CN110004101A

CN110004101A - 用于为目标蛋白量身构建最优的枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失表达宿主的方法

Info

Publication number: CN110004101A
Application number: CN201910299758.2A
Authority: CN
Inventors: 闫新; 赵雷真; 刘圆鑫
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2019-04-15
Publication date: 2019-07-12

Abstract

本发明属生物高技术领域，公开了一种用于为目标蛋白量身构建最适的枯草杆菌蛋白酶缺失表达宿主的方法。每个重组蛋白都有其独特的最优蛋白酶缺失突变表达宿主，而现有的枯草杆菌胞外蛋白酶缺失宿主适用性差，不能满足这种个性化需求。鉴于此，本发明提供一种用于为重组蛋白量身定制最适胞外蛋白酶缺失表达宿主的方法。该方法能准确评估枯草杆菌的每种胞外蛋白酶对目标蛋白生产的影响，从而确定有利和有害的胞外蛋白酶，然后通过失活不利的蛋白酶、保留有利的蛋白酶，获得最优宿主，以最大化提高目标蛋白的产量。

Description

用于为目标蛋白量身构建最优的枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失表达宿主的方法

技术领域

本发明属于生物高技术领域，公开了用于为目标蛋白量身构建最适的枯草杆菌蛋白酶缺失表达宿主的方法。

背景技术

枯草杆菌(Bacillus subtilis)是一个重要的重组蛋白表达宿主。该宿主具有安全性好、蛋白分泌能力强以及发酵培养成本低等优点。另一方面，该宿主也有些缺点，其中之一就是该菌分泌八种胞外蛋白酶，包括两种中性蛋白酶(NprE和NprB)，三种丝氨酸蛋白酶(Epr、Bpr和Vpr)，碱性蛋白酶AprE，金属蛋白酶Mpr和细胞壁蛋白酶WprA，这些蛋白酶会降解分泌细胞外的重组蛋白，降低其产量。解决该问题的直接办法是敲除这些蛋白酶的编码基因。目前已报道的蛋白酶缺失突变菌株有1A751(失活了NprE和AprE)(Microbiology,1995,doi:10.1099/13500872-141-2-281),WB600(失活了NprE、AprE、Epr、Bpr、Mpr和NprB)(J Bacteriol,1991,doi:10.1128/jb.173.16.4952-4958.1991),WB700(失活了NprE、AprE、Epr、Bpr、Mpr、NprB和Vpr)和WB800(失活了NprE、AprE、Epr、Bpr、Mpr、NprB、Vpr和WprA)(J Bacteriol,2002,doi:10.1128/JB.184.1.76-81.2002)。这些突变株有较低的胞外蛋白酶活性，在重组蛋白生产上优于它们的野生菌株。

然而，当研究者要在枯草杆菌中分泌表达一个蛋白时，首先要思考该选择哪个蛋白酶缺失宿主，1A751、WB600、WB700还是WB800？现实情况是没有选择标准，只能在这些宿主中碰运气。比如，普鲁兰酶在WB600(失活6个胞外蛋白酶)中的分泌量是其在WB800(失活8个胞外蛋白酶)中分泌量的三倍(Protein Expr Purif,2016，doi：10.1016/j.pep.2016.04.008)；1A751和WB700被分别用于高效分泌葡萄糖激酶和β-甘露聚糖酶(Biotechnol Bioeng,1999,doi:10.1002/(SICI)1097-0290(19990105)62:1<87::AID-BIT10>3.0.CO；2-I；J Agric Food Chem,2017,doi:10.1021/acs.jafc.6b05528)。这些结果说明两个问题：一，不是所有八个胞外蛋白酶对所有重组蛋白的表达都是有害的；二，某个胞外蛋白酶可能对蛋白A的生产是有利的，但对蛋白B的生产却是有害的，即有益或有害胞外蛋白酶的种类是随着目标重组蛋白的变化而变化的。这意味着每个重组蛋白都有其独特的最优蛋白酶缺失突变宿主；显然，现有的蛋白酶缺失突变宿主(1A751、600、700和800)并不能满足这种个性化的需求。要为目标重组蛋白量身定制最优的胞外蛋白酶突变宿主，首先要确定对该重组蛋白有益和有害的胞外蛋白酶，但目前尚无解决这一问题的方法。

