CN107200772A - 一种优化角蛋白酶Ker高效分泌表达的信号肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种优化角蛋白酶高效分泌表达的信号肽及其应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明通过对来源于枯草芽孢杆菌的46种分泌信号肽进行初步筛选，然后对其中6种明显提高角蛋白酶分泌量的分泌信号肽进行定向改造，从而获得一种优化角蛋白酶高效分泌表达的信号肽。此信号肽的N端具有信号肽AbnA的前九个氨基酸残基，H段具有信号肽YfkN的疏水序列，C端具有信号肽PhoB的后四个氨基酸残基。本发明通过在角蛋白酶Ker的N端融合此信号肽，使重组枯草芽孢杆菌的角蛋白酶分泌效率显著提高，其胞外角蛋白酶酶活提高了3.39倍。改造后的菌株的胞外产角蛋白酶能力显著提高，更利于工业化应用，可降低生产成本，提高生产效率。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程领域，具体是一种优化角蛋白酶Ker高效分泌表达的信号肽及其应用。
背景技术
角蛋白是一类不溶性的硬质蛋白，广泛存在于生物体的组织中，是羽毛、毛发、羊毛、指甲、犄角、蹄和鳞片等的主要组成成分。
角蛋白作为家禽业的副产物，是一笔可观的再生利用资源。由于角蛋白结构的特殊性，角蛋白很难被一般蛋白酶如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以及胰蛋白酶降解。传统的角蛋白酶处理工艺主要为高温加热酸碱水解法，这不仅会对环境造成污染，而且还会破坏部分氨基酸，从而影响角蛋白的利用率。采用生物转化法如利用角蛋白酶降解羽毛、毛发、羊毛，水解后的蛋白质和多肽物质可以作为饲料添加剂用于家禽饲料中，不仅可以达到资源回收利用和节约粮食的目的，而且也减少了环境污染。因此，发展生物转化法对角蛋白进行回收和处理是形势所需。
角蛋白酶作为特异性降解角蛋白的酶类，在饲料、皮革、精化和医药等行业具有广泛的用途，其独有的性质使其拥有其他商品化酶没有的优势，因此角蛋白酶的应用和研究价值巨大。目前角蛋白酶的工业化生产以及应用存在的主要问题是角蛋白酶的胞外表达量较低，难以满足工业的需求。
枯草芽孢杆菌由于其安全性以及具有蛋白质分泌能力强、无密码子偏好性等优点，被认为是理想的蛋白分泌表达宿主。如何提高角蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的胞外表达量是目前的研究热点。在角蛋白酶表达分泌过程中，表达载体上的信号肽影响角蛋白酶的分泌效率，因此选择合适的信号肽能有效提高角蛋白酶的分泌水平。由于同一种蛋白质在不同信号肽的引导下的分泌效率相差极大，因此目前提高蛋白质的分泌效率的主要方法是筛选或者改造不同的信号肽。
本发明基于来源于地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis BBE11-1的角蛋白酶Ker在枯草芽孢杆菌中表达的平台，通过筛选并改造信号肽，以期获得优化角蛋白酶Ker高效分泌表达的信号肽，实现角蛋白酶Ker在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，实现角蛋白酶Ker在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达，本发明提供了一种优化角蛋白酶Ker高效分泌表达的信号肽及其应用。
本发明所提供的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，此信号肽是通过对来源于枯草芽孢杆菌的三种信号肽改造获得。其N端具有信号肽AbnA的前九个氨基酸残基MKKKKTWKR，H段具有信号肽YfkN的疏水序列THVENILRILLPPIMILSLILPTPPI，C端具有信号肽PhoB的后四个氨基酸残基EASA。
本发明还提供一种编码上述的优化角蛋白酶Ker高效分泌表达的信号肽的基因；所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供一株角蛋白酶Ker分泌能力增强的枯草芽孢杆菌基因工程菌。
所述枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法具体如下：将编码角蛋白酶Ker的前肽和成熟酶的基因kerds与载体pSTOP1622连接，构建重组载体pSTOP1622-kerds；合成核苷酸序列“5’-ACAATGGTCCAAACTAGT+SEQ ID NO：2+GCTCAGCCGGCGAAAA-3’”；采用无缝克隆方法将信号肽基因融合到基因kerds的5’端，构建重组质粒pSTOP1622-24-kerds；转化枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600，获得枯草芽孢杆菌基因工程菌Bacillus subtilisWB600/pSTOP1622-24-kerds。
