JP2011155950A - 溶菌が抑制された微生物、当該微生物の製造方法、当該微生物を用いたタンパク質等の製造方法、及び微生物の溶菌抑制方法 - Google Patents
溶菌が抑制された微生物、当該微生物の製造方法、当該微生物を用いたタンパク質等の製造方法、及び微生物の溶菌抑制方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011155950A JP2011155950A JP2010022580A JP2010022580A JP2011155950A JP 2011155950 A JP2011155950 A JP 2011155950A JP 2010022580 A JP2010022580 A JP 2010022580A JP 2010022580 A JP2010022580 A JP 2010022580A JP 2011155950 A JP2011155950 A JP 2011155950A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- microorganism
- bacillus subtilis
- strain
- cell wall
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 304
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 145
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 83
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 65
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 title claims abstract description 63
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 title abstract description 12
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 83
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims abstract description 83
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 82
- 108010061062 CDPribitol ribitolphosphotransferase Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 54
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 23
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 53
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 40
- 101150044176 tagF gene Proteins 0.000 claims description 31
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 claims description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 15
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 14
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 9
- 101150009206 aprE gene Proteins 0.000 claims description 8
- 101150112117 nprE gene Proteins 0.000 claims description 8
- 101150105255 aprX gene Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 5
- 101150007891 bpr gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150070375 epr gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150045830 nprB gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108700026215 vpr Genes Proteins 0.000 claims description 4
- 101150024249 vpr gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150051250 wprA gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150017984 mpr gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 42
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 39
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 33
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 32
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 21
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 21
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 21
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 18
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 12
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 11
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 11
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 101150042065 spo0A gene Proteins 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 9
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 9
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229920006318 anionic polymer Polymers 0.000 description 8
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 101150115529 tagA gene Proteins 0.000 description 8
- 101150049453 tagD gene Proteins 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 101150047697 tagB gene Proteins 0.000 description 7
- 101150091526 tagG gene Proteins 0.000 description 7
- 101150031069 tagH gene Proteins 0.000 description 7
- 101150020588 tagO gene Proteins 0.000 description 7
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 7
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 101150091094 lipA gene Proteins 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 6
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 4
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 4
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 4
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 4
- 101100449690 Bacillus licheniformis (strain ATCC 14580 / DSM 13 / JCM 2505 / CCUG 7422 / NBRC 12200 / NCIMB 9375 / NCTC 10341 / NRRL NRS-1264 / Gibson 46) blaSE gene Proteins 0.000 description 4
- 101100238373 Bacillus subtilis (strain 168) mpr gene Proteins 0.000 description 4
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 4
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 4
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 4
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 4
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 101100109159 Bacillus subtilis (strain 168) aprX gene Proteins 0.000 description 3
- 101100043757 Bacillus subtilis (strain 168) bpr gene Proteins 0.000 description 3
- 101100043755 Bacillus subtilis (strain 168) epr gene Proteins 0.000 description 3
- 101100460774 Bacillus subtilis (strain 168) nprB gene Proteins 0.000 description 3
- 101100049732 Bacillus subtilis (strain 168) wprA gene Proteins 0.000 description 3
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 3
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 3
- 101100381938 Dichelobacter nodosus bprV gene Proteins 0.000 description 3
- 101710166469 Endoglucanase Proteins 0.000 description 3
- XYZZKVRWGOWVGO-UHFFFAOYSA-N Glycerol-phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(O)CO XYZZKVRWGOWVGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 3
- 101710149136 Protein Vpr Proteins 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 3
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 3
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 3
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 3
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 101150012183 tarA gene Proteins 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 2
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 2
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000205754 Colocasia esculenta Species 0.000 description 2
- 235000006481 Colocasia esculenta Nutrition 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 2
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 2
- 101150074058 tarB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150064896 tarD gene Proteins 0.000 description 2
- 101150061781 tarF gene Proteins 0.000 description 2
- 101150055446 tarI gene Proteins 0.000 description 2
- 101150109832 tarJ gene Proteins 0.000 description 2
- 101150100659 tarL gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 241001037822 Bacillus bacterium Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- VJDOAZKNBQCAGE-LMVFSUKVSA-N D-ribitol 5-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O VJDOAZKNBQCAGE-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 108010000540 Hexosaminidases Proteins 0.000 description 1
- 102000002268 Hexosaminidases Human genes 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 238000012218 Kunkel's method Methods 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 description 1
- 244000294411 Mirabilis expansa Species 0.000 description 1
- 235000015429 Mirabilis expansa Nutrition 0.000 description 1
