CN108588056B

CN108588056B - 一种低温α-淀粉酶Tcamy及其基因和应用

Info

Publication number: CN108588056B
Application number: CN201810198358.8A
Authority: CN
Inventors: 罗会颖; 涂涛; 姚斌; 郭玉杰; 杨雄震; 王亚茹; 黄火清; 王苑; 柏映国; 苏小运; 孟昆
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2018-03-12
Filing date: 2018-03-12
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2038-03-12
Also published as: CN108588056A

Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种来源于真菌的低温α‑淀粉酶Tcamy及其基因和应用。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。该淀粉酶Tcamy最适pH为5.0，在pH5.0‑pH10.0范围内，该酶能够维持其50％以上的酶活力，这说明此酶具有很好的pH稳定性。其最适温度35℃，在0℃下保持有27％的活性；当热处理温度超过其最适温度之后，酶活骤降,为典型的低温α‑淀粉酶。

Description

一种低温α-淀粉酶Tcamy及其基因和应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种低温α-淀粉酶Tcamy及其基因和应用。

背景技术

淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。淀粉酶家族包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α-淀粉酶为内切酶，以无规则的方式切开淀粉分子内部的α-1，4糖苷键，而使淀粉生成糊精和低聚糖，是一种钙离子依赖性酶。

α-淀粉酶(EC.3.2.1.1)属于糖苷水解酶13家族，能够作用于可溶性淀粉、糖元、直链淀粉等α-1,4-葡聚糖，其水解淀粉的主要产物是一些由葡萄糖单位组成的低聚糖和糊精的混合物。根据淀粉酶催化活性的最适作用温度不同，可将淀粉酶分为低温、中温和高温淀粉酶。低温淀粉酶在生物技术和工业应用中具有广泛的吸引力，低温淀粉酶在低温和中温下具有较高的催化活性，它意味着在工业生产过程有着中更少的能量消耗。在烘焙行业中，α-淀粉酶被用来改善面包的柔软性和体积，在此之后需要酶完全失活，这可以用热不稳定的低温淀粉酶来完成而不影响产品品质。作为洗涤剂的添加剂而言，低温淀粉酶不仅能在低水温环境中高效发挥作用，而且排放后对环境危害小。另外，应用低温淀粉酶来进行废水处理和生物修复也是未来的研究热点。

本发明从Thermoascus crustaceus JCM12803菌株中得到了一个新的低温α-淀粉酶基因Tcamy，其编码的低温α-淀粉酶具有以下几个优点：低温下催化活性高、广泛的pH稳定性。所有这些优点都意味着新发明的低温淀粉酶在饲料、食品、医药等行业中，将会比之前报道的淀粉酶更有应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的低温α-淀粉酶。

本发明的再一目的是提供编码上述低温α-淀粉酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述低温α-淀粉酶的基因工程方法。

本发明从Thermoascus crustaceus JCM12803中分离得到一种低温α-淀粉酶Tcamy，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

MHLRSFSILPALVVGTALAATPAQWRSQSVYFLLTDRFARTDGSTTAACDTDARAYCGGTWQGIIDHLDYIQGMGFTAIWITPVTENLPQDTGDGTSYHGYWQQDVYSLNSNYGTPDDLRALSSALHDRGMYLMVDVVANHMGYAGPGSSVDYTVFTPFNDQKYFHPYCSISNYDDQSNVEDCWLGDSTVSLPDLDTTRSDVQDMWYSWVKGLVANYSVDGLRIDTVKHVQKDFWPGYNDAAGVYCVGEVFDGDPSSTCDYQNYLDGVLNYPMYYPLLRAFSSTSGSISDLYNMINTVKSECADSTLLGTFVENHDNPRFASYTSDISLAKNALAFTILSDGIPIIYAGQEQHYSGGNDPANREAVWLSGYSTTSELYKFIAVSNQIRNHAISVDGDDYLTYKTYPIYQDTTTLAVRKGSLITVLSNLGSSGSSYTLSLGGTGYSSGQELMEIYSCTTVTADSSGNIAVPMGSGLPKAFYPTANLGGSGICGK该酶包括493个氨基酸，N端19个氨基酸为信号肽序列，因此，成熟的低温α-淀粉酶Tcamy的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

ATPAQWRSQSVYFLLTDRFARTDGSTTAACDTDARAYCGGTWQGIIDHLDYIQGMGFTAIWITPVTENLPQDTGDGTSYHGYWQQDVYSLNSNYGTPDDLRALSSALHDRGMYLMVDVVANHMGYAGPGSSVDYTVFTPFNDQKYFHPYCSISNYDDQSNVEDCWLGDSTVSLPDLDTTRSDVQDMWYSWVKGLVANYSVDGLRIDTVKHVQKDFWPGYNDAAGVYCVGEVFDGDPSSTCDYQNYLDGVLNYPMYYPLLRAFSSTSGSISDLYNMINTVKSECADSTLLGTFVENHDNPRFASYTSDISLAKNALAFTILSDGIPIIYAGQEQHYSGGNDPANREAVWLSGYSTTSELYKFIAVSNQIRNHAISVDGDDYLTYKTYPIYQDTTTLAVRKGSLITVLSNLGSSGSSYTLSLGGTGYSSGQELMEIYSCTTVTADSSGNIAVPMGSGLPKAFYPTANLGGSGICGK

信号肽序列为MHLRSFSILPALVVGTALA(SEQ ID NO.3).

