JP2018516076A - Aldcの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2015年5月22日に出願された米国仮特許出願第62/165690号明細書、2015年5月26日に出願された米国仮特許出願第62/166616号明細書および2015年5月29日に出願された米国仮特許出願第62/168415号明細書の優先権および利益を主張するものであり、各仮特許出願の名称は「ALDC方法」である。
2016年5月5日に作成され、本明細書に添付される、16,795バイトのサイズを有する「20160505_NB40737_PCT_SEQS_ST25.txt」という名称のファイルで提供される配列表は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
1.
Ai)バチルス(Bacillus)宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ(vpr)および/または細胞壁プロテアーゼ(wprA)を宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含む、バチルス(Bacillus)宿主細胞を用意する工程であって、その宿主細胞は、プロモーターと作動可能に結合した異種ALDC酵素をコードする核酸で形質転換されている、工程;および
ii)異種ALDC酵素の産生に好適な条件下で宿主細胞を培養する工程であって、それにより異種ALDC酵素が産生される、工程;または
Bi)バチルス(Bacillus)宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ(vpr)および/または細胞壁プロテアーゼ(wprA)を宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含む、バチルス(Bacillus)宿主細胞を用意する工程であって、その宿主細胞は、宿主細胞に、ALDC酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換されている、工程;および
ii)ALDC酵素の産生に好適な条件下で宿主細胞を培養する工程であって、それによりALDC酵素が産生される、工程
を含む、アセト乳酸デカルボキシラーゼ(ALDC)酵素を製造する方法。
2.産生されたALDC酵素を回収する工程をさらに含む、段落1の方法。
3.バチルス(Bacillus)宿主細胞は、バチルス・サブチリス(B.subtilis)である、段落1または2の方法。
4.バチルス(Bacillus)宿主細胞は、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素(Epr)をさらに欠失している、段落1〜3のいずれか1つの方法。
5.バチルス(Bacillus)宿主細胞は、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素(IspA)および/または内因性バシロペプチダーゼ(bacillopeptidase)F酵素(Bpr)をさらに欠失している、段落1〜4のいずれか1つの方法。
6.バチルス(Bacillus)宿主細胞は、中性メタロプロテアーゼ酵素(NprE)を欠失している、段落1〜5のいずれか1つの方法。バチルス(Bacillus)宿主細胞は、内因性中性メタロプロテアーゼ酵素(NprE)を欠失している、段落6の方法。
7.宿主細胞は、内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素(AprE)をさらに欠失している、段落1〜6のいずれか1つの方法。
8.宿主細胞は、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素(Vpr)をさらに欠失している、段落1〜7のいずれか1つの方法。
9.宿主細胞は、内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素(WprA)をさらに欠損している、段落1〜8のいずれか1つの方法。
10.宿主は、低減された量の、ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrOおよびywaDからなる群から選択される1種以上の追加のプロテアーゼをさらに有する、段落1〜9のいずれか1つの方法。宿主は、低減された量の、ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrO、およびywaDからなる群から選択される1種以上の追加の内因性プロテアーゼをさらに有する、段落1〜9のいずれか1つの方法。
11.遺伝子変異は、親細胞に存在する遺伝子の破壊を含む、段落1〜10のいずれか1つの方法。
12.破壊は、遺伝子の全部または一部の欠損の結果である、段落11の方法。
13.遺伝子の破壊は、遺伝子を含むゲノムDNAの一部の欠損の結果である、段落11の方法。
14.遺伝子の破壊は、変異誘発の結果である、段落11〜13のいずれか1つの方法。
15.遺伝子の破壊は、部位特異的組み換えを用いて行われる、段落11〜14のいずれか1つの方法。
16.遺伝子の破壊は、遺伝子の遺伝子座への選択マーカーの導入と組み合わされて行われる、段落11〜15のいずれか1つの方法。
17.ALDC酵素は、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ブレビバクテリウム・アセチリカム(Brevibacterium acetylicum)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、ロイコノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・ブレビス(Bacillu sbrevis)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)DXまたはバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)に由来する、段落1〜16のいずれか1つの方法。
18.ALDC酵素は、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)またはバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)に由来する、段落1〜17のいずれか1つの方法。
19.ALDC酵素は、配列番号2、配列番号3、配列番号5、配列番号7および配列番号8、またはそれらのいずれかの機能的断片から選択されるいずれか1つと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、段落1〜18のいずれか1つの方法。
20.プロモーターと作動可能に結合した異種ALDC酵素をコードする核酸を含むバチルス(Bacillus)宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ(vpr)および/もしくは細胞壁プロテアーゼ(wprA)を宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含む、バチルス(Bacillus)宿主細胞、またはバチルス(Bacillus)宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ(vpr)および/もしくは細胞壁プロテアーゼ(wprA)を宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含み、宿主細胞に、ALDC酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸を含む、バチルス(Bacillus)宿主細胞。
21.バチルス(Bacillus)宿主細胞は、バチルス・サブチリス(B.subtilis)である、段落20のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
22.宿主は、低減された量の内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素(Epr)をさらに有する、段落20または段落21のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
23.宿主は、低減された量の内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素(IspA)および/または内因性バシロペプチダーゼF酵素(Bpr)をさらに有する、段落20〜22のいずれか1つのバチルス(Bacillus)宿主細胞。