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-DZOUCCHMSA-N alpha-D-Glcp-(1->4)-alpha-D-Glcp-(1->4)-D-Glcp Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-DZOUCCHMSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001420 bacteriolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- -1 feeds Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 230000010365 information processing Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical group 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 235000013536 miso Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000223 polyglycerol Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000013555 soy sauce Nutrition 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 101150045632 tarK gene Proteins 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 101150007587 tpx gene Proteins 0.000 description 1
- 230000037426 transcriptional repression Effects 0.000 description 1
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【課題】微生物の溶菌抑制方法、溶菌が抑制された微生物及び当該微生物の製造方法、並びに当該微生物を用いたタンパク質等の製造方法を提供する。
【解決手段】枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子が発現抑制され、溶菌が抑制された微生物、当該微生物の製造方法、当該微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法、及び枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を有する微生物において、細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子を発現抑制する工程を含む微生物の溶菌抑制方法。
【選択図】なし
【解決手段】枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子が発現抑制され、溶菌が抑制された微生物、当該微生物の製造方法、当該微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法、及び枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を有する微生物において、細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子を発現抑制する工程を含む微生物の溶菌抑制方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、溶菌が抑制された微生物、当該微生物の製造方法、当該微生物を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法、及び微生物の溶菌抑制方法に関する。
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっており、遺伝子組換えのための宿主微生物の開発が進められている。例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）Marburg No.168系統株の様に宿主微生物として安全かつ優良と認められた微生物菌株に更に改良を加えた菌株が開発されている。
このような微生物を用いた物質生産を行う場合、用いる微生物の溶菌現象を制御しうることが望ましく、これまでに、微生物の溶菌抑制方法として種々の方法が提案されている。例えば、細胞壁溶解酵素をコードしている遺伝子を欠損させることで微生物の溶菌を抑制する方法（特許文献１及び非特許文献１参照）、細胞壁溶解酵素阻害タンパク質の高発現によって細胞壁溶解酵素を失活させる方法（特許文献２参照）、細胞壁溶解酵素に対する耐性を向上させる方法（特許文献３参照）等が提案されている。
Journal of Bioscience and Bioengineering，Vol.103，No.1，p.13-21（2007）
本発明は、物質生産の宿主となるような微生物において溶菌を抑制する方法及び溶菌が抑制された微生物を提供することを課題とする。また、本発明は、溶菌が抑制された微生物を用いたタンパク質等の目的物質の製造方法を提供することを課題とする。さらに、本発明は、溶菌が抑制された微生物の製造方法を提供することを課題とする。
発明者らは、上記課題に鑑み、細胞分裂や細胞の増殖に関して重要な因子である細胞壁溶解酵素（以下、細胞壁分解酵素又は溶菌酵素ともいう）群そのものに対して欠失等の人為的操作を行うことなく、微生物の溶菌を効果的に抑制し、タンパク質等の目的物質の生産性を向上させる方法を探索した。そして、細胞壁溶解酵素が細菌の細胞壁に存在するアニオン性ポリマーと結合することに着目し、細胞壁のアニオン性ポリマー量を減少させることで、細胞壁に対する細胞壁溶解酵素の結合力の低下を図れば、新たな溶菌抑制手法となりうると考えた。この考えの下、細胞壁のアニオン性ポリマー量を減少させる方法を鋭意検討したところ、枯草菌由来の細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子の発現を抑制することで、細胞壁のテイコ酸量が低下すること、その結果、細胞壁のテイコ酸量が低下した微生物では溶菌が抑制されることを見出した。さらに、この微生物が、タンパク質等の目的物質生産のために好適に用いることができることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
本発明は、枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子が発現抑制され、溶菌が抑制された微生物に関する。
また、本発明は、上記微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法に関する。
また、本発明は、枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を有する微生物において、枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子を発現抑制する工程を含む微生物の溶菌抑制方法に関する。
さらに、本発明は、枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、溶菌が抑制された微生物の製造方法に関する。
また、本発明は、上記微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法に関する。
また、本発明は、枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を有する微生物において、枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子を発現抑制する工程を含む微生物の溶菌抑制方法に関する。
さらに、本発明は、枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、溶菌が抑制された微生物の製造方法に関する。
本発明によれば、物質生産の宿主となるような微生物において、溶菌を抑制する方法及び溶菌が抑制された微生物を提供することができる。また、本発明によれば、溶菌が抑制された微生物を用いることで、タンパク質やポリペプチド等の目的物質を効率よく製造する方法を提供することができる。さらに、本発明によれば、溶菌が抑制された微生物の製造方法を提供することができる。
本発明に係る微生物は、例えば野生株と比較して溶菌速度が速い変異型微生物株において、その溶菌を有意に抑制しうるものであり、目的物質生産の過程において当該微生物株を長時間培養すること、すなわち目的物質の生産を長時間効率的に行うことができる。更に、細胞壁溶解による菌体内タンパク質や核酸などの漏出がなく、培養液から目的タンパク質等を容易に回収することができる。そのため、本発明に係る微生物を用いることで、目的物質の生産性を向上させた生産系を構築することが可能となる。
本発明に係る微生物は、例えば野生株と比較して溶菌速度が速い変異型微生物株において、その溶菌を有意に抑制しうるものであり、目的物質生産の過程において当該微生物株を長時間培養すること、すなわち目的物質の生産を長時間効率的に行うことができる。更に、細胞壁溶解による菌体内タンパク質や核酸などの漏出がなく、培養液から目的タンパク質等を容易に回収することができる。そのため、本発明に係る微生物を用いることで、目的物質の生産性を向上させた生産系を構築することが可能となる。
本発明に係る微生物は、枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子が発現抑制されたものである。より詳細には、本発明に係る微生物は、例えば野生型と比較して溶菌速度が速い変異株において、上記細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を少なくとも１つ発現抑制等して、その溶菌を有意に抑制したものであり、微生物を用いたタンパク質等の目的物質の生産系に好適に用いることができるものである。
一般的に、細菌は各種の溶菌酵素を有しており、これらの酵素は概して等電点が高く、細胞壁に対する結合ドメインを有し、細胞壁の構成成分であるアニオン性ポリマーとイオン結合する。細菌の細胞壁には細胞壁テイコ酸（メジャーテイコ酸及びマイナーテイコ酸）、テイクロン酸、リポテイコ酸等のアニオン性ポリマーが存在する。中でもメジャーテイコ酸とペプチドグリカンとが結合してなる細胞壁テイコ酸の存在比率が高いことが知られている。しかしながら、溶菌酵素による細胞壁溶解には複数の因子が関係しており、メジャーテイコ酸をはじめとする細胞壁のアニオン性ポリマー量を低下させることで、細菌における溶菌現象を抑制しうるか否かといった知見は得られていない。本発明は、アニオン性ポリマーとしてメジャーテイコ酸とペプチドグリカンとが結合してなる細胞壁テイコ酸を低減化することで、細胞壁と溶菌酵素との間の静電相互作用の低減化を図り、新たな溶菌抑制技術を確立するという新規知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明に係る微生物は、枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のうち少なくとも１つを発現抑制させることで、細胞壁の構成成分であるアニオン性ポリマー量が低減し、細胞壁と溶菌酵素との間のイオン結合力が低下し、本来は野生型と比較して溶菌しやすかった変異型微生物等であってもその溶菌を有意に抑制することを可能としたものである。そして、このような溶菌を抑制しうる微生物は、長時間の培養に適し、ひいては目的物質の生産率向上に資するため、タンパク質やポリペプチド等の目的物質生産を行うための宿主として有用である。
以下、本発明について詳細に説明する。
すなわち、本発明に係る微生物は、枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のうち少なくとも１つを発現抑制させることで、細胞壁の構成成分であるアニオン性ポリマー量が低減し、細胞壁と溶菌酵素との間のイオン結合力が低下し、本来は野生型と比較して溶菌しやすかった変異型微生物等であってもその溶菌を有意に抑制することを可能としたものである。そして、このような溶菌を抑制しうる微生物は、長時間の培養に適し、ひいては目的物質の生産率向上に資するため、タンパク質やポリペプチド等の目的物質生産を行うための宿主として有用である。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明に係る微生物は、野生型と比較して、枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子が発現抑制されている。枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子とは、枯草菌の細胞表層に特異的に存在しているメジャーテイコ酸とペプチドグリカンとが結合してなる細胞壁テイコ酸の生合成に関与する一連の酵素群をコードする遺伝子群をいい、具体的には枯草菌由来のtagA遺伝子、tagB遺伝子、tagD遺伝子、tagF遺伝子、tagG遺伝子、tagH遺伝子及びtagO遺伝子が挙げられる（例えば、A．Formstone et al.，Journal of Bacteriology，Vol.190，p.1812-1821（2008）参照）。これらの遺伝子群のうち、少なくとも１つの働きを抑制できれば、細胞壁テイコ酸（メジャーテイコ酸）生合成系全体を阻害しうるため、本発明の微生物においては上記遺伝子群のうち少なくとも１種以上の遺伝子についてその機能を抑制できればよい。中でも、細胞壁テイコ酸量の低下という観点からは、メジャーテイコ酸（ポリグリセロールリン酸鎖）の付加反応を触媒する酵素をコードするtagF遺伝子の機能が抑制されていることが好ましい。
本発明において発現抑制の対象となる遺伝子は、上述のように枯草菌において細胞壁テイコ酸の生合成に関与する一連の酵素群をコードする遺伝子群である枯草菌の細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子群及び当該遺伝子に相当する遺伝子であって、具体的には下記表１に示される枯草菌由来のtagA遺伝子、tagB遺伝子、tagD遺伝子、tagF遺伝子、tagG遺伝子、tagH遺伝子及びtagO遺伝子、並びに当該遺伝子に相当する遺伝子群の中から選択されるものである。なお、表中の各遺伝子の名称、番号及び機能等は、Nature，390，249-256,（1997）で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis（BSORF DB）でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2003年６月17日更新）された枯草菌ゲノムデーターに基づいて記載している。また、枯草菌由来のtagA遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び８に示す。枯草菌由来のtagB遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２及び９に示す。枯草菌由来のtagD遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び１０に示す。枯草菌由来のtagF遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４及び１１に示す。枯草菌由来のtagG遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５及び１２に示す。枯草菌由来のtagH遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号６及び１３に示す。枯草菌由来のtagO遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７及び１４に示す。
