CN108841808A - 酸性海藻糖酶TreA及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业基因技术领域，具体涉及一种来源于真菌的酸性海藻糖酶及其基因和应用。本发明的海藻糖酶TreA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明提供了一个新的海藻糖酶基因，其编码的海藻糖酶具有良好的性质，可以应用于昆虫防治、食品、淀粉糖、医药等工业。

Description

酸性海藻糖酶TreA及其基因和应用

技术领域

本发明属于农业基因技术领域，具体涉及一种来源于真菌的酸性海藻糖酶及其基因和应用。

背景技术

海藻糖是一种非还原性二糖，由两分子葡萄糖以α,α-1,1-糖苷键的连接形成，它的分子式为C₁₂H₂₂O₁₁，分子量大小为342.31，通常以二水化合物的形式存在。海藻糖在自然界中广泛存在，包括植物、藻类、真菌、细菌、昆虫等多种物种体内，被海藻糖酶分解成葡萄糖为机体提供能量。

海藻糖酶来源主要分为三类：第一类来源于细菌；第二类来源于植物和动物；第三类来源于真菌。根据酶催化反应的最适pH值，将真菌来源的海藻糖酶分为两种：一种是酸性海藻糖酶，一种是中性海藻糖酶。中性海藻糖酶存在于细胞内，受胞内磷酸化调控，但是它的耐热性不好。酸性海藻糖酶存在于细胞膜上，不受磷酸化的调控，它的耐热性比较好。

海藻糖酶可以广泛应用于食品、临床医疗、害虫防治等产业，因此，海藻糖酶的性质改良及作用机制的研究成为一个热点。现有的海藻酶比活低，且pH范围窄,不能满足现代产业的要求。

发明内容

为了解决现有的海藻酶不能满足现代产业需求的问题，本发明提供一种来源于真菌的酸性海藻糖酶，其具有优良的酶学性能，可以满足现代产业的要求。

本发明的目的在于提供一种海藻糖酶TreA。

本发明的再一目的在于提供编码上述海藻糖酶的基因。

本发明的再一目的在于提供含有上述基因的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供上述海藻糖酶的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述海藻糖酶的应用。

本发明提供一种海藻糖酶TreA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

其中，该酶全长1024个氨基酸，N端21个氨基酸为信号肽序列“MLVHTVVWLGVFLAFPGFTSA”。

因此，成熟的海藻糖酶TreA的理论分子量为112kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

该海藻糖酶的最适pH为4.0，在pH 1.0-pH 9.0范围内，该酶能够维持其79％以上的酶活力；最适温度为60℃，在65℃下处理1h，可以保持70％酶活力，在70℃下处理30min，能够保持40％的酶活力，在80℃时依然具有30％的酶活力，因此，具有良好的稳定性。

本发明还提供了海藻糖酶TreA的cDNA，全长为3075bp，cDNA序列如SEQ ID NO.3所示：

其中，信号肽的碱基序列为：“ATGCTAGTCCACACTGTGGTATGGCTAGGAGTGTTCCTGGCCTTCCCCGGATTTACCTCGGCG”。因此，成熟基因的编码序列为SEQ ID NO.4所示：

成熟蛋白理论分子量为109.6kDa，此酶属于糖苷水解酶65家族。

本发明还提供了包含上述海藻糖酶TreA基因的重组载体，优选为pPIC9-TreA。将本发明的海藻糖酶基因TreA插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将海藻糖酶基因TreA插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-TreA。

本发明还提供了包含上述海藻糖酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/TreA。

本发明还提供了一种制备海藻糖酶的方法，主要包括以下步骤：

1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组海藻糖酶的表达；

3)回收并纯化所表达的海藻糖酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/TreA。

本发明还提供了上述氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的蛋白在水解海藻糖方面的应用。运用基因工程手段产业化生产海藻糖酶，并将其应用于生物防治、食品、医药等工业。

本发明从Bispora sp.MEY-1菌株中得到了一个海藻糖酶基因，其编码的海藻糖酶具耐酸性、高比活的特点，可以被CO²⁺及巯基乙醇激活，还可以被枯草蛋白酶、胃蛋白酶激活。本发明海藻糖酶TreA性能优良，可利用基因工程手段将其应用于生物防治、食品、医药等工业。

附图说明

图1显示毕赤酵母中表达海藻糖酶TreA的SDS-PAGE结果，其中，M-标准分子量；1-海藻糖酶TreA的粗酶液；2-海藻糖酶TreA纯化的蛋白；3-EndoH脱糖基的蛋白。