发明内容

技术问题：每个重组蛋白都有其独特的最优蛋白酶缺失突变表达宿主，而现有的枯草杆菌胞外蛋白酶缺失宿主适用性差，不能满足这种个性化需求。鉴于此，本发明提供一种用于为重组蛋白量身定制最适胞外蛋白酶缺失表达宿主的系统及方法(图1)。该方法能准确评估枯草杆菌每种胞外蛋白酶(共八种)对目标蛋白生产的影响，从而确定有利和有害的胞外蛋白酶，然后通过失活不利于外源蛋白分泌的蛋白酶同时保留有利的蛋白酶，从而获得最优宿主，以最大化提高目标蛋白的产量。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种枯草杆菌168突变体系统，所述的系统由失活枯草杆菌(Bacillus subtilis)168(ATCC编号23857)中nprE,aprE,epr,bpr,mpr,nprB,vpr和wprA中任意7个及8个胞外蛋白酶编码基因的枯草杆菌突变株组成。

所述的九株枯草杆菌胞外蛋白酶缺失突变株包括：(1)同时失活枯草杆菌168中八个胞外蛋白酶基因nprE、aprE、epr、bpr、mpr、nprB、vpr和wprA的突变体PD8；(2)同时失活枯草杆菌168中七个胞外蛋白酶基因nprE、aprE、epr、bpr、mpr、nprB和vpr的枯草杆菌突变体PD7；(3)在突变株PD8的基础上分别回补nprE、aprE、epr、bpr、mpr、nprB和vpr七个胞外蛋白酶基因,构建七株枯草杆菌突变体PD8CnprE、PD8CaprE、PD8Cepr、PD8Cbpr、PD8Cmpr、PD8CnprB和PD8Cvpr每个突变体只表达一种胞外蛋白酶。

本发明所述的枯草杆菌168突变体系统可用于评估每种胞外蛋白酶(共8种)对目标蛋白在枯草杆菌中分泌表达水平的影响。

所述的枯草杆菌168突变体系统在为目标重组蛋白量身定制最优的胞外蛋白酶突变枯草杆菌168宿主中的应用。

一种为目标重组蛋白量身定制最优的胞外蛋白酶突变枯草杆菌168宿主的方法，将目标重组蛋白分别在权利要求1或2所述的枯草杆菌168突变体系统的九个突变株中进行分泌表达；以其在突变株PD8中的表达水平作为参照，当目标蛋白在某一突变株中产量高于参照，则该突变株中相应的蛋白酶就被评价为有利于目标蛋白的生产；相反，则该突变株中相应的蛋白酶被评价为不利于目标蛋白的生产；然后，失活不利于目的蛋白生产的蛋白酶，保留有利的蛋白酶，为目标蛋白量身构建最适的蛋白酶缺失宿主，最大化提高目标蛋白在枯草杆菌中的表达水平。

有益效果：

目前的胞外蛋白酶突变宿主适用性差，本发明通过构建一株同时失活八个胞外蛋白酶的突变体PD8和八株分别只表达单一胞外蛋白酶的突变体；以PD8作为参照，评估每种胞外蛋白酶对重组蛋白表达的影响，从而确定对该蛋白有益和有害的胞外蛋白酶；最后，通过失活有害的胞外蛋白酶同时保留有益的胞外蛋白酶，为该重组蛋白量身定制最优的胞外蛋白酶突变宿主，最大化该重组蛋白的产量。

附图说明

图1本发明的主要技术原理

图2枯草杆菌突变体的构建及鉴定

(a)和(b)为以枯草杆菌168为出发菌株，依次失活nprE、aprE、epr、bpr、mpr、nprB、vpr和wprA八个胞外蛋白酶基因，构建枯草杆菌突变体PD8的流程示意图及核酸凝胶电泳验证图。(c)和(d)为通过脱脂奶粉平板检测胞外蛋白酶活性。

