CN105505931B - 一种强启动子及其在提高纳豆激酶表达的应用 - Google Patents

一种强启动子及其在提高纳豆激酶表达的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种强启动子及其在提高纳豆激酶表达的应用，属于微生物基因工程领域。本发明涉及的一系列启动子基因是在启动子PP43和/或PHpaII的基础上对其进行n次(n≥1)串联形成的。在强启动子PHpaII‑PHpaII‑PP43控制转录下，重组纳豆激酶的纤溶活力高达264.2FU/ml。该方法高效安全，能够有效提高纳豆激酶的表达量，且为进一步研究启动子对异源基因表达的影响提供了理论基础。

Description

一种强启动子及其在提高纳豆激酶表达的应用
技术领域
本发明涉及一种强启动子及其在提高纳豆激酶表达的应用，属于微生物基因工程领域。
背景技术
心脑血管疾病严重的威胁着人类的身体健康，而目前临床注射的抗血栓药物普遍存在稳定性差、药效短、副作用大和成本高等缺点。自1987年，日本学者Sumi等首次从纳豆中分离纯化得到具有高效溶血栓功效的纳豆激酶，它便成为了近年溶血栓药物研究新方向之一。纳豆激酶(Nattokinase，NK)是一种由纳豆菌或纳豆枯草杆菌产生的碱性丝氨酸蛋白酶，因具有特殊的溶血栓活性，既能预防也能治疗血栓疾病。与其它溶栓药物相比，它具有安全性能好、无免疫原性、易被人体消化吸收、可静脉注射也可以口服、半衰期长、生产价格低廉等优点。但因纳豆激酶野生菌的产酶量低，严重限制了其发展，因此提高纳豆激酶的产酶量具有很好的研究价值。
枯草芽孢杆菌作为传统的工业生产菌，因其遗传和生理生化背景清晰，培养简单快速，蛋白质分泌能力高、非致病性及良好的发酵生产基础，被广泛应用于工、农、医药等多领域。本发明中选择使用的宿主菌是胞外蛋白酶活性较低的枯草芽孢杆菌WB800。
外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的高效表达是实现其在工业应用上的重要途径。目前，国内外研究学者大多通过菌株筛选、生产工艺条件优化，以及利用基因工程手段构建高效表达载体等方法来提高纳豆激酶产量。2014年，Suwanmanon等通过单因素和正交实验确定了枯草芽孢杆菌的最佳发酵培养基和发酵工艺条件，纳豆激酶表达量达到130.96FU/mL；黄磊等通过构建基因工程菌的方法成功实现了纳豆激酶在枯草芽孢杆菌中的表达(60U/mL)；本课题组也已通过信号肽筛选构建了重组纳豆激酶的高效分泌表达质粒，表达量达到190mg/L。然而目前纳豆激酶的产量仍不足以满足生产需求。
基因表达体系是一个复杂的过程，启动子是基因表达调控的重要顺式调控元件，也是基因工程表达载体的重要元件，选用强启动子可以使克隆基因高水平表达。
如何设计得到强启动子是目前亟需解决的问题，无论是在理论研究还是实际生产中都有十分重要的意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明通过对强启动子PP43和/或启动子PHpaII进行n次重复串联(n≥1)，以期提高启动子活力，实现外源蛋白的高效表达。本发明的目的是提供一种强启动子以及利用该强启动子在枯草芽孢杆菌WB800中高效表达重组纳豆激酶的方法。鉴于启动子是基因工程表达载体的重要元件，对外源基因表达水平有较大的影响，本发明以强启动子PP43和PHpaII基因序列为基础，采用对启动子PP43和/或PHpaII进行串联n次串联的方式得到一类新的启动子，提高RNA聚合酶与启动子结合的频率，进而提高启动子活力。本发明的新的启动子有效地提高了异源蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达量。
本发明的第一个目的是提供一种新的强启动子，是将启动子PP43和/或启动子PHpaII进行n次串联(n≥1)。
本发明中，如无特殊说明，启动子的串联是从左到右依次串联，比如PP43-PHpaII-PP43是指在将PHpaII串联到两个PP43的中间。
所述启动子的核苷酸序列是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10中的任意一种。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子是以下任意一种：
