CN109593746A

CN109593746A - 一种催化性能提高的角蛋白酶突变体及应用

Info

Publication number: CN109593746A
Application number: CN201910068548.2A
Authority: CN
Inventors: 史劲松; 龚劲松; 苏畅; 许正宏; 李恒; 孙雨欣
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-01-24
Filing date: 2019-01-24
Publication date: 2019-04-09

Abstract

本发明公开了一种催化性能提高的角蛋白酶突变体及应用，属于基因工程技术领域。本发明提供了一株基于前导肽工程和多位点饱和突变构建的重组角蛋白酶及前导肽工程改造的方法。重组菌株M7表现出高角蛋白酶催化潜力，酶活从179U/mL显著改善至1114U/mL，最适反应温度为40℃，最适反应pH为10.0，在40℃水浴90min后仍保留超过80％的酶活，热稳定性较好，适合于工业化大规模生产。并且利用前导肽工程改造蛋白酶的方法可以成为修饰具有自剪切特性的工业酶的通用途径。

Description

一种催化性能提高的角蛋白酶突变体及应用

技术领域

本发明涉及一种催化性能提高的角蛋白酶突变体及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白质，是一种硬性纤维蛋白，含有较多氢键和二硫键，其三维结构具有高度稳定性，加上疏水作用，其难以被胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等有效降解。角蛋白中蛋白质营养丰富，羽毛中蛋白占80％，羊毛中能占到99％，并且其含有多种动物所需要的必须氨基酸，这些都有很高的应用价值，但这些蛋白资源却被大量浪费，同时还对环境造成了污染，所以角蛋白的回收与利用受到人们越来越多的重视。

角蛋白酶具有专一的降解天然角蛋白的功能，是一种有着强生物活性的蛋白酶。大多属于胞外的丝氨酸蛋白酶类，少部分属于结合酶或胞内蛋白酶。目前文献报道的产角蛋白酶微生物主要来源于细菌、真菌或放线菌，这些微生物大多从羽毛，鸟类羽毛或毛发废弃物堆积处分离获得。角蛋白酶相比于其他蛋白酶可以更温和、高效地处理含有角蛋白的原料，同时其可以改善处理后的角蛋白的营养价值。目前，角蛋白酶广泛应用于医药、化工、饲料、纺织、制革等工业中，在生物制剂的制备、废弃生物资源的利用等方面具有重要的应用价值，因此关于角蛋白酶的研究备受关注。

据报道，国内角蛋白酶的研究多处于对菌株的分离、筛选、角蛋白酶的分离纯化以及理化性质的研究阶段。近年来，角蛋白酶基因的挖掘和生产受到越来越多的关注。然而，能够有效表达高活性的角蛋白酶的潜在菌株仍然很少，角蛋白酶产生菌普遍存在产酶水平偏低、生产成本较高的问题，这将成为角蛋白酶工业化生产及应用的主要障碍。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明结合前导肽工程和多位点饱和突变的方法对短小芽孢杆菌角蛋白酶分子进行改造，构建出一种重组角蛋白酶工程菌株，同时也提供了一种有效的前导肽工程改造策略。

本发明的第一个目的是提供一种角蛋白酶突变体，以氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的角蛋白酶为亲本，将亲本角蛋白酶前导肽切割位点P1的酪氨酸、前导肽区域第42位点的丝氨酸、54位点的天冬酰胺、62位点的异亮氨酸、91位点的谷氨酸、95位点的丝氨酸中至少一处突变为其他的氨基酸。

进一步地，将亲本角蛋白酶前导肽切割位点P1的酪氨酸突变为苯丙氨酸。

进一步地，将亲本角蛋白酶前导肽切割位点P1的酪氨酸突变为苯丙氨酸，以及将前导肽区域第42位点的丝氨酸突变为天冬氨酸、54位点的天冬酰胺突变为苯丙氨酸、62位点的异亮氨酸突变为谷氨酸、91位点的谷氨酸突变为天冬酰胺、95位点的丝氨酸突变为谷氨酸。