24.宿主は、低減された量の中性メタロプロテアーゼ酵素(NprE)をさらに有する、段落20〜23のいずれか1つのバチルス(Bacillus)宿主細胞。宿主は、低減された量の内因性中性メタロプロテアーゼ酵素(NprE)をさらに有する、段落20〜23のいずれか1つのバチルス(Bacillus)宿主細胞。
25.宿主は、低減された量の内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素(AprE)をさらに有する、段落20〜24のいずれか1つのバチルス(Bacillus)宿主細胞。
26.宿主細胞は、低減された量の内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素(Vpr)をさらに有する、段落20〜25のいずれか1つのバチルス(Bacillus)宿主細胞。
27.宿主細胞は、低減された量の内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素(WprA)をさらに有する、段落20〜26のいずれか1つのバチルス(Bacillus)宿主細胞。
28.宿主は、低減された量の、ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrOおよびywaDからなる群から選択される1種以上の追加のプロテアーゼをさらに有する、段落20〜27のいずれか1つのバチルス(Bacillus)宿主細胞。宿主は、低減された量の、ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrOおよびywaDからなる群から選択される1種以上の追加の内因性プロテアーゼをさらに有する、段落20〜27のいずれか1つのバチルス(Bacillus)宿主細胞。
29.ALDC酵素は、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ブレビバクテリウム・アセチリカム(Brevibacterium acetylicum)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、ロイコノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)DXまたはバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)に由来する、段落20〜28のいずれか1つのバチルス(Bacillus)宿主細胞。
30.ALDC酵素は、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)またはバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)に由来する、段落20〜29のいずれか1つのバチルス(Bacillus)宿主細胞。
31.ALDC酵素は、配列番号2、配列番号3、配列番号5、配列番号7および配列番号8、またはそれらのいずれかの機能的断片から選択されるいずれか1つと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、段落20〜30のいずれか1つのバチルス(Bacillus)宿主細胞。
32.プロモーターと作動可能に結合した異種ALDC酵素をコードする核酸を含むバチルス(Bacillus)宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ、および/もしくは細胞壁プロテアーゼ、および/もしくはALDC酵素のC末端から配列を切断することができる中性メタロプロテアーゼを宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含む、バチルス(Bacillus)宿主細胞、またはバチルス(Bacillus)宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ、および/もしくは細胞壁プロテアーゼ、および/もしくは前記ALDC酵素のC末端から配列を切断することができる中性メタロプロテアーゼを宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含み、宿主細胞に、ALDC酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸を含む、バチルス(Bacillus)宿主細胞。
33.ALDC酵素は、バチルス・ブレビス(B.brevis)AldBであり、かつC末端の配列は、QVHQAESERKである、段落32の宿主細胞。ALDC酵素は、バチルス・ブレビス(B.brevis)AldBであり、かつこのプロテアーゼは、前記ALDC酵素の前記C末端から配列QVHQAESERK(配列番号9)を切断することができる、段落32の宿主細胞。
34.バチルス(Bacillus)宿主細胞は、バチルス・サブチリス(B.subtilis)である、段落32のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
35.プロモーターと作動可能に結合した異種ALDC酵素をコードする核酸を含むバチルス(Bacillus)宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量のプロテアーゼを宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含み、そのプロテアーゼは、ALDC酵素のC末端および/もしくはN末端を開裂することができる、バチルス(Bacillus)宿主細胞、またはバチルス(Bacillus)宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量のプロテアーゼを宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含み、そのプロテアーゼは、ALDC酵素のC末端および/もしくはN末端を開裂することができ、その宿主細胞は、宿主細胞に、ALDC酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸を含む、バチルス(Bacillus)宿主細胞。
36.バチルス(Bacillus)宿主細胞は、バチルス・サブチリス(B.subtilis)である、段落35のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
37.プロテアーゼは、配列番号5、配列番号2または配列番号7の対応するC末端の275位で開裂することができる、段落35または36のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
38.プロテアーゼは、配列番号5、配列番号2または配列番号7の対応するC末端の276位で開裂することができる、段落35または36のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
39.プロテアーゼは、配列番号5、配列番号2または配列番号7の対応するN末端の37位で開裂することができる、段落35または36のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
40.プロテアーゼは、配列番号5、配列番号2または配列番号7の対応するN末端の38位で開裂することができる、段落35または36のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
41.プロテアーゼは、配列番号5、配列番号2または配列番号7の対応するN末端の39位で開裂することができる、段落35または36のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
42.プロテアーゼは、配列番号5、配列番号2または配列番号7の対応するN末端の40位で開裂することができる、段落35または36のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
43.プロテアーゼは、配列番号5、配列番号2または配列番号7の対応するN末端の42位で開裂することができる、段落35または36のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
44.プロテアーゼは、配列番号5、配列番号2または配列番号7の対応するN末端の43位で開裂することができる、段落35または36のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
45.プロテアーゼは、配列番号5、配列番号2または配列番号7の対応するN末端の39位で開裂することができる、段落35または36のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
46.ALDC酵素は、配列番号5、配列番号2または配列番号7と少なくとも80%の相同性を有するアミノ酸配列を含む、段落35〜45のいずれか1つのバチルス(Bacillus)宿主細胞。