本发明通过对来源于枯草芽孢杆菌的46种分泌信号肽进行初步筛选，然后对其中6种明显提高角蛋白酶分泌量的分泌信号肽进行定向改造，从而获得一种优化角蛋白酶Ker高效分泌表达的信号肽。本发明的优点是：通过在角蛋白酶Ker的N端融合此信号肽，使重组枯草芽孢杆菌的角蛋白酶Ker的分泌效率显著提高，其胞外角蛋白酶酶活由3017U/mL提高至10231U/mL，提高了3.39倍，更利于工业化应用。
附图说明
图1是本发明信号肽初筛-胞外角蛋白酶酶活检测结果-1；
图2是本发明信号肽初筛-胞外角蛋白酶酶活检测结果-2；
图3是本发明信号肽优化-胞外角蛋白酶酶活检测结果；
图4是本发明高分泌能力角蛋白酶生产菌株的验证。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明一种优化角蛋白酶高效分泌表达的信号肽及其应用作进一步的详细说明。
实验条件：
1、菌株与载体
大肠杆菌DH5α(购自TaKaRa)，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600(本实验室保存)，枯草芽孢杆菌表达载体pSTOP1622(购自MoBiTec公司)。
2、酶类及其他生化试剂
KOD DNA聚合酶及KOD-Plus-neo DNA聚合酶购自Toyobo公司，DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶购自Fermentase公司，细菌基因组提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒E.Z.N.A.购自Omega Bio-tek公司，Gibson Assembly Master Mix购自NEB公司，可溶性角蛋白(来源于羊毛)购自上海百威灵化学技术有限公司，其它化学试剂均为国产或进口分析纯。
3、培养基
LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10，pH 7.0。筛选培养基采用含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基。
B.subtilis WB600分批发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨20、酵母提取物10、葡萄糖10、KH2PO4 3、Na2HPO4 6、MgSO4 0.3，pH 7.0。
B.subtilis WB600补料发酵培养基(g/L)：葡萄糖500。
本发明中所用到的分子克隆技术和蛋白质检测技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照如下实验手册中的相关部分来进行。Green MR,Sambrook J.Molecular cloning:a laboratory manual[M].New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,2012。
实施例1信号肽的初步筛选
(1)基因ker的合成
根据来源于地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis BBE11-1的角蛋白酶Ker的NCBI登录号JX504681，搜索获得其基因序列，交由上海博益生物科技有限公司进行角蛋白酶Ker的全基因合成。
(2)表达载体pSTOP1622-ker的构建
根据Ker的基因序列设计PCR引物P1、P2(表1)，以合成基因ker为模板，以P1、P2为引物，进行PCR扩增，获得扩增产物ker(编码Ker的信号肽、前肽和成熟酶的核苷酸序列)；PCR扩增条件为：98℃5min；98℃20sec，60℃40sec，74℃2min，30个循环；74℃，10min；扩增产物经Spe I和BamH I双酶切，连接至载体pSTOP1622，构建重组载体pSTOP1622-ker。
表1载体构建所需引物
注：下划线部分为限制性内切酶的切割位点。
(3)信号肽筛选载体的构建
根据Ker的基因序列设计PCR引物P3(表1)，以合成基因ker为模板，以P3、P2为引物，进行PCR扩增，获得扩增产物kerds(编码Ker的前肽和成熟酶的核苷酸序列)；扩增产物经Spe I和BamH I双酶切，连接至载体pSTOP1622，构建重组载体pSTOP1622-kerds。
