别、转录的启动子序列为枯草杆菌的sigH基因的启动子序列和/或枯草杆菌的spoIIA操纵子的启动子序列，
所述sigA基因是编码序列号1所示的氨基酸序列的基因。
2.如权利要求1所述的变异芽孢杆菌属细菌，其特征在于，
芽孢杆菌属细菌为枯草杆菌。
3.一种重组微生物，其特征在于，
是在权利要求1或2所述的变异芽孢杆菌属细菌内导入有编码异种蛋白质或多肽的基因的重组微生物。
4.一种蛋白质或多肽的制造方法，其特征在于，
使用权利要求3所述的重组微生物。
5.如权利要求4所述的制造方法，其特征在于，
蛋白质为纤维素酶、淀粉酶或蛋白酶。
6.如权利要求5所述的制造方法，其特征在于，
纤维素酶为由序列号4所示的氨基酸序列构成的碱性纤维素酶，或者对于该氨基酸序列具有70％以上的同源性、并且具有碱性纤维素酶活性的纤维素酶。
7.如权利要求5所述的制造方法，其特征在于，
淀粉酶为由序列号19所示的氨基酸序列构成的碱性淀粉酶，或者对于该氨基酸序列具有70％以上的同源性、并且具有碱性淀粉酶活性的淀粉酶。
8.如权利要求5所述的制造方法，其特征在于，
蛋白酶为由序列号21所示的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶，或者对于该氨基酸序列具有70％以上的同源性、并且具有碱性蛋白酶活性的蛋白酶。
9.一种变异芽孢杆菌属细菌的构建方法，其特征在于，
进行构建以使得在芽孢杆菌属细菌的基因组上或质粒上，具有通过将含有在孢子形成期被特异识别、转录的启动子序列的DNA片段插入到与sigA基因的上游侧邻接的1～198个碱基对的区域中而形成的DNA，
所述在孢子形成期被特异识别、转录的启动子序列为枯草杆菌的sigH基因的启动子序列和/或枯草杆菌的spoIIA操纵子的启动子序列，
所述sigA基因是编码序列号1所示的氨基酸序列的基因。
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