後述するように、本発明の微生物の宿主は枯草菌に限定されるものではなく、枯草菌以外の微生物から作製してもよい。枯草菌以外の微生物を宿主として用いる場合には、用いる宿主に応じて枯草菌の有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子群に相当する遺伝子を特定し、当該遺伝子を発現抑制等させることで本発明の微生物を得ることができる。
本発明において、「枯草菌の有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子」とは、上述した枯草菌のtagA遺伝子、tagB遺伝子、tagD遺伝子、tagF遺伝子、tagG遺伝子、tagH遺伝子又はtagO遺伝子と機能的に一致する又は等価な遺伝子と定義する。ここで、機能的に一致する又は等価な遺伝子とは、枯草菌のtagA遺伝子、tagB遺伝子、tagD遺伝子、tagF遺伝子、tagG遺伝子、tagH遺伝子又はtagO遺伝子と機能的に均等であり、該遺伝子によりコードされたタンパク質が細胞壁テイコ酸の生合成系に関与するものをいう。具体的には、以下の（１）又は（２）の遺伝子が挙げられる。これらは「枯草菌の有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子」として、本発明において発現抑制等すべき遺伝子に含まれる。
本発明において、「枯草菌の有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子」とは、上述した枯草菌のtagA遺伝子、tagB遺伝子、tagD遺伝子、tagF遺伝子、tagG遺伝子、tagH遺伝子又はtagO遺伝子と機能的に一致する又は等価な遺伝子と定義する。ここで、機能的に一致する又は等価な遺伝子とは、枯草菌のtagA遺伝子、tagB遺伝子、tagD遺伝子、tagF遺伝子、tagG遺伝子、tagH遺伝子又はtagO遺伝子と機能的に均等であり、該遺伝子によりコードされたタンパク質が細胞壁テイコ酸の生合成系に関与するものをいう。具体的には、以下の（１）又は（２）の遺伝子が挙げられる。これらは「枯草菌の有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子」として、本発明において発現抑制等すべき遺伝子に含まれる。
（１）配列番号１〜７のいずれかで示される枯草菌由来のtagA遺伝子、tagB遺伝子、tagD遺伝子、tagF遺伝子、tagG遺伝子、tagH遺伝子又はtagO遺伝子の塩基配列において、当該塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ当該遺伝子と機能的に一致する又は等価な遺伝子。
（２）配列番号１〜７のいずれかで示される枯草菌由来のtagA遺伝子、tagB遺伝子、tagD遺伝子、tagF遺伝子、tagG遺伝子、tagH遺伝子又はtagO遺伝子の塩基配列において、１から数個の塩基配列が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなり、且つ当該遺伝子と機能的に一致する又は等価な遺伝子。
これらの「枯草菌の有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子」としては、バチルス属に属する菌類由来の遺伝子が好ましい。
なお、本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法（Science，227，1435,（1985））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメータであるUnit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
（２）配列番号１〜７のいずれかで示される枯草菌由来のtagA遺伝子、tagB遺伝子、tagD遺伝子、tagF遺伝子、tagG遺伝子、tagH遺伝子又はtagO遺伝子の塩基配列において、１から数個の塩基配列が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなり、且つ当該遺伝子と機能的に一致する又は等価な遺伝子。
これらの「枯草菌の有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子」としては、バチルス属に属する菌類由来の遺伝子が好ましい。
なお、本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法（Science，227，1435,（1985））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメータであるUnit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
「枯草菌の有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子」の具体的な例としては、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）Ｗ２３株のtarO遺伝子、tarA遺伝子、tarB遺伝子、tarI遺伝子、tarJ遺伝子、tarK遺伝子、tarL遺伝子、tarD遺伝子、tarF遺伝子、（Microbiology，148，815-824，(2002)）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のtarO遺伝子、tarA遺伝子、tarB遺伝子、tarI遺伝子、tarJ遺伝子、tarK遺伝子、tarL遺伝子、tarD遺伝子、tarF遺伝子（J．Bacteriol.，190，3046-3056，(2008)）等が挙げられる。上記の微生物では、細胞壁テイコ酸がグリセロールリン酸の代わりにリビトールリン酸で構成されることが知られている。また、Bacillus subtilis Ｗ２３株の上記tarA遺伝子等によって、枯草菌１６８株のtagA遺伝子等の機能が相補できるという報告もある（J．Bacteriol.，186，7865-7873，(2004)）。
以下、枯草菌の有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子を纏めて、単にテイコ酸合成酵素関連遺伝子ともいう。
以下、枯草菌の有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子を纏めて、単にテイコ酸合成酵素関連遺伝子ともいう。
換言すると、本発明に係る微生物は、上述したようなテイコ酸合成酵素関連遺伝子を有する微生物から作製することができる。但し、本発明に係る微生物は、テイコ酸合成酵素関連遺伝子を有することが知られている微生物から作製されたものに限定されるものではない。つまり、本発明に係る微生物としては、上述したテイコ酸合成酵素関連遺伝子の塩基配列又はタンパク質のアミノ酸配列に基づいて、遺伝子配列やタンパク質のアミノ酸配列を格納したデータベースから上述した同一性を基準としてテイコ酸合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子を検索することで、テイコ酸合成酵素関連遺伝子を有するものとして同定された微生物を用いてもよい。
細胞壁にテイコ酸が存在するという点から、本発明に係る微生物は、グラム陽性菌から作製されることが好ましく、枯草菌などのバチルス属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、リステリア（Listeria）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、ラクトバシラス(Lactobacillus)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、クロストリジウム(Clostridium)属に属する菌類から作製されることが好ましく、バチルス（Bacillus）属に属する菌類から作製することがより好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質又はポリペプチドを菌体外に分泌生産させる能力を有する点から、本発明に係る微生物は枯草菌から作製することが特に好ましい。本発明の微生物は、これらの宿主微生物を親微生物として構築されるものである。また、これらの親微生物は、野生型の微生物に限定されず、例えば種々の突然変異を有する変異株を対象とすることもできる。
細胞壁にテイコ酸が存在するという点から、本発明に係る微生物は、グラム陽性菌から作製されることが好ましく、枯草菌などのバチルス属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、リステリア（Listeria）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、ラクトバシラス(Lactobacillus)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、クロストリジウム(Clostridium)属に属する菌類から作製されることが好ましく、バチルス（Bacillus）属に属する菌類から作製することがより好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質又はポリペプチドを菌体外に分泌生産させる能力を有する点から、本発明に係る微生物は枯草菌から作製することが特に好ましい。本発明の微生物は、これらの宿主微生物を親微生物として構築されるものである。また、これらの親微生物は、野生型の微生物に限定されず、例えば種々の突然変異を有する変異株を対象とすることもできる。
さらに、溶菌が有意に抑制された微生物を得るという本発明の趣旨に鑑みれば、上述したようなテイコ酸合成酵素関連遺伝子を有する微生物であって、且つ野性株に比較してその溶菌速度が速い微生物株を用いて本発明に係る微生物を作製することも好ましい態様である。このような野性株に比較してその溶菌速度が速い微生物株は、その溶菌速度を測定することで特定することが可能である。一般に、細菌を培養し続けると、細菌の溶菌が進行に伴って培養液の濁度が減少する。従って、溶菌速度は、培養時間に対する培地濁度の減少率として算出することができる。すなわち、横軸を培養時間とし、縦軸を培地濁度として得られるグラフの傾きを溶菌速度とすることができる。なお、培地濁度は、例えば６００ｎｍにおける吸光度として分光光度計により測定することができる。実際の溶菌速度の測定及び比較については、後述する実施例２を参照することができる。
同様に、本発明の微生物において、テイコ酸合成酵素関連遺伝子の発現抑制の結果、当該微生物の溶菌が抑制されているかについても、上記のようにして確認することができる。具体的には、テイコ酸合成酵素関連遺伝子の発現を抑制した変異型微生物と発現を抑制していない野生型微生物とを培養し、その培地濁度や溶菌速度を比較することで、溶菌が抑制されたことを確認できる。
野性株に比較してその溶菌速度が速い微生物株として具体的には、上述したようなテイコ酸合成酵素関連遺伝子を有するバチルス属等に属する細菌類であって、且つ野性株に比べて溶菌速度が、例えば、野生株に比べて２〜３倍、好ましくは３〜１０倍速い微生物株が挙げられる。
同様に、本発明の微生物において、テイコ酸合成酵素関連遺伝子の発現抑制の結果、当該微生物の溶菌が抑制されているかについても、上記のようにして確認することができる。具体的には、テイコ酸合成酵素関連遺伝子の発現を抑制した変異型微生物と発現を抑制していない野生型微生物とを培養し、その培地濁度や溶菌速度を比較することで、溶菌が抑制されたことを確認できる。
野性株に比較してその溶菌速度が速い微生物株として具体的には、上述したようなテイコ酸合成酵素関連遺伝子を有するバチルス属等に属する細菌類であって、且つ野性株に比べて溶菌速度が、例えば、野生株に比べて２〜３倍、好ましくは３〜１０倍速い微生物株が挙げられる。
なかでも本発明に係る微生物は、野性株に比べて、少なくとも１種のプロテアーゼの活性が低下している又は活性を有しない微生物株（以下、プロテアーゼ欠損株ともいう）であることが好ましい。
一般に、微生物を用いたタンパク質等の目的物質の工業的生産には、その生産効率を向上させるべく種々の改良を加えた変異株が用いられる。例えば、目的物質としてタンパク質を生産させる場合、野生型の微生物は多種多様な内在性のタンパク質分解酵素（プロテアーゼ、ペプチダーゼ）を有しており、これらが目的のタンパク質を分解し、外来タンパク質の生産において障害になることがある。そのため、これらのタンパク質分解酵素遺伝子を欠損させる等の改変を加えた変異型微生物を用いることによって、生産される目的タンパク質の分解を防ぐ試みが行われている。このようにして改変された変異株は、プロテアーゼを欠損しているので、有用タンパク質等の物質生産のための宿主として好適である。しかしながら、このようなプロテアーゼ活性が著しく低い細胞では、細胞壁溶解酵素がプロテアーゼによる分解を受けず、細胞表層に蓄積するため、定常期に溶菌が観察されるとの報告がある（J．Biosci．Bioeng.，103，13-21，（2007）参照）。
そこで、本発明に係る微生物としてこのようなプロテアーゼ変異株を用い、当該変異株のテイコ酸合成酵素関連遺伝子を発現抑制等することで溶菌を抑制でき、タンパク質等の目的物質を生産する系において、当該微生物を比較的長期に亘って培養することができる。その結果、目的物質の生産効率を向上させることができ、物質の製造コストを低減することができる。なお、本発明で好ましく用いられるプロテアーゼ欠損株は、ぺプチダーゼ活性が低下している又は活性を有しない微生物株を包含するものである。
一般に、微生物を用いたタンパク質等の目的物質の工業的生産には、その生産効率を向上させるべく種々の改良を加えた変異株が用いられる。例えば、目的物質としてタンパク質を生産させる場合、野生型の微生物は多種多様な内在性のタンパク質分解酵素（プロテアーゼ、ペプチダーゼ）を有しており、これらが目的のタンパク質を分解し、外来タンパク質の生産において障害になることがある。そのため、これらのタンパク質分解酵素遺伝子を欠損させる等の改変を加えた変異型微生物を用いることによって、生産される目的タンパク質の分解を防ぐ試みが行われている。このようにして改変された変異株は、プロテアーゼを欠損しているので、有用タンパク質等の物質生産のための宿主として好適である。しかしながら、このようなプロテアーゼ活性が著しく低い細胞では、細胞壁溶解酵素がプロテアーゼによる分解を受けず、細胞表層に蓄積するため、定常期に溶菌が観察されるとの報告がある（J．Biosci．Bioeng.，103，13-21，（2007）参照）。
そこで、本発明に係る微生物としてこのようなプロテアーゼ変異株を用い、当該変異株のテイコ酸合成酵素関連遺伝子を発現抑制等することで溶菌を抑制でき、タンパク質等の目的物質を生産する系において、当該微生物を比較的長期に亘って培養することができる。その結果、目的物質の生産効率を向上させることができ、物質の製造コストを低減することができる。なお、本発明で好ましく用いられるプロテアーゼ欠損株は、ぺプチダーゼ活性が低下している又は活性を有しない微生物株を包含するものである。
本発明で好ましく用いられるプロテアーゼ欠損株として具体的には、野生株が本来有している複数のプロテアーゼ遺伝子のうち１又は複数のプロテアーゼ遺伝子が欠失等している変異株が挙げられ、例えば、枯草菌において主要な細胞外アルカリプロテアーゼであるAprE、或いは中性プロテアーゼであるNprEをコードする遺伝子、或いはそれら両遺伝子が欠損した変異型微生物（J．Bacteriol.，158，411，（1984）、J．Bacteriol.，160，15，（1984）、J．Bacteriol.，160，442，（1984）参照）、枯草菌由来の８種類（aprE遺伝子、nprB遺伝子、nprE遺伝子、bpr遺伝子、vpr遺伝子、mpr遺伝子、epr遺伝子、wprA遺伝子及びaprX遺伝子）のプロテアーゼ、ペプチダーゼの遺伝子について遺伝子が欠損微生物、更にはこれら８種類のプロテアーゼ、ペプチダーゼの遺伝子が全て欠損した枯草菌株（Appl．Environ．Microbiol.，68，3261，（2002）参照）、前記８種類のプロテアーゼ遺伝子の他に、更に枯草菌由来のaprX遺伝子を欠損した微生物（特開2006-174707号公報、J．Biosci．Bioeng.，104，135-143，（2007）参照）が知られており、これらは本発明において好ましく用いることができる。