本发明提供了编码上述低温α-淀粉酶基因Tcamy，具体地，该基因的基因组序列(含有八个内含子)如SEQ ID NO.4所示。

Atgcaccttcgatcattctcaatcctccccgctctggtggttggaaccgccctcgcggcaacgcctgctcaatggcgctctcaatcggtctacttccttctgacggacaggtttgcgaggactgatgggtcgaccacggctgcctgtgatacggatgcaagggtatattttgtttttattttccccggcttgataaaagaaaaaaaaagctaacactcaataaaggcatactgcggcggtacttggcagggaataatcgatcatgttcgtgatcctcctcctcctctttcaacctctaacagtaataaaaccctgactaactttctatctgtagctcgattacatccaaggaatgggcttcacagccatctggatcacccccgtcaccgaaaacctcccgcaggacaccggagacgggacatcatatcatggctactggcagcaggatgtgtgagttttgacccaatttgcaagaaaatggtaattcgacaggatgggagcagagagcatctacgtctgccacttctgacagcagactaacctgctgaaccaccatagatactccctcaactccaactacggcacacccgacgacctccgcgctctctcctccgccctccacgaccgcggcatgtacctcatggtggacgtcgtcgcgaaccacatggtgcgtttctcctcccctacccccccggaaaccaaccgtactgataaatgggcaaataccagggctacgccggccccggctcctccgtcgactacaccgtcttcacccccttcaacgaccagaaatacttccacccgtactgctcgatcagcaactacgacgaccaatccaacgttgaggactgctggctcggcgactcgacggtctctctgccggatctggataccacgaggtcggacgtgcaggatatgtggtatagctgggtaaaggggttggtggctaattattcgggtgagttcctctcccagtacctttgcatcacgcattaaggaaatataagaatataagaattatatgttaagttgagtgggggaaaaaatatagtggacggcctccgcatcgataccgtcaaacacgtccagaaggacttctggccgggctacaacgacgccgcaggcgtctactgcgtcggggaagtctttgacggggaccccagctctacctgcgactatcagaactatttggatggggtgttgaattatccgatgcaagtcttcactttgcatactagcctctatcaacaaacctgacgaaaaaaaaaatggtgacatctaacccctggatgtgcgtatgtacaggtactaccccctcctcagagcattctcatccacgagcggcagcatcagcgacctgtacaacatgatcaacacggtgaaatcggaatgcgccgactcgacgctcctgggcacctttgtcgagaaccacgataatccgcggtttgcttcgtaggttgaaccagttttctgctctgtcgcttttccctgtcgttatttcagaaaatatctagatagtgggtattgacaaaatatgcagatatacaagcgacatctccctcgccaaaaacgctctcgcattcaccatcctgtcggacggcatccccatcatctacgccggtcaggagcagcactacagcggcggaaatgaccccgcgaaccgtgaagcggtgtggctgtccggctactccacgaccagcgagctctacaagttcattgcggtttcgaaccagatccgcaatcatgcgataagtgtggacggtgatgactatttgacgtataaggtgagattgaccggaatcgattatttatatatagaaaatattttgtctttttccaaatttgctatgtgatgcagcacgaccagtatatatgctaacaagagtttcgctagacatacccaatttaccaagatacaaccacactggcggtacgcaaaggaagccttatcaccgtgctgtccaacctcggctcttccggcagctcttacacactctcgctgggcgggacgggctattcctccggccaggagctgatggaaatctactcctgcacgaccgtcacggcggattcaagcgggaatatcgcggttccgatggggagcggtcttccaaaggcgttttatcccacggctaatcttggaggaagcggtatctgtgggaaataa

该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.5所示。

Atgcaccttcgatcattctcaatcctccccgctctggtggttggaaccgccctcgcggcaacgcctgctcaatggcgctctcaatcggtctacttccttctgacggacaggtttgcgaggactgatgggtcgaccacggctgcctgtgatacggatgcaagggcatactgcggcggtacttggcagggaataatcgatcatctcgattacatccaaggaatgggcttcacagccatctggatcacccccgtcaccgaaaacctcccgcaggacaccggagacgggacatcatatcatggctactggcagcaggatgtatactccctcaactccaactacggcacacccgacgacctccgcgctctctcctccgccctccacgaccgcggcatgtacctcatggtggacgtcgtcgcgaaccacatgggctacgccggccccggctcctccgtcgactacaccgtcttcacccccttcaacgaccagaaatacttccacccgtactgctcgatcagcaactacgacgaccaatccaacgttgaggactgctggctcggcgactcgacggtctctctgccggatctggataccacgaggtcggacgtgcaggatatgtggtatagctgggtaaaggggttggtggctaattattcggtggacggcctccgcatcgataccgtcaaacacgtccagaaggacttctggccgggctacaacgacgccgcaggcgtctactgcgtcggggaagtctttgacggggaccccagctctacctgcgactatcagaactatttggatggggtgttgaattatccgatgtactaccccctcctcagagcattctcatccacgagcggcagcatcagcgacctgtacaacatgatcaacacggtgaaatcggaatgcgccgactcgacgctcctgggcacctttgtcgagaaccacgataatccgcggtttgcttcatatacaagcgacatctccctcgccaaaaacgctctcgcattcaccatcctgtcggacggcatccccatcatctacgccggtcaggagcagcactacagcggcggaaatgaccccgcgaaccgtgaagcggtgtggctgtccggctactccacgaccagcgagctctacaagttcattgcggtttcgaaccagatccgcaatcatgcgataagtgtggacggtgatgactatttgacgtataagacatacccaatttaccaagatacaaccacactggcggtacgcaaaggaagccttatcaccgtgctgtccaacctcggctcttccggcagctcttacacactctcgctgggcgggacgggctattcctccggccaggagctgatggaaatctactcctgcacgaccgtcacggcggattcaagcgggaatatcgcggttccgatggggagcggtcttccaaaggcgttttatcccacggctaatcttggaggaagcggtatctgtgggaaataa