(1)将启动子PP43和/或启动子PHpaII进行一次串联，形成序列如SEQ ID NO.1的启动子PP43-PHpaII、序列如SEQ ID NO.2的启动子PHpaII-PP43、序列如SEQ ID NO.3的启动子PHpaII-PHpaII，或者序列如SEQ ID NO.4所示的启动子PP43-PP43；
(2)将启动子PP43和/或启动子PHpaII进行两次串联，形成序列如SEQ ID NO.5的启动子PHpaII-PHpaII-PP43；序列如SEQ ID NO.6的启动子PP43-PP43-PP43；序列如SEQ ID NO.7的启动子PHpaII-PHpaII-PHpaII；序列如SEQ ID NO.8的启动子PP43-PHpaII-PP43；序列如SEQ ID NO.9的启动子PHpaII-PP43-PHpaII；序列如SEQ ID NO.10的启动子PP43-PP43-PHpaII；
(3)将启动子PP43和/或启动子PHpaII进行三次或者三次以上的串联。
本发明的第二个目的是提供含有所述强启动子的质粒载体。
在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体可以是以下任意一种：pMA0911-wapA，pMA0911-yncM(短线后为信号肽)。
在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pMA0911-wapA。所述载体pMA0911-wapA的信号肽为wapA。
本发明的第三个目的是提供含有所述质粒载体的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是枯草芽孢杆菌重组得到的重组枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌可以是以下任意一种：枯草芽孢杆菌168，WB800，WB800，pWB980。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌蛋白酶缺陷型菌株WB800。
本发明的第四个目的是提供一种所述基因工程菌的构建方法。
在本发明的一种实施方式中，所述构建方法是：首先将外源基因克隆到pMA0911质粒上，然后用本发明的强启动子代替pMA0911质粒上原有的启动子，得到含有强启动子和外源基因的重组表达质粒pMA0911P强-外源基因，然后将质粒pMA0911P强-外源基因转化到枯草芽孢杆菌，筛选即得到基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述构建方法具体是：(1)目的基因的获取：根据Genbank所提供的纳豆激酶基因序列(Genbank登录号：S51909.1)设计引物pro-NK-F/pro-NK-R，以纳豆芽孢杆菌(B.natto)的基因组DNA为模板扩增pro-nk基因；(2)穿梭质粒的构建：将PCR产物pro-nk，经EcoR I和BamH I双酶切后，连接到用同样限制性内切酶双酶切的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pMA0911-wapA，连接获得穿梭质粒pMA0911PHpaII-pro-NK；(3)根据启动子P43和PHpaII基因序列设计引物，分别以质粒pMA0911PHpaII-pro-NK以及枯草芽孢杆菌168基因组为模板进行PCR，得到含有目的启动子的基因片段，再以质粒pMA0911PHpaII-pro-NK为模板，PCR产物为引物进行全质粒PCR，得到重组表达质粒；(4)将重组表达质粒转入枯草芽孢杆菌WB800中，即得到基因工程菌。
本发明的第五个目的是提供一种利用所述强启动子提高外源蛋白表达的方法。
所述外源蛋白，在本发明的一种实施方式中，可以是以下任意一种：纳豆激酶、氨肽酶。
所述纳豆激酶，在本发明的一种实施方式中，其基因序列为Genbank登录号：S51909.1所示的序列。
所述方法是：首先将外源基因克隆到表达质粒上，然后对启动子PP43和/或PHpaII进行串联n次(n≥1)串联，形成一新的强启动子，既而得到含有强启动子的重组质粒，将重组质粒转化到宿主菌中得到重组菌，然后利用重组菌表达外源蛋白。
所述宿主菌，在本发明的一种实施方式中，可以是枯草芽孢杆菌168，WB800，WB800或pWB980。
所述表达质粒，可以是pMA0911，但不仅仅限于pMA0911，经多次实验验证，本发明的强启动子对于其他枯草穿梭载体同样适用。
所述表达，在本发明的一种实施方式中，是：将重组菌于37℃震荡培养8-12h。再将菌液按1-5％的接种量接种至30mL/250mL的摇瓶表达培养基中发酵表达。