本発明は細胞壁と溶菌酵素との静電的相互作用を低減化することで溶菌を抑制するものであるため、本発明で用いることができるプロテアーゼ欠損株としては、溶菌酵素を分解しうるプロテアーゼが活性低下している又は活性を有しない株であることが好ましい。溶菌酵素としては、リゾチーム、グルコサミニダーゼ、アミダーゼ、L，D-エンドペプチダーゼ、D，L-エンドペプチダーゼ等が挙げられる。なかでも、LytC（アミダーゼ）、LytE及びLytF（D，L-エンドペプチダーゼ）等の溶菌酵素は、細胞壁テイコ酸量の減少に特に強く影響を受けるため、本発明の微生物はこれらの酵素の溶菌作用を好ましく抑制することができる。
上述した溶菌酵素を分解しうるプロテアーゼをコードする遺伝子としては、例えば、枯草菌由来のaprX遺伝子、aprE遺伝子、nprB遺伝子、nprE遺伝子、bpr遺伝子、vpr遺伝子、mpr遺伝子、epr遺伝子、及びwprA遺伝子が挙げられ、これらの遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失、不活性化等したプロテアーゼ欠損株を好ましく用いることができる。なお、枯草菌の有するプロテアーゼをコードする遺伝子に相当する遺伝子とは、前述した枯草菌の有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子と同様に定義され、枯草菌の有するプロテアーゼをコードする遺伝子と機能的に一致する遺伝子と定義できる。また、その同一性の範囲及び算出方法についても、枯草菌の有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子について前述したのと同様の範囲及び方法である。
具体的には、aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr、wprA及びaprXの各遺伝子又は当該遺伝子に相当する９種類の遺伝子より選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させたものが好ましく、なかでも、aprX遺伝子、主要な細胞外アルカリプロテアーゼをコードするaprE遺伝子及び中性プロテアーゼをコードするnprE遺伝子、又は当該遺伝子に相当する３種の遺伝子を欠失又は不活性化させたものがより好ましく、aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr、wprA及びaprXの各遺伝子の全て、又は当該遺伝子に相当する９種類の遺伝子の全てを欠失又は不活性化させたものが特に好ましい。これらのプロテアーゼ遺伝子について、遺伝子番号及び遺伝子機能等を下記表２に示す。なお、表中の各遺伝子の名称、番号及び機能等は、Nature，390，249-256，（1997）で報告され、JAFAN：Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis（BSORF DB）でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2003年６月17日更新)された枯草菌ゲノムデーターに基づいて記載している。さらに、これらのプロテアーゼ遺伝子及び該遺伝子を欠失したプロテアーゼ欠損株についての詳細は、特開２００６−１７４７０７号公報の記載を参照することができる。溶菌酵素を分解しうるプロテアーゼをコードする遺伝子を欠失又は不活性化させる方法としては、後述するテイコ酸合成酵素関連遺伝子の発現抑制方法として示した方法に従い行うことができ、特に、遺伝子を欠失又は変異の導入による不活性化等によって遺伝子を破壊する手法を好ましく用いることができる。また、特開２００６−１７４７０７号公報の記載を参照することもできる。
上述した溶菌酵素を分解しうるプロテアーゼをコードする遺伝子としては、例えば、枯草菌由来のaprX遺伝子、aprE遺伝子、nprB遺伝子、nprE遺伝子、bpr遺伝子、vpr遺伝子、mpr遺伝子、epr遺伝子、及びwprA遺伝子が挙げられ、これらの遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失、不活性化等したプロテアーゼ欠損株を好ましく用いることができる。なお、枯草菌の有するプロテアーゼをコードする遺伝子に相当する遺伝子とは、前述した枯草菌の有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子と同様に定義され、枯草菌の有するプロテアーゼをコードする遺伝子と機能的に一致する遺伝子と定義できる。また、その同一性の範囲及び算出方法についても、枯草菌の有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子について前述したのと同様の範囲及び方法である。
具体的には、aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr、wprA及びaprXの各遺伝子又は当該遺伝子に相当する９種類の遺伝子より選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させたものが好ましく、なかでも、aprX遺伝子、主要な細胞外アルカリプロテアーゼをコードするaprE遺伝子及び中性プロテアーゼをコードするnprE遺伝子、又は当該遺伝子に相当する３種の遺伝子を欠失又は不活性化させたものがより好ましく、aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr、wprA及びaprXの各遺伝子の全て、又は当該遺伝子に相当する９種類の遺伝子の全てを欠失又は不活性化させたものが特に好ましい。これらのプロテアーゼ遺伝子について、遺伝子番号及び遺伝子機能等を下記表２に示す。なお、表中の各遺伝子の名称、番号及び機能等は、Nature，390，249-256，（1997）で報告され、JAFAN：Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis（BSORF DB）でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2003年６月17日更新)された枯草菌ゲノムデーターに基づいて記載している。さらに、これらのプロテアーゼ遺伝子及び該遺伝子を欠失したプロテアーゼ欠損株についての詳細は、特開２００６−１７４７０７号公報の記載を参照することができる。溶菌酵素を分解しうるプロテアーゼをコードする遺伝子を欠失又は不活性化させる方法としては、後述するテイコ酸合成酵素関連遺伝子の発現抑制方法として示した方法に従い行うことができ、特に、遺伝子を欠失又は変異の導入による不活性化等によって遺伝子を破壊する手法を好ましく用いることができる。また、特開２００６−１７４７０７号公報の記載を参照することもできる。
さらに、本発明において好ましく用いられるプロテアーゼ欠損株としては、欠失対象のプロテアーゼの転写を正に制御している転写因子の発現を抑制した株を挙げることができる。例えば、枯草菌において、この転写因子としてはspo0A遺伝子によってコードされる転写因子を挙げることができる。spo0A遺伝子を欠失した枯草菌変異株は、特定のプロテアーゼ（具体的には、前述のaprE、bpr、epr、mpr、nprB、nprE、vpr及びwprAの各遺伝子によってコードされるプロテアーゼ）の生産量が低いといった特徴を有している（J．Biosci．Bioeng．103，13（2007）参照）。もちろん、枯草菌以外の細菌においても、spo0A遺伝子の相同遺伝子を欠失させることによって、当該細菌由来のプロテアーゼ欠損株を作製することができる。なお、spo0A遺伝子の相同遺伝子とは、前述した枯草菌の有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子と同様に定義され、枯草菌の有するspo0A遺伝子と機能的に一致する遺伝子と定義できる。また、その同一性の範囲及び算出方法についても、枯草菌の有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子について前述したのと同様の範囲及び方法である。枯草菌由来のspo0A遺伝子によりコードされるSpo0Aタンパク質は、スポア形成の主要な転写制御因子である。spoOA遺伝子の相同遺伝子としては、例えば、スポア形成細菌のスポア形成の主要な転写制御因子をコードするspo0A遺伝子が挙げられる。
枯草菌由来のspo0A遺伝子について、遺伝子番号及び遺伝子機能等を下記表２に示す。さらに、spo0A遺伝子及び該遺伝子を欠失したプロテアーゼ欠損株についての詳細は、特開２００５−２９５８３０号公報の記載を参照することができる。野生株と比較して、細菌株のspo0A遺伝子又はその相同遺伝子の発現を低下させる方法としては、後述するテイコ酸合成酵素関連遺伝子の発現抑制方法として示した方法に従い行うことができ、特に、遺伝子を欠失又は変異の導入による不活性化等によって遺伝子を破壊する手法を好ましく用いることができる。また、特開２００５−２９５８３０号公報の記載を参照することもできる。
枯草菌由来のspo0A遺伝子について、遺伝子番号及び遺伝子機能等を下記表２に示す。さらに、spo0A遺伝子及び該遺伝子を欠失したプロテアーゼ欠損株についての詳細は、特開２００５−２９５８３０号公報の記載を参照することができる。野生株と比較して、細菌株のspo0A遺伝子又はその相同遺伝子の発現を低下させる方法としては、後述するテイコ酸合成酵素関連遺伝子の発現抑制方法として示した方法に従い行うことができ、特に、遺伝子を欠失又は変異の導入による不活性化等によって遺伝子を破壊する手法を好ましく用いることができる。また、特開２００５−２９５８３０号公報の記載を参照することもできる。
更に本発明の微生物の構築には、上述したプロテアーゼ以外の遺伝子群の欠損を組み合わせることも可能である。
本発明の微生物は、野生型に比べてテイコ酸合成酵素関連遺伝子の発現が抑制されているという特徴を有する。遺伝子発現抑制の手法は特に限定されず、当該遺伝子又はそれによりコードされるタンパク質の働きを、野生型微生物における本来の働きよりも有意に低下又は不活性化しうるものであればよく、通常の遺伝子工学的手法を用いることができる。例えば、テイコ酸合成酵素関連遺伝子を破壊する方法、テイコ酸合成酵素関連遺伝子の転写を抑制する方法、及びテイコ酸合成酵素関連遺伝子の翻訳を抑制する方法が挙げられる。また、テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は該遺伝子の転写・翻訳調節領域等を直接改変してもよく、発現を制御する他の因子（例えば、転写因子やアンチセンスRNA等）を制御又は改変するものであってもよい。また、本発明に係る微生物は、上述したような遺伝子工学的手法によって人為的に野生型の微生物からテイコ酸合成酵素関連遺伝子を発現抑制させた組換え株はもちろん、このような人為的な手法によらず上記テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を発現抑制している自然発生的な変異体をも包含する。
以下、遺伝子発現抑制の手法について詳細に説明する。
本発明においてテイコ酸合成酵素関連遺伝子の発現抑制は、当該遺伝子の転写又は翻訳を抑制する方法であることが好ましく、転写を抑制する方法であることがより好ましい。遺伝子発現のレベルを調節しうるため、そして、テイコ酸合成酵素関連遺伝子群が生育必須遺伝子であるとの報告（例えば、Journal of General Microbiology，131，p.929−941（1991）、Journal of bacteriology，183，p.6688-6693（2001）参照）もあるためである。
本発明においてテイコ酸合成酵素関連遺伝子の発現抑制は、当該遺伝子の転写又は翻訳を抑制する方法であることが好ましく、転写を抑制する方法であることがより好ましい。遺伝子発現のレベルを調節しうるため、そして、テイコ酸合成酵素関連遺伝子群が生育必須遺伝子であるとの報告（例えば、Journal of General Microbiology，131，p.929−941（1991）、Journal of bacteriology，183，p.6688-6693（2001）参照）もあるためである。
遺伝子の転写を抑制する方法としては、テイコ酸合成酵素関連遺伝子の転写が抑制されるように宿主微生物を改変する方法が好ましい。例えば、相同組換え等によって対象となる微生物のテイコ酸合成酵素関連遺伝子の転写プロモーター領域を、転写抑制型又は転写誘導型プロモーターで置換し形質転換した後、形質転換体を転写抑制又は転写誘導条件で培養する方法が挙げられる。
特に、前述したプロテアーゼ欠損株を宿主とし、該微生物のテイコ酸合成酵素関連遺伝子が転写誘導型プロモーターの制御下に発現するように当該宿主を改変することが好ましい。このように構築された微生物は、生産対象の有用タンパク質等の分解を防止することができるため、より優れた生産効率を達成することができる。
特に、前述したプロテアーゼ欠損株を宿主とし、該微生物のテイコ酸合成酵素関連遺伝子が転写誘導型プロモーターの制御下に発現するように当該宿主を改変することが好ましい。このように構築された微生物は、生産対象の有用タンパク質等の分解を防止することができるため、より優れた生産効率を達成することができる。
具体的には、転写誘導型プロモーター配列を有するベクター又は発現カセットを用いて、常法に従い宿主微生物を形質転換し、tagF遺伝子等のテイコ酸合成酵素関連遺伝子の上流に当該プロモーター配列を組み込むことが好ましい。ここで転写誘導型プロモーターとは、所定の物質の存在を条件として下流に位置する遺伝子の発現を亢進する機能を有するプロモーターを意味する。本発明に用いることができる転写誘導型プロモーターとしては特に限定されず、一例として、lacオペロンのリプレッサーであるlacIによって制御されＩＰＴＧ（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）の存在下で下流遺伝子の発現誘導するプロモーター（Pspac）、キシロース存在下で下流遺伝子の発現誘導するプロモーター（Pxyl）（Gene，181，71-76，(1996)）等を挙げることができる。
形質転換方法としては、微生物に目的ＤＮＡを導入しうる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（J．Bacterial．93，1925（1967））、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet．168，111（1979））、エレクトロポレーション法（FEMS Microbiol．Lett．55，135（1990））又はLP形質転換方法（T．Akamatsu及びJ．Sekiguchi，Archives of Microbiology，1987，146，p.353-357；T．Akamatsu及びH．Taguchi，Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2001，65，4，p.823-829）を用いることができる。
目的ＤＮＡ断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、ベクター又は発現カセット由来の薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主ゲノム中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
目的ＤＮＡ断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、ベクター又は発現カセット由来の薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主ゲノム中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
以下、転写誘導型プロモーターを用いたテイコ酸合成酵素関連遺伝子の発現抑制方法の一例として、ゲノム中のtagF遺伝子上流へPspac転写開始制御領域の導入を行う方法を図１に基づいて説明するが、本発明はこの手法に限定されるものではない。