进一步地，将亲本角蛋白酶前导肽切割位点P1的酪氨酸突变为苯丙氨酸，以及将前导肽区域第42位点的丝氨酸突变为天冬氨酸、54位点的天冬酰胺突变为丙氨酸、62位点的异亮氨酸突变为赖氨酸、95位点的丝氨酸突变为天冬氨酸。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述角蛋白酶突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的重组质粒。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述角蛋白酶突变体的重组菌。

进一步地，所述的重组菌是以芽孢杆菌、大肠杆菌、酵母或丝状真菌为宿主菌。

本发明的第五个目的是提供所述的角蛋白酶突变体在医药、化工、饲料、纺织或制革行业中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一株基于前导肽工程和多位点饱和突变构建的重组角蛋白酶工程菌及前导肽工程改造的方法。重组菌株M7表现出高角蛋白酶催化潜力，酶活从179U/mL显著改善至1114U/mL，最适反应温度为40℃，最适反应pH为10.0，在40℃水浴90min后仍保留超过80％的酶活，热稳定性较好，适合于工业化大规模生产。并且利用前导肽工程改造蛋白酶的方法可以成为修饰具有自剪切特性的工业酶的通用途径。

附图说明

图1为目的基因的扩增与表达质粒的构建；

图2为前导肽的缺失与截短验证；

图3为P1位点突变的结果；

图4为前导肽区域定点突变结果；

图5为饱和和组合突变的过程示意图；

图6为多位点饱和突变的结果；

图7为突变株测序结果；

图8为突变体M7在15L发酵罐生长与酶活曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：枯草芽孢杆菌系统中表达KerBp的方法

使用根据编码序列(SEQ ID NO.1)设计的基因特异性引物从短小芽孢杆菌的基因组中扩增KerBp，将凝胶纯化后的PCR产物与pMD19-T简单载体连接，然后将连接产物转化到克隆宿主大肠杆菌JM109中，并在37℃下在含有氨苄抗性(100μg/mL)的LB琼脂板上培养12h。将阳性菌落接种到加入10mL含有氨苄抗性(100μg/mL)的液体LB中培养10-12h，提取质粒并进行DNA测序(Sangon Biotech)验证。将克隆质粒和表达载体pMA5用限制性内切酶BamHI和Mlu I消化后，用T4 DNA连接酶在16℃连接8h，构建表达质粒kerBp-pMA5，经热激法，转化入克隆宿主大肠杆菌JM109中，提取表达质粒并转化到枯草芽孢杆菌WB600中用于角蛋白酶表达(图1)。

实施例2：发酵培养条件及角蛋白酶测定方法

将重组菌株在10mL含有卡那抗性(100μg/mL)的LB培养基中于37℃培养12h。随后，将种子液接种到50mL含有卡那抗性(100μg/mL)的TB培养基中，在37℃下进一步培养48h。将携带pMA5的枯草芽孢杆菌WB600(用作对照组)也在相同条件下培养。离心发酵液，12000rpm离心5min，收集上清液进行活性测定和SDS-PAGE分析。

使用1％可溶性角蛋白作为底物，在pH 9.0和40℃下测定酶活性。反应混合物含有1mL酶和1mL在Tris-HCl缓冲液(0.05M，pH9.0)中稀释的1％可溶性角蛋白，在40℃水浴15min进行反应，用2mL 5％TCA终止反应。将混合物以12000rpm离心5min，再静置10min后除去残留的底物。将1mL上清液与1mL福林酚试剂和5mL 0.4M Na₂CO₃在40℃下水浴20min。对照组在加入酶后立即终止反应，在660nm处测量角蛋白酶活性。一个单位的角蛋白酶活性定义为在15min内在660nm处增加0.01OD值。所有测定有三份平行样品。

实施例3：前导肽作用验证

以质粒kerBp-pMA5作为模板，信号和成熟角蛋白酶分别通过引物Signal(F)/Signal(D)，ker(F)/ker(D)进行扩增，构建前导肽缺失表达质粒SMF-pMA5，在大肠杆菌JM109中进行克隆，然后提取质粒，在枯草芽孢杆菌WB600中表达，经过SDS-PAGE分析，观察到分子量为30kDa的蛋白质条带，但是没有检测到角蛋白酶活性(图2a)。