图2显示海藻糖酶TreA的最适pH值情况。

图3显示海藻糖酶TreA的pH稳定性情况。

图4显示海藻糖酶TreA的最适温度情况。

图5显示海藻糖酶TreA的热稳定性情况。

图6显示海藻糖酶TreA对海藻糖酶的影响。

图7显示海藻糖酶TreA的蛋白酶抗性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)、毕赤酵母表达载体pPIC9。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶、连接酶。

3、培养基：

(1)产酶培养基：30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆粕，5g/L大麦葡聚糖，5g/L(NH₄)SO₄，1g/L KH₂PO₄，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，0.01g/L FeSO₄·7H₂O，0.2g/L CaCl₂于1L去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％NaCl，pH7.O)。

(3)BMGY培养基；1％酵母粉，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.000049<Biotin，1％甘油(v/v)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1获取海藻糖酶TreA

1.克隆海藻糖酶编码基因TreA

将液体培养3天的Bispora sp.MEY-1菌，12,000rpm离心10min，收集的菌丝体加入已高温灭菌的研钵中，用液氮迅速研磨至粉末，然后将研磨好的菌体转移至一个新的，装有15ml CTAB裂解液50mL离心管中，轻柔上下倒置混匀，置于65℃水浴锅保温3h，每隔20min，上下倒置轻柔混匀一次，以便充分裂解菌体。4℃、12,000rpm离心10min，吸取上清至新的离心管中，加入等体积的氯仿抽提，室温放置5min。4℃、12,000rpm离心10min。取上清再加入等体积的酚/氯仿抽提，室温放置5min。4℃、12,000rpm离心10min。以便尽量除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下l0000rpm离心l0min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量dd H₂O溶解，置于-20℃备用。

以Bispora sp.MEY-1总DNA为模板进行PCR扩增海藻糖酶的基因保守序列。PCR扩增得到一个约451bp片段。

根据测序得到的核甘酸序列设计TAIL-PCR引物uspl，usp2，us3；dspl，dsp2，dsp3，如表1所示。通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物。测序正确的片断经拼接后获得全长基因。

表1本实验所需的引物

2.获取海藻糖酶的cDNA

提取Bispora sp.MEY-1总RNA，利用Oligo(dT)₂₀和反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计扩增开放阅读框的的引物F和R，如表1所示，扩增该单链cDNA，获得海藻糖酶的cDNA序列。

通过对海藻糖酶的cDNA序列进行分析发现，cDNA全长3075bp,编码1024个氨基酸和一个终止子，N端的21个氨基酸为其信号肽序列，经比对证明从Bispora sp.MEY-1中分离克隆得到的编码海藻糖酶的基因为新基因。

3.构建海藻糖酶工程菌株

(1)表达载体的构建及在酵母中的表达

以测序正确的海藻糖酶TreA的cDNA为模板，合成了带有EcoR I和Not I限制性酶切位点的引物F和R，如表1所示，对TreA的成熟蛋白的编码区进行扩增。并利用EcoR I和NotI酶切PCR产物，连接进入表达载体pPIC9，海藻糖酶TreA成熟蛋白的序列插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体pPIC9-TreA，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1。挑取阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶Bgl II进行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GS115感受态细胞，30℃培养2-3天，挑取在MD平板上生长的转化子进行表达实验。

以同样的方式构建含TreA信号肽序列的cDNA的表达载体，并转化。

(2)高海藻糖酶活性转化子的筛选

从长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号先点到MD平板上，将MD平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从MD平板上挑取转化子接种于装有3mL BMGY培养基的离心管中，30℃、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液3,000×g离心15min，去上清，离心管中再加入1mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，在30℃、220rpm诱导培养；诱导培养48h后，3,000×g离心5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出高海藻糖酶活性的转化子。

4.制备海藻糖酶TreA

(1)海藻糖酶基因TreA在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达

筛选出酶活较高的转化子，接种于300mL BMGY液体培养基的1L三角瓶中，30℃，220rpm摇床振荡培养48h；5,000rpm离心5min，轻柔弃上清，再向菌体加入100mL含有0.5％甲醇的BMMY液体培养基，30℃，220rpm诱导培养72h。诱导培养期间，间隔24h补加一次甲醇溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5％左右；(3)12,000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，结果如图1所示。