47.ALDC酵素は、バチルス・ブレビス(B.brevis)AldBであり、かつC末端の配列は、QVHQAESERKである、段落35〜46のいずれか1つのバチルス(Bacillus)宿主細胞。前記ALDC酵素は、バチルス・ブレビス(B.brevis)AldBであり、かつこのプロテアーゼは、前記ALDC酵素の前記C末端から配列QVHQAESERKを開裂することができる、段落35〜46のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
48.プロテアーゼは、中性メタロプロテアーゼである、段落35〜47のいずれか1つのバチルス(Bacillus)宿主細胞。
49.プロテアーゼは、サーモリシンである、段落35〜48のいずれか1つのバチルス(Bacillus)宿主細胞。
いくつかの態様において、本発明は、より良好な安定性および/または活性を有するALDC酵素を提供し、任意選択により、微生物から回収し得るALDC酵素の収量が改善される。
|ZP_09451796.1|アセト乳酸デカルボキシラーゼ[ラクトバチルス・スエビカス(Lactobacillus suebicus)KCTC3549];gi|339624147|ref|ZP_08659936.1|アセト乳酸デカルボキシラーゼ[フルクロバチルス・イルクトサス(Fructobacillus jructosus)KCTC3544];andgi|336393727|ref|ZP_08575126.1|アセト乳酸デカルボキシラーゼ[ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルクエンス(Lactobacillus coryniformis subsp.torquens)KCTC3535]。UNIPROTアクセッションアクセッション番号P23616.1(Diderichsenetal.,JBacteriol.(1990)172(8):4315)は、ALDC酵素の一例である。UNIPROTアクセッション番号P23616.1は、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)に由来するか、または由来し得るALDC酵素の一例である。前述のアクセッション番号と結び付いた各配列は参照により本明細書に組み込まれる。
一態様において、本発明は、ALDC酵素の収量を増大させ、かつ/または安定性および/もしくは活性が増大したALDC酵素を産生する、1つ以上の遺伝子変異を有する宿主細胞を提供する。「遺伝子変異を含む宿主細胞」、「宿主細胞は遺伝子変異を含む」、「変異宿主細胞」、「変異株」、「変異体」、「宿主細胞」および「微生物」は、本明細書では互換的に使用され得る。本明細書で使用する場合、「遺伝子変異」は、親宿主細胞との比較で少なくとも1つの遺伝子変異を有する宿主細胞を指し、通常、遺伝子変異は宿主細胞のゲノムの変化である。宿主細胞の遺伝子変異は、自然突然変異および/または遺伝子工学(ベクターによる細胞の形質転換、ゲノムの特定遺伝子の除去など)の結果であり得る。遺伝子変異の例としては、親細胞と比較して低減された量の少なくとも1種の内因性プロテアーゼを変異株の細胞に産生させる遺伝子変異が挙げられる。一実施形態では、変異株は、親細胞と比較して異種のALDC酵素をコードする核酸配列を含むようにさらに改質される。一実施形態では、親株は、ALDC酵素をコードする異種核酸配列を含む。一実施形態では、変異株は、ALDC酵素をコードする内因性核酸配列を親株と比較して過剰に発現するように改質されている。一実施形態では、変異種は、宿主細胞に、ALDC酵素をコードする内因性核酸配列を親株と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換される。本明細書で使用する場合、「過剰発現している」、「過剰発現」および「過剰発現する」という用語は、ALDCをコードする核酸配列の発現を許容する同じ条件下で培養したときの、変異株におけるALDC酵素をコードする核酸配列の発現が、親株におけるALDC酵素をコードする核酸配列の発現と比較して増加することを指す。例えば、変異株によるALDC酵素をコードする核酸配列の発現は、親株によるALDC酵素をコードする核酸配列の発現より少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%高い。理論に拘束されることを望むものではないが、宿主細胞におけるALDC酵素をコードする内因性核酸配列の過剰発現は、宿主細胞におけるALDC酵素の産生量を、親細胞におけるALDC酵素の産生量より増大させる。宿主細胞は、親細胞と比較してプロテアーゼ活性および/またはプロテアーゼ機能が低下した細胞をスクリーニングすることにより確認し得る。遺伝子変異は、例えば、プロテアーゼをコードする1つ以上の遺伝子の破壊であってもよい。そのような遺伝子によってコードされるプロテアーゼの例としては、wprA、vpr、epr、ispA、bpr、nprE、aprE、ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrOおよびywaDが挙げられる。遺伝子変異は、例えば、プロテアーゼをコードする遺伝子の調節配列(例えば、プロモーター)、またはプロテアーゼの発現を制御し得る核酸配列の破壊であってもよい。理論に拘束されることを望むものではないが、破壊は、遺伝子および/または調節配列の全部または一部の欠損を引き起こし得る。遺伝子変異は、例えば、プロテアーゼをコードする核酸配列に結合可能なアンチセンス核酸配列をコードする核酸配列、またはプロテアーゼの発現を制御し得る核酸配列の宿主細胞への導入によってもたらされてもよい。遺伝子変異は、例えば、プロテアーゼをコードする1つ以上の遺伝子(WprA、Vpr、Epr、IspA、Bpr、NprE、AprE、ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrOおよびywaDなど)、またはプロテアーゼをコードする遺伝子の発現を制御し得る核酸配列の全部または一部の欠損であってもよい。遺伝子変異は、例えば、プロテアーゼをコードする遺伝子の調節配列(例えば、プロモーター)、またはプロテアーゼの発現を制御し得る核酸配列の欠損であってもよい。遺伝子変異は、例えば、プロテアーゼをコードする遺伝子、またはプロテアーゼをコードする遺伝子の発現を制御し得る核酸配列を含むゲノムDNAの一部の欠損であってもよい。ALDC酵素の収量に関連した「改善された」という用語および「増加した」という用語は、遺伝子変異を有する宿主細胞を培養したときに生成される(例えば、回収される)ALDC活性を有するタンパク質量が、親宿主細胞を同じ条件(例えば、同じ時間および温度)下で培養したときに生成されるALDC活性を有するタンパク質量と比較して増加したことを意味する。本明細書で使用する「より良好な安定性」および「増大した安定性」という用語は、遺伝子変異を有する宿主細胞が産生したALDC酵素のALDC活性が、同じ条件(例えば、同じ温度)下で培養された親株が産生したALDC酵素のALDC活性と比較して、より長期間維持されることを意味する。本明細書で使用する「より良好な活性」および「増大した活性」という用語は、遺伝子変異を有する宿主細胞が産生したALDC酵素が、同じ条件(例えば、同じ温度)下で培養された親株が産生したALDC酵素のALDC活性と比較して、より高いALDC活性を有していることを意味する。プロテアーゼに関連した「低減された量」という用語は、本明細書で使用する場合、遺伝子変異を有する宿主細胞が産生するプロテアーゼの量が、同じ条件下で培養した親株が産生するプロテアーゼの量と比較して低減されていることを意味する。機能性プロテアーゼに関連した「低減されたた量」という用語は、本明細書で使用する場合、遺伝子変異を有する宿主細胞が産生するプロテアーゼの量および/または活性が、同じ条件下で培養した親株が産生するプロテアーゼの量および/または活性と比較して低減されていることを意味する。プロテアーゼ活性は、本明細書に記載のプロテアーゼアッセイ(例えば、カゼインスポットプレートアッセイ)、または当技術分野で知られている任意の好適なアッセイで測定される。いくつかの実施形態において、本発明の宿主細胞では、実施例に記載のカゼインアッセイによるインキュベーション2日、5日または10日後に明確なハロー形成が見られない。
いくつかの態様において、本発明は、微生物からのALDCの回収を改善する方法を提供する。他の態様において、本発明は、本明細書に記載の宿主細胞中でALDCを生成する方法を提供する。