まず、ＳＤ配列を含むtagF遺伝子の５’側部分配列を、特異的なプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素で処理する。このＤＮＡ断片を、同じく制限酵素処理したPspac転写開始制御領域を有するプラスミドと結合し、該ＤＮＡ断片がPspac転写開始制御領域の下流に挿入された組換えプラスミドＤＮＡを得る。得られた組換えプラスミド中に目的ＤＮＡ断片が挿入されていることは、シークエンス等の通常の確認方法により確認することができる。なお、Pspac転写開始制御領域は枯草菌において、誘導物質にて制御が可能なプロモーターとして開発されたものである。lacリプレッサー遺伝子を共存させると、リプレッサーによりPspacプロモーターの発現は抑制されるが、誘導物質であるＩＰＴＧ（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside）を添加することによりリプレッサーが外れ、プロモーターが活性化することが知られているものである（Yansura，D．G．and D．J．Henner，Genetics and Biotechnology of Bacilli（1984）Development of an inducible promoter for controlled gene expression in Bacillus subtilis）。
次に、得られた組換えプラスミドを用いて、コンピテントセル法等の形質転換法によりプロテアーゼ欠損株の形質転換を行い、エリスロマイシン及びＩＰＴＧを含む培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離する。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、ＰＣＲ法によって、ゲノム中tagF遺伝子上流へPspac転写開始制御領域が導入されたことを確認することができる。
この形質転換体は、図１に示す様な一重交差の相同組換えが起こった結果得られたものであると考えられ、tagF本来のプロモーター（tagD上流のプロモーターでtagDEFオペロンとして発現制御されている）がspacプロモーターに置き換わり、添加するＩＰＴＧ濃度を適宜変化させることでtagF遺伝子の発現を人為的に制御しうるものとなっている。発現誘導物質であるＩＰＴＧの添加濃度により、所望のレベルにテイコ酸合成酵素関連遺伝子の発現を制御することができるため、微生物の生育状況やタンパク質生産量等の要素を適宜勘案して、テイコ酸合成酵素関連遺伝子発現抑制の強さをコントロールし、よりタンパク質生産に最適な条件を確立することが可能となる。
まず、ＳＤ配列を含むtagF遺伝子の５’側部分配列を、特異的なプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素で処理する。このＤＮＡ断片を、同じく制限酵素処理したPspac転写開始制御領域を有するプラスミドと結合し、該ＤＮＡ断片がPspac転写開始制御領域の下流に挿入された組換えプラスミドＤＮＡを得る。得られた組換えプラスミド中に目的ＤＮＡ断片が挿入されていることは、シークエンス等の通常の確認方法により確認することができる。なお、Pspac転写開始制御領域は枯草菌において、誘導物質にて制御が可能なプロモーターとして開発されたものである。lacリプレッサー遺伝子を共存させると、リプレッサーによりPspacプロモーターの発現は抑制されるが、誘導物質であるＩＰＴＧ（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside）を添加することによりリプレッサーが外れ、プロモーターが活性化することが知られているものである（Yansura，D．G．and D．J．Henner，Genetics and Biotechnology of Bacilli（1984）Development of an inducible promoter for controlled gene expression in Bacillus subtilis）。
次に、得られた組換えプラスミドを用いて、コンピテントセル法等の形質転換法によりプロテアーゼ欠損株の形質転換を行い、エリスロマイシン及びＩＰＴＧを含む培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離する。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、ＰＣＲ法によって、ゲノム中tagF遺伝子上流へPspac転写開始制御領域が導入されたことを確認することができる。
この形質転換体は、図１に示す様な一重交差の相同組換えが起こった結果得られたものであると考えられ、tagF本来のプロモーター（tagD上流のプロモーターでtagDEFオペロンとして発現制御されている）がspacプロモーターに置き換わり、添加するＩＰＴＧ濃度を適宜変化させることでtagF遺伝子の発現を人為的に制御しうるものとなっている。発現誘導物質であるＩＰＴＧの添加濃度により、所望のレベルにテイコ酸合成酵素関連遺伝子の発現を制御することができるため、微生物の生育状況やタンパク質生産量等の要素を適宜勘案して、テイコ酸合成酵素関連遺伝子発現抑制の強さをコントロールし、よりタンパク質生産に最適な条件を確立することが可能となる。
遺伝子を破壊する方法では、複数存在するテイコ酸合成酵素関連遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子を破壊する。遺伝子の破壊は、例えば、遺伝子を欠失させるか、遺伝子に変異を導入することにより行うことができる。
遺伝子の破壊には、例えば相同組換えによる方法を用いることができる。すなわち、塩基置換や塩基挿入等によって不活性化変異を導入した標的遺伝子、又は標的遺伝子の外側領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片等をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子変異部位の外側２ヶ所領域、又は標的遺伝子外側２ヶ所の領域で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失或いは不活性化させた遺伝子断片と置換することが可能である。或いは、標的遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断することによって不活性化することも可能である。
特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化させる方法については、既にいくつかの報告例があり（Mol．Gen．Genet.，223，268（1990）等）、こうした方法を繰り返すことによって、本発明の宿主微生物を得ることができる。
遺伝子の破壊には、例えば相同組換えによる方法を用いることができる。すなわち、塩基置換や塩基挿入等によって不活性化変異を導入した標的遺伝子、又は標的遺伝子の外側領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片等をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子変異部位の外側２ヶ所領域、又は標的遺伝子外側２ヶ所の領域で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失或いは不活性化させた遺伝子断片と置換することが可能である。或いは、標的遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断することによって不活性化することも可能である。
特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化させる方法については、既にいくつかの報告例があり（Mol．Gen．Genet.，223，268（1990）等）、こうした方法を繰り返すことによって、本発明の宿主微生物を得ることができる。
また、遺伝子に変異を導入する方法として、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することもできる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K（TAKARA社製）やMutant-G（TAKARA社製））などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異の導入を行ってもよい。
相同組換えにより遺伝子を欠失させる方法の一例を、図２に基づいて説明する。先ず、１回目のＰＣＲにおいて、宿主ゲノムＤＮＡ（例えば、細菌ゲノムＤＮＡ）において、欠失対象遺伝子（例えば、テイコ酸合成酵素関連遺伝子、溶菌酵素を分解するプロテアーゼをコードする遺伝子等）に隣接する５’側領域を含むＤＮＡ断片（Ａ断片：例えば、０．５〜３ｋｂｐ）及び欠失対象遺伝子に隣接する３’側領域を含むＤＮＡ断片（Ｃ断片：例えば、０．５〜３ｋｂｐ）、並びに薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ｂ断片）を、それぞれ特異的なプライマーセットを用いたＰＣＲによって増幅し、調製する。また、この際、Ａ断片増幅のＰＣＲでは、Ａ断片の３’末端にＢ断片の５’末端の相同配列（例えば、１０〜３０塩基）を付加するように設計したプライマーを用いる。同様に、Ｃ断片増幅のＰＣＲでは、Ｃ断片の５’末端にＢ断片の３’末端の相同配列（例えば、１０〜３０塩基）を付加するように設計したプライマーを用いる。
次いで、１回目のＰＣＲで調製した３種類のＰＣＲ産物（ＰＣＲ産物Ａ、Ｂ、Ｃ）を鋳型とし、Ａ断片のＰＣＲ増幅に使用したフォワードプライマーとＣ断片のＰＣＲ増幅に使用したリバースプライマーを用いて２回目のＰＣＲ（SOE（splicing by overlap extension）-PCR（Gene，77，61,（1989））を行うことによって、ＰＣＲ産物Ａの３’末端とＰＣＲ産物Ｂの５’末端との間にアニールが生じ、また同様にＰＣＲ産物Ｂの３’末端とＰＣＲ産物Ｃの５’末端との間にアニールが生じ、ＰＣＲ増幅の結果、Ａ断片−Ｂ断片−Ｃ断片の順に連結したＰＣＲ産物Ｄを得ることができる。
さらに、得られたＰＣＲ産物Ｄを宿主（例えば、細菌）に導入することで、宿主ゲノムＤＮＡとＰＣＲ産物Ｄとの間で相同組換えが生じ、宿主ゲノムＤＮＡの欠失対象遺伝子部位にＰＣＲ産物Ｄ中の薬剤耐性遺伝子を組み込むと同時に、宿主ゲノムＤＮＡ中の欠失対象遺伝子を欠失させることができる。この際、形質転換が行われたか否かの確認は、宿主ゲノムＤＮＡ中に組み込まれた薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤についての耐性を指標に確認することができる。
また、所定の遺伝子の欠失方法としては、ＳＯＥ−ＰＣＲ法によって調製される欠失導入用ＤＮＡ断片を挿入した欠失導入用プラスミドを用いた２段階の１重交差法を用いることもできる。本方法については、特開２００６−１７４７０７号公報を参照にして実施することが可能である。
また、テイコ酸合成酵素関連遺伝子の翻訳を抑制する方法としては、いわゆるアンチセンスＲＮＡを用いる方法が挙げられる。具体的には、テイコ酸合成酵素関連遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを転写する遺伝子を、細菌ゲノムＤＮＡに組み込み、当該アンチセンスＲＮＡを過剰発現させることで、テイコ酸合成酵素関連遺伝子のｍＲＮＡの翻訳が抑制される。
さらに、上述のような方法のほか、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行うことによって、目的の微生物株を得ることもできる。例えば、ランダムにクローニングしたＤＮＡ断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射する方法等が挙げられる。
以上の方法により構築された本発明の微生物は、タンパク質等の目的物質の製造に好適に用いることができる。微生物が生産しうる目的物質としては、用いる宿主微生物の種類に応じて最適なものを適宜選択することができ特に制限されないが、例えば、本発明に係る微生物が上述のプロテアーゼ欠損株である場合、タンパク質又はポリペプチド生産に好適に用いることができる。具体的には、本発明に係る微生物に、目的とするタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって、当該タンパク質又はポリペプチドを高生産する組換え微生物を得ることができる。
本発明の微生物を用いて生産しうるタンパク質又はポリペプチドとしては、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断等の各種産業用途に有用な酵素や生理活性因子等のタンパク質やポリペプチドが挙げられる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素（Oxidoreductase）、転移酵素（Transferase）、加水分解酵素（Hydrolase）、脱離酵素（Lyase）、異性化酵素（Isomerase）、合成酵素（Ligase/Synthetase）等が含まれるが、用いる宿主の種類や欠損しているプロテアーゼの種類に応じて最適な酵素を適宜選択することが好ましい。例えば、上述の溶菌酵素を分解するプロテアーゼ欠損株を用いた場合好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ等の加水分解酵素の遺伝子が挙げられる。
具体的には、多糖加水分解酵素の分類（Biochem．J.，280，309（1991））中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、特開２００６−１７４７０７号公報に記載された配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼや、当該アミノ酸配列の１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼが挙げられ、さらには、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
また、α-アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα-アミラーゼが挙げられ、特にバチルス属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、特開２００６−１７４７０７号公報に記載された配列番号６１で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。尚、アミノ酸配列の同一性は前述したLipman-Pearson法（Science，227，1435,（1985））によって計算される。
また、プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。
リパーゼの具体例としては、Jaegerらの分類（Biochem．J.，343，177-183(1999)）に従いTrue lipaseに分類されるリパーゼ、GDSLファミリーに分類されるリパーゼ、HSLファミリーに分類されるリパーゼの他、ファミリーＩＩＩからＶＩＩＩに分類されるリパーゼが挙げられる。中でも、枯草菌のLipA遺伝子によってコードされるLipAタンパク質（当該タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２０に示す）や、膜に局在することが知られているセラチア（Serratia marcescens）由来のLipAタンパク質（Journal of bioscience and bioengineering，2001(4)，409-415）がより好ましい。
更に、本発明により生産されるタンパク質としてはヒトなどの高等生物由来の生理活性タンパク質や酵素などが挙げられる。好適な例としては、インターフェロンα、インターフェロンβ、成長ホルモン、唾液腺アミラーゼ等が挙げられる。また、生理活性タンパク質などを構成する一部のドメイン等も発現可能であり、例えば、ヒトＣ型肝炎ウィルス抗体の抗原認識ドメインPreS2などが挙げられる。