去除信号肽序列后核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

gcaacgcctgctcaatggcgctctcaatcggtctacttccttctgacggacaggtttgcgaggactgatgggtcgaccacggctgcctgtgatacggatgcaagggcatactgcggcggtacttggcagggaataatcgatcatctcgattacatccaaggaatgggcttcacagccatctggatcacccccgtcaccgaaaacctcccgcaggacaccggagacgggacatcatatcatggctactggcagcaggatgtatactccctcaactccaactacggcacacccgacgacctccgcgctctctcctccgccctccacgaccgcggcatgtacctcatggtggacgtcgtcgcgaaccacatgggctacgccggccccggctcctccgtcgactacaccgtcttcacccccttcaacgaccagaaatacttccacccgtactgctcgatcagcaactacgacgaccaatccaacgttgaggactgctggctcggcgactcgacggtctctctgccggatctggataccacgaggtcggacgtgcaggatatgtggtatagctgggtaaaggggttggtggctaattattcggtggacggcctccgcatcgataccgtcaaacacgtccagaaggacttctggccgggctacaacgacgccgcaggcgtctactgcgtcggggaagtctttgacggggaccccagctctacctgcgactatcagaactatttggatggggtgttgaattatccgatgtactaccccctcctcagagcattctcatccacgagcggcagcatcagcgacctgtacaacatgatcaacacggtgaaatcggaatgcgccgactcgacgctcctgggcacctttgtcgagaaccacgataatccgcggtttgcttcatatacaagcgacatctccctcgccaaaaacgctctcgcattcaccatcctgtcggacggcatccccatcatctacgccggtcaggagcagcactacagcggcggaaatgaccccgcgaaccgtgaagcggtgtggctgtccggctactccacgaccagcgagctctacaagttcattgcggtttcgaaccagatccgcaatcatgcgataagtgtggacggtgatgactatttgacgtataagacatacccaatttaccaagatacaaccacactggcggtacgcaaaggaagccttatcaccgtgctgtccaacctcggctcttccggcagctcttacacactctcgctgggcgggacgggctattcctccggccaggagctgatggaaatctactcctgcacgaccgtcacggcggattcaagcgggaatatcgcggttccgatggggagcggtcttccaaaggcgttttatcccacggctaatcttggaggaagcggtatctgtgggaaataa

其中，信号肽的基因序列如SEQ ID NO.7所示。

atgcaccttcgatcattctcaatcctccccgctctggtggttggaaccgccctcgcg

本发明还提供了包含上述低温α-淀粉酶基因Tcamy的重组载体，优选为pPIC9-Tcamy。

本发明还提供了包含上述低温α-淀粉酶Tcamy的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

本发明还提供了一种制备低温α-淀粉酶Tcamy的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组低温α-淀粉酶表达；

3)回收并纯化所表达的低温α-淀粉酶Tcamy。

此低温α-淀粉酶Tcamy的理论分子量为51.8kDa。该低温α-淀粉酶Tcamy的最适pH为5.0,在pH4.5～7.0的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的60％以上。低温α-淀粉酶Tcamy在pH 5.0-10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在60％以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性；最适温度35℃，当酶促反应温度超过40℃时，酶活力骤降，在20℃下显示出40％的酶活，0℃下仍旧有27％的酶活。热稳定性方面，在30℃下保温30min后，剩余68％的酶活；在40℃下保温10min，几乎完全丧失酶活性。

本发明还提供了编码上述低温α-淀粉酶Tcamy的基因Tcamy。

本发明通过PCR的方法分离克隆了这个淀粉酶基因Tcamy，DNA全序列分析结果表明，淀粉酶Tcamy结构基因全长2167bp，含有8个内含子，cDNA长1482bp，编码493aa和一个终止密码子，N端19个氨基酸预测为信号肽序列。蛋白理论分子量为51.8kDa，等电点为4.37，该酶属于糖苷水解酶第13家族，是一种新的淀粉酶。

本发明还提供了包含上述低温α-淀粉酶基因的重组载体，优选为pPIC9-Tcamy。将本发明的低温α-淀粉酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将低温α-淀粉酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pPIC9-Tcamy。

本发明还提供了包含上述低温α-淀粉酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/Tcamy。

本发明还提供了一种制备低温α-淀粉酶的方法，包括以下步骤：

1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组α-淀粉酶的表达；

3)回收并纯化所表达的低温α-淀粉酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞GS115，得到重组菌株GS115/Tcamy。

附图说明

图1显示在毕赤酵母中表达的重组低温α-淀粉酶的SDS-PAGE分析，其中，M：蛋白质Marker；1、2：纯化的酶液；3：去糖基化处理的酶液。

图2显示重组低温α-淀粉酶的最适pH。

图3显示重组低温α-淀粉酶的pH稳定性。

图4显示重组低温α-淀粉酶的最适温度。

图5显示重组低温α-淀粉酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：表达宿主Pichia pastoris GS115，表达质粒载体pPIC9。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)YPD培养基：葡萄糖20g/L、酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L。