一態様において、本発明は、炭水化物含有基質の微生物による発酵により、ジアセチル低含有発酵アルコール製品を製造する方法に関する。「ジアセチル低含有」発酵アルコール製品は、本明細書で使用する場合、炭水化物含有基質を、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに/または本明細書に記載のALDCおよび/もしくはALDC誘導体組成物による発酵によって製造される発酵アルコール製品(例えば、ビール、ワイン、サイダー、ペリーおよび/または酒)であって、ジアセチル濃度が本明細書に記載の宿主細胞、ならびに/または本明細書に記載のALDCおよび/もしくはALDC誘導体組成物の非存在下において同じ発酵条件(例えば、同じ温度で、同じ時間)で炭水化物含有基質を発酵させることによって製造される発酵アルコール製品と比較して低い製品を指す。ジアセチル低含有発酵アルコール製品の例としては、ジアセチル濃度が約1ppm未満、および/またはジアセチル濃度が約0.5mg/L未満の発酵アルコール製品がある。一実施形態において、ジアセチル濃度は、約0.5ppm未満、約0.1ppm未満、約0.05ppm未満、約0.01ppm未満、または約0.001ppm未満である。一実施形態において、ジアセチル濃度は、約0.1mg/L未満、約0.05mg/L未満、約0.01mg/L未満、または約0.001mg/L未満である。
一態様において、本発明は、本明細書に記載のALDC酵素の異種発現体を有する宿主細胞に関する。他の態様において、宿主細胞は、本明細書に記載のプラスミドまたは発現ベクターを含み、好ましくは、それによって形質添加されている。他の態様において、本発明は、ALDC酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換されている宿主細胞に関する。
ブレビバチルス・ブレビス(Brevibacillus brevis)(バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)と呼ばれることがある)のアセト乳酸デカルボキシラーゼブレビバチル(ALDC)aldB遺伝子は既に同定されており(Diderichsen et al,J Bacteriol.1990:172(8):4315)、その配列はUNIPROTアクセッション番号P23616.1として登録されている。この遺伝子aldBの配列を配列番号1に示す。太字および下線で強調表示したヌクレオチドはシグナルペプチドをコードするヌクレオチドである。
配列番号1は、aldB遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号2は、アセト乳酸デカルボキシラーゼ(ALDC)aldBのアミノ酸配列を示す。
ブレビバチルス・ブレビス(Brevibacillus brevis)株由来のaldB遺伝子は、アセト乳酸デカルボキシラーゼ酵素(ALDC)をコードするが、この遺伝子を、バチルス・サブチリス(B.subtilis)aprEプロモーター、バチルス・サブチリス(B.subtilis)aprEシグナルペプチド配列、成熟aldBおよびBPN’ターミネーターからなる組み込み発現カセットを使用してバチルス・サブチリス(B.subtilis)内で産生させた。このカセットを、発現カセットと相同組み換えによりバチルス・サブチリス(B.subtilis)に導入したaldB発現カセットに関して先頭を合わせた配置方向でクローニングした。
Stain Free Imager Criterionによるタンパク質の決定
SDS−PAGEゲルおよびGel Doc(商標)EZイメージングシステムを用いた濃度測定により、タンパク質を定量した。この分析で使用した試薬:濃縮(2×)Laemmli Sample Buffer(Bio−Rad、カタログ番号161−0737);26−ウェルXT4−12%Bis−Tris Gel(Bio−Rad、カタログ番号345−0125);タンパク質マーカー「Precision Plus Protein Standards」(Bio−Rad、カタログ番号161−0363);タンパク質標準BSA(Thermo Scientific、カタログ番号23208)およびSimplyBlue Safestain(Invitrogen、カタログ番号LC 6060。分析は以下のように行った:96ウェル−PCRプレート中で、50μlの希釈酵素試料を、2.7mgのDTTを含有する50μLの試料バッファと混合した。プレートをBio−Rad製のMicroseal‘B’Filmで密封し、PCR装置に入れ、70°Cまで10分間加熱した。その後、容器をランニングバッファで満たし、ゲルカセットをセットした。次いで、10μLの各試料および標準(0.125〜1.00mg/ml BSA)をゲル上に置き、5μLのマーカーを加えた。その後、200Vで45分間電気泳動を行った。電気泳動に続き、ゲルを水で3回、5分間濯ぎ、その後、Safestain中で終夜染色し、最後に水で脱染した。その後、ゲルをImagerに移した。各バンドの強度計算にImage Labソフトウェアを使用した。標準試料のタンパク質の量を知ることにより、検量線を作ることができる。試料の量は、バンド強度および検量線から決定することができる。以下の実施例で示す分析に使用するaldBアセト乳酸デカルボキシラーゼ酵素の試料は、タンパク質定量法を用いて調製した。
配列確認の準備として、単離したaldB末端切断変異体のSDS−PAGEゲルを、後に説明するようにLC−MS/MSで分析した。NおよびC末端の決定を含めた配列確認の準備として、aldB酵素試料のSDS−PAGEゲルのタンパク質バンドに一連の化学処理を施した。個々の工程間で、Milli−Q水、50重量%エタノールおよび絶対エタノールをそれぞれ使用してゲル片を洗浄し、収縮させた。タンパク質をDTT/ヨードアセトアミド処理により還元/アルキル化した。リシンの側鎖のアセチル化を防ぐために、グアジニン化工程を実施し、リシンをホモアルギニンへと変換した。スルホ−NHS−酢酸(酢酸スルホスクシンイミジル)を使用するアセチル化反応は、タンパク質のN−末端残基のみを修飾する。40体積%18O水:60体積%16O水、およびタンパク質の消化に使用するタンパク質分解酵素(トリプシンおよびα−キモトリプシン)を含有するバッファでゲル片を膨潤させた。ペプチドの同位体パターンから明らかなように、得られたペプチドは、元の16Oを維持しているカルボキシル末端を除いて、18Oと16Oとの混合物を含有するであろう。N末端タンパク質由来のペプチドは、単にアセチル化されたペプチドとして生成するであろう。消化後、5重量%ギ酸およびアセトニトリルを用いてゲル片からペプチドを抽出し、次いで凍結乾燥させ、0.1重量%TFAに再溶解させた。消化生成物を分離(C18カラム)し、Proxeon nano−LCシステム、続いてLTQ Orbitrap(Thermo Fisher)高分解能質量分析計で分析し、ペプチドのMS/MSフラグメントスペクトルおよびペプチドの同位体パターンからアミノ酸配列を推定した(Xcalibur 2.0 SR2ソフトウェアを使用)。
α−アセト乳酸デカルボキシラーゼの分光光度分析
α−アセト乳酸デカルボキシラーゼ(ALDC)はα−アセト乳酸のアセトインへの脱カルボキシル化反応を触媒する。反応生成物のアセトインは、比色分析により定量化することができる。α−ナフト−ルおよびクレアチンと混合したアセトインは、OD522nmで特徴的な赤色吸収を示す。OD522nmおよびアセトイン検量線に基づいてALDC活性を算出した。分析は以下のように行った:100μLのエチル−2−アセトキシ−2−メチルアセトアセテート(Sigma、カタログ番号220396)と3.6mlの0.5M NaOHとを10℃で10分間混合することにより、20mMのアセト乳酸基質を調製した。20mlの50mM MES(pH6.0)を添加し、pHをpH6.0に調節し、50mMのMES(pH6.0)により体積を25mlに調節した。80μLの20mMアセト乳酸基質を、50mM MES(pH6.0)、0.6M NaCl、0.05%BRIJ35および0.01%BSAで希釈した20μLの酵素試料と混合した。基質/酵素混合物を30℃で10分間インキュベートした。その後、16μLの基質/酵素混合物を200μLの1M NaOH、1.0%α−ナフトール(Sigma、カタログ番号33420)および0.1%クレアチン(Sigma、カタログ番号C3630)中に移した。基質/酵素/発色試薬混合物を30℃で20分間インキュベートし、その後OD522nmを読み取った。ALDC活性の1単位を、この分析条件下で毎分1μモルのアセトインを生成する酵素の量と定義する。