图3百菌清水解脱氯酶(Chd)最适表达宿主的构建

图4淀粉酶AmyM最适表达宿主的构建

具体实施方式

实施例1九株枯草杆菌蛋白酶缺失突变体的构建

如图2a和2b所示，以枯草杆菌168为出发菌株，使用pheS*反向筛选标记(ApplMicrobiol Biotechnol,2017,doi:10.1007/s00253-016-7906-9)依次删除nprE、aprE、epr、bpr、mpr、nprB、vpr和wprA八个胞外蛋白酶基因，构建枯草杆菌突变体PD8。以删除nprE为例，用枯草杆菌168总DNA为模板，利用引物对nprE-LF-F/nprE-LF-R(SEQ ID NO.1/SEQID NO.2)、nprE-RF-F/nprE-RF-R(SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4)和nprE-DR-F/nprE-DR-R(SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6)分别扩增上游同源臂(upstream homologous arm,UHA)，同向重复区域(direct repeat sequence,DR)和下游同源臂(downstream homologous arm,DHA)，同时用引物对nprE-PC-F/nprE-PC-R以质粒pTPC(Appl Microbiol Biotechnol,2017,doi:10.1007/s00253-016-7906-9)为模版扩增出Pbc-pheS*-cat(PC)筛选盒；通过重叠延伸PCR把这四个片段按照UHA、DR、PC和DHA的顺序融合；将融合的片段转化枯草杆菌168感受态细胞，在含有5mg/L氯霉素的LB平板上筛选获得转化子；把转化子接种于液体LB中培养至OD₆₀₀约0.5，取100μL菌液涂布于含有10mM氯代苯丙氨酸的LB平板上；待长出单菌落后，用引物对nprE-YZ-F/nprE-YZ-R(SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8)进行PCR确定目标转化子，然后测序验证。通用的PCR反应体系为：2×Phanta Max Buffer(Mg²⁺plus)，25μL；dNTP Mix(10mM each)，1μL，引物1(20μM)，1μL；引物2(20μM)，1μL；DNA模板(100ng/μL)，1μL；PhantaMax Super-Fidelity DNA Polymerase，1μL；用超纯水补足至50μL。通用的PCR程序为：95℃，3min(1轮循环)；95℃15s，55℃15s，72℃3min(30轮循环)；72℃10min(1轮循环)；10℃5min(1轮循环)。所用引物列于表1。枯草杆菌感受态制作参照经典的化学法(J Bacteriol,1961,81:741-6)。

在突变株PD8(同时缺失八个胞外蛋白酶基因)的基础上，使用共转化的方法(JBiotechnol,2018,doi:10.1016/jbiotec)分别回补nprE、aprE、epr、bpr、mpr、nprB和vpr七个胞外蛋白酶基因,构建七株枯草杆菌突变体PD8CnprE、PD8CaprE、PD8Cepr、PD8Cbpr、PD8Cmpr、PD8CnprB和PD8Cvpr，每个突变体只表达一种胞外蛋白酶。需要说明的是，PD7为构建PD8过程中获得的只表达胞外蛋白酶WprA的突变体。以回补nprE为例，以枯草杆菌168总DNA为模板，用引物对nprE-LF-F/nprE-RF-R(SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.4)扩增nprE及其上下游区域；将PCR产物和质粒pUS20(J Biotechnol,2018,doi:10.1016/jbiotec)共同转化PD8感受态细胞，在含有100mg/L壮观霉素的LB平板上筛选转化子；用引物对nprE-YZ-F/nprE-YZ-R(SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8)进行PCR筛选成功发生nprE回补的转化子，并且进行测序验证；最后，通过传代培养将pUS20丢失，获得突变体PD8CnprE。通用的PCR反应体系和程序同上段，所用引物列于表1。有含有1％脱脂奶粉的LB平板检测所获突变株的胞外蛋白酶活性，如图2c和2d所示，表达NprE和AprE的突变株具有较高的胞外蛋白酶活性。