具体的には、多糖加水分解酵素の分類（Biochem．J.，280，309（1991））中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、特開２００６−１７４７０７号公報に記載された配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼや、当該アミノ酸配列の１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼが挙げられ、さらには、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
また、α-アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα-アミラーゼが挙げられ、特にバチルス属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、特開２００６−１７４７０７号公報に記載された配列番号６１で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。尚、アミノ酸配列の同一性は前述したLipman-Pearson法（Science，227，1435,（1985））によって計算される。
また、プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。
リパーゼの具体例としては、Jaegerらの分類（Biochem．J.，343，177-183(1999)）に従いTrue lipaseに分類されるリパーゼ、GDSLファミリーに分類されるリパーゼ、HSLファミリーに分類されるリパーゼの他、ファミリーＩＩＩからＶＩＩＩに分類されるリパーゼが挙げられる。中でも、枯草菌のLipA遺伝子によってコードされるLipAタンパク質（当該タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２０に示す）や、膜に局在することが知られているセラチア（Serratia marcescens）由来のLipAタンパク質（Journal of bioscience and bioengineering，2001(4)，409-415）がより好ましい。
更に、本発明により生産されるタンパク質としてはヒトなどの高等生物由来の生理活性タンパク質や酵素などが挙げられる。好適な例としては、インターフェロンα、インターフェロンβ、成長ホルモン、唾液腺アミラーゼ等が挙げられる。また、生理活性タンパク質などを構成する一部のドメイン等も発現可能であり、例えば、ヒトＣ型肝炎ウィルス抗体の抗原認識ドメインPreS2などが挙げられる。
また、目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましい。
上記の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域は所望の機能を有するものであれば制限は無いが、特にバチルス属細菌由来の領域が好ましい。更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス属細菌のリパーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域がセルラーゼ遺伝子の上流０．６〜１ｋｂ領域であるものが、目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開２０００−２１００８１号公報や特開平４−１９０７９３号公報等に記載されているバチルス属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域及び翻訳開始領域が分泌シグナルペプチド領域と共に目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的な転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域としては特開２００６−１７４７０７号公報に記載された配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１〜５７８の塩基配列、特開２００６−１７４７０７号公報に記載された配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６１５の塩基配列、また当該塩基配列に対して７０％以上、８０％以上若しくは９０％以上の相同性（同一性）を有することが好ましく、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、特に好ましくは９７％以上、より特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。
より具体的な分泌シグナル領域としてはバチルス属細菌のリパーゼ遺伝子である配列番号１９の塩基番号１〜９３の塩基配列、または当該塩基配列に対して７０％以上、８０％以上若しくは９０％以上の相同性を有することが好ましく、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、特に好ましくは９７％以上、より特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。
なお、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているＤＮＡ断片を意味する。
上記の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域は所望の機能を有するものであれば制限は無いが、特にバチルス属細菌由来の領域が好ましい。更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス属細菌のリパーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域がセルラーゼ遺伝子の上流０．６〜１ｋｂ領域であるものが、目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開２０００−２１００８１号公報や特開平４−１９０７９３号公報等に記載されているバチルス属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域及び翻訳開始領域が分泌シグナルペプチド領域と共に目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的な転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域としては特開２００６−１７４７０７号公報に記載された配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１〜５７８の塩基配列、特開２００６−１７４７０７号公報に記載された配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６１５の塩基配列、また当該塩基配列に対して７０％以上、８０％以上若しくは９０％以上の相同性（同一性）を有することが好ましく、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、特に好ましくは９７％以上、より特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。
より具体的な分泌シグナル領域としてはバチルス属細菌のリパーゼ遺伝子である配列番号１９の塩基番号１〜９３の塩基配列、または当該塩基配列に対して７０％以上、８０％以上若しくは９０％以上の相同性を有することが好ましく、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、特に好ましくは９７％以上、より特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。
なお、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているＤＮＡ断片を意味する。
上記の目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むＤＮＡ断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法によって本発明に係る微生物に取り込ませることによって、目的タンパク質又はポリペプチドを生産する組換え微生物を得ることができる。また、当該ＤＮＡ断片に本発明に係る微生物のゲノムとの適当な相同領域を結合したＤＮＡ断片を用い、ゲノムに直接組み込むことによっても当該組換え微生物を得ることができる。
組換え微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。培地の成分・組成などは特に限定されないが、好ましくは、炭素源としてマルトース又はマルトオリゴ糖を含む培地を用いれば、より良い結果が得られる。
タンパク質、ポリペプチドの採取・精製は、例えば遠心分離又はろ過による組換え微生物の分離、上清又はろ液中のタンパク質やポリペプチドの硫酸アンモニウム等の塩を加えることによる沈殿、エタノール等の有機溶媒を加えることによる沈殿、限外ろ過膜等を用いた濃縮や脱塩、イオン交換又はゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた精製等の方法を用いて行うことができる。
組換え微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。培地の成分・組成などは特に限定されないが、好ましくは、炭素源としてマルトース又はマルトオリゴ糖を含む培地を用いれば、より良い結果が得られる。
タンパク質、ポリペプチドの採取・精製は、例えば遠心分離又はろ過による組換え微生物の分離、上清又はろ液中のタンパク質やポリペプチドの硫酸アンモニウム等の塩を加えることによる沈殿、エタノール等の有機溶媒を加えることによる沈殿、限外ろ過膜等を用いた濃縮や脱塩、イオン交換又はゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた精製等の方法を用いて行うことができる。
以上のように、本発明に係る溶菌抑制方法によれば、少なくとも１種のテイコ酸合成酵素関連遺伝子を発現抑制することで、その溶菌が有意に抑制された微生物を得ることができる。本発明に係る溶菌抑制方法は、例えば野生型と比較して溶菌しやすい微生物株に対して好適に用いることができ、当該微生物株の培養を長時間に亘って継続することを可能とする。このような微生物をタンパク質等の目的物質生産に用いる場合、個々の菌体の培養時間を長くできるため、物質の生産性を向上させうる。そのため、本発明に係る微生物は、タンパク質等の目的物質の製造に好適に用いることができる。
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１ Dpr9/PtagF株の構築
本実施例では、プロテアーゼ遺伝子９重欠失株（Dpr9株）を宿主として用い、枯草菌由来の細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子であるtagF遺伝子発現制御株（Dpr9/PtagF）の構築方法を示す。
表３に示したプライマーtagF-21F及びtagF+444Rを用いて、tagF遺伝子のＳＤ配列を含む５’末端ＤＮＡ断片（465bp）を枯草菌168株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、PCRにて増幅した後、制限酵素EcoRIおよびBamHIで処理した（ＤＮＡ断片Ａ）。一方、spacプロモーター配列を有するプラスミドpMutin4（Microbiology，144，3097-3104,（1998））を制限酵素EcoRI及びBamHIで処理した後、図１に示すように、このプラスミドにtagF遺伝子のＤＮＡ断片Ａを挿入した。このプラスミドＤＮＡを大腸菌JM109株に形質転換し、得られた組換えプラスミドＤＮＡについて目的とするＤＮＡ断片Ａが挿入されていることをシーケンスにて確認し、挿入が確認されたプラスミドをpM4PtagFとした（図１：pM4PtagF）。pM4PtagFをさらに大腸菌C600株に形質転換し、ポリマー化したプラスミドＤＮＡを得た。ポリマー化したpM4PtagFを用いて、コンピテント法により枯草菌Dpr9株（特開2006-174707号公報の実施例１〜５において作製されたKao9株）の形質転換を行った。なお、枯草菌Dpr9株（Kao9株）は、プロテアーゼ遺伝子９重欠失株であり、枯草菌のaprE遺伝子、nprB遺伝子、nprE遺伝子、bpr遺伝子、vpr遺伝子、mpr遺伝子、epr遺伝子、wprA遺伝子及びaprX遺伝子の各遺伝子を欠損した枯草菌変異株である。形質転換後、エリスロマイシン（０．３μｇ/ｍＬ）および１ｍＭ ＩＰＴＧ（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、ＰＣＲによってtagF遺伝子の上流領域がtagF本来のプロモーター（tagD上流のプロモーターでtagDEFオペロンとして発現制御されている）からspacプロモーターに置換された目的の変異株（Dpr9/PtagF株）が構築できたことを確認した。以上のようにして、tagF遺伝子発現制御株（Dpr9/PtagF株）を構築した。
本実施例では、プロテアーゼ遺伝子９重欠失株（Dpr9株）を宿主として用い、枯草菌由来の細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子であるtagF遺伝子発現制御株（Dpr9/PtagF）の構築方法を示す。
表３に示したプライマーtagF-21F及びtagF+444Rを用いて、tagF遺伝子のＳＤ配列を含む５’末端ＤＮＡ断片（465bp）を枯草菌168株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、PCRにて増幅した後、制限酵素EcoRIおよびBamHIで処理した（ＤＮＡ断片Ａ）。一方、spacプロモーター配列を有するプラスミドpMutin4（Microbiology，144，3097-3104,（1998））を制限酵素EcoRI及びBamHIで処理した後、図１に示すように、このプラスミドにtagF遺伝子のＤＮＡ断片Ａを挿入した。このプラスミドＤＮＡを大腸菌JM109株に形質転換し、得られた組換えプラスミドＤＮＡについて目的とするＤＮＡ断片Ａが挿入されていることをシーケンスにて確認し、挿入が確認されたプラスミドをpM4PtagFとした（図１：pM4PtagF）。pM4PtagFをさらに大腸菌C600株に形質転換し、ポリマー化したプラスミドＤＮＡを得た。ポリマー化したpM4PtagFを用いて、コンピテント法により枯草菌Dpr9株（特開2006-174707号公報の実施例１〜５において作製されたKao9株）の形質転換を行った。なお、枯草菌Dpr9株（Kao9株）は、プロテアーゼ遺伝子９重欠失株であり、枯草菌のaprE遺伝子、nprB遺伝子、nprE遺伝子、bpr遺伝子、vpr遺伝子、mpr遺伝子、epr遺伝子、wprA遺伝子及びaprX遺伝子の各遺伝子を欠損した枯草菌変異株である。形質転換後、エリスロマイシン（０．３μｇ/ｍＬ）および１ｍＭ ＩＰＴＧ（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、ＰＣＲによってtagF遺伝子の上流領域がtagF本来のプロモーター（tagD上流のプロモーターでtagDEFオペロンとして発現制御されている）からspacプロモーターに置換された目的の変異株（Dpr9/PtagF株）が構築できたことを確認した。以上のようにして、tagF遺伝子発現制御株（Dpr9/PtagF株）を構築した。
実施例２ Dpr9/PtagF株の溶菌抑制
実施例１で作製したDpr9/PtagF株について、その溶菌抑制作用を調べた。