バチルス・サブチリス(B.subtilis)におけるaldB遺伝子の組み換えタンパク質発現に適した宿主を同定するために、種々の数のプロテアーゼ遺伝子をノックアウトした、3種の異なる株を試験した(2−欠損、5−欠損および7−欠損)。本明細書で使用する「ノックアウトされた」という用語は、遺伝子がノックアウトされていない親株と比べて遺伝子の発現がないか、もしくは低減するような、および/またはその遺伝子によってコードされるポリペプチドの量がゼロかもしくは減少するような遺伝子の不活性化を指す。遺伝子は、例えば、遺伝子もしくはその一部または調節要素(プロモーターなど)を欠損させることにより、または遺伝子もしくは調節要素(プロモーターなど)の少なくとも一部に配列を挿入することにより不活性化し得る。本明細書で使用する「2−欠損」という用語は、2つのプロテアーゼ遺伝子をノックアウトしたバチルス・サブチリス(B.subtilis)を指す。本明細書で使用する「5−欠損」という用語は、5つのプロテアーゼ遺伝子をノックアウトしたバチルス・サブチリス(B.subtilis)を指す。本明細書で使用する「7−欠損」という用語は、7つのプロテアーゼ遺伝子をノックアウトしたバチルス・サブチリス(B.subtilis)を指す。本明細書で使用する「5−欠損」株は「2−欠損」株から得られ、したがって、5−欠損株は、「2−欠損」で欠損した遺伝子と同じ2つのプロテアーゼ遺伝子と、別の3つのプロテアーゼ遺伝子とが欠損している。本明細書で使用する「7−欠損」株は「5−欠損」株から得られ、したがって、7−欠損株は、「5−欠損」で欠損した遺伝子と同じ5つのプロテアーゼ遺伝子と、別の2つのプロテアーゼ遺伝子(すなわち、vprおよびwprA)とが欠損している。ノックアウトし得るプロテアーゼ遺伝子の例としては、vpr、wprA、Epr、IspA、Bpr、NprE、AprE、ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrOおよびywaDをコードする遺伝子が挙げられる。「ノックアウトされた」という用語は、「破壊された」または「欠損した」という用語と互換的に使用し得る。遺伝子[配列番号4の]をpBN−ssoU発現ベクターに挿入し、実施例1に記載のように継時的に試料を取り出した。酵素試料を試料バッファ中で凍結させて、分解がさらに進まないよう制限し、aldB中に芳香族残基が存在しないことから、Coomassie染色を使用して、Criterion SDS−PAGE分析により全試料を一括して分析した(実施例3も参照)。2−、5−および7−欠損プロテアーゼ株におけるaldB発現体のSDS−pageを、醗酵時間24、48および72時間の試料のそれぞれについて図3に示す。完全長aldB(ゲル中で約35kDa)として、またはその切断変異体(ゲル中で28〜35kDa)として同定されたバンドには、ゲル上にマークを付している。aldB変異体を、実施例3の方法に記載したMS配列決定により同定した。2−欠損プロテアーゼ株のaldB発現体に顕著な分解が観察され、醗酵過程で完全長タンパク質は検出されず、28および30kDaの分子量の切断生成物が存在した。5−欠損株でもAldB切断生成物が観察されたが、醗酵開始時(24および48時間)に完全長タンパク質が存在し、切断生成物は、2−欠損株の切断生成物と比較してより大きかった(ゲル中で32〜35kDa)。完全長タンパク質から2つの主要な切断生成物への転換は、5−欠損株の醗酵過程の24時間から72時間にかけて進行するようと思われる。7−欠損プロテアーゼ株におけるaldB発現体は、醗酵の全過程を通して完全長aldBタンパク質のみを生成していることが観察され、切断生成物は検出されなかった。
カゼインスポットプレートアッセイの原理は、カゼインプレート上のハロー形成により、プロテアーゼ活性/加水分解を観察することである。
この分析の目的は、種々のアセト乳酸デカルボキシラーゼ変異体の、14℃、7日間の醗酵でのジアセチルおよび2,3−ペンタンジオン(ビシナルジケトン、VDK)の生成を抑制する能力を試験することであった。
1100gのMunton製Light Malt Extract(Batch XB 35189、有効期限2014年5月24日)抽出物を3000mlの温水道水に溶解した(45℃)。液体が均質になるまで、このスラリーを約10分間撹拌し、2.5M硫酸でpHを5.2に調節した。スラリーにHopfenveredlung、St.Johannから入手したビターホップを10ペレット加えた:アルファ酸含有量16.0%(EBC7.7 0規定HPLC分析、2013年10月1日)、その後、500mlのブルーキャップボトル(blue−cap bottle)に分割し、1時間沸騰させることによって確実にタンパク質を沈殿させ、潜在的細菌汚染を回避した。最終の麦汁の初期比重は1048(すなわち12°プラート)であった。ろ過した麦汁200gを500mlのコニカルフラスコに加え(醗酵容器;FV)、その後、13℃に冷却した。各コニカルフラスコに0.5%の最近製造された酵母、W34/70(Weihenstephan)を加えた(麦汁200g当たり、酵母1.0g)。類似のALDC活性となるよう酵素を加えた(0.04U/mL−麦汁、麦汁200g当たり8ALDC単位)。酵素を加えないコントロール醗酵では、酵素試料の量に対応する量の脱イオン水を加えた。
RFは酢酸の応答係数であり、
Areaは酢酸のGC面積であり、
Ws使用した試料の量(単位:mL)である。
Claims (49)
- Ai)バチルス(Bacillus)宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ(vpr)および/または細胞壁プロテアーゼ(wprA)を前記宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含む、バチルス(Bacillus)宿主細胞を用意する工程であって、前記宿主細胞は、プロモーターと作動可能に結合した異種ALDC酵素をコードする核酸で形質転換されている、工程;および
ii)前記異種ALDC酵素の産生に好適な条件下で前記宿主細胞を培養する工程であって、それにより前記異種ALDC酵素が産生される、工程;または
Bi)バチルス(Bacillus)宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ(vpr)および/または細胞壁プロテアーゼ(wprA)を前記宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含む、バチルス(Bacillus)宿主細胞を用意する工程であって、前記宿主細胞は、前記宿主細胞に、ALDC酵素をコードする内因性核酸配列を前記親細胞と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換されている、工程;および
ii)ALDC酵素の産生に好適な条件下で前記宿主細胞を培養する工程であって、それによりALDC酵素が産生される、工程
を含む、アセト乳酸デカルボキシラーゼ(ALDC)酵素を製造する方法。 - 前記産生されたALDC酵素を回収する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記バチルス(Bacillus)宿主細胞は、バチルス・サブチリス(B.subtilis)である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記バチルス(Bacillus)宿主細胞は、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素(Epr)をさらに欠失している、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バチルス(Bacillus)宿主細胞は、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素(IspA)および/または内因性バシロペプチダーゼF酵素(Bpr)をさらに欠失している、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バチルス(Bacillus)宿主細胞は、中性メタロプロテアーゼ酵素(NprE)を欠失している、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主細胞は、内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素(AprE)をさらに欠失している、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主細胞は、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素(Vpr)をさらに欠失している、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主細胞は、内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素(WprA)をさらに欠失している、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主細胞は、低減された量の、ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrOおよびywaDからなる群から選択される1種以上の追加のプロテアーゼをさらに有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子変異は、前記親細胞に存在する遺伝子の破壊を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記破壊は、前記遺伝子の全部または一部の欠損の結果である、請求項11に記載の方法。