(2)LB液体培养基：酵母浸提物5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L。

(3)LB固体培养基：酵母浸提物5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、15g/L琼脂粉。

(4)MD固体培养基：葡萄糖20g/L、琼脂糖20g/L、YNB13.4g/L、生物素0.004g/L。

(5)BMGY培养基：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、1％甘油、YNB13.4g/L、生物素0.004g/L。

(6)BMMY培养基：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、0.5％无水甲醇、YNB13.4g/L、生物素0.004g/L。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行

实施例1Thermoascus crustaceus JCM12803来源的低温α-淀粉酶编码基因Tcamy的克隆

提取Thermoascus crustaceus JCM12803基因组DNA。

设计克隆引物，以Thermoascus crustaceus JCM12803总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃ 5min；94℃ 30sec,55℃ 30sec,72℃ 2min,32个循环，72℃ 10min。得到一约1500bp片段，将该片段回收后送华大生物技术有限公司测序。

表1基因克隆本实验所需的引物

实施例2淀粉酶cDNA的获得

提取Thermoascus crustaceus JCM12803总RNA，利用Oligo(dT)₂₀和反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计扩增开放阅读框的的引物Tcamy-F和Tcamy-R(见表1)，扩增该单链cDNA，获得淀粉酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送测序。

通过对淀粉酶的基因组序列和cDNA序列比对后发现该基因有含有8个内含子，cDNA长1482bp，编码493个氨基酸和一个终止密码子，N端19个氨基酸为其信号肽序列，从Thermoascus crustaceus JCM12803中分离克隆得到的编码淀粉酶的基因为新基因。

实施例3淀粉酶工程菌株的构建

(1)表达载体的构建及在酵母的表达

以测序正确的淀粉酶Tcamy的cDNA为模板，设计合成了带有EcoR I和Not I限制性酶切位点的引物Tcamy-F和Tcamy-R(见表1)，对Tcamy的成熟蛋白的编码区进行扩增。并利用EcoR I和Not I酶切PCR产物，连接进入表达载体pPIC9，淀粉酶Tcamy成熟蛋白的序列插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体pPIC9/Tcamy，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶Bgl II进行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GS115感受态细胞，30℃培养2-3天，挑取在MD平板上生长的转化子进行进一步的表达实验，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。

以同样方法构建包含信号肽序列的重组表达载体。

(2)高淀粉酶活性转化子的筛选

用灭过菌的牙签从长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号先点到MD平板上，将MD平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从MD平板上挑取转化子接种于装有3mL BMGY培养基的离心管中，30℃、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液4500×g离心5min，去上清，离心管中再加入1mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，在30℃、220rpm诱导培养；诱导培养48h后，4500×g离心5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出高淀粉酶活性的转化子，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。

实施例4重组淀粉酶的制备

(1)淀粉酶基因Tcamy在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达

筛选出酶活较高的转化子，接种于300mL BMGY液体培养基的1L三角瓶中，30℃，220rpm摇床振荡培养48h；4500rpm离心5min，轻柔弃上清，再向菌体加入150mL含有0.5％甲醇的BMMY液体培养基，30℃，220rpm诱导培养48h。诱导培养期间，间隔24h补加一次无水甲醇以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5％左右；(3)12,000×g低温离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。

(2)重组淀粉酶的纯化

收集摇瓶表达的重组淀粉酶上清液，通过10kDa膜包进行浓缩，浓缩至约10倍体积后，用3kDa透析袋置于pH 6.5、10mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液中脱盐透析过夜处理。用平衡后的HiTrap Q XL阴离子柱纯化粗酶液，并收集不同梯度洗脱下来的蛋白。具体地，取脱盐透析后的Tcamy浓缩液2.0mL经预先用pH 6.5的10mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液为A液平衡过的HiTrap Q XL阴离子柱，然后用在A液基础上添加1mol/L的NaCl的B液进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定。

检测酶蛋白活性后进行SDS-PAGE蛋白电泳分析其纯度，采用Endo H(New EnglandBiolabs)处理酶蛋白，去除N-糖基化修饰。选择其中最纯的酶液进行酶学性质分析。经SDS-PAGE鉴定达到了蛋白电泳纯(图1)，重组淀粉酶的表达量为409.01U/mL，比活为303U/mg。经过Endo H酶脱糖基处理之后，蛋白条带有略微降低，与理论计算分子量相一致，为51.9kDa。

实施例5重组淀粉酶的活性分析

一、DNS法：具体方法如下：将按GB/T24401-2009方法配制的2％可溶性淀粉用相应pH缓冲溶液稀释至1％终浓度淀粉溶液作为底物，测量体系包括900μL的底物和100μL适当稀释的酶液，在35℃水浴锅中反应30min，加入1.5mL的DNS试剂终止反应后，置于沸水浴中处理5min，快速冷却至室温后取250μL混合液在酶标仪读取在波长540nm下的吸光值，每组反应设置一个空白对照及三个平行。

酶活单位(U)定义：在一定条件下，每分钟水解可溶性淀粉生成1μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位。

二、重组淀粉酶的性质测定

1、重组淀粉酶的最适pH和pH稳定性的测定方法如下:

