JP2012200168A - 遺伝子欠損株及びそれを用いたタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
【解決手段】特定の遺伝子欠失を組み合わせた枯草菌変異株。
【選択図】なし
Description
(1) epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprE及びaprXから選択される細胞外プロテアーゼ遺伝子が8個以上欠失又は不活性化し、かつ、cwlB、cwlF、PBSX、spoIIIC及びsigDから選択される溶菌酵素関連遺伝子又は遺伝子群が1個以上欠失又は不活性化している枯草菌変異株。
(2) 前記細胞外プロテアーゼ遺伝子が9個欠失又は不活性化している、前記(1)記載の枯草菌変異株。
(3) 細胞外プロテアーゼ遺伝子epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprE及びaprXと、溶菌酵素関連遺伝子又は遺伝子群cwlB、cwlF、PBSX、spoIIIC及びsigDと、が全て欠失又は不活性化している枯草菌変異株。
(4) 更に、異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を有する、前記(1)から(3)のいずれか1つに記載の枯草菌変異株。
(5) 前記異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、又は分泌用シグナル領域が結合している、前記(4)記載の枯草菌変異株。
(6) 前記転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌シグナル領域が、バチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域に由来するものである、前記(5)記載の枯草菌変異株。
(7) 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌シグナル領域が、配列番号86で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号88で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと70%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は、当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片である、前記(5)記載の枯草菌変異株。
(8) 前記(1)から(7)のいずれか1つに記載の枯草菌変異株を用いる、異種タンパク質又はポリペプチドの製造方法。
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枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表3−1、表3−2に示すeprfw1とeprUpr、及びeprDNfとeprrv−repの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のepr遺伝子の上流に隣接する0.6kb断片(A)、及び下流に隣接する0.5kb断片(B)をそれぞれ調製した。また別途プラスミドpC194(J.Bacteriol.150(2),815(1982))由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子の上流にプラスミドpUB110(Plasmid 15,93(1986))由来のrepU遺伝子のプロモーター領域(Nucleic Acids Res.17,4410(1989))を連結した1.2kb断片(C)を調製した。次に、得られた(A)(B)(C)3断片を混合して鋳型とし、表3−1、表3−2のプライマーeprfw2とCmrv2を用いたSOE−PCRを行うことによって、3断片を(A)(B)(C)の順になる様に結合させ、2.2kbのDNA断片を得た(図2)。このDNA断片の末端を平滑化及び5’−リン酸化し、プラスミドpUC118(Methods Enzymol.153,3(1987))のSmaI制限酵素部位に挿入してepr遺伝子欠失用プラスミドpUC118−CmrΔeprを構築した。尚、上記1.2kb断片(C)は、repUfwとrepUr−Cmのプライマーセット(表3−1、表3−2)及び鋳型としてプラスミドpUB110を用いて調製したrepU遺伝子プロモーター領域を含む0.4kb断片(D)と、CmUf−repとCmrv1のプライマーセット(表3−1、表3−2)及び鋳型としてプラスミドpC194を用いて調製したクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む0.8kb断片(E)とを混合して鋳型とし、表3−1、表3−2に示すプライマーrepUfwとCmrv1を用いたSOE−PCRを行なうことによって調製した。
実施例1にて構築したepr遺伝子欠失用プラスミドpUC118−CmrΔeprをコンピテントセル形質転換法(J.Bacteriol.93,1925(1967))によって枯草菌168株に導入し、epr遺伝子上流領域、あるいは下流領域の相当する領域間での1重交差の相同組換えによりゲノムDNAと融合した形質転換株を、クロラムフェニコール耐性を指標に取得した。得られた形質転換株をLB培地に接種し、37℃にて2時間培養後、再度、コンピテンス誘導操作を行うことにより、ゲノム上で重複して存在するepr遺伝子上流領域、あるいは下流領域の間におけるゲノム内相同組換えを誘導した。図2に示す様に、プラスミド導入の際と異なる領域で相同組換えが生じた場合、プラスミドに由来するクロラムフェニコール耐性遺伝子及びpUC118ベクター領域の脱落に伴ってepr遺伝子が欠失する。次に、クロラムフェニコール感受性となった株の存在比率を高める為、以下の要領でアンピシリン濃縮操作を行なった。コンピテントセル誘導後の培養液を終濃度5ppmのクロラムフェニコール及び終濃度100ppmのアンピシリンナトリウムを含むLB培地1mLに、600nmにおける濁度(OD600)が0.003となるように接種した。37℃にて5時間培養後、10,000ppmのアンピシリンナトリウム水溶液を10μL添加し、更に3時間培養した。培養終了後、2%塩化ナトリウム水溶液にて菌体を遠心洗浄した後、1mLの2%塩化ナトリウム水溶液に懸濁し、懸濁液100μLをLB寒天培地に塗沫した。37℃にて約15時間インキュベートし、生育した菌株のうち、プラスミド領域の脱落に伴ってクロラムフェニコール感受性となった株を選抜した。選抜した菌株のゲノムDNAを鋳型とし、表3−1、表3−2に示すプライマーeprfw2とeprrv−repを用いたPCRを行なってepr遺伝子欠失の確認を行ない、epr遺伝子欠失株を取得した。