- 前記遺伝子の破壊は、前記遺伝子を含むゲノムDNAの一部の欠損の結果である、請求項11に記載の方法。
- 前記遺伝子の破壊は、変異誘発の結果である、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子の破壊は、部位特異的組み換えを用いて行われる、請求項11〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子の破壊は、前記遺伝子の遺伝子座への選択マーカーの導入と組み合わされて行われる、請求項11〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ALDC酵素は、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ブレビバクテリウム・アセチリカム(Brevibacterium acetylicum)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、ロイコノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)DXまたはバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)に由来する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ALDC酵素は、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)またはバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)に由来する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ALDC酵素は、配列番号2、配列番号3、配列番号5、配列番号7および配列番号8、またはそれらのいずれかの機能的断片から選択されるいずれか1つと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- プロモーターと作動可能に結合した異種ALDC酵素をコードする核酸を含むバチルス(Bacillus)宿主細胞であって、低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ(vpr)および細胞壁プロテアーゼ(wprA)を前記宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含む、バチルス(Bacillus)宿主細胞、またはバチルス(Bacillus)宿主細胞であって、低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ(vpr)および/もしくは細胞壁プロテアーゼ(wprA)を前記宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含み、前記宿主細胞に、ALDC酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸を含む、バチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記バチルス(Bacillus)宿主細胞は、バチルス・サブチリス(B.subtilis)である、請求項20に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、低減された量の内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素(Epr)をさらに有する、請求項20または21に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、低減された量の内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素(IspA)および/または内因性バシロペプチダーゼF酵素(Bpr)をさらに有する、請求項20〜22のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、低減された量の中性メタロプロテアーゼ酵素(NprE)をさらに有する、請求項20〜23のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、低減された量の内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素(AprE)をさらに有する、請求項20〜24のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、低減された量の内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素(Vpr)をさらに有する、請求項20〜25のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、低減された量の内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素(WprA)をさらに有する、請求項20〜26のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、低減された量の、ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrOおよびywaDからなる群から選択される1種以上の追加のプロテアーゼをさらに有する、請求項20〜27のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記ALDC酵素は、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ブレビバクテリウム・アセチリカム(Brevibacterium acetylicum)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、ロイコノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)DXまたはバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)に由来する、請求項20〜28のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記ALDC酵素は、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)またはバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)に由来する、請求項20〜29のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記ALDC酵素は、配列番号2、配列番号3、配列番号5、配列番号7および配列番号8、またはそれらのいずれかの機能的断片から選択されるいずれか1つと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項20〜30のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- プロモーターと作動可能に結合した異種ALDC酵素をコードする核酸を含むバチルス(Bacillus)宿主細胞であって、低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ、および/もしくは細胞壁プロテアーゼ、および/もしくは前記ALDC酵素のC末端から配列を切断することができる中性メタロプロテアーゼを前記宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含む、バチルス(Bacillus)宿主細胞、またはバチルス(Bacillus)宿主細胞であって、低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ、および/もしくは細胞壁プロテアーゼ、および/もしくは前記ALDC酵素のC末端から配列を切断することができる中性メタロプロテアーゼを前記宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含み、前記宿主細胞に、ALDC酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸を含む、バチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記ALDC酵素は、バチルス・ブレビス(B.brevis)AldBであり、かつ前記プロテアーゼは、前記ALDC酵素の前記C末端から配列QVHQAESERKを切断することができる、請求項32に記載の宿主細胞。
