WO2020073866A1

WO2020073866A1 - 葡萄糖淀粉酶TlGA15及其基因和应用

Info

Publication number: WO2020073866A1
Application number: PCT/CN2019/109372
Authority: WO
Inventors: 罗会颖; 姚斌; 郭玉杰; 涂涛; 王苑; 黄火清; 柏映国; 苏小运; 王亚茹; 孟昆
Original assignee: 中国农业科学院饲料研究所
Priority date: 2018-10-09
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2020-04-16
Also published as: US11680255B2; US20210340514A1; CN109385413A; CN109385413B

Abstract

提供一种来源于真菌的葡萄糖淀粉酶TlGa15及其基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。该葡萄糖淀粉酶可应用于饲料、食品、医药等工业。

Description

葡萄糖淀粉酶TlGA15及其基因和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及葡萄糖淀粉酶TlGA15及其基因和应用。

背景技术

淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。淀粉酶家族包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α-淀粉酶为内切酶，作用于淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，生成糊精和低聚糖。β-淀粉酶为外切酶，它从淀粉非还原性顺次切下麦芽糖。而葡萄糖淀粉酶是一种作用于α-1,4糖苷键的外切酶，其系统名称为α-1,4-葡聚糖葡萄糖苷水解酶(α-1,4-glucan glucohydrolase,EC.3.2.1.3)或γ-淀粉酶(γ-amylase)，简称糖化酶。葡萄糖淀粉酶从非还原糖末端切下葡萄糖分子。葡萄糖淀粉酶底物专一性较低，即能够切断α-1,4-糖苷键，对α-1,6-糖苷键和α-1,3-糖苷键也有轻微的水解能力。葡萄糖淀粉酶是工业上用量最大的生物酶制剂之一，其可用于将淀粉酶水解产物转化为葡萄糖，进而葡萄糖再转化为工业产品，因此，被广泛地应用于食品、医药和发酵等工业。

葡萄糖淀粉酶在微生物中分布很广，现有技术中已存在来源于细菌、真菌和酵母的多种葡糖淀粉酶被报道，具体来源包括曲霉属、根霉属、腐质霉属、毛菌以及青霉属等。这些酶的最适温度一般为55-60℃，最适pH为3.5-5.0，而在实际的工业应用中，淀粉液化的温度通常在95℃条件下进行，现有糖化酶的最适温度与实际需要相去甚远，以致淀粉酶在高温下水解无法达到预期的效果。

发明内容

为了解决现有技术中存在的葡萄糖淀粉酶的最适温度较低的问题，本发明提供一种葡萄糖淀粉酶及其基因和应用。

本发明的目的在于提供一种葡萄糖淀粉酶。

本发明的再一目的在于提供葡萄糖淀粉酶基因。

本发明的再一目的在于提供包含葡萄糖淀粉酶基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供包含葡萄糖淀粉酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供葡萄糖淀粉酶的制备方法。

本发明的再一目的在于提供葡萄糖淀粉酶的应用。

根据本发明具体实施方式葡萄糖淀粉酶TlGA，其最适pH为5.0，其最适温度位65℃，具有较好的温度稳定性，且其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

其中，该酶全长613个氨基酸，N端20个氨基酸为信号肽序列“MQYLLKTTLGALSVAQLVIA”。

根据本发明的具体实施方式，成熟的葡萄糖淀粉酶TlGA15的理论分子量为63.3kDa，其最适pH为5.0，其最适温度位65℃，具有较好的温度稳定性，且其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

根据本发明的具体实施方式，本发明的葡萄糖淀粉酶具有以下特性，

(a)其最适pH为5.0，其最适温度位65℃，具有较好的温度稳定性；

(b)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示,或者具有与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有90％-99％一致性的氨基酸序列。

根据本发明的具体实施方式，所述葡萄糖淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示序列具有90％～99％的一致性，优选具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的一致性，其最适pH为5.0，其最适温度位65℃，具有较好的温度稳定性。

根据本发明的具体实施方式，提供了编码上述葡萄糖淀粉酶的基因。

根据本发明的具体实施方式，所述葡萄糖淀粉酶基因编码最适pH为5.0、最适温度位65℃、具有较好的温度稳定性的葡萄糖淀粉酶，该基因的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：

根据本发明的具体实施方式所述葡萄糖淀粉酶基因编码最适pH为5.0、最适温度位65℃、具有较好的温度稳定性的葡萄糖淀粉酶，该基因含有4个内含子，+240～293bp、+582～640bp、+737～786、+1428～1524为其内含子序列，cDNA长1824bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.4所示：

其中，信号肽的碱基序列为：

根据本发明的具体实施方式，所述葡萄糖淀粉酶基因编码最适pH为5.0、最适温度位65℃、具有较好的温度稳定性的葡萄糖淀粉酶，成熟基因的编码序列如SEQ ID NO.5所示：