所述发酵表达使用的表达培养基，在本发明的一种实施方式中，含有：1-5％胰蛋白胨、1-5％酵母提取物、0.1-5％甘油、17mM KH2PO4、72mM K2HPO4，并添加了0.02-0.08％氯化钙。
本发明的有益效果：采用对启动子PP43和/或PHpaII串联的方式，得到了一系列可提高外源蛋白产量的强启动子。本发明的强启动子PHpaII可以在枯草芽孢杆菌中高效表达外源基因。强启动子PHpaII-PHpaII-PP43相对于PHpaII启动子，使纳豆激酶酶活提高了138.4％，相对于PP43启动子，使纳豆激酶酶活提高了88％；PP43-PP43-PP43相较于PP43，使纳豆激酶酶活提高了75.9％；PHpaII-PHpaII-PHpaII相较于PHpaII，使纳豆激酶酶活提高了92.5％，PHpaII-PP43、PP43-PHpaII相对于P43启动子，也使纳豆激酶的酶活分别提高了49.9％、64.9％。本发明的强启动子，用于提高其他外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达，比如氨肽酶，也具有较好的效果。
附图说明
图1：枯草芽孢杆菌WB800中含不同启动子的表达质粒的构建；其中，Promoter x中的x分别代表PHpaII、PP43等不同启动子。
图2：串联启动子的结构示意图；其中，灰色方框表示信号肽(SP)，黑色方框表示纳豆激酶基因(pro-NK)，白色箭头表示启动子PHpaII或PP43。
图3：重组纳豆激酶表达产物的SDS-PAGE电泳图；其中，a)M：蛋白分子量标准；1，WB800/pMA0911PHpaII-pro-NK的发酵上清；2，WB800/pMA0911PP43-pro-NK的发酵上清；b)M：蛋白分子量标准；1，WB800/pMA0911PP43-PHpaII-pro-NK的发酵上清；2，WB800/pMA0911PHpaII-PP43-pro-NK的发酵上清；3，WB800/pMA0911PHpaII-PHpaII-pro-NK的发酵上清；4，WB800/pMA0911PP43-PP43-pro-NK的发酵上清；c)M：蛋白分子量标准；1，WB800/pMA0911PHpaII-PHpaII-PP43-pro-NK的发酵上清；2，WB800/pMA0911PHpaII-PP43-PHpaII-pro-NK的发酵上清；3，WB800/pMA0911 PHpaII-PHpaII-PHpaII-pro-NK的发酵上清；4，WB800/pMA0911PP43-PHpaII-PP43-pro-NK的发酵上清；5，WB800/pMA0911PP43-PP43-PHpaII-pro-NK的发酵上清；6，WB800/pMA0911 PP43-PP43-PP43-pro-NK的发酵上清。
图4：重组纳豆激酶纤溶活性的比较；其中1～12分别为WB800/pMA0911PHpaII-pro-NK；WB800/pMA0911PP43-pro-NK；WB800/pMA0911PP43-PHpaII-pro-NK；WB800/pMA0911PHpaII-PP43-pro-NK；WB800/pMA0911PHpaII-PHpaII-pro-NK；WB800/pMA0911PP43-PP43-pro-NK；WB800/pMA0911PHpaII-PHpaII-PP43-pro-NK；WB800/pMA0911PP43-PP43-PP43-pro-NK；WB800/pMA0911PHpaII-PHpaII-PHpaII-pro-NK；WB800/pMA0911PP43-PHpaII-PP43-pro-NK；WB800/pMA0911PHpaII-PP43-PHpaII-pro-NK；WB800/pMA0911PP43-PP43-PHpaII-pro-NK。
具体实施方式
材料和检测方法
2×YT培养基(g·L-1)：胰蛋白胨16，酵母提取物10，氯化钠5，用氢氧化钠调pH值至7.0。表达培养基(g·L-1)：1-5％胰蛋白胨、1-5％酵母提取物、0.1-5％甘油、17mM KH2PO4、72mM K2HPO4，并添加了0.02-0.08％氯化钙。