实施例2确定对百菌清水解脱氯酶(Chd)表达有益和有害的胞外蛋白酶

将百菌清水解脱氯酶基因chd(NCBI序列号：GQ292539)连接至载体pP43NMK(ApplEnviron Microbiol,2005,doi:10.1128/aem.71.7.4101-4103,NCBI序列号DQ264732)上，获得表达载体pP43Chd。具体地构建过程如下：以菌株Pseudomonas sp.CTN-3(JBacteriol,2010,doi:10.1128/JB.01547-09)总DNA为模版，用引物对chd-F/chd-R(SEQ IDNO.9/SEQ ID NO.10)扩增chd；将扩增产物与被HindⅢ和PstI酶切后的pP43NMK进行体外同源重组连接，把连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有100mg/L氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子并进行测序验证，得pP43Chd。将pP43Chd分别转化至上述九株枯草杆菌突变株(PD8、PD7、PD8CnprE、PD8CaprE、PD8Cepr、PD8Cbpr、PD8Cmpr、PD8CnprB和PD8Cvpr)中，将获得的九种表达菌株分别发酵培养，所用培养基为Super-Rich(蛋白胨2.5％，酵母提取物2％，K₂HPO₄ 0.3％，葡萄糖3％，pH值7.0)，培养条件为37℃和200转/分钟。每12h取样检测Chd酶活(方法参考文献J Bacteriol,2010,doi:10.1128/JB.01547-09)，确定每个突变株的最高Chd表达量。如图3所示，Chd在突变株PD8Cepr、PD8Cbpr和PD8Cmpr中的表达量比其在PD8中的分别提高了18％、59％和31％，这说明Epr、Bpr和Mpr有利于Chd的分泌，其余五种蛋白酶不利于Chd的表达。

实施例3确定对淀粉酶AmyM重组表达有益和有害的胞外蛋白酶

将淀粉酶基因amyM(NCBI序列号KM114206)连接到载体pP43NMK上，获得表达载体pP43AmyM。具体地构建过程如下：以菌株Corallococcus sp.EGB(Appl EnvironMicrobiol,2018,doi:10.1128/AEM.00152-18)总DNA为模版，用引物对amyM-F/amyM-R(SEQID NO.11/SEQ ID NO.12)扩增amyM，将扩增产物与被HindⅢ和PstI酶切后的pP43NMK进行体外同源重组连接，把连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有100mg/L氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子并进行测序验证。将pP43AmyM分别转化至上述九株枯草杆菌突变株(PD8、PD7、PD8CnprE、PD8CaprE、PD8Cepr、PD8Cbpr、PD8Cmpr、PD8CnprB和PD8Cvpr)中，将获得的九种表达菌株分别发酵培养，所用培养基为Super-Rich(蛋白胨2.5％，酵母提取物2％，K₂HPO₄ 0.3％，葡萄糖3％，pH值7.0)，培养条件为37℃和200转/分钟。每12h取样检测AmyM酶活(检测方法参照文献Appl Environ Microbiol,2015,DOI:10.1128/AEM.03934-14)，确定每个突变株的最高AmyM表达量。如图4所示，AmyM在突变株PD8Cbpr、PD8Cmpr、PD8CnprB、PD8Cvpr和PD7中的表达量比其在PD8中的分别提高了28％、20％、19％、15％和51％，这说明Bpr、Mpr、NprB、Vpr和WprA有利于AmyM的表达，NprE、AprE和Epr三种蛋白酶不利于AmyM的表达。

实施例4Chd最适表达宿主的构建

根据实施例2的结果，失活不利于Chd表达的蛋白酶NprE、AprE、NprB、Vpr和WprA，保留有利的蛋白酶Epr、Bpr和Mpr，获得蛋白酶缺失突变株PD9。构建过程为：以枯草杆菌168为出发菌株，重复实施例1中的方法，依次失活nprE、aprE、nprB、vpr和wprA五个蛋白酶基因。如图3所示，以PD9作为表达宿主时，Chd的表达量比其在PD8中的提高了80％，证明通过量身构建最优蛋白酶突变株可以显著提高Chd在枯草杆菌中的产量。