将实施例4纯化的重组淀粉酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。纯化后的淀粉酶Tcamy在35℃，不同的pH(pH 3.0-8.0,0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)的底物下进行酶促反应30min以测定其最适pH。结果(图2)表明，Tcamy的最适pH为5.0,在pH4.5-7.0的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的60％以上。淀粉酶于上述各种不同pH的缓冲液中室温处理60min，再在pH5.0缓冲液体系中35℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图3)表明，在pH 5.0-10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在50％以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性。

2、重组淀粉酶的最适温度及热稳定性测定方法如下:

重组淀粉酶的最适温度的测定为在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为重组淀粉酶在不同温度下处理不同时间，再在35℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明,其最适温度为35℃，当酶促反应温度超过40℃时，酶活力骤降；在20℃下显示出40％的酶活，0℃下仍旧有27％的酶活。酶的热稳定性试验表明(图5)，在30℃下保温30min后，剩余68％的酶活；当处理温度超过最适温度之后，极易失活，在40℃下保温10min，几乎完全丧失酶活性。

3、重组淀粉酶的K_m值测定方法如下:

确定测定Km及Vmax的反应时间为15min，用不同浓度的可溶性淀粉(1.0，0.8，0.5，0.25，0.2，0.15，0.13，0.1，0.08和0.05％)为底物，在最适条件下测定酶活性，计算出相应的反应速度，利用GraphPad Prism 5软件计算Km值及Vmax。

Tcamy以可溶性淀粉为底物时，在最适条件下的Km值、Vmax值分别是1.79mg/mL和296μmol/min·mg。

4、不同金属离子化学试剂对Tcamy酶活的影响测定如下:

在酶促反应体系中加入5mM的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在35℃、pH5.0条件下测定酶活性。结果(表2)表明，Fe³⁺对Tcamy有很强的抑制作用；β-巯基乙醇对Tcamy酶活有明显促进作用，而Na⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Zn²⁺对Tcamy酶活有轻微促进作用。

表2.各种金属离子和化学试剂对Tcamy活力的影响

金属离子	相对酶活(％)	金属离子或化学试剂	相对酶活(％)
				Control	100.0±0.97	-	-
K<sup>+</sup>	98.4	Cr<sup>3+</sup>	106.5
				Mg<sup>2+</sup>	95.5	Co<sup>2+</sup>	114.2
Na<sup>+</sup>	102.2	Zn<sup>2+</sup>	101.3
				Ca<sup>2+</sup>	107.2	Fe<sup>3+</sup>	9.57
Ni<sup>2+</sup>	98.3	β-Mercaptoethanol	133.5
				Ag<sup>+</sup>	93.24	EDTA	83.8
Mn<sup>2+</sup>	101.6	SDS	51.9

5、重组淀粉酶Tcamy的底物特异性。

重组α-淀粉酶Tcamy对可溶性淀粉有最高酶活，将其定义为100％时，Tcamy对于麦芽糊精和玉米糊精的酶活分别为47.1％和35.4％，对于γ-环糊精和β-环糊精的酶活分别为9.5％和7.9％，而以玉米支链淀粉、玉米直链淀粉、糖原、α-环糊精和生淀粉为底物时，未检测到还原糖产生。

序列表

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> 一种低温α-淀粉酶Tcamy及其基因和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 493

<212> PRT

<213> Thermoascus crustaceus JCM12803

<400> 1

Met His Leu Arg Ser Phe Ser Ile Leu Pro Ala Leu Val Val Gly Thr

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Thr Pro Ala Gln Trp Arg Ser Gln Ser Val Tyr Phe

20 25 30

Leu Leu Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Ser Thr Thr Ala Ala

35 40 45

Cys Asp Thr Asp Ala Arg Ala Tyr Cys Gly Gly Thr Trp Gln Gly Ile

50 55 60

Ile Asp His Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp

65 70 75 80

Ile Thr Pro Val Thr Glu Asn Leu Pro Gln Asp Thr Gly Asp Gly Thr

85 90 95

Ser Tyr His Gly Tyr Trp Gln Gln Asp Val Tyr Ser Leu Asn Ser Asn

100 105 110

Tyr Gly Thr Pro Asp Asp Leu Arg Ala Leu Ser Ser Ala Leu His Asp

115 120 125

Arg Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met Gly Tyr

130 135 140

Ala Gly Pro Gly Ser Ser Val Asp Tyr Thr Val Phe Thr Pro Phe Asn

145 150 155 160

Asp Gln Lys Tyr Phe His Pro Tyr Cys Ser Ile Ser Asn Tyr Asp Asp

165 170 175

Gln Ser Asn Val Glu Asp Cys Trp Leu Gly Asp Ser Thr Val Ser Leu

180 185 190

Pro Asp Leu Asp Thr Thr Arg Ser Asp Val Gln Asp Met Trp Tyr Ser

195 200 205

Trp Val Lys Gly Leu Val Ala Asn Tyr Ser Val Asp Gly Leu Arg Ile

210 215 220

Asp Thr Val Lys His Val Gln Lys Asp Phe Trp Pro Gly Tyr Asn Asp

225 230 235 240

Ala Ala Gly Val Tyr Cys Val Gly Glu Val Phe Asp Gly Asp Pro Ser

245 250 255

Ser Thr Cys Asp Tyr Gln Asn Tyr Leu Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro

260 265 270

Met Tyr Tyr Pro Leu Leu Arg Ala Phe Ser Ser Thr Ser Gly Ser Ile

275 280 285

Ser Asp Leu Tyr Asn Met Ile Asn Thr Val Lys Ser Glu Cys Ala Asp

290 295 300

Ser Thr Leu Leu Gly Thr Phe Val Glu Asn His Asp Asn Pro Arg Phe

305 310 315 320

Ala Ser Tyr Thr Ser Asp Ile Ser Leu Ala Lys Asn Ala Leu Ala Phe

325 330 335

Thr Ile Leu Ser Asp Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Ala Gly Gln Glu Gln