根据本发明的具体实施方式，所述葡萄糖淀粉酶基因编码最适pH为5.0、最适温度位65℃、具有较好的温度稳定性的葡萄糖淀粉酶，且其核苷酸序列与SEQ ID NO.3所示序列具有90％～99％的一致性，优选具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的一致性。

根据本发明的具体实施方式，提供了包含上述葡萄糖淀粉酶基因Tlga15的重组载体，优选为pPIC9-Tlga15。将本发明的葡萄糖淀粉酶基因Tlga15插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将葡萄糖淀粉酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-Tlga15。

本发明还提供了包含上述葡萄糖淀粉酶基因的重组菌株，优选为重组菌株。

本发明还提供了一种制备葡萄糖淀粉酶TlGA15的方法，包括以下步骤：

(1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导重组葡萄糖淀粉酶TlGA15的表达；以及

(3)回收并纯化所表达的葡萄糖淀粉酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/15。

本发明的葡萄糖淀粉酶TlGA15属于糖基水解酶第15家族，其最适pH为5.0，在pH 2.0-10.0范围内，该酶能够维持其50％以上的酶活力；其最适温度位65℃，在55℃下处理60min，酶活仍能保持79％，在60℃下处理60min，依然能够保持55％的酶活力，具有较好的温度稳定性。

本发明提供了上述葡萄糖淀粉酶TlGA15的应用，运用基因工程手段来产业化生产葡萄糖淀粉酶。本发明还提供了一个新的葡萄糖淀粉酶基因，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案可以实现利用基因工程手段生产性质优良、适合工业应用的葡萄糖淀粉酶。

附图说明

图1显示葡萄糖淀粉酶TlGA15的最适pH；

图2显示葡萄糖淀粉酶TlGA15的pH稳定性情况；

图3显示葡萄糖淀粉酶TlGA15的最适温度；

图4显示葡萄糖淀粉酶TlGA15的温度稳定性情况。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)、毕赤酵母表达载体pPIC9；

2、培养基：

(1)产酶培养基：30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆粕，5g/L大麦葡聚糖，5g/L(NH ₄)SO ₄，1g/L KH ₂PO ₄，0.5g/L MgSO ₄·7H ₂O，0.01g/L FeSO ₄·7H ₂O，0.2g/L CaCl ₂于1L去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min

(2)LB培养基：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl。

(3)YPD培养基：2％葡萄糖、1％酵母提取物、2％蛋白胨。

(4)BMGY培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，13.4％YNB，0.000049<Biotin，0.5％甘油(v/v)。

(5)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同。

实施例1葡萄糖淀粉酶编码基因Tlga15的克隆

1.葡萄糖淀粉酶的基因组DNA

以嗜热蓝状菌Talaromyces leycettanus JCM 12802总DNA为模板进行PCR扩增，引物如表1所示，PCR反应参数为：95℃5min；94℃30sec,50℃30sec,72℃2min,30个循环，72℃10min。得到一约1800bp片段，将该片段回收后测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

表1基因克隆本实验所需的引物

2.葡萄糖淀粉酶cDNA的获得

提取Talaromyces leycettanus JCM 12802的总RNA，利用Oligo(dT) ₂₀和反转录酶得到cDNA的一条链，然后利用表1所示的引物15F和15R，扩增该单链cDNA，获得葡萄糖淀粉酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后测序，得到葡萄糖淀粉酶的cDNA。

通过对葡萄糖淀粉酶的基因组序列和cDNA序列比对后发现，该基因有含有4个内含子，N端20个氨基酸为其信号肽序列，从Talaromyces leycettanus12802中分离克隆得到的编码葡萄糖淀粉酶的基因为新基因。

实施例2葡萄糖淀粉酶TlGA15工程菌株的构建

1.表达载体的构建及表达

以测序正确的葡萄糖淀粉酶编码基因Tlga15的cDNA片段为模板，以表1所示的带有EcoR I和Not I限制性酶切位点的引物15F和15R对其成熟蛋白的编码区进行扩增。利用EcoR I和Not I酶切PCR产物，连接进入表达载体pPIC9，葡萄糖淀粉酶成熟蛋白的序列插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体pPIC9-Tlga15，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶EcoR I和Not I进行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GS115感受态细胞，30℃培养2-3天，挑取在MD平板上生长的转化子。

以同样的方法构建含信号肽序列的葡萄糖淀粉酶基因的重组表达载体及转化子。

2.筛选高表达转化子

用灭过菌的牙签从长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号先点到MD平板上，将MD平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从MD平板上挑取转化子接种于装有3mL BMGY培养基的离心管中，30℃、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液3,000×g离心15min，去上清，离心管中再加入1mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，在30℃、220rpm诱导培养；诱导培养48h后，3,000×g离心5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出高葡萄糖淀粉酶活性的转化子。