epr遺伝子欠失株に対し、次の欠失としてwprA遺伝子の欠失をepr遺伝子欠失と同様に行なった。即ち、実施例1と同様にしてwprA遺伝子欠失用プラスミドpUC118−CmrΔwprAを構築し、構築したプラスミドのゲノムDNAへの導入とそれに続くゲノム内相同組換えによるwprA遺伝子の欠失によりepr遺伝子とwprA遺伝子の2重欠失株を取得した。以降同様の操作を繰り返すことにより、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprEの各遺伝子を順次欠失させ、8種類のプロテアーゼ遺伝子が欠失したプロテアーゼ8重欠失株を構築し、Δ8prt株と命名した。更に同様の操作を繰り返すことによりaprX遺伝子を欠失させたプロテアーゼ9重欠失株を構築し、Δ9prt株と命名した。各欠失を行う際に用いたプライマーの配列を表3−1、表3−2に示し、また各プライマーと実施例1で示したepr遺伝子欠失に用いたプライマーとの対応について表4に示す。
実施例3と同様にして、Δ9prt株より表3−1、表3−2及び表4に示すcwlB遺伝子欠失用のプライマーセットを用いてcwlB遺伝子の欠失を行い、9種類のプロテアーゼ遺伝子とcwlB遺伝子が欠失したΔ9B株を構築した。続いてPBSX遺伝子群の欠失を行うこととした。尚、本発明においてPBSX遺伝子群とは、枯草菌ゲノム上に連続して存在するxlyB遺伝子〜spoIISA遺伝子の38遺伝子群を指すものとする。Δ9B株より表3−1、表3−2及び表4に示すPBSX遺伝子群欠失用のプライマーセットを用いてPBSX遺伝子群の欠失を行い、Δ9BP株を構築した。またΔ9B株より表3−1、表3−2及び表4に示すcwlF遺伝子欠失用のプライマーセットを用いてcwlF遺伝子の欠失を行い、Δ9BF株を構築した。更にΔ9BP株より表3−1、表3−2及び表4に示すcwlF遺伝子欠失用のプライマーセットを用いてcwlF遺伝子の欠失を行い、Δ9BPF株を構築した。
図1に基づいて、ゲノム中spoIIIC遺伝子の薬剤耐性遺伝子による欠失方法を説明する。尚、spoIIIC遺伝子は、spoIVCB遺伝子と共に枯草菌の胞子形成期に特異的に機能するシグマ因子SigKをコードする遺伝子である。
図1に基づいて、ゲノム中sigD遺伝子の薬剤耐性遺伝子による欠失方法を説明する。尚、sigD遺伝子は枯草菌の細胞壁溶解、鞭毛形成、あるいは走化性等に関与する遺伝子の発現を制御するシグマ因子SigDをコードする遺伝子である。
プラスミドの構築は、In−FusionTM Advantage PCR Cloning Kit(Clontech社)を用いて行なった(図3)。プロトコールに従って設計したプライマー(表3−1、表3−2)を用いて、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−S237株(FERM BP−7875)由来のアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000−210081号)のプロモーターとシグナル配列の断片を、pHYS237(Biosci.Biotechnol.Biochem.,64(11):2281−9,2000)を鋳型にして、並びに、配列番号82で示される枯草菌セルラーゼ遺伝子bglCを、枯草菌ゲノムDNAを鋳型にして、それぞれPSF_infu(EcI)とPS237Rのプライマーセット、及びbglC−sig/PSFとbglC_infu(SaI)のプライマーセットを用いて増幅した。得られた増幅産物を、制限酵素EcoRI及びSalI消化により線状化したpHY300PLK及びIn−Fusion酵素を適当量で混合して30分間反応を行ない、S237セルラーゼのプロモーター配列及びシグナル配列にbglCの構造遺伝子が連結したプラスミドを構築し、それをpHPS−bglCと命名した。更に、当該プラスミドを大腸菌HB101コンピテントセル(TaKaRa)に導入し、形質転換した。
実施例7にて構築したプラスミドpHPS−bglCを、プロトプラスト形質転換法によって実施例3及び実施例6にて構築した枯草菌変異株Δ9prt株及びΔ9lyt株に導入した。同様に枯草菌野生株168株にも導入した。これにより得られた組換え菌株を、10mLのLB培地で30℃で一晩振盪培養し、更にこの培養液0.05mLを50mLの2×L−マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%NaCl、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4−5水和物、15ppmテトラサイクリン)に接種し、30℃にて3日間振盪培養を行った。遠心分離によって菌体を除くことにより培養液上清を得た。
実施例8にて得られた培養液上清5μL分をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE;濃縮ゲル4%、分離ゲル12.5%)に供し、タンパク質バンドの分離を行った(168株組換え菌株の2サンプル、Δ9prt株組換え菌株の2サンプル、Δ9lyt株組換え菌株の3サンプル)。その結果を図4に示す。168株組換え菌の培養上清には目的の枯草菌セルラーゼ遺伝子bglCがコードするセルラーゼBglCの分子量に相当する位置にバンドは認められなかった。一方でΔ9prt株組換え菌株とΔ9lyt株組換え菌株の培養上清にはBglCの分子量に相当する位置にバンドが認められたことから、両株において欠失されているプロテアーゼ遺伝子がコードするプロテアーゼがBglCの分解に関与しており、これらのプロテアーゼ遺伝子の欠失によりBglCの分泌生産が可能になったと考えられた。またΔ9prt株組換え菌株の培養上清には目的とするBglC以外のタンパク質が著量認められるのに対し、Δ9lyt株組換え菌株ではこれら夾雑タンパク質は大幅に減少していた。即ち、Δ9prt株では溶菌酵素関連遺伝子群の機能性産物の作用により細胞の溶解、及び細胞内タンパク質の漏出が起こっており、Δ9lyt株ではこの様な溶菌現象に伴うタンパク質の漏出が抑制された結果、培養上清中の夾雑タンパク質が減少したものと考えられた。