枯草芽孢杆菌WB800转化方法：挑单菌落WB800接种至2mL的SPI培养基中，37℃摇床培养过夜；从过夜培养物中取100μL，接种至5mL SPI培养基中，37℃摇床培养4-5h后开始测OD600。当OD600约为1.0时，移取200μL菌液转接至2mL的SPII培养基中，于37℃、100r·min-1摇床孵育1.5h；向管中加入20μL l00×EGTA(乙二醇双(α-氨基乙基醚)四乙酸)溶液，于37℃、100r·min-1摇床中培养10min后分装500μL每l.5mL离心管；向管中加入经过测序验证正确的适量质粒，吹吸混匀放置于37℃、100r·min-1的摇床中培养2h；培养结束，吸取菌液约200μL均匀涂相应的选择性平板，37℃过夜培养。
琼脂糖－纤维蛋白平板法初步鉴定纳豆激酶纤溶活性：制作琼脂糖－纤维蛋白平板法的原理是凝血酶激活纤维蛋白原生成纤维蛋白，进而形成由纤维蛋白组成的人工血栓平板。溶栓剂能够水解纤维蛋白，从而在人工血栓平板上形成水解圈，水解圈的面积与溶栓剂溶栓能力的大小成一定的线性关系，纳豆激酶的酶活参照以尿激酶标准品制作的标准曲线进行计算。运用此方法计算酶活时，酶活容易受到孵育时间、平板厚度、温度等影响，因而所测数据不能用来精确反应纳豆激酶酶活，但是可以用来初步表征是否具有溶栓活性。
紫外分光光度计法检测纳豆激酶纤溶活性：这是一种可以准确反应纳豆激酶纤溶活性的测定方法，它是由日本纳豆激酶协会建立(http://j-nattokinase.org/jnka_nk_english.html)，也是世界公认的纳豆激酶活性测定方法之一。本发明中纳豆激酶酶活的测定方法在该方法的基础上稍作改进。取1.4mL 50mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液与0.4mL 0.72％(w·v-1)的纤维蛋白原溶液混匀后，37℃放置10min。向上述溶液中加入0.1mL凝血酶溶液(20U·mL-1)充分混匀，37℃放置10min。再向上述反应体系中加入0.1mL稀释的酶液充分混匀，于37℃水浴中保温反应，分别在反应开始后的20min和40min时，分别混匀10s。在准确计时60min后加入2mL 0.2mol·L-1的三氯乙酸终止反应，并在37℃水浴中再保温20min。上述反应液于15000r·min-1下离心10min，测定离心上清液在275nm处的吸光值。一个酶活力单位(FU)定义为在37℃，pH 8.0的条件下，每分钟在275nm处吸光值变化0.01所需的酶量。
实施例1：pMA0911PHpaII-pro-NK载体的构建
根据Genbank所提供的纳豆激酶基因序列(Genbank登录号：S51909.1)设计引物pro-NK-F/pro-NK-R，以纳豆芽孢杆菌(B.natto)的基因组DNA为模板扩增pro-nk基因，凝胶电泳条带约为1100bp，与纳豆激酶原基因大小一致；(2)将PCR产物pro-nk进行纯化，经EcoRI和BamH I双酶切后，连接到用同样限制性内切酶双酶切的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pMA0911-wapA上，连接获得重组表达质粒pMA0911PHpaII-pro-NK，将该质粒转化大肠杆菌JM109，酶切验证后送测序，测序结果表明纳豆激酶基因成功插入至载体pMA0911-wapA；(3)提取质粒转化WB800，构建大肠-枯草穿梭载体pMA0911PHpaII-pro-NK。
表1本发明中用到的引物
实施例2：强启动子基因序列的设计
启动子PHpaII-PHpaII的基因序列的设计：
(1)根据PHpaII启动子基因序列设计引物PHpaII-PHpaII-F/PHpaII-PHpaII-R，以pMA0911PHpaII-pro-NK质粒为模板进行PCR，再以所得的PCR产物为引物，pMA0911PHpaII-pro-NK质粒为模板进行大引物PCR，将所得的PCR产物经DpnⅠ处理后转化大肠杆菌JM109中进行质粒扩增，涂布含有抗性的平板后37℃培养，挑取单菌落转至含有抗性的液体2×YT培养基培养；
(2)DNA测序，测序结果表明目的基因片段成功插入至原载体上PHpaII基因序列的后面，形成新的启动子PHpaII-PHpaII(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，成功构建了新的大肠-枯草穿梭载体pMA0911PHpaII-PHpaII-pro-NK。
基于类似的方法，成功构建了序列SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示的新的启动子P43-PHpaII、P43-P43-PHpaII等，以及含有该新型启动子的质粒pMA0911P43-PHpaII-pro-NK、pMA0911 P43-P43-PHpaII-pro-NK等。