使用kerBp-pMA5质粒作为模板，通过设计具有不同同源臂的引物分别扩增信号肽序列和截短的突变序列，然后将信号肽添加到成熟酶的N-末端，获得不同前导肽长度的重组质粒，于枯草芽孢杆菌WB600中进行表达，并进行活性测定。活性测定的结果显示前导肽的不同截短，导致酶活性的显著降低(图2b)。

实施例4：前导肽切割位点P1处的氨基酸取代过程

以来自大肠杆菌JM109的质粒kerBp-pMA5作为DNA模板，通过使用含有突变位点的部分互补引物(如表1)，进行一步反向PCR以扩增突变的线性质粒。PCR扩增反应在50μL体系中进行，反应体系中加入25μLPrimeSTAR HS(Premix)，20μL ddH₂O，2μL模板DNA，上下游引物各1.5μL。反应条件为在94℃预变性5min后开始循环：94℃变性45s，57℃退火30s，72℃延伸10min，共30个循环；72℃终延伸10min。然后用Dpn I限制酶消化可甲基化的模板质粒DNA。随后，将酶消化的产物直接转化到大肠杆菌JM109中，提取质粒并转化到枯草芽孢杆菌WB600中以表达角蛋白酶。通过观察牛奶平板上转化体周围的透明圈大小和测定酶活，发现Y(P1)F突变体酶活增加2倍，达到437U/mL(图3b)。经过SDS-PAGE分析，显示两条分子量约为40kDa的前体和30kDa的成熟角蛋白酶的蛋白质条带，Y(P1)F的成熟角蛋白酶条带比kerBp更明显(图3c)。

表1 P1位点氨基酸替换引物设计

实施例5：在前导肽区域进行定点突变的方法

以来自大肠杆菌JM109的质粒kerBp-pMA5作为DNA模板，选择18个位点进行突变，包括S(42)D，A(49)S，A(51)V，T(52)K，N(54)A，A(60)I，I(62)K，N(64)S，Q(79)K，V(80)A，S(83)D，A(87)L，K(89)E，E(91)K，S(95)D，K(104)V，E(106)H和Y(108)L，以含有突变位点的一对部分互补的寡核苷酸序列作为引物(如表2)。经过一步反向PCR后，用Dpn I酶消化甲基化模板DNA，将消化后的突变质粒转入大肠杆菌JM109中进行环化修复，然后转化到枯草芽孢杆菌WB600中。通过透明圈观察以及酶活性测定筛选突变转化子。其中突变株S(42)D，A(49)S，N(54)A，I(62)K，E(91)K，S(95)D表现出不同程度的酶活提升(图4)。

表2定点突变引物设计

实施例6：多点饱和突变的方法

根据上述定点突变的结果，将阳性突变位点分成两组，进行饱和组合突变，其中第一轮引入突变位点为42、49、54以及62，第二轮引入91和95，构建突变文库。具体步骤为：(1)第一轮融合PCR引入第一组突变(4个位点)：以重组质粒Y(P1)F为模板，混合引物F1/R2和F2/R1为引物分别扩增上游和下游基因片段；然后以F1/R1为引物，将两个基因片段作为融合PCR的模板；(2)进行融合PCR产物的纯化；(3)通过第二轮融合PCR引入第二组突变(两个位点)：以步骤2的产物为模板，以混合引物F1/R3和F3/R1为引物，扩增上游和下游基因片段；然后以F1/R1为引物，将两个基因片段作为融合PCR的模板；(4)进行融合PCR产物的纯化和限制酶的消化；(5)使用T4连接酶连接目标质粒并转化到宿主菌中(引物序列如表3，过程如图5)。

PCR扩增反应在50μL体系中进行，加入0.5μLPfu酶，10μL5×Pfu buffer，4μLdNTPs，28μL ddH2O，2.5μL模板DNA，上下游引物各2.5μL。反应条件为在94℃预变性5min后开始循环：94℃变性45s，根据引物设计的不同退火温度下退火30s，72℃延伸10min，共30个循环；72℃终延伸10min。然后用Dpn I限制酶消化可甲基化的模板质粒DNA，将酶消化的产物直接转化到大肠杆菌JM109中，提取质粒并转化到枯草芽孢杆菌WB600中以表达角蛋白酶。