セルロース(粉砕パルプ)を用い、セルロース糖化反応を行った。なお粉砕パルプは、粉末状パルプ(日本製紙ケミカル社製「W−400G」、400メッシュパス90以上、セルロース含有量99質量%、水分含量1質量%)を媒体撹拌式ミル(アトライタ、三井鉱山(株)製、「MA1D−X」、容器全容量:5.5L)に500g投入し、媒体として、直径10mm、材質ジルコニア、ジルコニアボール:11kgをアトライタに充填(充填率59%)して、回転数307rpmの条件で、2時間粉砕処理することにより粉砕パルプを調製した。
150mgの上記粉砕パルプを、3mLの酵素反応液(最終濃度0.1M酢酸緩衝液(pH5)、蓋つきスクリュー管(No.5、φ27×55mm;マルエム製))に懸濁し、Δ9prt株組換え菌株、あるいはΔ9lyt株組換え菌株の培養上清を500μL添加し、50℃で振盪撹拌(150rpm、タイテック製恒温振盪機「BR−15CF」)しながら所定の時間反応させた。反応終了後、遠心分離(4℃、12,000rpm、5分間)によって沈殿物と上清液を分離し、上清液中に遊離した還元糖をDNS法によって定量した。
DNS溶液200μLに上清液2μLを添加し、100℃で5分間熱処理した。冷却後、反応液100μLの吸光度(535nm)をマイクロプレートリーダー(Molecular Devices社製)で測定した。上清液に遊離した還元糖量をDNS法(「生物化学実験法」還元糖の定量法、学会出版センター)によってグルコース換算により定量した。糖化率(%)は、「遊離還元糖量×0.9÷反応前のホロセルロース量×100」で算出した。各培養液上清の粉砕パルプに対する糖化活性を表5に示す。
N252セルラーゼ分泌生産用プラスミドを以下の様に構築した。
アルカリセルラーゼ分泌生産性評価は以下の様に行った。即ち、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−S237株(FERM BP−7875)由来のアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000−210081号公報)断片(3.1kb)がシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY−S237を、プロトプラスト形質転換法により実施例3及び4にて構築した枯草菌変異株Δ9prt株、Δ9BP株及びΔ9BF株、更に野生株168株に導入した。これによって得られた各組換え菌株を10mLのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05mLを50mLの2×L−マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1% NaCl、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4−5水和物、15ppmテトラサイクリン)に接種し、30℃にて3日間振盪培養を行った。遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。セルラーゼ活性測定については、1/7.5Mリン酸緩衝液(pH7.4、和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p−nitrophenyl−β−D−cellotrioside(生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp−ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。また遠心分離を行う前の培養液を1%塩化ナトリウム水溶液にて適宜希釈した後、分光光度計DU650(ベックマンコールター)を用いて測定した600nmの濁度(OD600)を生育度とした。
Claims (8)
- epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprE及びaprXから選択される細胞外プロテアーゼ遺伝子が8個以上欠失又は不活性化し、かつ、cwlB、cwlF、PBSX、spoIIIC及びsigDから選択される溶菌酵素関連遺伝子又は遺伝子群が1個以上欠失又は不活性化している枯草菌変異株。
- 前記細胞外プロテアーゼ遺伝子が9個欠失又は不活性化している、請求項1記載の枯草菌変異株。
- 細胞外プロテアーゼ遺伝子epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprE及びaprXと、
溶菌酵素関連遺伝子又は遺伝子群cwlB、cwlF、PBSX、spoIIIC及びsigDと、が全て欠失又は不活性化している枯草菌変異株。 - 更に、異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を有する、請求項1から3のいずれか1項記載の枯草菌変異株。
- 前記異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、又は分泌用シグナル領域が結合している、請求項4記載の枯草菌変異株。
- 前記転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌シグナル領域が、バチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域に由来するものである、請求項5記載の枯草菌変異株。
- 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌シグナル領域が、配列番号86で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号88で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと70%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は、当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片である、請求項5記載の枯草菌変異株。
- 請求項1から7のいずれか1項記載の枯草菌変異株を用いる、異種タンパク質又はポリペプチドの製造方法。
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