实施例5AmyM最适表达宿主的构建

根据实施例3的结果，失活不利于AmyM生产的蛋白酶NprE、AprE和Epr,保留有利的蛋白酶Bpr、Mpr、NprB、Vpr和WprA，获得枯草杆菌蛋白酶缺失突变株PD3。构建过程为：以枯草杆菌168为出发菌株，重复实施例1中的方法，依次失活nprE、aprE和epr三个蛋白酶基因。如图4所示，以PD3作为表达宿主时，AmyM的分泌量比其在PD8中的提高了77％，证明通过量身构建最优蛋白酶突变株可以显著提高AmyM在枯草杆菌中的产量。

表1本发明所用引物

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 用于为目标蛋白量身构建最优的枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失表达宿主的方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tagtgaacgg aagaaacg 18

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgttgagtat tccagaatgc gcggtcaatg gtgaattaca 40

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctaatgactg gcttttataa atagacatta tcggatttat 40

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tagtgaaaag ccgtc 15

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgtaattcac cattgaccgc gcattctgga atactcaaca 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggatccgtta tcgattttcg gttcaacaga cactcccgcc 40

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atttcatgcg ctgtca 16

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atcttatccg ttctccaa 18

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtaacacatg cctcagctgc agcaaccgaa ctcatcttgg acttc 45

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccatgattac gccaagcttt catcatcaag gcctggctgc gaga 44

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aacacatgcc tcagctgcag caaaaccgtt agatggcgcg 40

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

attacgccaa gctttcatca ttaaaatgaa gctgtcgctg 40

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌168突变体系统，其特征在于，所述的系统由失活枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168中nprE,aprE,epr,bpr,mpr,nprB,vpr和wprA中任意7个及8个胞外蛋白酶编码基因的枯草芽孢杆菌突变株组成。

2.根据权利要求1所述的突变体系统,其特征在于,包括：(1)同时失活枯草杆菌168(ATCC编号23857)中八个胞外蛋白酶基因nprE、aprE、epr、bpr、mpr、nprB、vpr和wprA的突变株PD8；(2)同时失活枯草杆菌168中七个胞外蛋白酶基因nprE、aprE、epr、bpr、mpr,nprB和vpr的枯草杆菌突变株PD7；(3)在突变株PD8的基础上分别回补nprE,aprE,epr,bpr,mpr,nprB和vpr七个胞外蛋白酶基因,构建七株枯草杆菌突变株PD8CnprE,PD8CaprE,PD8Cepr,PD8Cbpr,PD8Cmpr,PD8CnprB和PD8Cvpr，每个突变株只表达一种胞外蛋白酶。

3.权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌168突变体系统在评估枯草芽孢杆菌168中每种胞外蛋白酶对目标蛋白在枯草杆菌中分泌表达水平影响中的应用。

4.权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌168突变体系统在为目标重组蛋白量身定制最优的胞外蛋白酶突变枯草杆菌168宿主中的应用。

5.一种为目标重组蛋白量身定制最优的胞外蛋白酶突变枯草杆菌168宿主的方法，其特征在于，将目标重组蛋白分别在权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌168突变体系统的九个突变株中进行分泌表达；以其在突变株PD8中的表达水平作为参照，当目标蛋白在某一突变株中产量高于参照，则该突变株中相应的蛋白酶就被评价为有利于目标蛋白的生产；相反，则该突变株中相应的蛋白酶被评价为不利于目标蛋白的生产；然后，失活不利于目的蛋白生产的蛋白酶，保留有利的蛋白酶，为目标蛋白量身构建最适的蛋白酶缺失宿主，最大化提高目标蛋白在枯草杆菌中的表达水平。