实施例3重组葡萄糖淀粉酶TlGA15的制备

1.葡萄糖淀粉酶基因Tlga15在毕赤酵母发酵水平的大量表达

筛选出酶活较高的转化子，接种于YPD培养基中活化、富集；进行在发酵水平的大量表达。发酵液12,000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。

2.葡萄糖淀粉酶TlGA15的纯化

收集摇瓶表达的重组葡萄糖淀粉酶TlGA15上清液，通过10kDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10kDa超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的重组葡萄糖淀粉酶TlGA15，通过离子交换层析进行纯化。具体地，取萄糖淀粉酶TlGA15浓缩液2.0mL，经预先用20mM Tris-HCl(pH 6.5)平衡过的HiTrap Q Sepharose XL阴离子柱，然后用0-1.0mol/L的NaCl进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定。

实施例4葡萄糖淀粉酶TlGA15性质分析

采用DNS法对本发明的葡萄糖淀粉酶TlGA15进行活性分析。具体方法如下：在pH 5.0，65℃条件下，1mL的反应体系包括l00μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应30min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。葡萄糖淀粉酶活性单位定义：在65℃pH5.0条件下，每分钟内催化水解底物释放出1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位(U)。

1.葡萄糖淀粉酶TlGA15的最适pH及pH稳定性

所用缓冲液为pH 1.0～3.0甘氨酸-盐酸缓冲液，pH3.0～9.0的柠檬酸-磷酸氢二钠系列缓冲液，pH9.0～12甘氨酸-NaoH系列缓冲液，将经纯化的葡萄糖淀粉酶TlGA在上述不同的pH下的缓冲液中进行酶促反应，以测定其最适pH。

如图1所示，在温度为65℃下，葡萄糖淀粉酶TlGA15的最适pH为5.0，且在pH3.0-pH5.5范围内，该酶能够维持其50％以上的酶活力。

将葡萄糖淀粉酶TlGA15酶液混在不同pH值的缓冲液，于37℃下处理60min，再测定酶活性，以研究酶的pH稳定性。

如图2所示，葡萄糖淀粉酶TlGA15在pH2.0-pH10.0之间能够维持50％以上的酶活力，说明该酶具有优良的pH稳定性。

2.葡萄糖淀粉酶TlGA15反应最适温度及热稳定性

在pH 5.0条件下，于不同温度(20-80℃)测定纯化的葡萄糖淀粉酶TlGA15酶活性。

如图3所示，葡萄糖淀粉酶TlGA15的最适反应温度为65℃，在70℃时依然具有70％以上的酶活力。

在不同温度下处理不同时间，再在60℃下进行酶活性测定，以测定葡萄糖淀粉酶TlGA的热稳定性。

如图4所示，葡萄糖淀粉酶TlGA15在55℃下处理60min，还能保持79％的酶活力，在60℃下处理60min，能够保持55％的酶活力，即使该酶在70℃下处理5min，依然能够保持24％的酶活力，这表明该酶具有较好的稳定性。

3.葡萄糖淀粉酶TlGA15的比活及动力学

以不同浓度(0.4-3mmol/L)的淀粉为底物，在pH5.0的0.1mol/L的柠檬酸缓冲液体系中，65℃下测定酶活性,反应时间5分钟，计算出其在65℃下的反应速度，利用双倒数作图法求得其Km值和Vmax。

经测定,葡萄糖淀粉酶TlGA15在65℃下以淀粉为底物的Km值为1.86mg/ml,最大反应速度Vmax为714μmol/min/mg，比活为542U/mg。

Claims

葡萄糖淀粉酶，其特征在于，

(a)其最适pH为5.0，其最适温度位65℃，具有较好的温度稳定性；

(b)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示,或者具有与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有90％-99％一致性的氨基酸序列。
葡萄糖淀粉酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的葡萄糖淀粉酶。
根据权利要求2所述的葡萄糖淀粉酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示,或者具有与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示核苷酸序列具有90％-99％一致性的核苷酸序列。
包含权利要求2所述葡萄糖淀粉酶基因的重组表达载体。
根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述葡萄糖淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示,或者具有与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示核苷酸序列具有90％-99％一致性的核苷酸序列。
包含权利要求2所述葡萄糖淀粉酶基因的重组菌株。
根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述葡萄糖淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示,或者具有与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示核苷酸序列具有90％-99％一致性的核苷酸序列。
一种制备权利要求1所述的葡萄糖淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)用包含编码葡萄糖淀粉酶的基因的重组表达载体转化宿主细胞；

(2)培养宿主细胞，诱导葡萄糖淀粉酶表达；

(3)分离纯化获得的葡萄糖淀粉酶TlGA。
根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述编码葡萄糖淀粉酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示,或者具有与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示核苷酸序列具有90％-99％一致性的核苷酸序列。
权利要求1所述的葡萄糖淀粉酶TlGA的应用。