根据透明圈产生的速度和大小进行第一轮筛选，首先挑出总共160(65和95)个突变体转化体，并通过活性测定接种到液体LB培养基中进行第二轮筛选。根据两轮筛选，进一步选择酶活性增强的总共46种(28和18)突变体用于发酵和酶活测定。如图6所示，与野生型角蛋白酶相比，15种菌株表现出的更高活性，酶活超过800U/mL；从46株中随机选择7株(其中包含酶活最高的菌株)进行序列测定，如图7所示，其中突变体M7酶活为1114U/mL，较原始菌株提高了6倍。

表3多位点饱和突变引物

注：F2是42～62(F)NDT:42～62(F)VHG:42～62(F)TGG＝12:9:1的混合物；

R2是42～62(R)NDT:42～62(R)VHG:42～62(R)TGG＝12:9:1的混合物；

F3是91～95(F)NDT:91～95(F)VHG:91～95(F)TGG＝12:9:1的混合物；

R3是91～95(R)NDT:91～95(R)VHG:91～95(R)TGG＝12:9:1的混合物。

实施例7：重组角蛋白酶在15L发酵罐的发酵过程

将从组合突变文库中筛选出的催化性能提高幅度最大的突变体M7于15L发酵罐中进行放大发酵。首先在固体LB平板上活化目标菌株，将单个菌落挑取到10mL液体LB培养基中并在37℃，220rpm下培养10h。然后将种子液通过3％接种量转移到50mL TB培养基中，在37℃下进一步培养10-12h。接着将培养液用5％接种量接种到含有9L TB培养基的15L发酵罐中。培养温度设定在37℃，pH为6.8-7.2，搅拌速度为400rpm，通气量为1.5vvm。每4h测定一次细胞浓度和酶活性以绘制生长过程曲线。菌株在最初的8h内繁殖但没有有效的酶积累。在第24h，细胞浓度达到最大值，在此阶段，连续产生和积累角蛋白酶。24h后细胞浓度开始保持接近稳定，而酶活继续上升，在第32h达到最大值，活性为3040U/mL(图8)。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种催化性能提高的角蛋白酶突变体及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1152