340 345 350

His Tyr Ser Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala Val Trp Leu

355 360 365

Ser Gly Tyr Ser Thr Thr Ser Glu Leu Tyr Lys Phe Ile Ala Val Ser

370 375 380

Asn Gln Ile Arg Asn His Ala Ile Ser Val Asp Gly Asp Asp Tyr Leu

385 390 395 400

Thr Tyr Lys Thr Tyr Pro Ile Tyr Gln Asp Thr Thr Thr Leu Ala Val

405 410 415

Arg Lys Gly Ser Leu Ile Thr Val Leu Ser Asn Leu Gly Ser Ser Gly

420 425 430

Ser Ser Tyr Thr Leu Ser Leu Gly Gly Thr Gly Tyr Ser Ser Gly Gln

435 440 445

Glu Leu Met Glu Ile Tyr Ser Cys Thr Thr Val Thr Ala Asp Ser Ser

450 455 460

Gly Asn Ile Ala Val Pro Met Gly Ser Gly Leu Pro Lys Ala Phe Tyr

465 470 475 480

Pro Thr Ala Asn Leu Gly Gly Ser Gly Ile Cys Gly Lys

485 490

<210> 2

<211> 474

<212> PRT

<213> Thermoascus crustaceus JCM12803

<400> 2

Ala Thr Pro Ala Gln Trp Arg Ser Gln Ser Val Tyr Phe Leu Leu Thr

1 5 10 15

Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Ser Thr Thr Ala Ala Cys Asp Thr

20 25 30

Asp Ala Arg Ala Tyr Cys Gly Gly Thr Trp Gln Gly Ile Ile Asp His

35 40 45

Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Thr Pro

50 55 60

Val Thr Glu Asn Leu Pro Gln Asp Thr Gly Asp Gly Thr Ser Tyr His

65 70 75 80

Gly Tyr Trp Gln Gln Asp Val Tyr Ser Leu Asn Ser Asn Tyr Gly Thr

85 90 95

Pro Asp Asp Leu Arg Ala Leu Ser Ser Ala Leu His Asp Arg Gly Met

100 105 110

Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met Gly Tyr Ala Gly Pro

115 120 125

Gly Ser Ser Val Asp Tyr Thr Val Phe Thr Pro Phe Asn Asp Gln Lys

130 135 140

Tyr Phe His Pro Tyr Cys Ser Ile Ser Asn Tyr Asp Asp Gln Ser Asn

145 150 155 160

Val Glu Asp Cys Trp Leu Gly Asp Ser Thr Val Ser Leu Pro Asp Leu

165 170 175

Asp Thr Thr Arg Ser Asp Val Gln Asp Met Trp Tyr Ser Trp Val Lys

180 185 190

Gly Leu Val Ala Asn Tyr Ser Val Asp Gly Leu Arg Ile Asp Thr Val

195 200 205

Lys His Val Gln Lys Asp Phe Trp Pro Gly Tyr Asn Asp Ala Ala Gly

210 215 220

Val Tyr Cys Val Gly Glu Val Phe Asp Gly Asp Pro Ser Ser Thr Cys

225 230 235 240

Asp Tyr Gln Asn Tyr Leu Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr

245 250 255

Pro Leu Leu Arg Ala Phe Ser Ser Thr Ser Gly Ser Ile Ser Asp Leu

260 265 270

Tyr Asn Met Ile Asn Thr Val Lys Ser Glu Cys Ala Asp Ser Thr Leu

275 280 285

Leu Gly Thr Phe Val Glu Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Ala Ser Tyr

290 295 300

Thr Ser Asp Ile Ser Leu Ala Lys Asn Ala Leu Ala Phe Thr Ile Leu

305 310 315 320

Ser Asp Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Ala Gly Gln Glu Gln His Tyr Ser

325 330 335

Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala Val Trp Leu Ser Gly Tyr

340 345 350

Ser Thr Thr Ser Glu Leu Tyr Lys Phe Ile Ala Val Ser Asn Gln Ile

355 360 365

Arg Asn His Ala Ile Ser Val Asp Gly Asp Asp Tyr Leu Thr Tyr Lys

370 375 380

Thr Tyr Pro Ile Tyr Gln Asp Thr Thr Thr Leu Ala Val Arg Lys Gly

385 390 395 400

Ser Leu Ile Thr Val Leu Ser Asn Leu Gly Ser Ser Gly Ser Ser Tyr

405 410 415

Thr Leu Ser Leu Gly Gly Thr Gly Tyr Ser Ser Gly Gln Glu Leu Met

420 425 430

Glu Ile Tyr Ser Cys Thr Thr Val Thr Ala Asp Ser Ser Gly Asn Ile

435 440 445

Ala Val Pro Met Gly Ser Gly Leu Pro Lys Ala Phe Tyr Pro Thr Ala

450 455 460

Asn Leu Gly Gly Ser Gly Ile Cys Gly Lys

465 470

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> Thermoascus crustaceus JCM12803