采用NEB公司的Gibson Assembly Master Mix构建包含枯草芽孢杆菌信号肽和重组载体pSTOP1622-kerds的信号肽筛选载体。所需引物(表1中P4和P5、表2)按照该产品说明书的要求进行设计，PCR等相关操作按照该产品说明书进行。
具体操作如下：
以pSTOP1622-kerds为模板，采用引物P4、P5(表1)，进行PCR扩增得到载体片段；PCR扩增条件为：94℃5min；94℃30sec，55℃20sec，68℃4min，35个循环；68℃，10min。以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600基因组为模板，用表2中相应引物扩增出编码不同信号肽(表2)的基因序列。PCR扩增得到的载体片段分别与不同的信号肽片段混合，采用Gibson Assembly Master Mix进行无缝克隆，获得包含不同信号肽的信号肽筛选载体。
表2信号肽筛选载体构建所需引物
(4)重组角蛋白酶Ker在枯草芽孢杆菌中的表达
将构建成功的信号肽筛选载体、pSTOP1622-ker转化至枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis WB600感受态细胞，同时转化pSTOP1622作为阴性对照Contr.，获得重组枯草芽孢杆菌。
重组枯草芽孢杆菌的种子培养条件为：采用LB液体培养基，用250mL三角瓶进行培养，其中培养基的装液量为20mL，培养温度为37℃，转速为200rpm，培养时间为10h。重组枯草芽孢杆菌的发酵培养条件为：采用LB液体培养基，用250mL三角瓶进行培养，其中培养基的装液量为25mL，接种量为3％，培养温度为37℃，转速为200rpm。当培养至菌体OD600nm达到1时，添加终浓度为0.5％的木糖，诱导时间为30h。
(5)胞外角蛋白酶酶活的测定
胞外角蛋白酶酶活的测定参照中华人民共和国专业标准SB/T10317-1999：蛋白酶活力测定法，并通过适当的修改进行测定。其中，底物由酪蛋白改为角蛋白；适当缩小反应体系。具体测定步骤如下：将发酵液于4℃下10 000×g离心10min，取上清液进行适当稀释后，取200μL与300μL 50mM Gly-NaOH缓冲液(pH 9.0)溶解1％的角蛋白底物混匀，50℃反应10min，加入500μL 4M TCA溶液终止反应。离心10min，吸取200μL上清液，依次加入1mL 0.5MNa2CO3和200μL福林酚试剂，50℃反应10min。以零时间的反应液作为空白对照，测定A660nm。以角蛋白为底物，每min催化分解角蛋白生成1μg酪氨酸所需的酶量定义为一个酶活单位。
重组枯草芽孢杆菌的胞外角蛋白酶酶活测定结果如图1和图2所示。其中胞外角蛋白酶酶活高于300U/mL的六种重组枯草芽孢杆菌所对应的六种信号肽如表3所示。
表3信号肽初筛结果
实施例2信号肽的优化
(1)信号肽突变体的基因合成
信号肽初步筛选结果显示，信号肽YfkN、Bpr、Mpr、PhoB、WapA、AbnA能有效提高角蛋白酶Ker的分泌效率。根据信号肽的结构特征对以上六种信号肽的氨基酸序列和核苷酸序列进行分区，即N端、H段、C端，如表4～9所示。对这六种信号肽的三段区域进行重新组合，共获得216(6×6×6)种信号肽突变体(图3)。根据这六种信号肽的基因序列，设计核苷酸序列“5’-ACAATGGTCCAAACTAGT+信号肽突变体的核苷酸序列+GCTCAGCCGGCGAAAA-3’”，由上海博益生物科技有限公司进行基因合成。
表4信号肽YfkN
表5信号肽Bpr
表6信号肽Mpr
表7信号肽PhoB
表8信号肽WapA
表9信号肽AbnA
(2)信号肽突变体筛选载体的构建
采用NEB公司的Gibson Assembly Master Mix构建包含信号肽突变体和重组载体pSTOP1622-kerds的信号肽突变体筛选载体。以pSTOP1622-kerds为模板，采用引物P4、P5(表1)，进行PCR扩增得到载体片段。PCR扩增得到的载体片段分别与不同的信号肽突变体片段混合，采用Gibson Assembly Master Mix进行无缝克隆，获得包含不同信号肽突变体的信号肽筛选载体。
(3)信号肽突变体的筛选
将构建成功的信号肽突变体筛选载体、pSTOP1622-ker转化至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600感受态细胞，同时转化pSTOP1622作为阴性对照Contr.，获得重组枯草芽孢杆菌。