实施例3：重组纳豆激酶发酵合成
重组菌的构建：将实施例2得到的序列正确的重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB800中，在37℃，过夜静置培养后，挑取单菌落于10mL 2×YT种子培养基中，37℃进行培养；按1-5％的接种量转接至含30mL TB培养基的250mL三角瓶中，200r/min，温度37℃，培养48小时。取发酵上清进行SDS-PAGE蛋白电泳(图3)。
如图3所示，获得28kDa左右的电泳条带，表明重组枯草芽孢杆菌成功分泌表达了纳豆激酶。紫外分光光度计法检测各重组纳豆激酶48h的纤溶活力(图4)，具体结果如表2所示。结果表明，本发明的表达水平显著高于Suwanmanon等(Suwanmanon K.et al.,CyTA-Journal of Food,2014,12(3):282-290)的报道(130.96FU/mL)。
此外，启动子PP43和PHpaII进行两次串联时得到的启动子PHpaII-P43-P43以及P43-PHpaII-PHpaII，采用相同的方式，用于纳豆激酶的表达，结果发现这两种启动子介导的纳豆激酶的纤溶活性很低，分别为22.5FU/mL、54.58FU/mL。
表2不同启动子对酶活的影响
启动子 酶活(FU/mL) 相对于PP43提高量(％) 相对于PHpaII提高量(％)
PP43 140.5 — 26.81
PHpaII 110.8 — —
SEQIDNO.1 231.7 64.91 109.12
SEQIDNO.2 210.6 49.89 90.07
SEQIDNO.3 199.4 41.92 79.96
SEQIDNO.4 157.2 11.89 41.88
SEQIDNO.5 264.2 88.04 138.45
SEQIDNO.6 247.1 75.87 123.01
SEQIDNO.7 213.3 51.81 92.51
SEQIDNO.8 196.46 39.83 77.31
SEQIDNO.9 187.2 33.24 68.95
SEQIDNO.10 165.78 17.99 49.62
以上数据表明，通过对启动子的串联改造，一定程度上提高了纳豆激酶的表达量，该方法为进一步研究启动子对异源基因表达的影响提供了基础。
实施例4：本发明的强启动子用于氨肽酶的表达
首先将氨肽酶基因克隆到枯草穿梭质粒上，然后用本发明的强启动子代替穿梭质粒上原有的启动子，得到含有强启动子和氨肽酶基因的重组表达质粒，然后将重组表达质粒转化到枯草芽孢杆菌，筛选即得到基因工程菌。以含有PHpaII、PP43启动子的同一穿梭质粒、同一基因、同一宿主构建的重组菌为对照，在同一条件下发酵生产氨肽酶，结果显示，本发明的强启动子比为改造前的启动子，酶活均有所提高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种强启动子，其特征在于，所述强启动子是将启动子PP43和/或启动子PHpaII进行n次串联，其中n≥1；
所述启动子的核苷酸序列是SEQ ID NO.1-10中的任意一种。
2.含有权利要求1所述强启动子的质粒载体。
3.含有权利要求2所述质粒载体的基因工程菌。
4.权利要求1所述强启动子在提高外源蛋白表达方面的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述外源蛋白为纳豆激酶或氨肽酶。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述外源蛋白的表达是在枯草芽孢杆菌中进行。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用，是将外源蛋白编码基因克隆到pMA0911质粒上，然后用核苷酸序列是SEQ ID NO.1-10的任一启动子代替pMA0911质粒上原有的启动子，得到含有重组表达质粒，然后将重组表达质粒转化到枯草芽孢杆菌中得到重组菌，再用重组菌发酵培养表达。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵培养表达使用的表达培养基为：1-5％胰蛋白胨、1-5％酵母提取物、0.1-5％甘油、17mM KH2PO4、72mM K2HPO4，并添加了0.02-0.08％氯化钙。
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