(2)重组海藻糖酶的纯化

收集摇瓶表达的重组海藻糖酶上清液，通过10kDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10kDa超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的重组TreA，通过离子交换层析进行纯化。具体地，取TreA浓缩液2.0mL经预先用20mM Tris-HCl(pH 7.5)平衡过的HiTrap Q Sepharose XL阴离子柱，然后用0-1mol/L的NaCl进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定。

实施例2测定海藻糖酶TreA的部分性质

采用DNS法对本发明的海藻糖酶进行活性分析。具体方法如下：在pH4.0，50℃条件下，1mL的反应体系包括l00μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应l0min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。海藻糖酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解海藻糖生成lμmol还原糖所需的酶量为1个活性单位(U)。

1.海藻糖酶TreA的最适pH及pH稳定性

在不同的pH下，进行酶促反应以测定海藻糖酶TreA最适pH。所用缓冲液为pH 1.5～4.0KCl-盐酸缓冲液，pH4.0～7.0的柠檬酸-磷酸氢二钠系列缓冲液。纯化的海藻糖酶TreA在不同pH的缓冲体系，如图2所示，50℃下测定的pH适性结果表明，TreA的最适pH为4.0，在pH2.2-pH5.0范围内，该酶能够维持其60％以上的酶活力。

在37℃下，将酶液在不同pH值的缓冲液中处理60min，再测定海藻糖酶的剩余酶活以研究酶的pH稳定性。如图3所示，当pH1.0-pH9.0之间时，海藻糖酶TreA能够维持79％以上的酶活力，说明该酶具有优良的pH稳定性。

2.海藻糖酶TreA的最适温度及热稳定性

在pH 4.0条件下，测定不同温度(30-90℃)下的海藻糖酶TreA的酶活性，如图4所示，实验结果表明，该酶的最适反应温度为60℃，在70℃时依然具有60％以上的酶活力。

在不同温度下处理不同时间，再在60℃下检测酶活性，对海藻糖酶TreA进行耐温性测定。如图5所示，实验表明，该海藻糖酶在65℃下处理60min，可以剩余70％的酶活力，即使该酶在70℃下处理30min，依然能够保持40％的酶活力，这表明该酶具有较好的稳定性。

3.不同离子对海藻糖酶TreA活力的影响

分别将Na⁺、k⁺、Ca²⁺、Li⁺、CO2⁺、Cr³⁺、Ni⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Mn2⁺、Zn²⁺、Pb⁺、SDS、Ag⁺、Hg^{2 +}、EDTA、巯基乙醇18种物质加入底物溶液中，使其浓度分别为5mM/mL、10mM/mL，测海藻糖酶的剩余酶活力。

如图6所示，当化学物质浓度为5mM/mL时，CO²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Pb⁺、巯基乙醇对海藻糖酶起激活作用；SDS、Ag⁺、Hg²⁺对海藻糖酶具有抑制作用。当化学物质浓度为10mM/mL时，CO²⁺、巯基乙醇对海藻糖酶具有激活作用，Cu²⁺、Fe²⁺、Ag⁺、Hg²⁺对海藻糖酶具有抑制作用。

4.海藻糖酶TreA对蛋白酶的抗性

在纯化的海藻糖酶TreA酶液中分别添加胰蛋白酶、蛋白酶K、胶原蛋白酶、糜蛋白酶、枯草蛋白酶、胃蛋白酶，处理30min和60min，测海藻糖酶的剩余酶活。

如图7所示，实验结果表明，海藻糖酶TreA具有非常好的抗蛋白酶作用的能力，蛋白酶K和胰蛋白酶对海藻糖酶的活力具有轻微的一致作用，而胃蛋白酶、枯草蛋白酶、糜蛋白酶、胶原蛋白酶等海藻糖酶活力没有影响。

序列表

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> 酸性海藻糖酶TreA及其基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1024

<212> PRT

<213> 嗜酸真菌(Bispora sp. MEY-1)

<400> 1

Met Leu Val His Thr Val Val Trp Leu Gly Val Phe Leu Ala Phe Pro

1 5 10 15

Gly Phe Thr Ser Ala Lys Ile Tyr Ser Thr Gln Phe Asp Gly Thr Thr

20 25 30

Trp Asp Asp Glu Asn Trp Arg Ile Gln Thr Thr Ala Leu Asn Gln Gly

35 40 45

His Tyr Glu Ser Arg Met Ser Leu Ser Asn Gly Tyr Leu Gly Ile Asn

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Ile Ser Gly Ile Pro His Trp Ala Gly Leu His Ile Arg Ser Gly Asp

130 135 140

Glu Val Leu Ala Ala Asn Thr Ser Ser Ser Gln Ile Ser Asn Phe Arg

145 150 155 160

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Thr Pro Asn Ser Gly Pro Ala Ile Asp Val Glu Tyr Ser Met Leu Val

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225 230 235 240

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Gln Asn Thr Ala Leu Glu Gly Cys Trp Asn Ala Val His Ser Gly Trp

325 330 335

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340 345 350

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370 375 380

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Gly Asn Asn Thr Lys Leu Asp Ser Asn Ser Ile Pro Val Ala Gly Phe

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515 520 525

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565 570 575

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580 585 590

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<212> PRT

<213> 嗜酸真菌(Bispora sp. MEY-1)

<400> 2

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1 5 10 15

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145 150 155 160

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165 170 175

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210 215 220

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405 410 415

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705 710 715 720

Gly Tyr Leu Gly Leu His Leu Val Leu Asp Ser Leu Asn Ile Asn Pro

725 730 735

Ser Leu Pro Pro Gln Ile Pro Tyr Ile Asp Tyr Arg Thr Phe Tyr Trp

740 745 750

Gln Gly Trp Pro Ile Asn Ala Thr Ser Asn Gln Thr His Thr Thr Leu

755 760 765

Thr Arg Leu Ser Thr Pro Leu Pro Gly Ala Asn Met Thr Phe Glu Asn

770 775 780

Ser Ser Ile Pro Val Thr Ile Gly Ile Asn Gly Ser Met Val Thr Ser

785 790 795 800

Gly Ser Ser Val Met Arg Leu Glu Pro Ser Gly Thr Leu Thr Val Pro

805 810 815

Asn Arg Gln Ile Gly Asp Lys Leu Thr Val Pro Gly Asn Ile Ala Gln

820 825 830

Cys Gln Pro Ile Val Ser Ser Thr Val Asp Tyr Val Arg Gly Gln Phe

835 840 845

Pro Leu Ala Ala Val Asp Gly Ala Val Ser Thr Lys Trp Gln Pro Thr

850 855 860

Gln Leu Asn Ile Ser Ser Ser Ile Thr Val Glu Leu Ala Glu Pro Tyr

865 870 875 880

Val Pro Ile Thr Ala Ile Gln Phe Asp Trp Ala Gln Asn Pro Pro Ser

885 890 895

Ser Tyr Ser Val Thr Phe Ser Asn Ser Ser Ser Asp Ser Asn Phe Val

900 905 910

Lys Val Thr Ser Ser Asp Gln Val Ala Ile Ser Asn Lys Tyr Asp Pro

915 920 925

Ala Thr Ala Ala Ile Ile Thr Asp Tyr Gln Ser Asn Thr Thr Asn Val

930 935 940

Thr Leu Ser Pro Pro Val Tyr Ser Gly Lys Tyr Ala Thr Leu Thr Ile

945 950 955 960

Ser Gly Asn Gln Gly Leu Val Gly Thr Pro Asp Glu Arg Asn Gly Thr

965 970 975

Gly Ala Thr Val Ala Glu Phe Val Ile Val Ala Ser Asp Gly Arg Asn

980 985 990

Val Ala Arg Arg Ser Ser Pro Thr Leu Val Ile

995 1000

<210> 3

<211> 3075

<212> DNA

<213> 嗜酸真菌(Bispora sp. MEY-1)

<400> 3

atgctagtcc acactgtggt atggctagga gtgttcctgg ccttccccgg atttacctcg 60

gcgaagatat attcgactca attcgatgga acgacatggg acgatgaaaa ctggagaatc 120

cagacgacgg cgctgaatca agggcattac gagtcgcgca tgtccctttc aaatggttac 180

ttgggcatca atgtcgccgc tcttggcccg ttcttcgaag tggacgtccc ggttgacggc 240

gacgtgatca atggatggcc gctgttcgat cgccggcaga cattcgccac gatagcaggg 300

ttctacgatg tgacgccgac gacaaatggg tttgccaacg ggacaaactt cccttggttg 360

gcgcagtacg gctgggacag tgtgataagt ggaattccgc actgggcagg cctgcacatc 420

cgctctggcg acgaagtcct tgcagccaac acatcttcga gtcagatttc gaatttccgc 480

tcaaccctgg atattcacaa tggaatgttc atgtggaatt acacttggac tcctaacagc 540

gggccagcaa ttgacgtgga atattcgatg cttgtgcaca agctctgtgt caaccaggcc 600

gccgttcagc tcaagatgac cgcctcagaa gacgtcaacg tgtccgttat tgacgtacta 660

gatgggaatt gtgcggttcg gtcgacgttt gtggacaagg gttatgagtc gacgcttcca 720

atcatatggt ccgcagtccg gccggacaac attgcgaacg tcacggcata tgtctactct 780

gctctggttg gcgatgagta ctgtgacaat gggagtcgat ctgaatacac gtcaccatct 840

gtcatcgggg gcaacagctc ttccattgct caagcgatga atgttgatct gaaggcggga 900

aagacaagta cagtcactaa gttcatcggc ggcgcatcta gtgatgcatt tgatgaccca 960

caaaataccg ctctggaggg ttgttggaac gctgtgcact cgggatggga tgatatggtt 1020

gcgtctcata cgaaagaatg gcacgacatc atgagaaaag attcggtgga cagcttccat 1080

tacccccaga atggctcgct gccggacgac ccaaatattg ttcagctcca gatcctggct 1140

gtgacgaacc cttattatct cttgcagaac acagttagcg tcaacgcttt catagctgca 1200

gggaataata cgaagcttga tagcaacagc atcccagttg cgggcttcgg aagtgacagc 1260

tatgccgggc agattttttg ggacgctgaa gtgtggatgg cgccaggtct tgtggttgca 1320

ttcccagacg ctgcgagaca gattgccaga tatcggatag aacgattccc tatggcaaag 1380

gccaatatca acaccgcata ccagtccagc caaaatgaga cgggcaaatt ctcaccaaat 1440

ggtgccgtct tcccatggac cagcggtcga tacggcaatt gcacgataac cggaccgtgc 1500

tttgactatg aatatcacat caatggagac attggcctgg aagtatataa ctactatgcg 1560

gtcactggtg acaccgattt tttcaaatcc gagttgttcc cgatatacga tgcggtggcg 1620

caattctacg ccgacttggt cacatacaac caaacggcgc aaatgtacta cctgtacaat 1680

gccacagatc cggacgaata cgccaacttt cagaccaacg tgggttatac catggtattg 1740

atgaagaccc acatcgatac ggccaatgca ctacgtgctc gtctgggtat ggaacaaaac 1800

aaaacctggg cggaaatcgc cagcaaaatt gatattccaa tcgatcactc ggccaatatt 1860

attctagaat atcaaaccat gaataacacg gtgtctgtca agcaagcaga tgtagtgttg 1920

gttgacaact tcctcgacta tcctaaccca tacagcctca acgacttgga ctactatgct 1980

ggcaagcagt cgccaaatgg gcccggcatg acctacgctg tgtttagcat tgtggcgaat 2040

gaagtgagcc cgtctggctg ctcttcttat acctacgacc tcaacggagc tgaaccgtac 2100

ctcagagggc catggttcca atacagtgag cagctaatcg acaacttcca agagaatggt 2160

ggcacacatc ctgcatttcc attccttact ggaatgggag gctcaaacca agtggccgtt 2220

tttggctatc tcgggctgca tttggtcctt gattcgttaa atataaaccc ttcgctgccg 2280

ccacaaatac cgtacattga ctacaggact ttctattggc aagggtggcc tatcaatgcc 2340

acatctaatc agactcacac gacactgaca aggttgtcaa ccccacttcc aggtgccaat 2400

atgacgtttg agaactcctc aattccagtt acgattggca tcaatggttc tatggtcacg 2460

tctggttcca gcgtgatgcg cctagagcct tcaggaacac taactgttcc aaatcgacaa 2520

attggagaca agttgactgt gccaggaaac attgcacaat gtcaaccaat tgtatcgtcg 2580

acggttgact acgtgagagg gcagtttccg ctggccgctg tcgacggggc ggtatctacc 2640

aaatggcagc caactcaact gaacatcagc tcttccatca ccgttgaact agcggagcca 2700

tatgtgccca tcacggccat ccaatttgat tgggcgcaaa atccaccctc gagctacagt 2760

gtcacatttt ccaactcaag ctccgattca aattttgtaa aagttaccag cagcgatcag 2820

gttgccatca gcaacaaata cgatccggca acggccgcaa tcatcacgga ctaccagtcc 2880

aatacaacga acgtcacctt gagtccaccc gtgtacagcg ggaaatatgc gacattgaca 2940

atttccggta accaggggtt ggttggcaca ccggatgaac gcaatgggac gggggcgact 3000

gtagcagaat ttgtaattgt tgcatcggat ggtcgtaatg tggcaagacg gagttcaccc 3060

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<210> 4

<211> 3012

<212> DNA

<213> 嗜酸真菌(Bispora sp. MEY-1)

<400> 4

aagatatatt cgactcaatt cgatggaacg acatgggacg atgaaaactg gagaatccag 60

acgacggcgc tgaatcaagg gcattacgag tcgcgcatgt ccctttcaaa tggttacttg 120

ggcatcaatg tcgccgctct tggcccgttc ttcgaagtgg acgtcccggt tgacggcgac 180

gtgatcaatg gatggccgct gttcgatcgc cggcagacat tcgccacgat agcagggttc 240

tacgatgtga cgccgacgac aaatgggttt gccaacggga caaacttccc ttggttggcg 300

cagtacggct gggacagtgt gataagtgga attccgcact gggcaggcct gcacatccgc 360

tctggcgacg aagtccttgc agccaacaca tcttcgagtc agatttcgaa tttccgctca 420

accctggata ttcacaatgg aatgttcatg tggaattaca cttggactcc taacagcggg 480

ccagcaattg acgtggaata ttcgatgctt gtgcacaagc tctgtgtcaa ccaggccgcc 540

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gggaattgtg cggttcggtc gacgtttgtg gacaagggtt atgagtcgac gcttccaatc 660

atatggtccg cagtccggcc ggacaacatt gcgaacgtca cggcatatgt ctactctgct 720

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atcgggggca acagctcttc cattgctcaa gcgatgaatg ttgatctgaa ggcgggaaag 840

acaagtacag tcactaagtt catcggcggc gcatctagtg atgcatttga tgacccacaa 900

aataccgctc tggagggttg ttggaacgct gtgcactcgg gatgggatga tatggttgcg 960

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acgaaccctt attatctctt gcagaacaca gttagcgtca acgctttcat agctgcaggg 1140

aataatacga agcttgatag caacagcatc ccagttgcgg gcttcggaag tgacagctat 1200

gccgggcaga ttttttggga cgctgaagtg tggatggcgc caggtcttgt ggttgcattc 1260

ccagacgctg cgagacagat tgccagatat cggatagaac gattccctat ggcaaaggcc 1320

aatatcaaca ccgcatacca gtccagccaa aatgagacgg gcaaattctc accaaatggt 1380

gccgtcttcc catggaccag cggtcgatac ggcaattgca cgataaccgg accgtgcttt 1440

gactatgaat atcacatcaa tggagacatt ggcctggaag tatataacta ctatgcggtc 1500

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ggctatctcg ggctgcattt ggtccttgat tcgttaaata taaacccttc gctgccgcca 2220

caaataccgt acattgacta caggactttc tattggcaag ggtggcctat caatgccaca 2280

tctaatcaga ctcacacgac actgacaagg ttgtcaaccc cacttccagg tgccaatatg 2340

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ggagacaagt tgactgtgcc aggaaacatt gcacaatgtc aaccaattgt atcgtcgacg 2520

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acattttcca actcaagctc cgattcaaat tttgtaaaag ttaccagcag cgatcaggtt 2760

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acaacgaacg tcaccttgag tccacccgtg tacagcggga aatatgcgac attgacaatt 2880

tccggtaacc aggggttggt tggcacaccg gatgaacgca atgggacggg ggcgactgta 2940

gcagaatttg taattgttgc atcggatggt cgtaatgtgg caagacggag ttcacccacc 3000

ttggttattt ga 3012

Claims (10)

1.一种海藻糖酶TreA，其特征在于，所述海藻糖酶TreA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.一种海藻糖酶TreA基因，其特征在于，编码权利要求1所述的海藻糖酶TreA。

3.根据权利要求2所述的海藻糖酶TreA基因，其特征在于，所述海藻糖酶TreA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

4.包含权利要求2所述的海藻糖酶TreA基因的重组菌株。

5.包含权利要求2所述的海藻糖酶TreA基因的重组菌株GS115/TreA。

6.一种制备海藻糖酶TreA的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)用含有编码海藻糖酶TreA基因的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导海藻糖酶TreA的表达；

(3)回收并纯化所表达的海藻糖酶TreA。

7.权利要求1所述海藻糖酶TreA的应用。

8.氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的蛋白作为海藻糖酶的应用。

9.氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的蛋白在水解海藻糖方面的应用。

10.氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的蛋白在生物防治、食品或医药领域中的应用。