重组枯草芽孢杆菌的种子培养条件为：采用LB液体培养基，用96深孔板进行培养，其中培养基的装液量为1mL，培养温度为37℃，转速为200rpm，培养时间为10h。重组枯草芽孢杆菌的发酵培养条件为：采用LB液体培养基，用96深孔板进行培养，其中培养基的装液量为1mL，接种量为3％，培养温度为37℃，转速为200rpm。当培养至菌体OD600nm达到1时，添加终浓度为0.5％的木糖，诱导时间为30h。
胞外角蛋白酶酶活的测定参照实施例一进行，测定结果如图3所示。胞外角蛋白酶酶活最高的重组枯草芽孢杆菌对应的信号肽突变体24号由信号肽AbnA的N端、信号肽YfkN的H段、信号肽PhoB的C端组成，其氨基酸序列为MKKKKTWKRTHVENILRILLPPIMILSLILPTPPIEASA。
实施例3高分泌能力角蛋白酶生产菌株的验证
采用分批-补料发酵方式对实施例二中构建的重组枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis WB600/pSTOP1622-24-kerds进行发酵验证。重组菌Bacillus subtilis WB600/pSTOP1622-24-kerds和Bacillus subtilis WB600/pSTOP1622-ker的种子培养条件为：采用LB液体培养基，用500mL三角瓶进行培养，其中培养基的装液量为50mL，培养温度为37℃，转速为200rpm，培养时间为10h。重组菌的分批-补料发酵条件为：采用B.subtilis WB600分批发酵培养基，将种子接种于3L全自动发酵罐，搅拌转速为400rpm，培养温度为37℃，通气量为1.5vvm，用氨水控制pH不低于7.0。在分批发酵6h后开始以6g/(L·h)恒速流加B.subtilis WB600补料发酵培养基。当培养至菌体OD600nm达到15时，添加终浓度为0.5％的木糖，接种32h后发酵结束。重组菌的胞外角蛋白酶酶活的测定参照实施例一进行，测定结果如图4所示：重组菌Bacillus subtilis WB600/pSTOP1622-ker的胞外角蛋白酶酶活为3017U/mL；Bacillus subtilis WB600/pSTOP1622-24-kerds的胞外角蛋白酶酶活为10231U/mL，提高了3.39倍。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围的内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。
<110> 江西省科学院微生物研究所
<120> 一种优化角蛋白酶Ker高效分泌表达的信号肽及其应用
<160> 2
<210> 1
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
MKKKKTWKRT HVENILRILL PPIMILSLIL PTPPIEASA 39
<210> 2
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ATGAAAAAGA AAAAAACATG GAAACGCACA CACGTCGAAA ACATTCTCCG 50
TATTCTTTTG CCCCCAATTA TGATACTTAG CCTAATCCTC CCAACACCAC 100
CCATTGAAGC CAGCGCC 117
Claims (7)
1.一种优化角蛋白酶Ker高效分泌表达的信号肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。
2.一种编码权利要求1所述的信号肽的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.应用权利要求2所述基因的核苷酸构建的分泌效率提高的基因工程菌。
4.权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是分泌角蛋白酶Ker能力提高的基因工程菌。
5.权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是枯草芽孢杆菌基因工程菌。
6.根据权利要求3至5任一所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，将所述基因的核苷酸融合到需要表达的基因上，使融合后的基因编码的蛋白质的N端融合有相应信号肽。
7.权利要求3至5任一所述的基因工程菌在角蛋白酶Ker生产中的应用。
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