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

atgtgcgtga aaaagaaaaa tgtgatgaca agtgttttat tggctgtccc tcttctgttt 60

tcagcagggt ttggaggctc catggcaaat gccgagacgg tctccaaaac agatagtgaa 120

aaaagctata ttgttggttt taaagcctct gccaccacaa acagctctaa aaaacaagct 180

gtcattcaaa atggtggaaa actagaaaaa caataccgcc tcattaatgc tgcacaagtg 240

aaaatgtccg aacaagccgc caaaaaactt gaacatgacc ctagcattgc ttacgtagaa 300

gaagaccata aagcagaagc atatgcacaa accgtccctt atggaatccc tcaaatcaaa 360

gctccagctg tacacgctca aggttataaa ggtgctaatg tcaaagtagc tgtccttgat 420

actggaatcc acgctgcaca ccctgattta aatgttgcag gcggtgcgag cttcgtccct 480

tcagagccaa atgccaccca agactttcaa tcacatggaa ctcacgtagc tggaaccatt 540

gctgcccttg ataacacaat tggtgtactc ggggtcgctc caagcgcttc cctatatgct 600

gtaaaagtat tagaccgcta tggcgacgga caatacagct ggattattag cggtattgaa 660

tgggctgtag ccaataatat ggatgtcatc aatatgagct taggcggacc aagcggttca 720

actgcgctta aaaatgccgt cgatacagcg aataaccgtg gagtcgttgt tgtggcagcc 780

gcaggtaatt ctggctctag cggctctagc agtacagttg gctatccagc aaaatacgat 840

tctacaattg ctgttgccaa tgtaaacagt aacaatgtca gaaactcatc ttctagcgca 900

ggtcctgaat tagatgtttc tgcacctggt acttctattt taagtacagt gccaagcagt 960

ggatacactt cttatactgg aacatctatg gcgtctcctc atgtagcagg agcagcagcg 1020

cttattcttt ctaaaaaccc gaacctaaca aattcacagg ttcgccagcg cttagaaaat 1080

acagcgacac cgcttggtga ctcattctat tatggaaaag ggttaatcaa cgttcaagca 1140

gcttctaact aa 1152

<210> 2

<211> 383

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 2

Met Cys Val Lys Lys Lys Asn Val Met Thr Ser Val Leu Leu Ala Val

1 5 10 15

Pro Leu Leu Phe Ser Ala Gly Phe Gly Gly Ser Met Ala Asn Ala Glu

20 25 30

Thr Val Ser Lys Thr Asp Ser Glu Lys Ser Tyr Ile Val Gly Phe Lys

35 40 45

Ala Ser Ala Thr Thr Asn Ser Ser Lys Lys Gln Ala Val Ile Gln Asn

50 55 60

Gly Gly Lys Leu Glu Lys Gln Tyr Arg Leu Ile Asn Ala Ala Gln Val

65 70 75 80

Lys Met Ser Glu Gln Ala Ala Lys Lys Leu Glu His Asp Pro Ser Ile

85 90 95

Ala Tyr Val Glu Glu Asp His Lys Ala Glu Ala Tyr Ala Gln Thr Val

100 105 110

Pro Tyr Gly Ile Pro Gln Ile Lys Ala Pro Ala Val His Ala Gln Gly

115 120 125

Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile His

130 135 140

Ala Ala His Pro Asp Leu Asn Val Ala Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro

145 150 155 160

Ser Glu Pro Asn Ala Thr Gln Asp Phe Gln Ser His Gly Thr His Val

165 170 175

Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Thr Ile Gly Val Leu Gly Val

180 185 190

Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asp Arg Tyr Gly

195 200 205

Asp Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Ser Gly Ile Glu Trp Ala Val Ala

210 215 220

Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser

225 230 235 240

Thr Ala Leu Lys Asn Ala Val Asp Thr Ala Asn Asn Arg Gly Val Val

245 250 255

Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Ser Thr

260 265 270

Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Thr Ile Ala Val Ala Asn Val

275 280 285

Asn Ser Asn Asn Val Arg Asn Ser Ser Ser Ser Ala Gly Pro Glu Leu

290 295 300

Asp Val Ser Ala Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr Val Pro Ser Ser

305 310 315 320

Gly Tyr Thr Ser Tyr Thr Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala

325 330 335

Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Asn Pro Asn Leu Thr Asn Ser

340 345 350

Gln Val Arg Gln Arg Leu Glu Asn Thr Ala Thr Pro Leu Gly Asp Ser

355 360 365

Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ser Asn

370 375 380

Claims

1.一种角蛋白酶突变体，其特征在于，以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶为亲本，将亲本角蛋白酶前导肽切割位点P1的酪氨酸、前导肽区域第42位点的丝氨酸、54位点的天冬酰胺、62位点的异亮氨酸、91位点的谷氨酸、95位点的丝氨酸中至少一处突变为其他的氨基酸。

2.根据权利要求1所述的角蛋白酶突变体，其特征在于，将亲本角蛋白酶前导肽切割位点P1的酪氨酸突变为苯丙氨酸。

3.根据权利要求1所述的角蛋白酶突变体，其特征在于，将亲本角蛋白酶前导肽切割位点P1的酪氨酸突变为苯丙氨酸，以及将前导肽区域第42位点的丝氨酸突变为天冬氨酸、54位点的天冬酰胺突变为苯丙氨酸、62位点的异亮氨酸突变为谷氨酸、91位点的谷氨酸突变为天冬酰胺、95位点的丝氨酸突变为谷氨酸。

4.根据权利要求1所述的角蛋白酶突变体，其特征在于，将亲本角蛋白酶前导肽切割位点P1的酪氨酸突变为苯丙氨酸，以及将前导肽区域第42位点的丝氨酸突变为天冬氨酸、54位点的天冬酰胺突变为丙氨酸、62位点的异亮氨酸突变为赖氨酸、95位点的丝氨酸突变为天冬氨酸。

5.一种编码权利要求1～4任一项所述的角蛋白酶突变体的基因。

6.一种携带权利要求5所述的基因的重组质粒。

7.一种表达权利要求1～4任一项所述的角蛋白酶突变体的重组菌。

8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌是以芽孢杆菌、大肠杆菌、酵母或丝状真菌为宿主菌。

9.权利要求1～4任一项所述的角蛋白酶突变体在医药、化工、饲料、纺织或制革行业中的应用。