- 前記バチルス(Bacillus)宿主細胞は、バチルス・サブチリス(B.subtilis)である、請求項32または33に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- プロモーターと作動可能に結合した異種ALDC酵素をコードする核酸を含むバチルス(Bacillus)宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量の少なくとも1種のプロテアーゼを前記宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含み、前記プロテアーゼは、前記ALDC酵素のC末端および/もしくはN末端を開裂することができる、バチルス(Bacillus)宿主細胞、またはバチルス(Bacillus)宿主細胞であって、前記親細胞と比較して低減された量のプロテアーゼを前記宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含み、前記プロテアーゼは、前記ALDC酵素のC末端および/もしくはN末端を開裂することができ、前記宿主細胞は、前記宿主細胞に、ALDC酵素をコードする内因性核酸配列を前記親細胞と比較して過剰に発現させる核酸を含む、バチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記バチルス(Bacillus)宿主細胞は、バチルス・サブチリス(B.subtilis)である、請求項35に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記プロテアーゼは、配列番号5、配列番号2または配列番号7の対応するC末端の275位で開裂することができる、請求項35または36に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記プロテアーゼは、配列番号5、配列番号2または配列番号7の対応するC末端の276位で開裂することができる、請求項35または36に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記プロテアーゼは、配列番号5、配列番号2または配列番号7の対応するN末端の37位で開裂することができる、請求項35〜38のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記プロテアーゼは、配列番号5、配列番号2または配列番号7の対応するN末端の38位で開裂することができる、請求項35〜38のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記プロテアーゼは、配列番号5、配列番号2または配列番号7の対応するN末端の39位で開裂することができる、請求項35、37または38のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記プロテアーゼは、配列番号5、配列番号2または配列番号7の対応するN末端の40位で開裂することができる、請求項35〜38のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記プロテアーゼは、配列番号5、配列番号2または配列番号7の対応するN末端の42位で開裂することができる、請求項35〜38のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記プロテアーゼは、配列番号5、配列番号2または配列番号7の対応するN末端の43位で開裂することができる、請求項35〜38のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記プロテアーゼは、配列番号5、配列番号2または配列番号7の対応するN末端の39位で開裂することができる、請求項36〜38のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- ALDC酵素は、配列番号5、配列番号2または配列番号7と少なくとも80%の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項35〜45のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記ALDC酵素は、バチルス・ブレビス(B.brevis)AldBであり、かつ前記プロテアーゼは、前記ALDC酵素の前記C末端から配列QVHQAESERKを開裂することができる、請求項35〜46のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記プロテアーゼは、中性メタロプロテアーゼである、請求項35〜47のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
- 前記プロテアーゼは、サーモリシンである、請求項35〜48のいずれか一項に記載のバチルス(Bacillus)宿主細胞。
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Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006068148A1 (ja) * | 2004-12-20 | 2006-06-29 | Kao Corporation | 組換え微生物 |
WO2009022162A1 (en) * | 2007-08-15 | 2009-02-19 | Cobra Biologics Limited | Bacillus with inactivated or downregulated htra and/or htrb |
JP2009038985A (ja) * | 2007-08-06 | 2009-02-26 | Kao Corp | 微生物及びこれを用いたタンパク質又ポリペプチドの製造方法 |
CN101948821A (zh) * | 2010-09-03 | 2011-01-19 | 南宁邦尔克生物技术有限责任公司 | 一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产α-乙酰乳酸脱羧酶的方法 |
JP2011504097A (ja) * | 2007-10-31 | 2011-02-03 | ダニスコ・ユーエス・インク | セリンプロテアーゼの無い環境での中性メタロプロテアーゼの産出とその使用 |
JP2011155950A (ja) * | 2010-02-03 | 2011-08-18 | Kao Corp | 溶菌が抑制された微生物、当該微生物の製造方法、当該微生物を用いたタンパク質等の製造方法、及び微生物の溶菌抑制方法 |
JP2012115219A (ja) * | 2010-12-02 | 2012-06-21 | Kao Corp | エンドグルカナーゼの製造法 |
WO2012127002A1 (en) * | 2011-03-23 | 2012-09-27 | Novozymes A/S | Sweet-tasting polypeptide from gram-positive bacteria |
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Family Cites Families (9)
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---|---|---|---|---|
DK149335C (da) | 1983-06-03 | 1986-10-20 | Novo Industri As | Alpha-acetolactat-decarboxylase samt fremgangsmaade til fremstilling deraf |
US5475101A (en) | 1990-10-05 | 1995-12-12 | Genencor International, Inc. | DNA sequence encoding endoglucanase III cellulase |
JPH06502223A (ja) | 1990-10-05 | 1994-03-10 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | セルラーゼによる綿含有織物の処理方法 |