<400> 3

Met His Leu Arg Ser Phe Ser Ile Leu Pro Ala Leu Val Val Gly Thr

1 5 10 15

Ala Leu Ala

<210> 4

<211> 2167

<212> DNA

<213> Thermoascus crustaceus JCM12803

<400> 4

atgcaccttc gatcattctc aatcctcccc gctctggtgg ttggaaccgc cctcgcggca 60

acgcctgctc aatggcgctc tcaatcggtc tacttccttc tgacggacag gtttgcgagg 120

actgatgggt cgaccacggc tgcctgtgat acggatgcaa gggtatattt tgtttttatt 180

ttccccggct tgataaaaga aaaaaaaagc taacactcaa taaaggcata ctgcggcggt 240

acttggcagg gaataatcga tcatgttcgt gatcctcctc ctcctctttc aacctctaac 300

agtaataaaa ccctgactaa ctttctatct gtagctcgat tacatccaag gaatgggctt 360

cacagccatc tggatcaccc ccgtcaccga aaacctcccg caggacaccg gagacgggac 420

atcatatcat ggctactggc agcaggatgt gtgagttttg acccaatttg caagaaaatg 480

gtaattcgac aggatgggag cagagagcat ctacgtctgc cacttctgac agcagactaa 540

cctgctgaac caccatagat actccctcaa ctccaactac ggcacacccg acgacctccg 600

cgctctctcc tccgccctcc acgaccgcgg catgtacctc atggtggacg tcgtcgcgaa 660

ccacatggtg cgtttctcct cccctacccc cccggaaacc aaccgtactg ataaatgggc 720

aaataccagg gctacgccgg ccccggctcc tccgtcgact acaccgtctt cacccccttc 780

aacgaccaga aatacttcca cccgtactgc tcgatcagca actacgacga ccaatccaac 840

gttgaggact gctggctcgg cgactcgacg gtctctctgc cggatctgga taccacgagg 900

tcggacgtgc aggatatgtg gtatagctgg gtaaaggggt tggtggctaa ttattcgggt 960

gagttcctct cccagtacct ttgcatcacg cattaaggaa atataagaat ataagaatta 1020

tatgttaagt tgagtggggg aaaaaatata gtggacggcc tccgcatcga taccgtcaaa 1080

cacgtccaga aggacttctg gccgggctac aacgacgccg caggcgtcta ctgcgtcggg 1140

gaagtctttg acggggaccc cagctctacc tgcgactatc agaactattt ggatggggtg 1200

ttgaattatc cgatgcaagt cttcactttg catactagcc tctatcaaca aacctgacga 1260

aaaaaaaaat ggtgacatct aacccctgga tgtgcgtatg tacaggtact accccctcct 1320

cagagcattc tcatccacga gcggcagcat cagcgacctg tacaacatga tcaacacggt 1380

gaaatcggaa tgcgccgact cgacgctcct gggcaccttt gtcgagaacc acgataatcc 1440

gcggtttgct tcgtaggttg aaccagtttt ctgctctgtc gcttttccct gtcgttattt 1500

cagaaaatat ctagatagtg ggtattgaca aaatatgcag atatacaagc gacatctccc 1560

tcgccaaaaa cgctctcgca ttcaccatcc tgtcggacgg catccccatc atctacgccg 1620

gtcaggagca gcactacagc ggcggaaatg accccgcgaa ccgtgaagcg gtgtggctgt 1680

ccggctactc cacgaccagc gagctctaca agttcattgc ggtttcgaac cagatccgca 1740

atcatgcgat aagtgtggac ggtgatgact atttgacgta taaggtgaga ttgaccggaa 1800

tcgattattt atatatagaa aatattttgt ctttttccaa atttgctatg tgatgcagca 1860

cgaccagtat atatgctaac aagagtttcg ctagacatac ccaatttacc aagatacaac 1920

cacactggcg gtacgcaaag gaagccttat caccgtgctg tccaacctcg gctcttccgg 1980

cagctcttac acactctcgc tgggcgggac gggctattcc tccggccagg agctgatgga 2040

aatctactcc tgcacgaccg tcacggcgga ttcaagcggg aatatcgcgg ttccgatggg 2100

gagcggtctt ccaaaggcgt tttatcccac ggctaatctt ggaggaagcg gtatctgtgg 2160

gaaataa 2167

<210> 5

<211> 1482

<212> DNA

<213> Thermoascus crustaceus JCM12803

<400> 5

atgcaccttc gatcattctc aatcctcccc gctctggtgg ttggaaccgc cctcgcggca 60

acgcctgctc aatggcgctc tcaatcggtc tacttccttc tgacggacag gtttgcgagg 120

actgatgggt cgaccacggc tgcctgtgat acggatgcaa gggcatactg cggcggtact 180

tggcagggaa taatcgatca tctcgattac atccaaggaa tgggcttcac agccatctgg 240

atcacccccg tcaccgaaaa cctcccgcag gacaccggag acgggacatc atatcatggc 300

tactggcagc aggatgtata ctccctcaac tccaactacg gcacacccga cgacctccgc 360

gctctctcct ccgccctcca cgaccgcggc atgtacctca tggtggacgt cgtcgcgaac 420

cacatgggct acgccggccc cggctcctcc gtcgactaca ccgtcttcac ccccttcaac 480

gaccagaaat acttccaccc gtactgctcg atcagcaact acgacgacca atccaacgtt 540

gaggactgct ggctcggcga ctcgacggtc tctctgccgg atctggatac cacgaggtcg 600

gacgtgcagg atatgtggta tagctgggta aaggggttgg tggctaatta ttcggtggac 660