実施例１にて得られたDpr9/PtagF株及び対照として枯草菌Dpr9株をLB寒天培地（Dpr9/PtagF株を培養する場合は、０．３ｐｐｍエリスロマイシンおよび１ｍＭ ＩＰＴＧを含む）に植菌し、３７℃で８時間培養した。その後ＯＤ６００ｎｍ＝０．０１になるように５ｍＬのＬＢ培地（Dpr9/PtagF株を培養する場合は、０．３ｐｐｍエリスロマイシンおよび０．４ｍＭ ＩＰＴＧを含む）で一夜３０℃で振盪培養を行い、更にこの培養液０．６ｍＬを３０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７／５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４-５水和物）に接種し、３０℃で２日間、振盪培養を行った。培養後、培養液の濁度をＯＤ６００ｎｍにて測定し、各菌株における溶菌速度を比較した。結果を図３に示す。
実施例１で作製したDpr9/PtagF株について、その溶菌抑制作用を調べた。
実施例１にて得られたDpr9/PtagF株及び対照として枯草菌Dpr9株をLB寒天培地（Dpr9/PtagF株を培養する場合は、０．３ｐｐｍエリスロマイシンおよび１ｍＭ ＩＰＴＧを含む）に植菌し、３７℃で８時間培養した。その後ＯＤ６００ｎｍ＝０．０１になるように５ｍＬのＬＢ培地（Dpr9/PtagF株を培養する場合は、０．３ｐｐｍエリスロマイシンおよび０．４ｍＭ ＩＰＴＧを含む）で一夜３０℃で振盪培養を行い、更にこの培養液０．６ｍＬを３０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７／５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４-５水和物）に接種し、３０℃で２日間、振盪培養を行った。培養後、培養液の濁度をＯＤ６００ｎｍにて測定し、各菌株における溶菌速度を比較した。結果を図３に示す。
図３から明らかなように、Dpr9株では培養後３５時間以降に培養液濁度が低下しており、溶菌が起こっている。それに対してＩＰＴＧ非存在下におけるDpr9/PtagF株の培養液濁度は低下せず、溶菌が抑制されている。このことから、Dpr9/PtagF株においては、ＩＰＴＧ非存在下すなわちtagF遺伝子を発現しない条件下において溶菌抑制が可能であることが示された。
実施例３ Dpr9/PtagF株の細胞壁溶解酵素（溶菌酵素）活性
実施例１にて得られたDpr9/PtagF株及び対照としてDpr9株を用い、それぞれの株において細胞壁溶解酵素（溶菌酵素）活性をザイモグラム解析（J．Bacteriol.，174，464,（1992）；J．Bacteriol.，175，6260,（1993）参照）にて解析した。実施例２に示した培養方法に従って、これら菌株を培養し、細胞表層の溶菌酵素を調製し（FEMS Microbiol．Lett.，112，135-140（1993））、ザイモグラム解析に用いた。結果を図４に示す。
実施例１にて得られたDpr9/PtagF株及び対照としてDpr9株を用い、それぞれの株において細胞壁溶解酵素（溶菌酵素）活性をザイモグラム解析（J．Bacteriol.，174，464,（1992）；J．Bacteriol.，175，6260,（1993）参照）にて解析した。実施例２に示した培養方法に従って、これら菌株を培養し、細胞表層の溶菌酵素を調製し（FEMS Microbiol．Lett.，112，135-140（1993））、ザイモグラム解析に用いた。結果を図４に示す。
図４から明らかなように、Dpr9株では溶菌現象が確認された培養３５時間後（図３参照）において複数の細胞壁溶解酵素活性が認められた。これに対して、ＩＰＴＧ非存在下におけるDpr9/PtagF株では、同時間帯における細胞壁溶解酵素活性が大幅に減少することが確認された。
実施例４ Dpr9/PtagF株の細胞壁中のテイコ酸量の測定
１．枯草菌のテイコ酸の調製
実施例１にて得られたDpr9/PtagF株及び対照として枯草菌Dpr9株をLB寒天培地（Dpr9/PtagF株を培養する場合は、０．３ｐｐｍエリスロマイシンおよび１ｍＭ ＩＰＴＧを含む）に植菌し、３７℃で８時間培養した。その後ＯＤ６００ｎｍ＝０．０１になるように５ｍＬのＬＢ培地（Dpr9/PtagF株を培養する場合は、０．３ｐｐｍエリスロマイシンおよび０．４ｍＭ ＩＰＴＧを含む）で一夜３０℃で振盪培養を行い、更にこの培養液０．６ｍＬを３０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７/５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン4-5水和物）に接種し、３０℃で２日間、振盪培養を行った。遠心分離（１００００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，２０℃）にて培養液濁度の合計がＯＤ３，０００程度となるように集菌し、菌体を２０ｍｌの３Ｍ ＬｉＣｌで懸濁した。菌懸濁液を１０分間煮沸処理した後、０．１ｍｍサイズのガラスビーズを加えてホモジナイズ処理（NISSEI Ace Homogenizer AM-8使用）を行い、菌体の破砕を顕微鏡観察により確認した。その後、約１Ｌのイオン交換水を加え、上清を遠心分離し（KUBOTA KR-2000c ローター:RA-6使用、３０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，４℃）、得られた上清をさらに遠心分離した（KUBOTA KR-2000c ローター:RA-3使用、１２，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）。沈殿物を２０ｍｌのイオン交換水に懸濁した後、２０ｍｌの８％ＳＤＳを加え、１０分間煮沸処理した。その後さらに遠心分離（KUBOTA KR-2000c ローター:RA-3使用、１２，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，室温）し、沈殿物を１０ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌに懸濁し、遠心分離（KUBOTA KR-2000c ローター:RA-3使用、１２，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，室温）した。上記条件で懸濁および遠心分離操作を5回程繰り返し、沈殿物の洗浄を行なった。さらに沈殿物を１０ｍlのイオン交換水に５回ほど置換処理した後、２ｍｌのイオン交換水に懸濁した。この細胞壁懸濁液を凍結乾燥し、粉末状の細胞壁を得た。
得られた細胞壁３０ｍｇを６００μＬの１０％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）に懸濁し、これを６５℃で１０時間以上インキュベートした後、遠心分離（KUBOTA KR-2000c ローター:RA-3使用、１２，０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，室温）し、上清画分を細胞壁テイコ酸サンプルとして分取した。さらに沈殿物を１４００μＬのイオン交換水で懸濁し、遠心分離後、この上清画分も細胞壁テイコ酸サンプルとして分取した。
１．枯草菌のテイコ酸の調製
実施例１にて得られたDpr9/PtagF株及び対照として枯草菌Dpr9株をLB寒天培地（Dpr9/PtagF株を培養する場合は、０．３ｐｐｍエリスロマイシンおよび１ｍＭ ＩＰＴＧを含む）に植菌し、３７℃で８時間培養した。その後ＯＤ６００ｎｍ＝０．０１になるように５ｍＬのＬＢ培地（Dpr9/PtagF株を培養する場合は、０．３ｐｐｍエリスロマイシンおよび０．４ｍＭ ＩＰＴＧを含む）で一夜３０℃で振盪培養を行い、更にこの培養液０．６ｍＬを３０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７/５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン4-5水和物）に接種し、３０℃で２日間、振盪培養を行った。遠心分離（１００００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，２０℃）にて培養液濁度の合計がＯＤ３，０００程度となるように集菌し、菌体を２０ｍｌの３Ｍ ＬｉＣｌで懸濁した。菌懸濁液を１０分間煮沸処理した後、０．１ｍｍサイズのガラスビーズを加えてホモジナイズ処理（NISSEI Ace Homogenizer AM-8使用）を行い、菌体の破砕を顕微鏡観察により確認した。その後、約１Ｌのイオン交換水を加え、上清を遠心分離し（KUBOTA KR-2000c ローター:RA-6使用、３０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，４℃）、得られた上清をさらに遠心分離した（KUBOTA KR-2000c ローター:RA-3使用、１２，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）。沈殿物を２０ｍｌのイオン交換水に懸濁した後、２０ｍｌの８％ＳＤＳを加え、１０分間煮沸処理した。その後さらに遠心分離（KUBOTA KR-2000c ローター:RA-3使用、１２，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，室温）し、沈殿物を１０ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌに懸濁し、遠心分離（KUBOTA KR-2000c ローター:RA-3使用、１２，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，室温）した。上記条件で懸濁および遠心分離操作を5回程繰り返し、沈殿物の洗浄を行なった。さらに沈殿物を１０ｍlのイオン交換水に５回ほど置換処理した後、２ｍｌのイオン交換水に懸濁した。この細胞壁懸濁液を凍結乾燥し、粉末状の細胞壁を得た。
得られた細胞壁３０ｍｇを６００μＬの１０％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）に懸濁し、これを６５℃で１０時間以上インキュベートした後、遠心分離（KUBOTA KR-2000c ローター:RA-3使用、１２，０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，室温）し、上清画分を細胞壁テイコ酸サンプルとして分取した。さらに沈殿物を１４００μＬのイオン交換水で懸濁し、遠心分離後、この上清画分も細胞壁テイコ酸サンプルとして分取した。
２．細胞壁中のリン酸の定量
Dpr9/PtagF株及び対照としてDpr9株の細胞壁テイコ酸量を、リン酸量を指標として定量した。上記で得られた細胞壁テイコ酸サンプルについて、リン酸の定量をモリブデンブルー法（Microbiology，143，947-956,（1997）参照）に従い行なった。結果を表４に示す。
Dpr9/PtagF株及び対照としてDpr9株の細胞壁テイコ酸量を、リン酸量を指標として定量した。上記で得られた細胞壁テイコ酸サンプルについて、リン酸の定量をモリブデンブルー法（Microbiology，143，947-956,（1997）参照）に従い行なった。結果を表４に示す。
表４から明らかなように、Dpr9株およびDpr9/PtagF株における、細胞壁１ｍｇの当りのリン酸量は、それぞれ１．２１ｎｍｏｌ及び０．８１ｎｍｏｌであった。すなわち、Dpr9/PtagF株の細胞壁中のテイコ酸量は、Dpr9株と比較して約３割減少していることが確認された。アミノ酸配列情報から、TagFタンパク質は細胞壁テイコ酸の構成成分であるグリセロールリン酸のポリマー化反応を触媒していると考えられる。Dpr9/PtagF株では、ＩＰＴＧ非存在下ではtagF遺伝子が発現していないため、細胞壁中に含まれるグリセロールリン酸量がtagF遺伝子を発現しているDpr9株と比較して低い値となった。
実施例５ リパーゼの生産
実施例１にて得られたDpr9/PtagF株及び対照として枯草菌Dpr9株を用い、それぞれの株に、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（配列番号１７（当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１８に示す））の転写開始制御領域及び翻訳開始制御プロモーター領域（配列番号１７の塩基番号１３〜５７８の領域）、枯草菌LipAのシグナルペプチド領域、LipAの成熟領域及びlipAのターミネーター部位（配列番号１９の塩基番号１〜７２５の領域）をコードするＤＮＡ断片がシャトルベクターpHY300PLKのBamHIおよびXbaI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHLApm（特開2009-038985号公報参照）を、コンピテント形質転換法によって導入した。これら菌株をそれぞれDpr9/PtagF（pHLApm）株およびDpr9（pHLApm）株と命名した。Dpr9/PtagF（pHLApm）株およびDpr9（pHLApm）株は１５ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地（Dpr9/PtagF（pHLApm）株を培養する場合は、さらに０．３ｐｐｍエリスロマイシンおよび１ｍＭ ＩＰＴＧを含む）に植菌し、３７℃で８時間培養した。その後ＯＤ６００ｎｍ＝０．０１になるように５ｍＬの１５ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地（Dpr9/PtagF（pHLApm）株を培養する場合は、さらに０．３ｐｐｍエリスロマイシンおよび０．４ ｍＭ ＩＰＴＧを含む）で一夜３０℃で振盪培養を行い、更にこの培養液０．６ｍＬを３０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７／５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４-５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃で３日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除き、培養液上清中のリパーゼを電気泳動（SDS-PAGE）によって確認した。結果を図５に示す。
実施例１にて得られたDpr9/PtagF株及び対照として枯草菌Dpr9株を用い、それぞれの株に、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（配列番号１７（当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１８に示す））の転写開始制御領域及び翻訳開始制御プロモーター領域（配列番号１７の塩基番号１３〜５７８の領域）、枯草菌LipAのシグナルペプチド領域、LipAの成熟領域及びlipAのターミネーター部位（配列番号１９の塩基番号１〜７２５の領域）をコードするＤＮＡ断片がシャトルベクターpHY300PLKのBamHIおよびXbaI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHLApm（特開2009-038985号公報参照）を、コンピテント形質転換法によって導入した。これら菌株をそれぞれDpr9/PtagF（pHLApm）株およびDpr9（pHLApm）株と命名した。Dpr9/PtagF（pHLApm）株およびDpr9（pHLApm）株は１５ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地（Dpr9/PtagF（pHLApm）株を培養する場合は、さらに０．３ｐｐｍエリスロマイシンおよび１ｍＭ ＩＰＴＧを含む）に植菌し、３７℃で８時間培養した。その後ＯＤ６００ｎｍ＝０．０１になるように５ｍＬの１５ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地（Dpr9/PtagF（pHLApm）株を培養する場合は、さらに０．３ｐｐｍエリスロマイシンおよび０．４ ｍＭ ＩＰＴＧを含む）で一夜３０℃で振盪培養を行い、更にこの培養液０．６ｍＬを３０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７／５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４-５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃で３日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除き、培養液上清中のリパーゼを電気泳動（SDS-PAGE）によって確認した。結果を図５に示す。