US5246853A (en) | 1990-10-05 | 1993-09-21 | Genencor International, Inc. | Method for treating cotton-containing fabric with a cellulase composition containing endoglucanase components and which composition is free of exo-cellobiohydrolase I |
US5861271A (en) | 1993-12-17 | 1999-01-19 | Fowler; Timothy | Cellulase enzymes and systems for their expressions |
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CN102876704A (zh) * | 2012-09-20 | 2013-01-16 | 江南大学 | 利用重组枯草芽孢杆菌高效表达Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脱羧酶 |
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Patent Citations (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006068148A1 (ja) * | 2004-12-20 | 2006-06-29 | Kao Corporation | 組換え微生物 |
JP2006174707A (ja) * | 2004-12-20 | 2006-07-06 | Kao Corp | 組換え微生物 |
JP2009038985A (ja) * | 2007-08-06 | 2009-02-26 | Kao Corp | 微生物及びこれを用いたタンパク質又ポリペプチドの製造方法 |
WO2009022162A1 (en) * | 2007-08-15 | 2009-02-19 | Cobra Biologics Limited | Bacillus with inactivated or downregulated htra and/or htrb |
JP2011504097A (ja) * | 2007-10-31 | 2011-02-03 | ダニスコ・ユーエス・インク | セリンプロテアーゼの無い環境での中性メタロプロテアーゼの産出とその使用 |
US20110104786A1 (en) * | 2007-10-31 | 2011-05-05 | Anita Van Kimmenade | Use and production of neutral metalloproteases in a serine protease-free background |
JP2011155950A (ja) * | 2010-02-03 | 2011-08-18 | Kao Corp | 溶菌が抑制された微生物、当該微生物の製造方法、当該微生物を用いたタンパク質等の製造方法、及び微生物の溶菌抑制方法 |
CN101948821A (zh) * | 2010-09-03 | 2011-01-19 | 南宁邦尔克生物技术有限责任公司 | 一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产α-乙酰乳酸脱羧酶的方法 |
JP2012115219A (ja) * | 2010-12-02 | 2012-06-21 | Kao Corp | エンドグルカナーゼの製造法 |
WO2012127002A1 (en) * | 2011-03-23 | 2012-09-27 | Novozymes A/S | Sweet-tasting polypeptide from gram-positive bacteria |
JP2012200168A (ja) * | 2011-03-24 | 2012-10-22 | Kao Corp | 遺伝子欠損株及びそれを用いたタンパク質の製造方法 |
WO2014202793A1 (en) * | 2013-06-21 | 2014-12-24 | Novozymes A/S | Production of polypeptides without secretion signal in bacillus |
Non-Patent Citations (9)
Title |
---|
AMB EXPRESS, vol. Vol.1, 22 (11 pages), JPN6020029438, 2011, ISSN: 0004537173 * |
DASEBASE UNIPROTKB/SWISS-PROT[ONLINE], JPN6019042159, November 1991 (1991-11-01), pages 23616, ISSN: 0004537172 * |
DIDERICHSEN B, ET AL.: "Cloning of aldB, Which Encodes α-Acetolactate Decarboxylase, an Exoenzyme from Bacillus brevis", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 172, no. 8, JPN6019042152, August 1990 (1990-08-01), pages 4315 - 4321, XP055418745, ISSN: 0004537171 * |
KAWAMURA, F. ET AL.: "Construction of a Bacillus subtilis Double Mutant Deficient in Extracellular Alkaline and Neutral Pr", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 160, no. 1, JPN6019042157, October 1984 (1984-10-01), pages 442 - 444, ISSN: 0004322512 * |
MICROBIOLOGY RESOURCE ANNOUNCEMENTS, vol. Vol.7, No.18, e01380-18, JPN6020029437, 2018, ISSN: 0004537174 * |
STNAHL, M. L. ET AL.: "Replacement of the Bacillus subtilis Subtilisin Structural Gene with an In Vitro-Derive Deletion Mut", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 158, no. 2, JPN6019042155, May 1984 (1984-05-01), pages 411 - 418, ISSN: 0004322511 * |
WU SAU-CHING, ET AL.: "Functional Production and Characterization of a Fibrin-Specific Single-Chain Antibody Fragment from", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 68, no. 7, JPN6019042150, July 2002 (2002-07-01), pages 3261 - 3269, XP002522796, ISSN: 0004537170, DOI: 10.1128/AEM.68.7.3261-3269.2002 * |
YANG, M. Y. ET AL.: "Cloning of the Neutral Protease Gene of Bacillus subtilis and the Use of the Cloned Gene to Create a", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 160, no. 1, JPN6019042153, October 1984 (1984-10-01), pages 15 - 21, XP001314029, ISSN: 0004322510 * |
ZHANG XIAO-ZHOU, ET AL.: "One-step production of lactate from cellulose as the sole carbon source without any other organic nu", METABOLIC ENGINERRING, vol. 13, JPN6019042148, 3 May 2011 (2011-05-03), pages 364 - 372, ISSN: 0004537169 * |
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