ggcctccgca tcgataccgt caaacacgtc cagaaggact tctggccggg ctacaacgac 720

gccgcaggcg tctactgcgt cggggaagtc tttgacgggg accccagctc tacctgcgac 780

tatcagaact atttggatgg ggtgttgaat tatccgatgt actaccccct cctcagagca 840

ttctcatcca cgagcggcag catcagcgac ctgtacaaca tgatcaacac ggtgaaatcg 900

gaatgcgccg actcgacgct cctgggcacc tttgtcgaga accacgataa tccgcggttt 960

gcttcatata caagcgacat ctccctcgcc aaaaacgctc tcgcattcac catcctgtcg 1020

gacggcatcc ccatcatcta cgccggtcag gagcagcact acagcggcgg aaatgacccc 1080

gcgaaccgtg aagcggtgtg gctgtccggc tactccacga ccagcgagct ctacaagttc 1140

attgcggttt cgaaccagat ccgcaatcat gcgataagtg tggacggtga tgactatttg 1200

acgtataaga catacccaat ttaccaagat acaaccacac tggcggtacg caaaggaagc 1260

cttatcaccg tgctgtccaa cctcggctct tccggcagct cttacacact ctcgctgggc 1320

gggacgggct attcctccgg ccaggagctg atggaaatct actcctgcac gaccgtcacg 1380

gcggattcaa gcgggaatat cgcggttccg atggggagcg gtcttccaaa ggcgttttat 1440

cccacggcta atcttggagg aagcggtatc tgtgggaaat aa 1482

<210> 6

<211> 1425

<212> DNA

<213> Thermoascus crustaceus JCM12803

<400> 6

gcaacgcctg ctcaatggcg ctctcaatcg gtctacttcc ttctgacgga caggtttgcg 60

aggactgatg ggtcgaccac ggctgcctgt gatacggatg caagggcata ctgcggcggt 120

acttggcagg gaataatcga tcatctcgat tacatccaag gaatgggctt cacagccatc 180

tggatcaccc ccgtcaccga aaacctcccg caggacaccg gagacgggac atcatatcat 240

ggctactggc agcaggatgt atactccctc aactccaact acggcacacc cgacgacctc 300

cgcgctctct cctccgccct ccacgaccgc ggcatgtacc tcatggtgga cgtcgtcgcg 360

aaccacatgg gctacgccgg ccccggctcc tccgtcgact acaccgtctt cacccccttc 420

aacgaccaga aatacttcca cccgtactgc tcgatcagca actacgacga ccaatccaac 480

gttgaggact gctggctcgg cgactcgacg gtctctctgc cggatctgga taccacgagg 540

tcggacgtgc aggatatgtg gtatagctgg gtaaaggggt tggtggctaa ttattcggtg 600

gacggcctcc gcatcgatac cgtcaaacac gtccagaagg acttctggcc gggctacaac 660

gacgccgcag gcgtctactg cgtcggggaa gtctttgacg gggaccccag ctctacctgc 720

gactatcaga actatttgga tggggtgttg aattatccga tgtactaccc cctcctcaga 780

gcattctcat ccacgagcgg cagcatcagc gacctgtaca acatgatcaa cacggtgaaa 840

tcggaatgcg ccgactcgac gctcctgggc acctttgtcg agaaccacga taatccgcgg 900

tttgcttcat atacaagcga catctccctc gccaaaaacg ctctcgcatt caccatcctg 960

tcggacggca tccccatcat ctacgccggt caggagcagc actacagcgg cggaaatgac 1020

cccgcgaacc gtgaagcggt gtggctgtcc ggctactcca cgaccagcga gctctacaag 1080

ttcattgcgg tttcgaacca gatccgcaat catgcgataa gtgtggacgg tgatgactat 1140

ttgacgtata agacataccc aatttaccaa gatacaacca cactggcggt acgcaaagga 1200

agccttatca ccgtgctgtc caacctcggc tcttccggca gctcttacac actctcgctg 1260

ggcgggacgg gctattcctc cggccaggag ctgatggaaa tctactcctg cacgaccgtc 1320

acggcggatt caagcgggaa tatcgcggtt ccgatgggga gcggtcttcc aaaggcgttt 1380

tatcccacgg ctaatcttgg aggaagcggt atctgtggga aataa 1425

<210> 7

<211> 57

<212> DNA

<213> Thermoascus crustaceus JCM12803

<400> 7

atgcaccttc gatcattctc aatcctcccc gctctggtgg ttggaaccgc cctcgcg 57

Claims

1.一种低温α-淀粉酶Tcamy，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。

2.一种低温α-淀粉酶基因Tcamy，其特征在于，其编码权利要求1所述的低温α-淀粉酶Tcamy。

3.根据权利要求2所述的低温α-淀粉酶基因Tcamy，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

4.包含权利要求2所述低温α-淀粉酶基因Tcamy的重组载体。

5.包含权利要求2所述的低温α-淀粉酶基因Tcamy的重组载体pPIC9-Tcamy，其中，将核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的低温α-淀粉酶基因Tcamy插入到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，得到所述重组载体pPIC9-Tcamy。

6.包含权利要求2所述低温α-淀粉酶基因Tcamy的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，其所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

8.根据权利要求6所述的重组菌株，所述重组菌株为重组毕赤酵母菌株GS115/Tcamy。

9.权利要求1所述的低温α-淀粉酶Tcamy用于降解可溶性淀粉、麦芽糊精和/或玉米糊精的应用。