図５から明らかなように、Dpr9/PtagF株では対照のDpr9株と比較して同等のリパーゼ生産性が認められた。すなわち、Dpr9株と比較しても、tagF遺伝子の発現抑制によってタンパク質の分泌生産に負の影響を及ぼすことはなく、tagF遺伝子が発現抑制されたDpr9/PtagF株もプロテアーゼ欠失株であるDpr9株と同様に、タンパク質生産に好適に用いることができると考えられる。
Claims (13)
- 枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子が発現抑制され、溶菌が抑制された微生物。
- 発現抑制される前記少なくとも１つの遺伝子が、枯草菌由来のtagF遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の微生物。
- 少なくとも１種のプロテアーゼについて活性が低下した又は活性を有しない微生物であることを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物。
- 前記プロテアーゼが細胞壁溶解酵素を分解するものであることを特徴とする請求項３記載の微生物。
- 前記プロテアーゼをコードする遺伝子が枯草菌由来のaprX遺伝子、aprE遺伝子、nprB遺伝子、nprE遺伝子、bpr遺伝子、vpr遺伝子、mpr遺伝子、epr遺伝子及びwprA遺伝子、並びに当該遺伝子に相当する遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項３又は４に記載の微生物。
- バチルス属（Bacillus）に属する細菌であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物。
- 枯草菌（Bacillus subtilis）であることを特徴とする請求項６記載の微生物。
- 目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入したことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物。
- 請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
- 枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を有する微生物において、枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子を発現抑制する工程を含む微生物の溶菌抑制方法。
- 発現抑制される前記少なくとも１つの遺伝子が、枯草菌由来のtagF遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子であることを特徴とする請求項１０記載の溶菌抑制方法。
- 少なくとも１種のプロテアーゼについて活性が低下した又は活性を有しない微生物であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の溶菌抑制方法。
- 枯草菌が有する細胞壁テイコ酸合成酵素関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、溶菌が抑制された微生物の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010022580A JP6059416B2 (ja) | 2010-02-03 | 2010-02-03 | 溶菌が抑制された微生物、当該微生物の製造方法、当該微生物を用いたタンパク質等の製造方法、及び微生物の溶菌抑制方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010022580A JP6059416B2 (ja) | 2010-02-03 | 2010-02-03 | 溶菌が抑制された微生物、当該微生物の製造方法、当該微生物を用いたタンパク質等の製造方法、及び微生物の溶菌抑制方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011155950A true JP2011155950A (ja) | 2011-08-18 |
| JP6059416B2 JP6059416B2 (ja) | 2017-01-11 |
Family
ID=44588512
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010022580A Active JP6059416B2 (ja) | 2010-02-03 | 2010-02-03 | 溶菌が抑制された微生物、当該微生物の製造方法、当該微生物を用いたタンパク質等の製造方法、及び微生物の溶菌抑制方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6059416B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017042124A (ja) * | 2015-08-28 | 2017-03-02 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | Ｃｄｐ−グリセロールグリセロフォスフォトランスフェラーゼ欠損豚丹毒菌とその利用 |
| JP2018516076A (ja) * | 2015-05-22 | 2018-06-21 | デュポン ニュートリション バイオサイエンシス エーピーエス | Ａｌｄｃの製造方法 |
| CN110004101A (zh) * | 2019-04-15 | 2019-07-12 | 南京农业大学 | 用于为目标蛋白量身构建最优的枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失表达宿主的方法 |
| WO2021001397A1 (en) | 2019-07-04 | 2021-01-07 | Basf Se | A recombinant cell for producing proteins |
-
2010
- 2010-02-03 JP JP2010022580A patent/JP6059416B2/ja active Active
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| JPN6014026478; Ａｍｉｔ Ｐ． Ｂｈａｖｓａｒ ｅｔ ａｌ．: 'Ｔｅｉｃｈｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓ ａｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｔｈａｔ Ｉｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ Ｔｅｉｃｈｕ' Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． Ｖｏｌ．１８６, 2004, ｐ７８６５-７８７３ * |
| JPN6014026480; 野上龍造: 'ペニシリンによって誘発される黄色ブドウ球菌の溶菌機序' 広島大学歯学雑誌 Ｖｏｌ．１５, 19831201, ｐ２５９-２７１ * |
| JPN6014026483; Ａｍｉｔ Ｐ． Ｂｈａｖｓａｒ ｅｔ ａｌ．: 'Ｐｒｅｃｉｓｅ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｇＤ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｔｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ， Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ３-Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｃｙｔｉｄｙｌｙｌｔｒａｎ' Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． Ｖｏｌ．１８３, 2001, ｐ６６８８-６６９３ * |
| JPN6014026485; Ｒ． Ｊ． ＢＯＹＬＡＮ ｅｔ ａｌ．: 'Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ： Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ｂｉｏｓｙｎ' Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． Ｖｏｌ． １１０, 1972, ｐ２８１-２９０ * |
| JPN6014026487; Ｂｒｉｅｈｌ， Ｍ ｅｔ ａｌ．: 'Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｗａｌｌ ｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ' Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３５, 1989, ｐ１３２５-１３３４ * |
| JPN6014026489; Ｒｉｋｉｎｏｒｉ ＭＵＲＡＹＡＭＡ ｅｔ ａｌ．: 'Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｕｓｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｐｐｉｎｇ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ' Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．６８, 2004, ｐ１６７２-１６８０ * |
| JPN7014001916; '枯草菌分泌シグナルペプチドの網羅的スクリーニングによる高効率分泌発現系の構築' Ｂｉｏ ｖｉｅｗ Ｎｏ．５８, 200911, ｐ２６-２７ * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018516076A (ja) * | 2015-05-22 | 2018-06-21 | デュポン ニュートリション バイオサイエンシス エーピーエス | Ａｌｄｃの製造方法 |
| JP2017042124A (ja) * | 2015-08-28 | 2017-03-02 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | Ｃｄｐ−グリセロールグリセロフォスフォトランスフェラーゼ欠損豚丹毒菌とその利用 |
| CN110004101A (zh) * | 2019-04-15 | 2019-07-12 | 南京农业大学 | 用于为目标蛋白量身构建最优的枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失表达宿主的方法 |
| WO2021001397A1 (en) | 2019-07-04 | 2021-01-07 | Basf Se | A recombinant cell for producing proteins |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6059416B2 (ja) | 2017-01-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7231228B2 (ja) | バチルス・リケニフォルミスにおける増加したタンパク質産生のための組成物及び方法 | |
| JP4485341B2 (ja) | 組換え微生物 | |
| EP3259358B1 (en) | Enhanced protein expression | |
| JP2006296268A (ja) | 組換え微生物 | |
| JP5226958B2 (ja) | 組換え微生物 | |
| JP5753419B2 (ja) | 遺伝子欠損株及びそれを用いたタンパク質の製造方法 | |
| JP6059416B2 (ja) | 溶菌が抑制された微生物、当該微生物の製造方法、当該微生物を用いたタンパク質等の製造方法、及び微生物の溶菌抑制方法 | |
| JP5294666B2 (ja) | 組換え微生物 | |
| JP4915728B2 (ja) | 組換え微生物 | |
| JP5513759B2 (ja) | タンパク質又はポリペプチドの生産方法 | |
| JP2006345860A (ja) | 組換えバチルス属細菌 | |
| JP4832153B2 (ja) | 組換え微生物 | |
| JP4509743B2 (ja) | 組換え微生物 | |
| JP4496000B2 (ja) | 宿主微生物 | |
| JP2007049986A (ja) | 組換え微生物 | |
| JP4736085B2 (ja) | 宿主微生物 | |
| JP2023500362A (ja) | バチルス属（ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞における強化されたタンパク質産生のための組成物及び方法 | |
| JP4839169B2 (ja) | 組換え微生物 | |
| JP2009038985A (ja) | 微生物及びこれを用いたタンパク質又ポリペプチドの製造方法 | |
| JP5829802B2 (ja) | 組換え枯草菌 | |
| JP5841749B2 (ja) | 組換え微生物 | |
| JP2007306911A (ja) | 組換え微生物 | |
| JP5739114B2 (ja) | 組換え微生物 | |
| JP4842750B2 (ja) | 組換え微生物 | |
| JP4842751B2 (ja) | 組換え微生物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20121211 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140701 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20140821 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140821 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20150303 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20150602 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150608 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20160603 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160603 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160810 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20160810 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161209 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6059416 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |