CN109371004A - 热稳定性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体K203E及其基因和应用 - Google Patents

热稳定性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体K203E及其基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种真菌来源的酸性蛋白酶Bs2688突变体及其基因和应用。本发明蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明提供了一个新的蛋白酶基因，实现利用基因工程手段生产性质优良的蛋白酶，可应用于饲料、食品、医药等工业。

Description

热稳定性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体K203E及其基因和 应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种真菌来源的热稳定性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体及其基因和应用。
背景技术
蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，其在植物、动物和微生物中都有广泛存在。相比于动植物来源的蛋白酶，微生物源蛋白酶，具有培养方便、操作简单和产酶量高的特点，便于工业化的批量生产得以大规模生产应用。因此，微生物源蛋白酶成为了目前的蛋白酶的重要来源。
蛋白酶的分类方式有很多，按照蛋白酶作用的pH，将其分成酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶。酸性蛋白酶通常在pH 2.0～6.0之间是稳定的，最适pH值随种属不同稍有不同，但通常都在pH 3.0左右，如黑曲霉所产酸性蛋白酶的最适pH为3.0，灰绿青霉为pH3.5，酵母菌也在pH 3.0。该类酶拥有较高的序列相似性，其三维结构呈对称的双叶型。按活性中心的不同，蛋白酶分为：丝氨酸蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。
蛋白酶在食品、酿造、毛皮与皮革、医药和饲料等行业中均有广泛应用。乳品行业中，利用凝乳酶对酪蛋白的高度专一性，蛋白酶可以参与奶酪的制造过程。白酒酿造的发酵过程中，利用酸性蛋白酶起协同作用，溶解发酵原料的颗粒，提高原材料的利用率，促进微生物生长，分解蛋白质提供生香前体物质和风味物质，分解酵母菌体蛋白。在毛皮、皮革的制造过程中，酸性蛋白酶将纤维间质除去，使皮质更加柔软、丰满。饲料行业中，酸性蛋白酶的添加可提高蛋白质的可消化性，使高分子的蛋白质降解为低分子的肽及氨基酸，易于畜禽消化吸收，可降低饲料对幼仔消化道的刺激，减少营养障碍，提高饲料利用率，促进畜禽生长。
目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定。因此，酸性蛋白酶的酶活不高，酶自身最适作用条件与所催化的环境条件之间在pH、温度等方面的差别，导致酶的催化效率降低，从而限制了酸性蛋白酶在工业中的应用。
发明内容
为了解决现有的酸性蛋白酶的酶活不高、催化效率低下的问题，本发明提供一种真菌来源的热稳定性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体，其具有耐酸、耐高温、易于生产发酵的特点。
本发明的目的是提供一种热稳定提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体。
本发明的再一目的是提供上述蛋白酶的基因。
本发明的再一目的是提供包含上述蛋白酶的重组载体。
本发明的再一目的是提供包含上述蛋白酶基因的重组菌株。
本发明的再一目的是提供一种制备蛋白酶的方法。
本发明的再一目的是提供上述蛋白酶的应用。
根据本发明的具体实施方式，酸性蛋白酶Bs2688的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：
其中，该酶全长407个氨基酸，N端19个氨基酸为信号肽序列，即“MHSFVTAAALVASASLTLA”。因此，蛋白酶原Bs2688的理论分子量为40.3kDa，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：
为进一步提高酸性蛋白酶Bs2688的热稳定性，对其进行了突变改造。75℃下处理5min后，野生型的酶活剩余53％，而突变体K203E的剩余酶活为68％，较野生型有了大幅度的提高。
根据本发明的具体实施方式，耐热性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体K203E的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示：
本发明还提供了编码SEQ ID No.3氨基酸序列的突变体K203E的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示：
本发明还提供了包含上述蛋白酶基因的重组载体，优选为pPIC9-Bs2688。将本发明的蛋白酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将蛋白酶基因插入到质粒pPIC9上的SnaB I和Avr II限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-Bs2688。
本发明还提供了包含上述蛋白酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/Bs2688。
本发明还提供了一种制备蛋白酶突变体的方法，包括以下步骤：
1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组蛋白酶的表达；
3)回收并纯化所表达的蛋白酶。
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/Bs2688。
本发明还提供了上述氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白做为蛋白酶再水解酪蛋白方面的应用。
本发明提供了利用基因工程手段生产性质优良的蛋白酶突变体，75℃下，野生型的酶活剩余53％，突变体K203E的剩余酶活为68％，较野生型有了大幅度的提高。本发明的蛋白酶突变体可应用于饲料、食品、医药等工业。
附图说明
图1显示本发明蛋白酶突变体的最适pH值；
图2显示本发明蛋白酶突变体的pH稳定性情况；
图3显示本发明蛋白酶突变体的最适反应温度；
图4显示本发明蛋白酶突变体与野生型在75℃处理5min后的酶活情况。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)及毕赤酵母表达载体pPIC9。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶、连接酶。
3、培养基：
(1)产酶培养基：30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆粕，5g/L大麦葡聚糖，5g/L(NH4)SO4，1g/L KH2PO4，0.5g/L MgSO4·7H2O，0.01g/L FeSO4·7H2O，0.2g/L CaCl2于1L去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min
(2)大肠杆菌培养基LB(126蛋白胨、0.5％酵母提取物、126NaCL，pH7.0)。
(3)BMGY培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.000049<Biotin，1％甘油(v/v)。
(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。
实施例1制备蛋白酶Bs2688突变体
1.克隆蛋白酶编码基因Bs2688
将液体培养3天的真菌Bispora sp.MEY-1，12,000rpm离心10min，收集的菌丝体加入已高温灭菌的研钵中，用液氮迅速研磨至粉末，然后将研磨好的菌体转移至一个新的、装有15ml CTAB裂解液50mL离心管中，轻柔上下倒置混匀，置于65℃水浴锅保温3h，每隔20min，上下倒置轻柔混匀一次，以便充分裂解菌体。4℃、12,000rpm离心10min，吸取上清至新的离心管中，加入等体积的氯仿抽提，室温放置5min。4℃、12,000rpm离心10min。取上清再加入等体积的酚/氯仿抽提，室温放置5min。4℃、12,000rpm离心10min。以便尽量除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下l0000rpm离心l0min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量dd H2O溶解，置于-20℃备用。
设计克隆引物Bs2688F和Bs2688R，以Bispora sp.MEY-1基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到一约1800bp片段。
表1 PCR扩增所需的引物
2.构建突变体
提取Bispora sp.MEY-1的总RNA，利用Oligo(dT)20和反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计扩增开放阅读框的引物Bs2688F和Bs2688R，具体序列如表1所示，扩增该单链cDNA，获得蛋白酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后测序。
通过对蛋白酶的基因组序列和cDNA序列比对后发现该基因中含有2个内含子，cDNA长1224bp，编码407个氨基酸，N端19个氨基酸为其信号肽序列，经比对从Bisporasp.MEY-1中分离克隆得到的编码蛋白酶的基因Bs2688为新基因。
以构建好的野生型质粒作为模板，引入突变碱基，突变方式为K203E，将上述所得重组质粒送去测序，验证序列的正确性，将突变体命名为Bs2688-K203E。
3.构建蛋白酶工程菌株
(1)构建表达载体
以测序正确的蛋白酶Bs2688的cDNA为模板，设计合成了带有SnaB I和Avr II限制性酶切位点的引物F和R，如表1所示，对Bs2688的成熟蛋白的编码区进行扩增，并利用SnaBI和Avr II酶切PCR产物，连接进入表达载体pPIC9，蛋白酶Bs2688成熟蛋白的序列插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体pPIC9-Bs2688，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1。阳性转化子进行DNA测序。用限制性内切酶Bgl II进行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GS115感受态细胞，30℃培养2-3天，挑取在MD平板上生长的转化子进行进一步的表达实验。
对于测序正确的突变体制备重组质粒，用限制性内切酶Bgl II进行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GS115感受态细胞，30℃培养2-3天，挑取在MD平板上生长的转化子进行进一步的表达实验。
以同样的方式对Bs2688的含信号肽完整蛋白的编码区和突变体K203E的编码区构建重组表达载体。
(2)高蛋白酶活性转化子的筛选
在长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号点到MD平板上，将MD平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从MD平板上挑取转化子接种于装有3mL BMGY培养基的离心管中，30℃、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液3,000×g离心15min，去上清，离心管中再加入1mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，在30℃、220rpm诱导培养；诱导培养48h后，3,000×g离心5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出高蛋白酶活性的转化子。
4.制备重组蛋白酶
(1)蛋白酶基因Bs2688突变体在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达
筛选出酶活较高的转化子，接种于300mL BMGY液体培养基的1L三角瓶中，30℃，220rpm摇床振荡培养48h；5,000rpm离心5min，轻柔弃上清，再向菌体加入100mL含有0.5％甲醇的BMMY液体培养基，30℃，220rpm诱导培养72h。诱导培养期间，间隔24h补加一次甲醇溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5％左右；(3)12,000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。
(2)重组蛋白酶的纯化
收集摇瓶表达的重组蛋白酶上清液，通过10kDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10kDa超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的重组蛋白酶Bs2688突变体，通过离子交换层析进行纯化，对收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定。
实施例2.验证重组蛋白酶的酶学性能
采用福林酚试剂显色法对本发明的蛋白酶进行活性分析。具体方法如下：
在pH 3.0，55℃条件下，1mL的反应体系包括500μL适当的稀释酶液，500μL底物，反应10min，加入1mL三氯乙酸(0.4mol/L)终止反应；将该反应体系12000rpm离心3min，吸500μL上清液加入2.5mL碳酸钠(0.4mol/L)，再加入500μL福林酚试剂，40℃显色20min冷却后680nm测定OD值。蛋白酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解底物酪蛋白生成lμmol酪氨酸所需的酶量为1个活性单位(U)。
1.蛋白酶Bs2688及其突变体的最适pH及pH稳定性
经纯化的表达的蛋白酶Bs2688及突变体Bs2688Y-K203E在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 1.0～3.0甘氨酸-盐酸缓冲液，pH3.0～8.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓冲液及pH 8.0～l0.0是Tris-HCl系列缓冲液。
75℃下测定的蛋白酶Bs2688和突变体Bs2688-K203E的最适pH均为3.0，在pH 2.5-pH 3.5范围内，该酶能够维持其70％以上的酶活力，其中，图1显示突变体Bs2688-K203E的最适pH情况。
将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理60min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。实验结果表明，蛋白酶Bs2688及突变体Bs2688-K203E在pH 1.0-pH 6.0之间能够维持80％以上的酶活力，说明它们均具有优良的pH稳定性，其中图2显示突变体Bs2688-K203E的pH稳定情况。
2.蛋白酶Bs2688反应最适温度及热稳定性
在pH 3.0条件下，测定蛋白酶在30-90℃下的酶活性。
本发明的蛋白酶Bs2688及突变体Bs2688K203E的最适反应温度均为75℃，在80℃时依然具有50％以上的酶活力，其中，图3显示突变体Bs2688-K203E的最适温度。
为了测定其野生型和突变体的热稳定性，将野生型Bs2688和突变体Bs2688-K203E在75℃下处理5min，再测定蛋白酶的剩余酶活。如图4所示，结果表明，野生型Bs2688在75℃条件下处理5min的剩余53％的酶活力；突变体Bs2688-K203E处理后的剩余的68％的酶活。因此，突变体Bs2688-K203E与野生型Bs2688相比，在75℃条件下处理5min后的剩余酶活均明显提高。
序列表
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 热稳定性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体K203E及其基因和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 407
<212> PRT
<213> 嗜热真菌MEY-1(Bispora sp. MEY-1)
<400> 1
Met His Ser Phe Val Thr Ala Ala Ala Leu Val Ala Ser Ala Ser Leu
1 5 10 15
Thr Leu Ala Ala Pro Ala Gln Ile Val Gly Arg Ser Thr Phe Gln Ile
20 25 30
Asp Gln Val Ala Ser Gly Lys Val Tyr Lys Asn Gly Pro Met Ala Met
35 40 45
Met Gln Thr Tyr Asn Lys Tyr Ala His Val Gly Ala Val Ala Pro Ala
50 55 60
Ala Val Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Thr Gly Glu Val Ser Ala
65 70 75 80
Asn Pro Glu Gln Tyr Asp Glu Ser Tyr Leu Cys Pro Val Thr Ile Gly
85 90 95
Asp Gln Thr Leu Asn Leu Asp Phe Asp Thr Gly Ser Ala Asp Leu Trp
100 105 110
Val Phe Ser Thr Leu Thr Pro Ser Ser Glu Ser Thr Gly His Thr Leu
115 120 125
Tyr Asn Pro Ala Asp Ser Gly Thr Glu Lys Gln Gly Tyr Thr Trp Asn
130 135 140
Ile Thr Tyr Gly Asp Gly Ser Gly Ala Ala Gly Val Val Tyr Ala Asp
145 150 155 160
Lys Val Val Val Gly Gly Val Thr Ala Thr Ser Gln Ala Val Glu Ala
165 170 175
Ala Thr Ser Val Ser Ser Glu Phe Thr Gln Asp Thr Lys Asn Asp Gly
180 185 190
Leu Leu Gly Leu Ala Phe Ser Ser Ile Asn Thr Val Gln Pro Val Gln
195 200 205
Gln Thr Thr Phe Phe Asp Thr Val Lys Asp Thr Leu Ala Lys Lys Leu
210 215 220
Phe Thr Ala Asp Leu Lys Lys Gly Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Phe Gly
225 230 235 240
Tyr Ile Asp Ser Ser Lys Tyr Thr Gly Thr Ile Thr Tyr Val Pro Val
245 250 255
Asn Asn Glu Asn Gly Phe Trp Gln Phe Thr Ala Gly Gly Tyr Ser Ile
260 265 270
Gly Gly Gly Asn Gly Thr Ser Gly Ser Asn Ala Thr Thr Gly Ser Ile
275 280 285
Gly Thr Ser Ile Ala Asp Thr Gly Thr Thr Leu Leu Tyr Leu Pro Ser
290 295 300
Asn Val Val Thr Ala Tyr Tyr Lys Gln Val Ser Gly Ala Ser Tyr Asn
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Ser Ala Gln Gly Gly Tyr Thr Tyr Pro Cys Gly Ala Thr Leu Pro Asp
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340 345 350
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340 345 350
Asn Thr Gly Ile Gly Phe Asn Ile Phe Gly Asp Ile Phe Leu Lys Ser
355 360 365
Val Tyr Ala Val Phe Asp Gln Thr Gln Ser Ser Pro Arg Leu Gly Phe
370 375 380
Ala Glu Gln Ser
385
<210> 3
<211> 388
<212> PRT
<213> 嗜热真菌MEY-1(Bispora sp. MEY-1)
<400> 3
Ala Pro Ala Gln Ile Val Gly Arg Ser Thr Phe Gln Ile Asp Gln Val
1 5 10 15
Ala Ser Gly Lys Val Tyr Lys Asn Gly Pro Met Ala Met Met Gln Thr
20 25 30
Tyr Asn Lys Tyr Ala His Val Gly Ala Val Ala Pro Ala Ala Val Val
35 40 45
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Thr Gly Glu Val Ser Ala Asn Pro Glu
50 55 60
Gln Tyr Asp Glu Ser Tyr Leu Cys Pro Val Thr Ile Gly Asp Gln Thr
65 70 75 80
Leu Asn Leu Asp Phe Asp Thr Gly Ser Ala Asp Leu Trp Val Phe Ser
85 90 95
Thr Leu Thr Pro Ser Ser Glu Ser Thr Gly His Thr Leu Tyr Asn Pro
100 105 110
Ala Asp Ser Gly Thr Glu Lys Gln Gly Tyr Thr Trp Asn Ile Thr Tyr
115 120 125
Gly Asp Gly Ser Gly Ala Ala Gly Val Val Tyr Ala Asp Lys Val Val
130 135 140
Val Gly Gly Val Thr Ala Thr Ser Gln Ala Val Glu Ala Ala Thr Ser
145 150 155 160
Val Ser Ser Glu Phe Thr Gln Asp Thr Lys Asn Asp Gly Leu Leu Gly
165 170 175
Leu Ala Phe Ser Ser Ile Asn Thr Val Gln Pro Val Gln Gln Thr Thr
180 185 190
Phe Phe Asp Thr Val Lys Asp Thr Leu Ala Glu Lys Leu Phe Thr Ala
195 200 205
Asp Leu Lys Lys Gly Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Phe Gly Tyr Ile Asp
210 215 220
Ser Ser Lys Tyr Thr Gly Thr Ile Thr Tyr Val Pro Val Asn Asn Glu
225 230 235 240
Asn Gly Phe Trp Gln Phe Thr Ala Gly Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Gly
245 250 255
Asn Gly Thr Ser Gly Ser Asn Ala Thr Thr Gly Ser Ile Gly Thr Ser
260 265 270
Ile Ala Asp Thr Gly Thr Thr Leu Leu Tyr Leu Pro Ser Asn Val Val
275 280 285
Thr Ala Tyr Tyr Lys Gln Val Ser Gly Ala Ser Tyr Asn Ser Ala Gln
290 295 300
Gly Gly Tyr Thr Tyr Pro Cys Gly Ala Thr Leu Pro Asp Phe Asn Val
305 310 315 320
Ala Ile Gly Gly Lys Thr Phe Val Val Pro Gly Thr Asp Leu Asn Tyr
325 330 335
Ala Pro Ile Asn Ser Ala Gly Thr Thr Cys Phe Gly Gly Ile Gln Ala
340 345 350
Asn Thr Gly Ile Gly Phe Asn Ile Phe Gly Asp Ile Phe Leu Lys Ser
355 360 365
Val Tyr Ala Val Phe Asp Gln Thr Gln Ser Ser Pro Arg Leu Gly Phe
370 375 380
Ala Glu Gln Ser
385
<210> 4
<211> 1167
<212> DNA
<213> 嗜热真菌MEY-1(Bispora sp. MEY-1)
<400> 4
gctccggccc agattgtcgg ccgcagcacc tttcagatcg atcaagtggc ctctggtaag 60
gtctacaaga acggccctat ggccatgatg cagacataca acaagtacgc gcacgtaggc 120
gccgtcgcgc ccgctgccgt tgtggccgcc gcggccgccg cgcagactgg cgaggtgtcc 180
gcaaatcccg agcagtacga cgaaagctac ctttgtcctg tcactattgg ggatcagacc 240
ttgaacttgg acttcgacac gggcagcgcg gacctttggg tgttttcaac cctcactccg 300
tcaagcgagt caacaggcca cacgttgtat aaccccgccg actctggcac ggagaagcag 360
ggctatacct ggaacatcac ctacggcgac ggctcgggcg cagccggtgt ggtgtacgcc 420
gataaggtgg tcgttggcgg ggtcaccgcg acctcgcagg cggtggaggc ggcgacatcg 480
gtctccagcg aattcacaca ggacaccaag aacgatggcc tgctcggctt ggcgttcagc 540
tcgatcaata ccgttcagcc ggtgcaacag actactttct tcgatacggt caaggacacg 600
ctggccgaaa agctcttcac tgccgatctc aagaaggggg ctgccggcag ctatggtttt 660
ggttacatcg acagctccaa atacaccggc accatcacct atgtgcccgt gaacaatgag 720
aacggcttct ggcagttcac cgcaggcggc tactccatcg gtggcggcaa cggcacgtca 780
ggcagcaacg cgaccacagg cagcattggc acctccatcg cggacaccgg caccaccctc 840
ctctacttgc ccagcaacgt agtcacggct tactacaagc aagtctcggg cgcttcttat 900
aactcggcgc aaggcggtta cacttacccg tgcggtgcca ctctgcccga cttcaacgtg 960
gccattggcg gcaagacttt cgtcgtcccc ggcaccgatc tcaattacgc gcctatcaac 1020
agcgcgggca ccacgtgctt cggcgggatt caagctaaca cgggcatcgg attcaacatc 1080
ttcggcgaca ttttcctaaa gagcgtctac gccgtcttcg accagactca gagctcgccg 1140
cgcctcggct ttgccgagca atcgtaa 1167

Claims (9)

1.热稳定性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体，其特征在于，所述酸性蛋白酶Bs2688突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.热稳定性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体基因，其特征在于，编码权利要求1所述的酸性蛋白酶Bs2688突变体。
3.根据权利要求2所述的热稳定性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体基因，其特征在于，所述酸性蛋白酶Bs2688突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
4.包含权利要求2所述的酸性蛋白酶Bs2688突变体基因的重组表达载体。
5.包含权利要求2所述的酸性蛋白酶Bs2688突变体基因的重组菌株。
6.制备热稳定性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)以包含编码酸性蛋白酶Bs2688突变体基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
(2)培养重组菌株，诱导表达酸性蛋白酶Bs2688突变体；
(3)分离纯化获得的酸性蛋白酶Bs2688突变体。
7.权利要求1所述的热稳定性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体的应用。
8.氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白在水解酪蛋白方面的应用。
9.氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白在饲料、食品或医药领域中的应用。
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